CN110387367B

CN110387367B - 一种褐藻胶裂解酶

Info

Publication number: CN110387367B
Application number: CN201910829284.8A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 刘振; 程丹阳; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2039-09-03
Also published as: US20210062177A1; CN110387367A

Abstract

本发明提供一种褐藻胶裂解酶，该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明所提供的褐藻胶裂解酶酶可用于催化海藻酸钠产生不饱和2‑8糖，主要产物为不饱和二糖，经制备可得不饱和二糖和不饱和三糖。

Description

一种褐藻胶裂解酶

技术领域

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种PL-6家族褐藻胶裂解酶ScCD6酶学性质表征及产物分析。

背景技术

褐藻是三大藻类之一，主要成分为褐藻胶、甘露醇和海带多糖。其中，甘露醇和海带多糖的利用的相关研究较为成熟，因此，如何高效降解褐藻胶并实现工业化应用是目前研究的热点。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)构成的线性多糖，其降解产物褐藻寡糖具有重要的生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、促进植物根细胞生长等，因此受到了广泛的关注。

褐藻胶裂解酶(Aly)可以通过β-消除反应机制来降解褐藻胶，并且在降解产物的非还原端形成不饱和的碳碳双键，由此于紫外235nm下产生特殊吸收峰，可用来进行产物检测。根据Aly的底物特异性，可将其分为poly M，poly G和双功能型的褐藻胶裂解酶；根据其酶切方式，可将其分为内切型(endo-type)和外切型(exo-type)褐藻胶裂解酶，内切型Aly降解褐藻胶的终产物为褐藻寡糖(AOs)，常见产物聚合度为2-6，而外切型Aly的产物单一，终产物为单糖，但也有二糖为最小酶切单元的报道；根据CAZY数据库的分类，褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶(PL)，并具体分为PL-5，PL-6，PL-7，PL-14，PL-15，PL-17和PL-18七个家族。

目前，制备褐藻寡糖的方法主要是酸解等化学法，制备条件剧烈且容易造成环境污染，而相比之下，生物法降解褐藻多糖条件温和、易于控制并且绿色环保，因此开发高效、稳定性高且易于制备的褐藻胶裂解酶是十分必要的。

发明内容

本发明提供一种PL-6褐藻胶裂解酶ScCD6,并应用该酶降解海藻酸钠产生褐藻寡糖。

本发明首先提供一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列SEQ ID NO:1如下：MNRPRLSTYAAITVAAITIAALTTAASALASTGDTSSRTPSGNSTPQANATIVNVSSSTQLTTAMANAVAGQTIVLANGSYSIGKLNAKNGTSSAPITIMAAQQGKAIITGGQLEVLSSSYVTFSGLKWTNSNTLKITSSHHIRLTRNHFRLTESSSLKWIIIQGANSHHNRIDHNLFEEKHQLGNFITIDGSSTQQSQYDLIDYNHFRNIGPRATNEMEAIRVGWSAISKSDGFTTVENNLFENCDGDPEIVSVKSNANTVRYNTFRTSQGSVSLRHGNRSQVHGNFFFGGGKTGTGGVRVYGQDHKIYNNHFEGLTGTGYDAALQLDGGDVDTSGALSSHWRVYRATAVHNTFVNNVSNIEIGANYSLAPVDSLVADNIVVGSSGKLFNELKMPKNMTYAGNIGWPTGSATIGITTGVRTVNPLLAKQGEVYRLGTGSPAVNTASGSYSFLADDMDGQSRSGTADVGADELSTGTVVHKPLNSADVGISAP；

编码上述酶的基因，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，序列如下：ATGAACAGACCAAGGCTCAGCACCTACGCCGCGATCACCGTCGCGGCCATCACGATCGCGGCCCTCACCACCGCAGCATCCGCTCTCGCCTCCACCGGCGATACGTCGTCGCGCACCCCGAGCGGGAACTCGACCCCACAGGCCAACGCCACCATCGTCAACGTCTCGTCGTCGACGCAGTTGACCACCGCGATGGCCAACGCCGTAGCCGGCCAAACGATCGTCCTCGCCAACGGCTCCTACTCGATCGGCAAGCTCAACGCCAAGAACGGCACCTCCAGCGCACCCATCACGATCATGGCCGCCCAACAGGGCAAGGCGATCATCACCGGAGGGCAGCTCGAGGTTCTCAGCTCGTCGTACGTGACGTTCTCCGGGCTGAAGTGGACGAACAGCAACACGTTGAAGATCACCAGTTCGCACCACATCCGGTTAACCCGCAACCACTTCCGGCTCACCGAGTCGAGCTCGTTGAAGTGGATCATCATCCAGGGAGCCAACAGCCACCACAACCGGATCGACCACAACCTGTTCGAGGAGAAGCACCAGCTCGGCAACTTCATCACCATCGACGGGTCTTCGACCCAGCAGTCGCAGTACGACCTGATCGACTACAACCACTTTCGCAACATCGGTCCGCGCGCCACCAACGAGATGGAGGCGATCCGGGTCGGCTGGAGTGCGATCTCCAAGTCGGACGGGTTCACCACGGTCGAGAACAACCTCTTCGAGAACTGCGACGGCGACCCTGAGATCGTCTCCGTGAAGAGCAACGCCAACACCGTCCGGTACAACACCTTCCGGACATCACAGGGCTCGGTGTCCCTGCGCCACGGCAACCGCAGCCAGGTCCACGGCAACTTCTTCTTCGGAGGCGGCAAGACCGGCACCGGCGGCGTCCGGGTCTACGGCCAGGACCACAAGATATACAACAACCACTTCGAAGGACTGACCGGCACCGGCTACGACGCGGCGCTGCAACTCGACGGCGGGGACGTCGACACCTCAGGCGCGCTCTCCTCGCACTGGCGGGTGTACCGGGCCACGGCAGTGCACAACACCTTCGTCAACAACGTCTCGAACATCGAGATCGGCGCCAACTACAGTCTCGCCCCGGTCGACAGCCTGGTCGCCGACAACATCGTCGTCGGTTCTTCCGGCAAGCTCTTCAACGAGCTGAAGATGCCCAAGAACATGACGTACGCGGGCAACATCGGCTGGCCGACGGGTTCCGCCACCATCGGGATCACCACCGGCGTCCGCACCGTGAACCCGCTCCTGGCCAAGCAGGGTGAGGTCTACCGCCTCGGCACCGGTAGCCCCGCGGTGAACACCGCGTCGGGTAGCTACAGCTTCCTCGCCGATGACATGGACGGTCAGTCACGCAGTGGAACGGCCGATGTCGGAGCGGACGAACTGTCCACCGGCACCGTGGTCCACAAGCCGCTCAACTCCGCCGACGTCGGAATCAGCGCCCCCTGA；

其次，本发明提供一种重组表达载体，该重组表达载体携带有编码上述褐藻胶裂解酶的基因；

本发明还提供重组宿主，用于重组表达上述褐藻胶裂解酶；

本发明中的褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠可得不饱和2-8糖，主要产物为不饱和二糖，且其含量占总不饱和寡糖产物的70％左右；该酶可同时降解poly M和poly G多糖片段，并产生相应M寡糖及G寡糖；

进一步的，所述反应的最适温度为50℃，最适pH为9.0。

进一步的，所述反应中底物(海藻酸钠，poly M，poly G)浓度为0.3％(w/v)，加酶量为0.6U，反应在30℃，pH 7.0的条件下反应12小时，所得产物用于HPLC检测；

进一步的，所述酶在40℃以下及pH 7.0-10.0条件下具有良好的稳定性，30℃下保存24小时保留80％酶活，在pH 7.0-10.0时，4℃存放4天仍保留80％的酶活。

进一步的，所述酶可用于催化海藻酸钠产生不饱和2-8糖，主要产物为不饱和二糖，经制备可得不饱和二糖和不饱和三糖。

附图说明

图1：本发明中褐藻胶裂解酶ScCD6的氨基酸序列分析(A)、进化树分析(B)及多序列比对分析(C)图；

图2：本发明中褐藻胶裂解酶ScCD6纯化SDS-PAGE图，其中M为广谱蛋白Marker(11-180kDa)；1为发酵液上清；2为发酵液上清穿透液；3为40mM咪唑洗脱液；4为80mM咪唑洗脱液；5为细胞破碎液；6为细胞破碎液穿透液；7为40mM咪唑洗脱液；8为80mM咪唑洗脱液；

图3：本发明中褐藻胶裂解酶ScCD6酶学性质图，其中(A)最适反应温度；(B)最适反应pH；(C)温度稳定性；(D)pH稳定性；(E)金属离子及化学试剂对ScCD6酶活的影响；(F)底物特异性；

图4：本发明中褐藻胶裂解酶ScCD6降解多糖的产物分析图，其中(A)降解海藻酸钠结果图；(B)降解poly M结果图；(C)降解poly G结果图。

具体实施方式

本发明用到了分子生物学和酶催化领域使用的常规技术和方法，下面将结合实施例和附图对该发明进行详细的描述：

实施例1褐藻胶裂解酶的来源及序列分析

将Streptomyces coelicolor A3(2)全基因组测序后获得ScCD6序列，此序列长1483个碱基，编码含有493个氨基酸的蛋白质，将此序列提交NCBI进行BLAST分析，分析结果预测此蛋白为PL-6家族褐藻胶裂解酶，SignalP 4.1分析结果显示此序列N端含有长30个氨基酸的信号肽；利用MEGA6.0将不同家族褐藻胶裂解酶序列进行系统进化树分析，结果证实其编码基因确属于PL-6家族；另外，利用软件ClustalX及在线分析网站ESPript 3.0进行多序列比对分析，分析结果显示ScCD6与来自Stenotrophomonas maltophilia的polyMG特异性褐藻胶裂解酶(GenBank accession no.AFC88009.1)具有最高的序列相似性，其相似性约为27.68％(图1)。

为进一步预测该酶的理化性质，将序列提交至Expasy在线分析网站，分析可知，该酶的分子质量为52.12kDa，等电点为7.89，稳定系数为27.83，可认定其为较稳定蛋白。

实施例2褐藻胶裂解酶的异源表达及纯化

将目标蛋白基因通过无缝拼接的方式与pET-28a质粒载体进行重组，以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主，获得可以产生褐藻胶裂解酶ScCD6的工程菌株。LB培养发酵并以IPTG诱导目标蛋白表达，离心收集发酵液上清及菌体，将菌体破碎收集细胞破碎液，同时将发酵液上清及细胞破碎液过Ni柱纯化。纯化时使用不同浓度梯度的咪唑洗脱液进行洗脱，使用的咪唑洗脱液浓度梯度为0mM，10mM，20mM，40mM，80mM，100mM，120mM，200mM，500mM，不同浓度咪唑洗脱液使用20mM pH 8.0PBS(500mM NaCl)缓冲液稀释获得。结果发现40mM及80mM的咪唑可将目标蛋白洗脱下来，并获得单一条带。

实施例3褐藻胶裂解酶的酶学性质研究

以0.3％(w/v)海藻酸钠为底物，采用200μL反应体系，反应时间20min，煮沸2min灭活后DNS法测定产物中还原糖含量来表征酶活。

pH 7.0，温度范围30-100℃的条件下测定ScCD6最适反应温度为50℃；50℃，pH3.0-10.0测定得最适pH为9.0。测定温度稳定性时，将ScCD6置于30℃，40℃，50℃，60℃下孵育，不同时间取样测定其残余酶活；测定pH稳定性时，将酶在4℃存放于pH 7.0，8.0，9.0，10.0的缓冲液中，不同时间取样测定残余酶活。结果显示ScCD6在40℃以下及pH 7.0-10.0的环境下酶活十分稳定。金属离子及化学试剂对酶活的影响结果显示，Mn²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺，Ba²⁺，Co²⁺可促进酶活，Mg²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺和SDS抑制酶活，另外，Ca²⁺，Na⁺，K⁺对酶活几乎没有影响，但Na₂EDTA可以使ScCD6丧失酶活，具体数据如图3。为探究ScCD6的底物特异性，以海藻酸钠，poly M和poly G为底物，于40℃反应20min，DNS法测定还原糖含量，结果可知ScCD6为polyM特异型褐藻胶裂解酶。

表1金属离子及化学试剂对ScCD6酶活的影响

实施例4褐藻胶裂解酶ScCD6降解多糖的产物研究

以0.3％(w/v)的海藻酸钠、poly M及poly G为底物，采用200μL反应体系，加入0.6U褐藻胶裂解酶ScCD6，置于30℃，pH 7.0的条件下反应12小时，所得反应产物煮沸10min并于10,000rpm离心10min以除去体系中蛋白等杂质，收集上清过0.22μm滤膜，进行HPLC检测。HPLC条件为：使用Superdex^TM30Increase 30/100Gel column，以0.2M NH₄HCO₃为流动相，流速0.4mL/min，检测温度为室温(～25℃)，上样量100μL，紫外235nm检测。

HPLC检测结果显示，ScCD6对三种多糖均具有降解作用，而降解主产物为不饱和二糖，同时也有3-8糖产生，说明ScCD6作为内切型褐藻胶裂解酶可以降解海藻酸钠制备多种分子量的不饱和寡糖。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种新型褐藻胶裂解酶

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 493

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Met Asn Arg Pro Arg Leu Ser Thr Tyr Ala Ala Ile Thr Val Ala Ala

1 5 10 15

Ile Thr Ile Ala Ala Leu Thr Thr Ala Ala Ser Ala Leu Ala Ser Thr

20 25 30

Gly Asp Thr Ser Ser Arg Thr Pro Ser Gly Asn Ser Thr Pro Gln Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Ile Val Asn Val Ser Ser Ser Thr Gln Leu Thr Thr Ala

50 55 60

Met Ala Asn Ala Val Ala Gly Gln Thr Ile Val Leu Ala Asn Gly Ser

65 70 75 80

Tyr Ser Ile Gly Lys Leu Asn Ala Lys Asn Gly Thr Ser Ser Ala Pro

85 90 95

Ile Thr Ile Met Ala Ala Gln Gln Gly Lys Ala Ile Ile Thr Gly Gly

100 105 110

Gln Leu Glu Val Leu Ser Ser Ser Tyr Val Thr Phe Ser Gly Leu Lys

115 120 125

Trp Thr Asn Ser Asn Thr Leu Lys Ile Thr Ser Ser His His Ile Arg

130 135 140

Leu Thr Arg Asn His Phe Arg Leu Thr Glu Ser Ser Ser Leu Lys Trp

145 150 155 160

Ile Ile Ile Gln Gly Ala Asn Ser His His Asn Arg Ile Asp His Asn

165 170 175

Leu Phe Glu Glu Lys His Gln Leu Gly Asn Phe Ile Thr Ile Asp Gly

180 185 190

Ser Ser Thr Gln Gln Ser Gln Tyr Asp Leu Ile Asp Tyr Asn His Phe

195 200 205

Arg Asn Ile Gly Pro Arg Ala Thr Asn Glu Met Glu Ala Ile Arg Val

210 215 220

Gly Trp Ser Ala Ile Ser Lys Ser Asp Gly Phe Thr Thr Val Glu Asn

225 230 235 240

Asn Leu Phe Glu Asn Cys Asp Gly Asp Pro Glu Ile Val Ser Val Lys

245 250 255

Ser Asn Ala Asn Thr Val Arg Tyr Asn Thr Phe Arg Thr Ser Gln Gly

260 265 270

Ser Val Ser Leu Arg His Gly Asn Arg Ser Gln Val His Gly Asn Phe

275 280 285

Phe Phe Gly Gly Gly Lys Thr Gly Thr Gly Gly Val Arg Val Tyr Gly

290 295 300

Gln Asp His Lys Ile Tyr Asn Asn His Phe Glu Gly Leu Thr Gly Thr

305 310 315 320

Gly Tyr Asp Ala Ala Leu Gln Leu Asp Gly Gly Asp Val Asp Thr Ser

325 330 335

Gly Ala Leu Ser Ser His Trp Arg Val Tyr Arg Ala Thr Ala Val His

340 345 350

Asn Thr Phe Val Asn Asn Val Ser Asn Ile Glu Ile Gly Ala Asn Tyr

355 360 365

Ser Leu Ala Pro Val Asp Ser Leu Val Ala Asp Asn Ile Val Val Gly

370 375 380

Ser Ser Gly Lys Leu Phe Asn Glu Leu Lys Met Pro Lys Asn Met Thr

385 390 395 400

Tyr Ala Gly Asn Ile Gly Trp Pro Thr Gly Ser Ala Thr Ile Gly Ile

405 410 415

Thr Thr Gly Val Arg Thr Val Asn Pro Leu Leu Ala Lys Gln Gly Glu

420 425 430

Val Tyr Arg Leu Gly Thr Gly Ser Pro Ala Val Asn Thr Ala Ser Gly

435 440 445

Ser Tyr Ser Phe Leu Ala Asp Asp Met Asp Gly Gln Ser Arg Ser Gly

450 455 460

Thr Ala Asp Val Gly Ala Asp Glu Leu Ser Thr Gly Thr Val Val His

465 470 475 480

Lys Pro Leu Asn Ser Ala Asp Val Gly Ile Ser Ala Pro

485 490

<210> 2

<211> 1482

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

atgaacagac caaggctcag cacctacgcc gcgatcaccg tcgcggccat cacgatcgcg 60

gccctcacca ccgcagcatc cgctctcgcc tccaccggcg atacgtcgtc gcgcaccccg 120

agcgggaact cgaccccaca ggccaacgcc accatcgtca acgtctcgtc gtcgacgcag 180

ttgaccaccg cgatggccaa cgccgtagcc ggccaaacga tcgtcctcgc caacggctcc 240

tactcgatcg gcaagctcaa cgccaagaac ggcacctcca gcgcacccat cacgatcatg 300

gccgcccaac agggcaaggc gatcatcacc ggagggcagc tcgaggttct cagctcgtcg 360

tacgtgacgt tctccgggct gaagtggacg aacagcaaca cgttgaagat caccagttcg 420

caccacatcc ggttaacccg caaccacttc cggctcaccg agtcgagctc gttgaagtgg 480

atcatcatcc agggagccaa cagccaccac aaccggatcg accacaacct gttcgaggag 540

aagcaccagc tcggcaactt catcaccatc gacgggtctt cgacccagca gtcgcagtac 600

gacctgatcg actacaacca ctttcgcaac atcggtccgc gcgccaccaa cgagatggag 660

gcgatccggg tcggctggag tgcgatctcc aagtcggacg ggttcaccac ggtcgagaac 720

aacctcttcg agaactgcga cggcgaccct gagatcgtct ccgtgaagag caacgccaac 780

accgtccggt acaacacctt ccggacatca cagggctcgg tgtccctgcg ccacggcaac 840

cgcagccagg tccacggcaa cttcttcttc ggaggcggca agaccggcac cggcggcgtc 900

cgggtctacg gccaggacca caagatatac aacaaccact tcgaaggact gaccggcacc 960

ggctacgacg cggcgctgca actcgacggc ggggacgtcg acacctcagg cgcgctctcc 1020

tcgcactggc gggtgtaccg ggccacggca gtgcacaaca ccttcgtcaa caacgtctcg 1080

aacatcgaga tcggcgccaa ctacagtctc gccccggtcg acagcctggt cgccgacaac 1140

atcgtcgtcg gttcttccgg caagctcttc aacgagctga agatgcccaa gaacatgacg 1200

tacgcgggca acatcggctg gccgacgggt tccgccacca tcgggatcac caccggcgtc 1260

cgcaccgtga acccgctcct ggccaagcag ggtgaggtct accgcctcgg caccggtagc 1320

cccgcggtga acaccgcgtc gggtagctac agcttcctcg ccgatgacat ggacggtcag 1380

tcacgcagtg gaacggccga tgtcggagcg gacgaactgt ccaccggcac cgtggtccac 1440

aagccgctca actccgccga cgtcggaatc agcgccccct ga 1482

Claims

1.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，所述的方法是使用氨基酸序列为SEQ IDNO:1的褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠来制备褐藻寡糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降解过程反应条件为pH 9.0，温度为50℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中海藻酸钠浓度为0.3％，反应时间为12小时，加酶量为0.6U。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述褐藻寡糖产物包含2-6糖，且主产物为不饱和二糖。