CN109971734B - 一种pH不敏感高温耐受性HSL家族脂类水解酶及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在酸性至碱性pH条件下都能够高效催化酯类水解的热稳定脂类水解酶Poc14及其应用。本发明所涉及脂类水解酶基因来自热泉细菌Porphyrobacter cryptus DSM12079，所述的脂类水解酶基因经大肠杆菌E.coli菌株异源表达后，在55℃达到最大酶活性，当pH值在6.5和8.5之间保持高活性，对于有机溶剂和金属离子有较强耐受性，在Tritonx100、甘油以及DMSO环境下有较强的酶学活性。该基因所编码的Poc14的热稳定性和对pH较强的适应性，使其可应用于废水处理、精细化工、制药和环境修复等高温、含盐和含有机溶剂条件下的工业生产。

Description

一种pH不敏感高温耐受性HSL家族脂类水解酶及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种热泉细菌来源pH不敏感高温耐受性HSL家族脂类水解酶及应用。

背景技术

脂类水解酶广泛存在于微生物、动物和植物中，是一种能够催化脂肪酸酯键水解或合成反应的一类水解酶的总称。脂类水解酶参与生物体多个代谢过程，在酯类运输、细胞结构构建以及能量代谢中发挥重要功能，是维持生命体生存所必需的酶类之一。细菌HSL家族脂类水解酶氨基酸序列与真核生物中HSL水解酶高度相似，其氨基酸序列包含四个保守区，其三个催化残基丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸分别位于三个保守区域内。HSL家族水解酶广泛存在于原核与真核生物中，是具有广泛底物谱的一类水解酶。广泛底物谱和功能多样性使该家族水解酶在诸如食品、医药、纺织、洗涤、污水处理、环境修复等领域具有广泛的潜在应用价值，成为国内外研究热点。

自然热泉温度高，富含矿物质及硫等元素。存在热泉中的微生物具备高温耐受性等特点。所筛选的酶资源一般在高温耐受性，极端酸碱度以及金属和硫化物耐受性方面，有比较突出的特点。因此，热泉环境是一个获取特殊性质工业用酶的资源宝库。

本发明从一种热泉细菌中筛选到一种新型HSL家族水解酶基因，并对该基因进行了重组表达。重组酶具有热稳定性，并且在范围很广的pH条件下都能保持高度的活性，可用于精细化工、制药、洗涤、废水处理和环境修复等工业领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的热泉细菌来源水解酶、其编码基因及其制备方法，该水解酶可用于广泛pH条件下高温反应中酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明涉及具有水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致；

(b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的水解酶活性。

本发明所述的具有水解酶活性的多肽，其来源于热泉的嗜热细菌Porphyrobactercryptus DSM12079。所述菌株购自德国布伦瑞克(Braunschweig)DSMZ菌种库，保藏编号为：DSM12079。

本发明针对分离自热泉的嗜热细菌Porphyrobacter cryptus DSM12079,通过对其基因组DNA序列分析，筛选获得水解酶基因poc14，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。基因poc14大小为1011bp，碱基组成为156A(15.43％)、176T(17.41％)、377C(37.29％)和302G(29.87％)，编码蛋白大小为336个氨基酸残基，分子量35.77kDa。其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。将该水解酶Poc14氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是宏基因组来源α/β水解酶，一致性为94％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_027442143.1)。其序列功能迄今为止尚无正式论文或图书发表。氨基酸序列分析结果表明，该蛋白包含四个氨基酸序列保守区域，分别为组氨酸－甘氨酸－甘氨酸－甘氨酸－笨丙氨酸保守区(氨基酸序列109-113)、包含丝氨酸活性位点(氨基酸位置183)的甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸－丙氨酸－甘氨酸－甘氨酸保守区(氨基酸序列181-186)、包含天冬氨酸活性位点(氨基酸位置275)的天冬氨酸－脯氨酸保守区(氨基酸序列275-276)以及包含组氨酸活性位点(氨基酸位置305)的组氨酸－丝氨酸－笨丙氨酸保守区(氨基酸序列305-307)。其氨基酸序列特征符合HSL水解酶家族特征。综上所述，Poc14应为HSL水解酶家族中的一名新成员。

本发明还涉及多肽分子N端氨基酸序列1-20号氨基酸以及由5-16号氨基酸所形成的α-螺旋结构，α-螺旋结构序列为:赖氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-酪氨酸-精氨酸-丝氨酸-丙氨酸-赖氨酸-天冬氨酸。与Genebank中上传蛋白序列以及功能已鉴定的水解酶Est8相比，此N端氨基酸序列及α-螺旋结构为Poc14所特有。其α-螺旋结构在维持该水解酶在不同环境中的结构稳定性和功能稳定性方面有较为重要的意义。

在不影响水解酶Poc14蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离催化中心氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到水解酶突变体。如前所述，本发明所述的水解酶Poc14的催化中心为SEQ ID NO:2所示的181-186、275-276和305-307氨基酸位置。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域1-20、181-186、275-276和305-307位氨基酸位置的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的水解酶Poc14具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。所述的突变体能够基本保留水解酶Poc14的生物学功能，优选该突变体具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的水解酶Poc14至少90％以上的酶活性，更优选具有至少95％以上的酶活性，最优选至少99％以上的酶活性。

本发明还涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的人工变体，突变位置优选小于5个，更优选小于3个，最优选仅为1个位置氨基酸的突变。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如Η.Neurath和R.L.Hill，1979于The Proteins，Academic Press，NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly等。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science，241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO95/17413或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5，223，409；WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，1986，Gene46:145和1988，DNA 7:127)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有水解酶活性的水解酶Poc14的核苷酸序列，或由编码本发明具有水解酶Poc14活性的突变体的核苷酸序列组成。

本发明涉及编码具有水解酶Poc14活性的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致；

(b)多核苷酸，其为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除1-60、541-558、823-828和913-921位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到的突变体基因，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明水解酶Poc14的核苷酸序列。该序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致；将该水解酶基因序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是Porphyrobacter sp.CACIAM 03H1基因组核苷酸，一致性为84％(其在GenBank数据库中的注册号为CP021378.1)。该基因编码催化活性中心氨基酸的密码子位于基因SEQ ID NO:1的547-549、823-825、913-915号碱基对。

本发明还提供对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除1-60、541-558、823-828和913-921位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留水解酶Poc14蛋白生物学活性的突变体基因。优选的水解酶Poc14突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明水解酶的分离的多核苷酸以提供水解酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Poc14基因连接到合适的载体上。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于水解酶Poc14的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的水解酶Poc14的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Poc14基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组水解酶Poc14。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，可通过如下原生质体转化或或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达水解酶Poc14。在一个优选的实施方案中，利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Poc14基因连接到载体上pSMT3(Herrmann,J.1996)上，并转化至原核生物E.coli菌株，利用重组载体pSMT3-poc14中强启动子大量表达Poc14融合蛋白。

本发明还涉及用于产生本发明所述水解酶Poc14的方法，其包括：(a)在有助于产生水解酶Poc14的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID NO:1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述水解酶Poc14的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述水解酶的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。

所得水解酶Poc14可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)或差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)等方法。

本发明还提供了水解酶Poc14或能表达水解酶Poc14的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，水解酶Poc14具有酯酶活性。Poc14或上述能表达Poc14的宿主菌可用于水解C2-C16链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。

经测定表明，水解酶Poc14对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。因此，优选Poc14水解酶用于催化水解C2-C8短链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，最适的短链脂肪酸脂底物为具有C6短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚己酸酯。

Poc14催化水解活性在pH范围6.0～9.5有很高的活性(为最大酶活的80％以上)，最适pH为8.0。温度范围为35～65℃，最适反应温度55℃，其最适温度接近酶活温度范围的上限，符合嗜热微生物酶学活性特征。在30～50℃中孵育6h，仍能保持60％以上活性；Poc14活性会被Cu²⁺和Zn²⁺离子明显抑制，EDTA、Ca²⁺和Sr²⁺存在下对酶活影响不大。土温20、土温80、丙酮、甲醇和异丙醇对Poc14活性抑制作用较为明显。Triton对Poc14的活性有轻微的促进作用。

从热泉所分离的的嗜热细菌Porphyrobacter cryptus DSM12079中筛选获得新的pH稳定热稳定水解酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化酯类水解的生产过程中。获得的水解酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产。该水解酶可应用于广泛的pH环境中，包括酸性、中性及碱性水解环境，为后续的工业应用提供成本低廉的热稳定水解酶。该酶的生产可在洗涤剂、废水处理、精细化工、制药和环境修复等不同pH环境的生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为纯化水解酶Poc14的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。

图2为水解酶Poc14的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12:对硝基苯酚十二酸酯；C14对硝基苯酚十四酸酯；C16:对硝基苯酚十六酸酯。定义底物为C6时测定值为100％。

图3为水解酶Poc14最适反应pH图。

图4为水解酶Poc14最适反应温度图。

图5为水解酶Poc14不同温度下热稳定性图。

图6为二价阳离子对水解酶AlinE4活性影响图。

图7为有机溶剂对水解酶Poc14活性影响图。

具体实施方式

实施例1水解酶基因Poc14的获取

基于分离自热泉的细菌Porphyrobacter cryptus DSM12079全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因。通过Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知水解酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得Poc14基因，大小为1011bp，碱基组成为156A(15.43％)、176T(17.41％)、377C(37.29％)和302G(29.87％)其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为336个氨基酸残基，分子量35.17kDa，其氨基酸序列如下所示(其三字母氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)：

将该水解酶Poc14氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是宏基因组来源α/β水解酶，一致性为94％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_027442143.1)。其序列功能迄今为止尚无正式论文或图书发表。

序列分析表明，水解酶Poc14属于酯酶HSL家族。氨基酸序列分析结果显示，该酶活性中心由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸组成。三个活性残基分别位于甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸－丙氨酸－甘氨酸－甘氨酸保守区(氨基酸序列181-186)、天冬氨酸－脯氨酸保守区(氨基酸序列275-276)以及组氨酸－丝氨酸－笨丙氨酸保守区(氨基酸序列305-307)。其氨基酸序列特征符合HSL水解酶家族特征。综上所述，Poc14应为酯酶家族和HSL水解酶家族中的一名新成员。

实施例3 Poc14二级及三级蛋白结构分析

将本发明获得的Poc14氨基酸序列置于蛋白结构预测软件APSSP分析，结果表明Poc14N端独有序列中的5-16号氨基酸序列存在完整的α-螺旋二级结构。通过蛋白结构软件Phyre2进行蛋白三维空间比对显示，Poc14蛋白三级结构与Est8蛋白相近，且N端α-螺旋二级结构为Poc14所独有。说明N端α-螺旋二级结构对于Poc14的结构稳定性有重要作用。

实施例4基因Poc14的重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的基因Poc14克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBI ORFFinder的ORF分析获得的基因开放阅读框序列，设计扩增全基因的上游引物Poc14F(5’-TCGCGGATCCATGCGCTTGGCGAAGCTGCC-3’，BamHI)和下游引物Poc14R(5’-TCCCGAGCTCTCATGCGGGGTTTGCCAGCATG-3’，SacI)，PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用BamHI和SacI双酶切PCR产物，纯化后的片段与经BamHI和SacI双酶切的质粒pSMT3连接，采用CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Omega，美国)提取阳性克隆的质粒，经BamHI和SacI双酶切鉴定，获得1000bp左右的DNA片段，经测序鉴定为基因Poc14。将重组表达质粒转化到E.coli(BL21)表达菌株中，构建表达重组菌株。

实施例5利用重组表达菌株表达重组基因Poc14

将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有50μg/ml卡那霉素和34ug/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，转入20℃以150r/min振荡培养16h。低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液(500mM氯化钠，10mM咪唑，20mM Tris盐酸，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测目的蛋白在洗脱液中的分布情况。利用ULP1酶在透析袋中切除重组蛋白N端的类泛素SUMO，并采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析去除SUMO蛋白，收集样品进行SDS-PAGE检测。得到电泳纯的重组蛋白Poc14，分子量约35kDa(图1)。用Brandford法测定蛋白质浓度。

实施例6重组基因Poc14的活性检测

利用对硝基苯酚己酸酯法测定纯化的重组水解酶Poc14活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，采用紫外可见光分光光度计(Beckman DU800型，美国)于40℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅2min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为5217U/mg。

实施例7水解酶Poc14底物特异性分析

水解酶Poc14的底物特异性分析采用体系(1ml)：100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，1mM底物，加入185ng纯酶蛋白，在25℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，Poc14对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C4、C6和C8)具有较高催化活性，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高(图2)。结果表明，水解酶Poc14对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。

实施例8水解酶Poc14最适反应条件分析

水解酶Poc14最适反应pH在3.0～11.0范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚己酸酯和185ng纯酶蛋白，在40℃下连续测定吸光值A₃₄₈ 2min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 6.0～7.5)，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5～9.0)和100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0～10.5)。测定结果表明，Poc14最适反应pH为8.0，在pH 6.0～10.5范围内具有活性，且在pH 6.0～9.5之间酶活维持在很高的水平(为最大酶活的80％以上)，显示出十分宽广的pH适用范围(图3)。

水解酶Poc14最适反应温度在35～70摄氏度范围内测定。具体操作为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，分别在35、40、45、50、55、60、65和70摄氏度条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明Poc14的反应温度范围为35～65摄氏度，最适反应温度为55摄氏度(图3)。

实施例9水解酶Poc14酶学稳定性分析

水解酶Poc14的热稳定性分析具体操作为：在30至70摄氏度温度区间内每10摄氏度为一个梯度建立温度梯度。将酶液分别在各温度梯度条件下孵育1h和6h，测定酶的活性；测活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。结果表明，在30～50摄氏度中孵育6h条件下，Poc14仍能保持60％以上活性(图5)；说明Poc14具有较好的热稳定性。

二价阳离子对水解酶Poc14活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Ba²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺和乙二胺四乙酸(EDTA)，测定酶活性。测酶活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)和185ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，Poc14活性会被Cu²⁺和Zn²⁺离子明显抑制，在EDTA、Ca²⁺和Sr²⁺存在下对酶活影响不大(保留50％以上活性)，(图6)。

有机溶剂对水解酶Poc14活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入有机溶剂，测定酶的活性。加入有机溶剂的用量与种类有15％(v/v)：丙酮(Acetone)、乙腈(Acetonitrile)、乙醇(Ethanol)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Glycerol)、异丙醇(Isopropanol)和甲醇(Methanol)。1％(v/v)：土温20(T20)、土温80(T80)，或100倍Triton，测活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚己酸酯，100mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，土温20、土温80、丙酮、甲醇和异丙醇对Poc14活性抑制作用较为明显。Triton对Poc14的活性有轻微的促进作用(图7)。

序列表

<110> 自然资源部第二海洋研究所

<120> 一种pH不敏感高温耐受性HSL家族脂类水解酶及应用

<150> 2019100335898

<151> 2019-01-14

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1011

<212> DNA

<213> Porphyrobacter cryptus

<400> 1

atgcgcttgg cgaagctgcc cgccctcgcc tatcgcagcg ccaaagacac gggagagagc 60

atgaccgaca ccccctatat ccgccccgac atgaaggcct tcctcgagat gatggcgcag 120

gtgaacgggc ccaagctcag cgaaatgagc ctcgatgagg cgcgcgcctc ctaccttgcc 180

atgcacaacc ttgccgaccg cccggcgcgc gcgctgccgg tgatccgcga tctttcctgc 240

cccggcccca agggcgagat tgccttacgt ctctacgacc cgcgcgagag ccgcgagggg 300

ccaacgcccg tcatcacctt cttccacggc ggcggctttg tcatcggcga tctcgatacc 360

caccatgcgc tgtgcaccga gatcgctgcg ctcatggatc tgccgctggt cgcggtccac 420

tatgcccgcg cgcccgaggc gcccttcccc gccgcaatcc tcgattgcga ggcggcaacg 480

cgctggatcg cttccagccc cgccgagctg ggccttaccg cgagcggcat catcaccatc 540

ggtgattcgg ccgggggcaa tgccacggtg gtggtcggcc aattgctcgc cgccagcccg 600

gctgccgttc cggtggtgct gcaggtgccg atcttcccgc tggtggccga tgcggtcagc 660

tcggagagca tggccgcctt ttccgagggc tatcttctca ccgccgagac catggccttc 720

ttcgatgccg cctatggtgc cgatcgctct gacccccgcg gctttccgat cctcgggcgg 780

cacgacaacg cgccccccac catcgtggtg accgccagcc tcgatccgat ccgcgattcg 840

ggccgcgcct atgccaaggc gcttatcgat gccgggcgcg actgcgtgtt cctcgagatg 900

cgcggggtca cgcactcctt caccaacctg cgccagatgg tgccgagcac gcaggccgac 960

ctcgaacgcg tcatcgcggc gatgcagttc atgctggcaa accccgcatg a 1011

<210> 3

<211> 336

<212> PRT

<213> Porphyrobacter cryptus

<400> 3

Met Arg Leu Ala Lys Leu Pro Ala Leu Ala Tyr Arg Ser Ala Lys Asp

1 5 10 15

Thr Gly Glu Ser Met Thr Asp Thr Pro Tyr Ile Arg Pro Asp Met Lys

20 25 30

Ala Phe Leu Glu Met Met Ala Gln Val Asn Gly Pro Lys Leu Ser Glu

35 40 45

Met Ser Leu Asp Glu Ala Arg Ala Ser Tyr Leu Ala Met His Asn Leu

50 55 60

Ala Asp Arg Pro Ala Arg Ala Leu Pro Val Ile Arg Asp Leu Ser Cys

65 70 75 80

Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ile Ala Leu Arg Leu Tyr Asp Pro Arg Glu

85 90 95

Ser Arg Glu Gly Pro Thr Pro Val Ile Thr Phe Phe His Gly Gly Gly

100 105 110

Phe Val Ile Gly Asp Leu Asp Thr His His Ala Leu Cys Thr Glu Ile

115 120 125

Ala Ala Leu Met Asp Leu Pro Leu Val Ala Val His Tyr Ala Arg Ala

130 135 140

Pro Glu Ala Pro Phe Pro Ala Ala Ile Leu Asp Cys Glu Ala Ala Thr

145 150 155 160

Arg Trp Ile Ala Ser Ser Pro Ala Glu Leu Gly Leu Thr Ala Ser Gly

165 170 175

Ile Ile Thr Ile Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn Ala Thr Val Val Val

180 185 190

Gly Gln Leu Leu Ala Ala Ser Pro Ala Ala Val Pro Val Val Leu Gln

195 200 205

Val Pro Ile Phe Pro Leu Val Ala Asp Ala Val Ser Ser Glu Ser Met

210 215 220

Ala Ala Phe Ser Glu Gly Tyr Leu Leu Thr Ala Glu Thr Met Ala Phe

225 230 235 240

Phe Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Asp Arg Ser Asp Pro Arg Gly Phe Pro

245 250 255

Ile Leu Gly Arg His Asp Asn Ala Pro Pro Thr Ile Val Val Thr Ala

260 265 270

Ser Leu Asp Pro Ile Arg Asp Ser Gly Arg Ala Tyr Ala Lys Ala Leu

275 280 285

Ile Asp Ala Gly Arg Asp Cys Val Phe Leu Glu Met Arg Gly Val Thr

290 295 300

His Ser Phe Thr Asn Leu Arg Gln Met Val Pro Ser Thr Gln Ala Asp

305 310 315 320

Leu Glu Arg Val Ile Ala Ala Met Gln Phe Met Leu Ala Asn Pro Ala

325 330 335

Claims (26)

1.一种具有水解酶活性的分离的多肽，其与SEQ ID NO:2所示的多肽序列一致。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽包含四个氨基酸序列保守区域，分别为氨基酸序列109-113位的组氨酸－甘氨酸－甘氨酸－甘氨酸－笨丙氨酸保守区、包含183位丝氨酸活性位点氨基酸序列为181-186的甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸－丙氨酸－甘氨酸－甘氨酸保守区、包含275位天冬氨酸活性位点氨基酸序列为275-276的天冬氨酸－脯氨酸保守区以及包含305位组氨酸活性位点氨基酸序列为305-307的组氨酸－丝氨酸－笨丙氨酸保守区。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽分子N端氨基酸序列5-16号氨基酸形成α-螺旋结构，α-螺旋结构序列为:赖氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-酪氨酸-精氨酸-丝氨酸-丙氨酸-赖氨酸-天冬氨酸。

4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽水解酶的催化中心为SEQ ID NO:2所示的181-186、275-276和305-307氨基酸位置。

5.一种编码权利要求1所述多肽的多核苷酸，其与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列一致。

6.一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求5的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述多肽的产生。

7.一种重组表达载体，其包含权利要求6的核酸构建体。

8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于：所述的载体为原核表达载体pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D2、pPIC9、pHIL-S1；或动物细胞表达载体pSVK3、pMSG。

9.根据权利要求8所述的重组表达载体，其特征在于：所述的载体为大肠杆菌表达载体pSMT3。

10.一种宿主，其由权利要求7-9任一项所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

11.根据权利要求10所述的宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

12.根据权利要求11所述的宿主，其为E.coli细菌、甲醇酵母或中国仓鼠卵巢细胞。

13.根据权利要求12所述的宿主，其为E.coli细菌。

14.一种产生权利要求1所述多肽的方法，其包括：

(a)、在有助于产生水解酶的条件下培养权利要求10所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID NO:1所示核苷酸；

(b)、回收所述多肽。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(b)中，回收方法包括离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(b)中，通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦层析、大小排阻层析或差示溶解度方法。

17.权利要求1所述的多肽或权利要求10所述的能表达多肽的宿主在催化酯类水解中的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的酯类为C2-C16链脂肪酸酯。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的酯类为对硝基苯酚乙酸酯，对硝基苯酚丁酸酯，对硝基苯酚己酸酯，对硝基苯酚辛酸酯，对硝基苯酚癸酸酯，对硝基苯酚十二酸酯，对硝基苯酚十四酸酯，对硝基苯酚十六酸酯。

20.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的酯类为C2-C8短链脂肪酸酯。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述的酯类为具有C6短碳链的对硝基苯酚酯。

22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述的酯类为对硝基苯酚己酸酯。

23.根据权利要求17-22任一项所述的应用，其特征在于，所述的水解酶催化水解温度范围为35～65℃。

24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述的水解催化水解温度范围为55℃。

25.根据权利要求17-22任一项所述的应用，其特征在于，所述的水解酶催化水解的pH值为6.0～9.5。

26.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，所述的水解酶催化水解的pH值为8。

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