CN117230049B - 一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶突变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，更具体而言，涉及一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶突变体及其用途；本发明提供了一种来源于Reinekea thalattae的褐藻胶裂解酶突变体，其热稳定性相对于野生型得到了提高，在最适催化条件下，本发明的突变体酶催化底物海藻酸钠以生产褐藻寡糖的相对酶活无明显下降，具有重要的工业应用和经济价值。

Description

一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶突变体及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体而言，涉及一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶的突变体酶。

背景技术

海藻酸钠，又名褐藻酸钠，最初提取自褐藻类生物生成的褐藻胶，在工业中通常由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）和α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通过1,4-糖苷键聚合而成，在食品工业中具有增稠、凝胶、稳定体系等多种用途。褐藻寡糖（Alginate Oligosaccharide，AOS）是一种聚合度为2-10的分子，由褐藻胶分解而成，具有调节人体免疫、抗氧化、抗肿瘤、保护神经系统、促进植物生长、抑菌等多种功能。AOS因具有特殊的化学特性和生物特性，在农业、食品、药品、保健品、化妆品、冶金、化工等领域具有潜在、广泛的应用价值。目前，褐藻胶的分解方法包括化学分解法、物理分解法和生物酶法，其中由于通过褐藻胶裂解酶的生物酶法的反应副产物少、耗能低且能生成含有不饱和双键的高生物活性寡糖，具有环保、清洁、条件温和、效率高等优点，其取代物理化学法成为制备AOS的主流方法已是必然。

迄今为止，尽管国内外学者对褐藻胶裂解酶的来源、分类、酶学性质、酶的结构、酶催化机理等方面作了大量的基础研究，但现有技术中的褐藻胶裂解酶仍存在发酵水平低、酶活力不高、价格昂贵、稳定性差、且不适合大规模使用等问题。国际市场上只有美国Sigma公司商业化的褐藻胶裂解酶产品A1603-100MG，酶活力大于10000 U/g，但价格昂贵，且仅以试剂形式出售。

Reinekea thalattae来源的褐藻胶裂解酶（Reth-Alyase）是一种新型的7家族褐藻胶裂解酶（P7 family），其对海藻酸钠有着极高的催化活力，比酶活达756.7 U/mg。同时，该酶对多聚古洛糖醛酸展现出较高的催化活力，这一性质目前在P7家族里面报道的较少。然而，Reth-Alyase的热稳定性较差，在40℃下保持4 h后的酶活不足20%。

因此，本领域仍需要一种具有较高活力同时稳定性较好的褐藻胶裂解酶。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，发明人根据已有褐藻胶裂解酶的晶体结构进行同源建模，分析关键位点氨基酸残基，使用定点突变的方法来源于Reinekea thalattae的褐藻胶裂解酶进行催化效率和热稳定性改造，并选择非保守氨基酸残基进行突变，寻找合适的热稳定性提高的突变体酶，由此完成了本发明。

因此，本发明的第一方面提供了一种褐藻胶裂解酶突变体，所述褐藻胶裂解酶来源于Reinekea thalattae，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述突变体包括在第44位和/或第149位的突变。

本发明的第二方面提供了一种基因，其编码根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体。

本发明的第三方面提供了一种表达载体，其包含根据本发明第二方面的基因。

本发明的第四方面提供了一种表达细胞，其包含根据本发明第二方面的基因或根据本发明第三方面的表达载体。

本发明的第五方面提供了一种制备褐藻寡糖的方法，所述方法包括将根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体或根据本发明第四方面的表达细胞添加至含有海藻酸盐反应体系中，进行反应。

本发明的第六方面提供了根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体或根据本发明第二方面的基因或根据本发明第三方面的表达载体或根据本发明第四方面的表达细胞在制备包含褐藻寡糖的产品中的用途。

本发明包括以下一个或者多个有益效果：

本发明提供了来源于Reinekea thalattae的褐藻胶裂解酶的突变体，其稳定性得到了提高，特别是双点突变体S44N/H149D在40℃下保持4 h后的酶活仍能保持在50%以上；在最适催化条件下，本发明的突变体酶催化底物海藻酸钠以生产褐藻寡糖的相对酶活无明显下降，这一发现对于工业化制备褐藻寡糖具有重要的研究和经济价值。

附图说明

图1为比较在35℃下的野生型酶和突变体酶的残余酶活的图。

图2为比较在40℃下的野生型酶和突变体酶的残余酶活的图。

图3为示出在不同pH条件下的突变体的相对酶活的图，其中A为突变体S44N，B为突变体H149D，C为突变体S44N/H149D。

图4为野生型酶与突变体酶的反应最适温度比较图。

具体实施方式

在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。

在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。

在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。

在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母或三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用Ala或A表示，甘氨酸可用Gly或G表示，缬氨酸可用Val或V表示，亮氨酸可用Leu或L表示，异亮氨酸可用Ile或I表示，脯氨酸可用Pro或P表示，苯丙氨酸可用Phe或F表示，酪氨酸可用Tyr或Y表示，色氨酸可用Trp或W表示，丝氨酸可用Ser或S表示，苏氨酸可用Thr或T表示，半胱氨酸可用Cys或C表示，蛋氨酸可用Met或M表示，天冬酰胺可用Asn或N，谷氨酰胺可用Gln或Q表示，天冬氨酸可用Asp或D表示，谷氨酸可用Glu或E表示，赖氨酸可用Lys或K表示，精氨酸可用Arg或R表示，组氨酸可用His或H表示。

类似地，在本发明中，核苷酸或者碱基采用单字母缩写来表示，例如，腺嘌呤用A表示，鸟嘌呤用G表示，胞嘧啶用C表示，胸腺嘧啶用T表示。

为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。

如上所述，Reinekea thalattae来源的褐藻胶裂解酶对海藻酸钠具有极高的催化活力，但是该酶的热稳定性较差，在40℃下保持4 h后的酶活不足20%。因此，本领域仍需要一种具有较高活力同时稳定性较好的褐藻胶裂解酶。

针上述技术问题，发明人根据已有褐藻胶裂解酶的晶体结构进行了同源建模，分析关键位点氨基酸残基，使用定点突变的方法对来源于Reinekea thalattae的褐藻胶裂解酶进行催化效率和热稳定性改造，并选择非保守氨基酸残基进行突变，寻找合适的热稳定性提高的突变体酶，由此完成了本发明。

因此，本发明的第一方面提供了一种褐藻胶裂解酶突变体，所述褐藻胶裂解酶来源于Reinekea thalattae，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述突变体包括在第44位和/或第149位的突变。从SEQ ID NO.1中可以看出，野生型褐藻胶裂解酶在第44位的氨基酸为丝氨酸，在第149位的氨基酸为组氨酸。可以将这些位置的氨基酸突变为其他氨基酸例如天冬酰胺、天冬氨酸或与之具有相似性质的同类氨基酸，从而得到热稳定性得到提高的褐藻胶裂解酶突变体。

在一个优选的实施方案中，所述突变体包括突变S44N、H149D、以及S44N和H149D。在一个进一步优选的实施方案中，所述突变体包括突变S44N和H149D。

发明人发现，与野生型褐藻胶裂解酶相比，这三种褐藻胶裂解酶突变体的最高酶活基本保持一致甚至更高，最适温度也基本保持一致。值得注意的是，发明人发现，这三种突变体的最适pH较野生型酶发生了偏移，由7.5变成了8.0，同时突变体S44N/H149D的热稳定性发生了显著提高：其在40℃下保持4 h后的酶活仍能保持在50%以上。在最适催化条件下，突变体酶催化底物海藻酸钠生产褐藻寡糖的相对酶活也无明显下降，这一发现对于工业化制备褐藻寡糖具有重要的研究和经济价值。

本发明的第二方面提供了一种基因，其编码根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体。

本发明的第三方面提供了一种表达载体，其包含根据本发明第二方面的基因。

在一个实施方案中，所述表达载体可以为原核表达载体，例如质粒。在一个优选的实施方案中，所述质粒包括但不限于所述质粒为pET质粒如pET-22b（+）质粒、Duet质粒、pGEX质粒、pHY300质粒、pHY300PLK质粒、pPIC3K质粒或pPIC9K质粒。

本发明的第四方面提供了一种表达细胞，其包含根据本发明第二方面的基因或根据本发明第三方面的表达载体。

在一个实施方案中，所述表达细胞可以是来源于原核生物如大肠杆菌的细胞，或来源于真核细胞如动物的细胞。

在一个优选实施方案中，所述表达细胞为大肠杆菌BL21(DE3)株。

本发明的第五方面提供了一种制备褐藻寡糖的方法，所述方法包括将根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体或根据本发明第四方面的表达细胞添加至含有海藻酸盐的反应体系中，进行反应。

所述海藻酸盐可以为海藻酸的任何盐，但优选为海藻酸的碱金属盐，例如钠盐、钾盐等。

在一个实施方案中，所述反应体系的pH值范围为7.5-8.5，更优选为8.0。

在一个实施方案中，所述反应在30-40℃进行，更优选在35℃进行。

本发明的第六方面提供了根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体或根据本发明第二方面的基因或根据本发明第三方面的表达载体或根据本发明第四方面的表达细胞在制备包含褐藻寡糖的产品中的用途。

如上文所述，褐藻寡糖可以通过使用褐藻胶裂解酶催化海藻酸盐获得。因此，在这一方面，制备包含褐藻寡糖的产品意味着使用本发明的褐藻胶裂解酶突变体或生产该突变体的体系来催化海藻酸盐如海藻酸钠来制备包含褐藻寡糖的产品。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅是说明性的，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

材料和方法：

LB培养基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，培养基的pH为7.0。

褐藻胶裂解酶活测定方法：以0.35%的海藻酸钠为底物，加入0.6 μg/mL的纯酶和600 mmol/L NaCl，在35℃、pH 7.5条件下使反应体系进行酶反应，持续5 min，然后煮沸5min灭活。与两倍体积的3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液混合，煮沸5 min显色，冷却后稀释4倍，在560 nm波长下测定吸光度。以葡萄糖为标准还原糖，计算反应生成的还原糖的量。

酶活定义（U）：标准反应条件下，每分钟释放1 μmol还原糖所需的酶量，其中还原糖的含量通过DNS比色法测得。

实施例1: Reinekea thalattae褐藻胶裂解酶突变体的制备

（1）野生型质粒pET-22b(+)-Reth-Alyase的构建：将部分信号肽编码序列从Reinekea thalattae来源的褐藻胶裂解酶基因切除，然后连接至质粒pET-22b(+)的多克隆位点，以获得野生型质粒pET-22b(+)-Reth-Alyase。部分信号肽编码序列被切除的褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MADAKAPSTKFDLLGWTLSVPVDDDGNGKSDQIKEKALNSGYVSPEFFYLNDEGGMVFKSPIEGAKTSANTTYTRSELREMIRRGDTSHKTQGVGGNNWVFSTAPAEDLAAAGGVDGSMEATLSVNHVTTGGEGYQIGRVIIGQIHATHNEPIRLYYRKLPGNSKGSIYYAHEPTKESGKKEIWVEMVGSKSNSASDPADGIALDEKFSYRIDVKGNELKVTLMRPGKPDVVRVTDMSESGYDKGGIYMYFKAGVYNQNKSGDPDDYVQATFYDLNVTH

（2）pET-22b(+)-S44N和pET-22b(+)-H149D单点突变质粒的构建：本实验中采用原理简单、操作便捷的QuikChange™法进行定点突变。待构建的单点突变体包括：S44N、H149D。如果测序验证结果表明除了所需突变位点外没有出现随机突变，则突变质粒pET-22b(+)-S44N、pET-22b(+)-H149D构建成功。

具体地，以重组质粒pET22b(+)-Reth-Alyase为模板，设计正向和反向引物，突变引物如下所示，黑体下划线字母为突变位点：

S44N-F：5’-CATTGAATTCTGGCTATGTAAATCCTGAGTTTTTTTACTTGAA-3’

S44N-R：5’-TTCAAGTAAAAAAACTCAGGCTTTACATAGCCAGAATTCAATG-3’

H149D-F：5’-CAGATCCATGCGACTGATAATGAGCCGATTCGTT-3’

H149D-R：5’-AACGAATCGGCTCATTATCAGTCGCATGGATCTG-3

PCR扩增：反应体系总体积为20 μL，反应体系组成如表1所示，反应程序如表2所示。

表1、PCR反应体系组成

表2、PCR反应程序

（3）pET-22b(+)-S44N/H149D双点突变质粒的构建：以步骤（2）构建的单点突变质粒为模板，利用（2）所述的引物，采用QuikChange™法进行定点突变得到双点突变质粒pET-22b(+)-S44N/H149D。

（4）PCR产物核酸电泳验证及模板消化：通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带大小是否正确，验证无误后向PCR产物体系中加入1 μL的Q.cut DpnI和2μL的Q.cut Buffer（10×），并于37℃进行1 h的酶切反应，以去除体系中的野生型重组质粒。然后挑取阳性克隆子进行质粒抽提和DNA测序。

实施例2: 褐藻胶裂解酶突变体的表达纯化

将实施例1中经测序验证的各突变质粒和野生型质粒分别转化至大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3）细胞中，挑取阳性转化子在LB培养基中并于37℃、200 rpm摇培过夜，然后接入LB培养基中并于37℃培养至OD₆₀₀值为0.6~0.8，降温至28℃，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mM，诱导6 h，得到发酵液。

将发酵液于4℃、8000 rpm离心5 min，取菌体。加入15 mL缓冲液（50 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，调节pH至约7.5）充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间l s，停止时间2 s，共计15 min。将获得的破碎液进行低温高速离心，离心条件为4℃、8000 rpm离心15 min。再用0.45 μm微孔滤膜过滤，从而获得褐藻胶裂解酶突变体的粗酶液和野生型褐藻胶裂解酶的粗酶液。

准备镍离子亲和层析柱：首先，利用恒流泵，向层析柱里泵入去离子水以冲洗层析柱（约6~12倍柱体积），然后用低盐浓度的缓冲液（500 mmol/L NaCl，50 mM Tris-HCl，调节pH至约7.5）平衡层析柱环境。待层析柱下端的流出液通过紫外检测器示数稳定（约需5倍柱体积缓冲液），将得到的粗酶液加入到层析柱中。先用含有低浓度咪唑的缓冲液（500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，50 mM Tris-HCl，调节pH至约7.5）冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液（500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，50 mM Tris-HCl，调节pH至约7.5）洗脱。收集吸收峰的洗脱液，在4℃条件下透析去除咪唑与残余金属离子以获得目的蛋白。纯化后的野生型褐藻胶裂解酶及其突变体均达到电泳纯，其水解海藻酸钠的比酶活分别为765.7 U/mg（野生型）、843.6 U/mg（突变体S44N）、719.8 U/mg（突变体H149D）和827.0U/mg（突变体S44N/H149D）。从这些结果可以看出，与野生型相比，突变体的比酶活相当，甚至更高。

实施例3：突变前后酶的热稳定性比较和半衰期测定

将实施例2中得到的酶液稀释至浓度约0.6 μg/mL后，分别在35℃、40℃的温度中保温，间隔定时取样并在酶最适条件下进行裂解反应，以观察本发明的褐藻胶裂解酶突变体在不同的温度下随时间的酶活变化，其中以未经热处理的酶液为对照（即100%）。

半衰期测定依据阿伦尼乌斯方程计算，其中未保温即保温0时刻的相对酶活设为E₀，保温t时间后的残余酶活为E_t。以保温时间t为横坐标，ln（E_t/E₀）为纵坐标，可以拟合出一条直线。通过直线的斜率，可以进一步计算出半衰期（t_1/2）。

具体计算公式如下：

其中，E₀是初始酶活，E_t是孵育t时间后的残余酶活，t_1/2为酶在该温度下失活的半衰期。

其中，k为反应速率常数，R为8.31 J/（mol·k），Ea为使酶热失活的活化能。

本实施例研究了突变体S44N、H149D、S44N/H149D的热稳定性，结果发现所有突变体的热稳定性均得到了改善，其中突变体S44N/H149D的热稳定性得到最大幅度的改善。

具体地，突变体S44N和H149D在35℃的半衰期由野生型酶的5.8 h分别提高到了6.8 h和7.7 h，分别提高了17%和33%，且这两个突变体在35℃下保持4 h后的残余酶活由野生型酶的390 U/mg分别提升至423 U/mg和435 U/mg，而突变体S44N/H149D在35℃下保持4h后的残余酶活由野生型酶的390 U/mg提升至562 U/mg，半衰期提高至11.7 h，较野生型酶提高了1.02倍（如图1所示）；此外，突变体S44N和H149D在40℃的半衰期由野生型酶的2.6 h分别提高到了3.2 h和3.6 h，分别提高了23%和38%，其在40℃下保持4 h后的残余酶活由野生型酶的165 U/mg分别提升至344 U/mg和370 U/mg，而突变体S44N/H149D在40℃下保持4h后的残余酶活由野生型酶的165 U/mg提升至388 U/mg，半衰期提高到4.4 h，提升了69%（如图2所示）。这些结果均表明Reth-Alyase的突变体S44N/H149D较野生型酶的热稳定性有了显著的增强。

实施例4：突变前后酶的最适pH比较

本实施例致力于研究pH对热稳定性改造后的突变体酶的催化活性的影响。具体地，选用50 mmol/L不同pH值的缓冲液（磷酸钠缓冲液，pH 6.0~7.5；Tris-HCl缓冲液，pH7.5~9.0；甘氨酸-NaOH缓冲液，pH 9.0~10.5），按照DNS法测定不同pH值下的褐藻胶裂解酶的酶活，以最大酶活为100%，分别计算各pH值条件下的相对酶活。

图3分别示出了S44N（A）、H149D（B）和S44N/H149D（C）的相对酶活，可以看出，突变体S44N、H149D和S44N/H149D在pH 6.5~8.0的范围内的酶活逐渐上升，并在pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中出现峰值，此后随着pH的增加相对酶活开始下降，可见这三种突变体的最适pH值相对野生型（最适pH为7.5）均发生了偏移，在pH 8.0时相对酶活达到峰值。

实施例5：突变前后酶的最适温度比较

本实施例对温度对突变体酶催化活性的影响进行了研究。具体地，分别将实施例2制备的突变体酶S44N、H149D、S44N/H149D和野生型酶在各自的最适pH条件下于不同温度（25~50℃）下进行酶反应，结果发现，突变体的最适温度与野生型酶相比没有发生显著变化，均在35℃附近（如图4所示）。

Claims (14)

1.一种褐藻胶裂解酶突变体，所述褐藻胶裂解酶来源于Reinekea thalattae，并且氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变体仅包括突变S44N和/或H149D。

2.一种基因，编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体。

3.一种表达载体，包含权利要求2所述的基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其中所述表达载体为原核表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述原核表达载体是质粒，所述质粒选自pET质粒、Duet质粒、pGEX质粒、pHY300质粒、pHY300PLK质粒、pPIC3K质粒或pPIC9K质粒。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其中所述pET质粒是pET-22b（+）质粒。

7.一种表达细胞，包含权利要求2所述的基因或者权利要求3-6中任一项所述的表达载体。

8.根据权利要求7所述的表达细胞，其中所述表达细胞是来源于原核生物的细胞，或者来源于真核生物。

9.根据权利要求8所述的表达细胞，其中所述原核生物是大肠杆菌BL21(DE3)株。

10.根据权利要求8所述的表达细胞，其中所述真核生物是动物。

11.一种制备褐藻寡糖的方法，所述方法包括将权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体或权利要求7-10中任一项所述的表达细胞添加至含有海藻酸盐的反应体系中，进行反应。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述反应体系的pH值范围为7.5-8.5，所述反应在30-40℃进行。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述反应体系的pH值为8.0，所述反应在35℃进行。

14.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3-6中任一项所述的表达载体或权利要求7-10中任一项所述的表达细胞在制备包含褐藻寡糖的产品中的用途。