CN111304186B

CN111304186B - 一种肝素c5异构酶高催化活性菌株的构建方法

Info

Publication number: CN111304186B
Application number: CN202010127050.1A
Authority: CN
Inventors: 康振; 陈坚; 王兵兵; 周正雄; 金学荣; 胥睿睿
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: CN111304186A

Abstract

本发明公开了一种肝素C5异构酶高催化活性菌株的构建方法，属于生物工程技术领域。本方法首先选用大肠杆菌作为宿主菌，然后利用N端融合促溶标签的方法对C5异构酶进行表达优化，将优化后的C5蛋白序列进一步通过分子对接进行蛋白质工程改造，得到高活性的生产菌株。本发明首次采用微生物细胞表达106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸后的C5，得到的酶催化活性为5.81U/mL，相比未突变前提高了141％，比酶活为145.14U/mg，相比未突变前提高了128％。

Description

一种肝素C5异构酶高催化活性菌株的构建方法

技术领域

本发明涉及一种肝素C5异构酶高催化活性菌株的构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(Heparin sulfate)是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺通过交替连接而成的，是由肝素前体经过一系列变构化及硫酸化作用而形成的一种直链带负电荷的线性多糖。肝素存在于动物细胞的表面或胞外基质中，临床上主要用于治疗血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术和术后抗凝血等。

目前肝素的生产方法有生物提取法、化学酶法合成、全酶法合成。生物提取法主要是从动物小肠粘膜中提取，但动物组织中同时含有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等一系列其他的糖胺聚糖，易造成提取的肝素被污染；化学法生产周期长，过程繁琐；酶法合成产物单一，过程简单。

为了得到结构均一性较好、生物安全的肝素，利用微生物进行肝素的合成可以有效避免上述问题。肝素C5异构酶催化葡萄糖醛酸5-COOH发生翻转形成艾杜糖醛酸，但目前肝素 C5异构酶表达量低，催化活性低，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种肝素C5异构酶突变体，所述肝素C5异构酶突变体的构建方法是：首先肝素C5异构酶的N端融合促溶标签SET2，然后通过分子改造获得肝素C5异构酶突变体；所述分子改造包括(1)-(6)中的任意一种：

(1)将肝素C5异构酶的106位氨基酸(按照建模时的序号计，应为153位氨基酸)由缬氨酸突变为精氨酸；

(2)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；

(3)将肝素C5异构酶的498位氨基酸(按照建模时的序号计，应为545位氨基酸)由天冬氨酸突变为精氨酸；

(4)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；

(5)将肝素C5异构酶的352位氨基酸(按照建模时的序号计，应为399位氨基酸)由甘氨酸突变为谷氨酸；

(6)将肝素C5异构酶的350位氨基酸(按照建模时的序号计，应为397位氨基酸)由赖氨酸突变为丙氨酸；

所述肝素C5异构酶来源于斑马鱼(Danio rerio)，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SET2来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。编码所述肝素C5异构酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码SET2的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述肝素C5异构酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒包括pCold系列质粒。

本发明的第四个目的是表达上述肝素C5异构酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主包括大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供一种提高肝素C5异构酶催化活性的方法，首先肝素C5异构酶的N端融合酿酒酵母的促溶标签SET2，然后通过分子改造获得肝素C5异构酶突变体；所述分子改造包括(1)-(6)中的任意一种：

(1)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸；

(2)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；

(3)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸；

(4)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；

(5)将肝素C5异构酶的352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸；

(6)将肝素C5异构酶的350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸；

所述肝素C5异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SET2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第六个目的是提供一种生产肝素C5异构酶的方法，是以上述基因工程菌为生产菌株，诱导发酵生产肝素C5异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是向OD₆₀₀为0.6-0.8的生产菌株培养物中，加入 IPTG，12-25℃ ，200-220rpm诱导发酵。

本发明还提供了上述肝素C5异构酶突变体在食品、化工或制药领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次采用微生物细胞中以pCold系列载体表达斑马鱼来源的C5，得到的酶催化活性为1.87U/mL。

本发明首次采用微生物细胞表达N端融合促溶标签SET2的C5，得到的酶催化活性为 2.41U/mL，相比对照提高了29％。

本发明首次采用微生物细胞表达106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸后的C5，得到的酶催化活性为5.81U/mL，相比未突变前提高了141％，比酶活为145.14U/mg，相比未突变前提高了128％。

本发明首次采用微生物细胞表达106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸后的C5，得到的酶催化活性为2.80U/mL，相比未突变前提高了16％，比酶活为70U/mg，相比未突变前提高了 10％。

本发明首次采用微生物细胞表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸后的C5，得到的酶催化活性为2.82U/mL，相比未突变前提高了17％，比酶活为70.5U/mg，相比未突变前提高了11％。

本发明首次采用微生物细胞表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸后的C5，得到的酶催化活性为4.29U/mL，相比未突变前提高了78％，比酶活为107.2U/mg，相比未突变前提高了69％。

本发明首次采用微生物细胞表达352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸后的C5，得到的酶催化活性为3.83U/mL，相比未突变前提高了59％，比酶活为95.8U/mg，相比未突变前提高了51％。

本发明首次采用微生物细胞表达350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸后的C5，得到的酶催化活性为3.16U/mL，相比未突变前提高了31％，比酶活为78.9U/mg，相比未突变前提高了24％。

附图说明

图1是肝素C5异构酶催化过程图。

图2是肝素C5异构酶N端融合促溶标签SET2的质粒图谱。

图3是肝素C5异构酶N端融合MBP、SUMO、SET2后的蛋白电泳图(A)和酶活(B)，其中，泳道1：maker；泳道2：E.coli BL21(DE3)-pCold III-MBP-C5胞内上清；泳道3： E.coliBL21(DE3)-pCold III-SUMO-C5胞内上清；泳道4：E.coli BL21(DE3)-pCold III-SET2-C5胞内上清；泳道5：对照胞内上清；泳道6：对照胞内沉淀；泳道7：E.coli BL21 (DE3)-pColdIII-MBP-C5胞外沉淀；泳道8：E.coli BL21(DE3)-pCold III-SUMO-C5胞内沉淀；泳道9：E.coli BL21(DE3)-pCold III-SET2-C5胞内沉淀。

图4是各个肝素C5异构酶突变体的酶活图，图中V153R、V153K、D545R、D545Y、G399E、K397A中的氨基酸序列是按照建模时的序号计算，分别对应实施例2中的C5-V106R、C5-V106K、C5-D498R、C5-D498Y、C5-G352E、C5-K352A。

具体实施方式

1.AST IV:酰基硫酸转移酶IV，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID:83783。

2.C5:肝素C5异构酶，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID:100007670(SEQID NO.1)。

3.2-OST:肝素硫酸转移酶2-OST，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID:395140 (SEQ ID NO.2)。

4.MBP:麦芽糖结合蛋白，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID:948538。

5.SET2:促溶标签2，编码该酶的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

6.SUMO:小泛素蛋白，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID:852122。

7.PNPS:对硝基苯磺酸

8.PNP:对硝基苯酚

9.PAP:3^′5′-二磷酸腺苷

10.C5的酶活测定方法:以N-硫酸化肝素前体为底物，构建催化反应体系(见图1)，包括20mM Tris-HCl(pH 7.4)，50mM PNPS，0.5mM PAP，0.5mg AST IV，0.3mg 2-OST， 0.3mgC5，0.3mg N-硫酸化肝素前体，37℃，反应8h后100℃加热5min终止反应后在 400nm波长下测定吸光值。

C5的酶活的定义：在最适反应条件下(37℃，pH 7.4)，每小时生成1μmol/L的PNP所需的酶量。

实施例1：C5、2-OST和AST IV的制备

1.表达AST IV、2-OST或C5的重组大肠杆菌的构建

将编码AST IV的基因与pCold III载体连接，获得重组质粒pCold III-AST IV；将重组质粒pCold III-AST IV转化到E.coli BL21(DE3)中，获得表达AST IV的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pCold III-AST IV。

将编码2-OST的基因与pET28a载体连接，获得重组质粒pET28a-2OST；将重组质粒pET28a-2OST转化到E.coli BL21(DE3)中，获得表达2-OST的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pET28a-2OST。

将编码C5的基因与pCold III载体连接，获得重组质粒pCold III-C5；将重组质粒pCold III-C5转化到E.coli BL21(DE3)中，获得表达C5的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pCold III-C5。

2.表达AST IV、2-OST或C5的重组大肠杆菌的诱导表达

挑取以pET系列载体构建的重组菌株单菌落于3mL LB培养基(加入终浓度为100μg/mL 的卡那青霉素)中，37℃，220rpm过夜培养。按1％(V/V)的比例转接50mL TB培养基(加入终浓度为100μg/mL的卡那青霉素)，37℃，220rpm培养2h至OD_600nm大约在0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃诱导10h。

挑取以pCold系列载体构建的重组菌株单菌落于3mL LB培养基(加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素)中，37℃，220rpm过夜培养。按1％(V/V)的比例转接50mL TB 培养基(加入终浓度为50μg/mL的卡那青霉素)，37℃，220rpm培养2h至OD_600nm大约在0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，15℃诱导22h。

将上述培养物于8500rpm，4℃离心5min收集菌体，用预冷的Tris-HCl(pH 7.4)清洗两遍，重悬菌体至50mL，冰浴超声，条件为：功率300W，工作4S，间歇6S，10min，4℃， 12000r/min离心30min，分别收集上清和沉淀，上清即为所需粗酶液。

3.AST IV、2-OST和C5的纯化

首先用25mL溶液A(20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L Na₂PO₄，pH 7.4)平衡Ni-HisTrap FF柱，将粗酶液透过0.22μm滤膜后，上清液以1.5mL/min的速度通过Ni-His Trap FF柱，分别用10％，30％，100％的溶液B(20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L Na₂PO₄，500mmol/L咪唑，pH 7.4)进行洗脱并收集相对应的洗脱液。

将纯化后的AST IV、2-OST蛋白用于检测C5的酶活。测得C5的酶活为1.87U/mL，以此作为对照。

实施例2：C5的N端融合酿酒酵母的促溶标签SET2

将C5的N端融合MBP、SET2或SUMO，将融合后的基因分别与pCold III载体连接，分别获得重组质粒pCold III-MBP-C5、pCold III-SET2-C5、pCold III-SUMO-C5(见图2)；将重组质粒pCold III-MBP-C5、pCold III-SET2-C5、pCold III-SUMO-C5分别转化到大肠杆菌中，获得融合表达C5与MBP、SET2或SUMO的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pCold III-MBP-C5、E.coli BL21(DE3)-pCold III-SET2-C5或E.coli BL21(DE3)-pCold III-SUMO-C5。

诱导表达及纯化过程同实施例1。

结果如图3所示，测得C5的N端融合MBP、SET2、SUMO后的酶活分别为1.91U/mL、2.41U/mL、2.41U/mL。

实施例3：C5的分子改造

根据已报道的酶结构分析，经过Discovery Studio分子对接，选择底物结合口袋5埃范围内的氨基酸位点VAL06ASP498、GLY352、LYS350，以pCold III-SET2-C5为基础，进行定点饱和突变(突变引物见表1)。

表1突变引物

引物名称	引物
		VAL106-F	TTGAGGGTTACAACGTGGAANNNCGTGACCGTGTGAAGTGCAT
VAL106-R	TTCCACGTTGTAACCCTCAAAGCT
		LYS350-F	GATCATGGTGACCCGTNNNCTGGGTGAAGGTTTTCGTGCG
LYS350-R	ACGGGTCACCATGATCGGC
		GLY352-F	TCATGGTGACCCGTAAACTGNNNGAAGGTTTTCGTGCGCTGGAG
GLY352-R	CAGTTTACGGGTCACCATGATCGG
		ASP498-F	AACCTGGCGCGTTGGNNNTATCACACCACCCACATCAACC
ASP498-R	CCAACGCGCCAGGTTC

结果如图4所示，采用大肠杆菌表达106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸后的C5-V106R，得到的酶催化活性为5.81U/mL，相比未突变前提高了141％，比酶活为145.14U/mg，相比未突变前提高了128％；采用大肠杆菌表达106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸后的C5-V106K，得到的酶催化活性为2.80U/mL，相比未突变前提高了16％，比酶活为70U/mg，相比未突变前提高了10％；采用大肠杆菌表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸后的C5-D498R，得到的酶催化活性为2.82U/mL，相比未突变前提高了17％，比酶活为70.5U/mg，相比未突变前提高了11％；采用大肠杆菌表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸后的C5-D498Y，得到的酶催化活性为4.29U/mL，相比未突变前提高了78％，比酶活为107.2U/mg，相比未突变前提高了69％；采用大肠杆菌表达352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸后的C5-G352E，得到的酶催化活性为3.83U/mL，相比未突变前提高了59％，比酶活为95.8U/mg，相比未突变前提高了51％；采用大肠杆菌表达352位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸后的C5-K352A，得到的酶催化活性为3.16U/mL，相比未突变前提高了31％，比酶活为78.9U/mg，相比未突变前提高了24％。转化、诱导表达及纯化过程同实施例1。

实施例3：产物的分子量检测

以测定C5-V106R酶活后的反应液为底物，加入肝素裂解酶I和III，37℃，反应24h后 100℃加热5min终止反应，8000rpm离心10min后过0.22μm的滤膜，然后进行LC-MS检测。LC洗脱条件为30min内甲醇浓度从0线性上升到40％。MS条件为在负离子模式下进行 100-2000m/z扫描，其中氮气为载气，产物分子量为495.99。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种肝素C5异构酶高催化活性菌株的构建方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaattcccga aaatcgacag ccacccgcag caaccgcagc cgccggagcc gccgccggtg 60

gttggtggcg ttcgttatga ggaaatcgat tgcctgatta acgacgatgc gaccattaag 120

ggtcgtcgtg agggcagcga agtttacatg ccgtttagct ggatggagaa atatttcgaa 180

gtgtacggca aggtggttca atacgacggt tatgatcgtt tcgagtttag ccacagctat 240

agcaaagttt acgcgcagcg tgaacaatat cacccgaacg gcgtgttcat gagctttgag 300

ggttacaacg tggaagttcg tgaccgtgtg aagtgcatca gcggtgtgga gggcgttccg 360

ctgagcaccc agtggggtcc gcaaggttac ttttatgcga tccagattgc gcaatatggt 420

ctgagccact acagcaaaaa cctgaccgag cgtccgccgc acgtggaagt ttatgacacc 480

gcggaggaac gtgatagccg tagcagcgcg tggaccgtgc cgaaaggttg cagcctgacc 540

cgtgtttacg ataagacccg tgcgaccagc gtgcgtgaat ttagcgcgcc ggagaacagc 600

gaaggcgtta gcctgccgct gggtaacacc aaagacttca tcattagctt tgatctgaag 660

ttcaccagca acggcagcgt gagcgttatc ctggagacca ccgaaaaagg tccgccgttc 720

gtgatccact atgttaccac cacccagctg attctgctga aggaccgtga tatcacctac 780

ggtattggcc cgcgtaccac ctggaccacc gttacccgtg acctgctgac cgatctgcgt 840

aaaggtatcg gcctgagcaa caccaaggcg gtgaaagcga ccaagaccat gccgcgtcgt 900

gtggttaaac tggtggtgca cggtaccggc accattgaca acatcaccat tagcaccacc 960

agccacatgg cggcgtttta cgcggcgagc gactggctgg ttcgtaacca ggatgagcgt 1020

ggtggctggc cgatcatggt gacccgtaaa ctgggtgaag gttttcgtgc gctggagccg 1080

ggttggtaca gcgcgatggc gcagggtcaa gcgatgagca ccctggttcg tgcgtatctg 1140

atgaccaaag acgatcgtta tctgaaggcg gcgctgcgtg cgaccggtcc gtttaagctg 1200

ccgagcgaac aacacggtgt gaaagcggtt ttcatgaaca agtacgactg gtatgaggaa 1260

tacccgacca ttccgagcag ctttgttctg aacggcttca tctatagcct gattggtctg 1320

ttcgacctgg cgcagaccgc gggcgagaag ctgggtcgtg atgcgggtca actgtacagc 1380

aagggtatgg aaagcctgaa ggtgatgctg ccgctgtatg acaccggtag cggcaccatc 1440

tacgatctgc gtcactttat tctgggtacc gcgccgaacc tggcgcgttg ggattatcac 1500

accacccaca tcaaccagct gcaactgctg ggtaccatcg acaacagccc gattttccgt 1560

gatagcgtga aacgttggaa gagctacctg aaaggtggcc gtgcgaagca caactaagaa 1620

ttc 1623

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<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列

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gatggtccta gacaagaagt tgctttggat gaagaagatg atgttgttat tatttacaac 60

agagttccta agactgcttc tacttctttc actaatattg cttatgattt gtgtgctaag 120

aacagatacc atgttttgca tattaacact actaagaaca acccagttat gtctttgcaa 180

gatcaagtta gatttgttaa gaacgttact tcttggaagg aaatgaagcc aggtttttac 240

catggtcatg tttcttactt ggattttgct aagtttggtg ttaagaagaa gccaatttac 300

attaacgtta ttagagatcc tattgaaaga ttggtttctt actattactt cttgagattt 360

ggtgatgatt atagacctgg tttgagaaga agaaagcaag gtgataagaa gacttttgat 420

gaatgtgttg ctgctggtgg ttctgattgt gctcctgaaa aattgtggtt gcaaattcca 480

tttttttgtg gtcattcttc tgaatgttgg aatgttggtt ctagatgggc tttggaacaa 540

gctaaatata atttgattaa tgaatacttt ttggttggtg ttactgaaga attggaagat 600

tttattatgt tgttggaagc tgctttgcca agattcttca gaggtgctac tgaattgtac 660

agaactggta aaaaatctca tttgagaaaa actactgaaa aaaaattgcc aactaaagaa 720

actattgcta aattgcaaca atctgaaatt tggaaaatgg aaaatgaatt ctacgaattc 780

gctttggaac aattccaatt cgttagagct catgctgtta gagaaaaaga tggtgaattg 840

tatattttgg ctcaaaattt cttctatgaa aaaatttatc ctaaatctaa t 891

<210> 3

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaccccgaag aggcgagtgt tacttcaaca gaagaaacct taacgccagc acaggaggcc 60

gcagagaccg aggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggaggc tgagaccgct 120

gaacaaacta gtgacgagaa gaccaccggc tggcggggcg gccacgtggt ggagggcctg 180

gccggcgagc tggagcagct gcgggccagg ctggagcacc accctcaggg ccagcgggag 240

ccctccggcg gctgcaagct gggcctgggt accgagaacc tgtacttcca atcc 294

<210> 4

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Glu Phe Pro Lys Ile Asp Ser His Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Glu

1 5 10 15

Pro Pro Pro Val Val Gly Gly Val Arg Tyr Glu Glu Ile Asp Cys Leu

20 25 30

Ile Asn Asp Asp Ala Thr Ile Lys Gly Arg Arg Glu Gly Ser Glu Val

35 40 45

Tyr Met Pro Phe Ser Trp Met Glu Lys Tyr Phe Glu Val Tyr Gly Lys

50 55 60

Val Val Gln Tyr Asp Gly Tyr Asp Arg Phe Glu Phe Ser His Ser Tyr

65 70 75 80

Ser Lys Val Tyr Ala Gln Arg Glu Gln Tyr His Pro Asn Gly Val Phe

85 90 95

Met Ser Phe Glu Gly Tyr Asn Val Glu Val Arg Asp Arg Val Lys Cys

100 105 110

Ile Ser Gly Val Glu Gly Val Pro Leu Ser Thr Gln Trp Gly Pro Gln

115 120 125

Gly Tyr Phe Tyr Ala Ile Gln Ile Ala Gln Tyr Gly Leu Ser His Tyr

130 135 140

Ser Lys Asn Leu Thr Glu Arg Pro Pro His Val Glu Val Tyr Asp Thr

145 150 155 160

Ala Glu Glu Arg Asp Ser Arg Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Lys Gly

165 170 175

Cys Ser Leu Thr Arg Val Tyr Asp Lys Thr Arg Ala Thr Ser Val Arg

180 185 190

Glu Phe Ser Ala Pro Glu Asn Ser Glu Gly Val Ser Leu Pro Leu Gly

195 200 205

Asn Thr Lys Asp Phe Ile Ile Ser Phe Asp Leu Lys Phe Thr Ser Asn

210 215 220

Gly Ser Val Ser Val Ile Leu Glu Thr Thr Glu Lys Gly Pro Pro Phe

225 230 235 240

Val Ile His Tyr Val Thr Thr Thr Gln Leu Ile Leu Leu Lys Asp Arg

245 250 255

Asp Ile Thr Tyr Gly Ile Gly Pro Arg Thr Thr Trp Thr Thr Val Thr

260 265 270

Arg Asp Leu Leu Thr Asp Leu Arg Lys Gly Ile Gly Leu Ser Asn Thr

275 280 285

Lys Ala Val Lys Ala Thr Lys Thr Met Pro Arg Arg Val Val Lys Leu

290 295 300

Val Val His Gly Thr Gly Thr Ile Asp Asn Ile Thr Ile Ser Thr Thr

305 310 315 320

Ser His Met Ala Ala Phe Tyr Ala Ala Ser Asp Trp Leu Val Arg Asn

325 330 335

Gln Asp Glu Arg Gly Gly Trp Pro Ile Met Val Thr Arg Lys Leu Gly

340 345 350

Glu Gly Phe Arg Ala Leu Glu Pro Gly Trp Tyr Ser Ala Met Ala Gln

355 360 365

Gly Gln Ala Met Ser Thr Leu Val Arg Ala Tyr Leu Met Thr Lys Asp

370 375 380

Asp Arg Tyr Leu Lys Ala Ala Leu Arg Ala Thr Gly Pro Phe Lys Leu

385 390 395 400

Pro Ser Glu Gln His Gly Val Lys Ala Val Phe Met Asn Lys Tyr Asp

405 410 415

Trp Tyr Glu Glu Tyr Pro Thr Ile Pro Ser Ser Phe Val Leu Asn Gly

420 425 430

Phe Ile Tyr Ser Leu Ile Gly Leu Phe Asp Leu Ala Gln Thr Ala Gly

435 440 445

Glu Lys Leu Gly Arg Asp Ala Gly Gln Leu Tyr Ser Lys Gly Met Glu

450 455 460

Ser Leu Lys Val Met Leu Pro Leu Tyr Asp Thr Gly Ser Gly Thr Ile

465 470 475 480

Tyr Asp Leu Arg His Phe Ile Leu Gly Thr Ala Pro Asn Leu Ala Arg

485 490 495

Trp Asp Tyr His Thr Thr His Ile Asn Gln Leu Gln Leu Leu Gly Thr

500 505 510

Ile Asp Asn Ser Pro Ile Phe Arg Asp Ser Val Lys Arg Trp Lys Ser

515 520 525

Tyr Leu Lys Gly Gly Arg Ala Lys His Asn Glu Phe

530 535 540

<210> 5

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Pro Glu Glu Ala Ser Val Thr Ser Thr Glu Glu Thr Leu Thr Pro

1 5 10 15

Ala Gln Glu Ala Ala Glu Thr Glu Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu

20 25 30

Ala Glu Leu Glu Ala Glu Thr Ala Glu Gln Thr Ser Asp Glu Lys Thr

35 40 45

Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly Leu Ala Gly Glu Leu

50 55 60

Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro Gln Gly Gln Arg Glu

65 70 75 80

Pro Ser Gly Gly Cys Lys Leu Gly Leu Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe

85 90 95

Gln Ser

Claims

1.一种肝素C5异构酶突变体，其特征在于，所述肝素C5异构酶突变体的构建方法是：首先肝素C5异构酶的N端融合促溶标签SET2，然后通过分子改造获得肝素C5异构酶突变体；所述分子改造包括（1）-（6）中的任意一种：

（1）将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸；

（2）将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；

（3）将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸；

（4）将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；

（5）将肝素C5异构酶的352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸；

（6）将肝素C5异构酶的350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸；

所述肝素C5异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SET2的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。

2.编码权利要求1所述的肝素C5异构酶突变体的基因。

3.含权利要求2所述的基因的质粒。

4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒包括pCold系列质粒。

5.表达权利要求1所述的肝素C5异构酶突变体的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主包括大肠杆菌BL21（DE3）。

7.一种提高肝素C5异构酶催化活性的方法，其特征在于，首先肝素C5异构酶的N端融合促溶标签SET2，然后通过分子改造获得肝素C5异构酶突变体；所述分子改造包括（1）-（6）中的任意一种：

（1）将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸；

（2）将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；

（5）将肝素C5异构酶的352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸；

（6）将肝素C5异构酶的350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸；

8.一种生产肝素C5异构酶的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求5或6所述的基因工程菌为生产菌株，诱导发酵生产肝素C5异构酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是向OD₆₀₀为0.6-0.8的生产菌株培养物中，加入IPTG，12-25℃，200-220 rpm诱导发酵。

10.权利要求1所述的肝素C5异构酶突变体在化工或制药领域的应用。