CN112301012B

CN112301012B - 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法

Info

Publication number: CN112301012B
Application number: CN202011101602.8A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 王蕾; 孔德民
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2040-10-15
Also published as: CN112301012A

Abstract

本发明公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Bacillus stearothermophilus NO2的环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到了歧化水解比以及歧化反应催化效率提高的突变体；其中，突变体L277M/G282A的歧化活力与水解活力比值与野生型环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力的比值相比，提高了183.33％；突变体L277F、G282A、L277F/G282A的歧化反应催化效率与野生酶相比有所提高，分别是野生酶的1.128倍、1.186倍和1.253倍；采用本发明所构建的突变体能够降低生产成本，适于工业化生产。

Description

一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，EC 2.4.1.19)属于α-淀粉酶家族(糖苷水解酶13_2，GH13_2)，能够以淀粉、麦芽糊精等为底物催化转糖苷反应以及水解反应。其中，转糖苷反应包括歧化反应、环化反应及偶合反应。歧化反应是两个不同分子间发生的转糖苷反应，环化反应是分子内发生的转糖苷反应，偶合反应是环化反应的逆反应。在实际应用中，常利用CGTase歧化反应生成多种水溶性、稳定性提高的糖苷化合物，如L-抗坏血酸、橙皮苷、柚皮苷的糖基化产物。然而，已发现的所有天然来源的CGTase均同时具有歧化和水解活性，水解反应作为副反应会降低转糖苷产物的产量；因此，在工业生产中CGTase的水解活性应该尽可能的降低。

目前，CGTase很难进一步提高其歧化反应效率，大多数的突变体不能同时兼顾提高歧化活力和降低水解活力，歧化水解比或歧化反应效率的提高可以有效的提高产量，是工业生产中需要解决的一大难题。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明通过对来源于Bacillusstearothermophilus NO2的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，以获得歧化水解比或歧化反应催化效率提高的突变体，将突变体应用于工业生产。

本发明提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位氨基酸进行突变得到的；

或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第282位氨基酸进行突变得到的；

或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位氨基酸和第282位氨基酸同时进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(d)任一：

(a)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位的由亮氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为L277F，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第282位的由甘氨酸突变为丙氨酸，并命名为G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(c)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位和第282位由亮氨酸和甘氨酸分别突变为甲硫氨酸和丙氨酸，并命名为L277M/G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(d)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位和第282位由亮氨酸和甘氨酸分别突变为苯丙氨酸和丙氨酸，并命名为L277F/G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于Bacillusstearothermophilus NO2，编码所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供了一种编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。

本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET系列载体、Duet系列载体、pGEX系列载体、pHY300系列载体、pHY300PLK系列载体、pPIC3K系列载体或pPIC9K系列载体。

在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。

本发明还提供了一种携带上述基因或上述重组载体的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为重组原核细胞或真核细胞；所述原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

在本发明的一种实施方式中，所述携带上述基因或上述重组载体的细胞的构建方法为：将携带编码所环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的歧化活力由4-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖-4-6-O-亚乙基和麦芽糖来测定。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的水解活力由可溶性淀粉测定。

本发明还提供了一种上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备方法，所述方法为：将携带上述基因或上述重组载体的细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的发酵上清液中，分离得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体。

本发明还提供了一种提高提高环糊精葡萄糖基转移酶催化效率或环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力比值的方法，所述方法为：

将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位氨基酸由亮氨酸突变为苯丙氨酸；

或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第282位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸；

或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位和第282位氨基酸由亮氨酸和甘氨酸分别突变为甲硫氨酸和丙氨酸；

或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位和第282位氨基酸由亮氨酸和甘氨酸分别突变为苯丙氨酸和丙氨酸。

本发明还提供了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述细胞，或上述制备方法在(a)～(c)至少一方面的应用：

(a)水解淀粉或水解麦芽糊精；

(b)提高环糊精葡萄糖基转移酶催化效率；

(c)提高环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力比值。

本发明还提供了一种制备淀粉糖或糖苷化合物的方法，所述方法为将上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体或上述细胞添加至含有淀粉的反应体系中进行反应。

有益效果：

本发明所得到的突变体L277F、G282A、L277M/G282A和L277F/G282A具有如下效果：

(1)采用本发明的方法，得到了歧化活力与水解活力比值得到提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，突变体L277F和L277M/G282A的歧化活力与水解活力比值与野生型环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力的比值相比，分别提高了32.04％和183.33％。

(2)采用本发明的方法，环糊精葡萄糖基转移酶在歧化反应中催化效率得到了提高，突变体L277F、G282A和L277F/G282A的kcat/Km分别为773.82s^-1mM^-1、813.53s^-1mM^-1和859.97s^-1mM^-1，与野生酶kcat/Km为686.07s^-1mM^-1相比，分别是野生酶的1.13倍、1.19倍和1.25倍。

具体实施方式

下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母粉5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母粉5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1，琼脂粉20g·L^-1。

TB发酵培养基：胰蛋白胨12g·L^-1，酵母粉24g·L^-1，甘油5g·L^-1，KH₂PO₄ 2.31g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g·L^-1，甘氨酸7.5g·L^-1。

环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力的测定方法：

(1)预热：各取300μL的4mM 4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷-4-6-O-亚乙基(EPS)和80mM麦芽糖(50mM，pH 5.5的磷酸缓冲液配制)，50℃保温10min。

(2)反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加热终止反应，然后加入100μL去离子水及100μLα-葡萄糖苷酶在60℃条件下反应1h。

(3)测量：加入100μL 1M Na₂CO₃终止反应并调节pH至8.0左右显色，在401nm下测量样品的吸光度并计算酶活力。

酶活定义：一个酶活单位(U)定义为一个单位活性定义为每分钟转化1μmol EPS所需酶量。

环糊精葡萄糖基转移酶水解活力的测定方法

预热：取1mL的1％可溶性淀粉(50Mm，pH 5.5的磷酸缓冲液配制)和900μL的磷酸缓冲液，50℃保温10min。

反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加入3mL的DNS(3,5-二硝基水杨酸)终止反应，然后煮沸加热7min显色，放入冰水中冷却。

测量：样品定容至15mL，在540nm下测定样品的吸光度并计算酶活力。

酶活定义：一个酶活单位(U)定义为一个单位活性定义为每分钟生成1μmol麦芽糖所需酶量。

实施例1：野生型环糊精葡萄糖基转移酶的表达

从实验室前期保藏的甘油管中蘸取E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-cgt(构建方法记载于熊艳军《环糊精葡萄糖基转移酶合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的研究》的文献中)的菌液接种于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)中，于37℃，200rpm，培养8-10h，得到种子液；按5％(v/v)接种量将种子液接入TB发酵培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，在25℃摇床培养发酵60h后，得到发酵液，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集上清液，即为野生酶的粗酶液。

实施例2：环糊精葡萄糖基转移酶单突变体的制备及表达

(1)环糊精葡萄糖基转移酶的单突变体的制备

根据Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)，分别设计并合成引入单突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶基因Cgt进行定点突变，分别测序确认环糊精葡萄糖基转移酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变环糊精葡萄糖基转移酶。

定点突变体编码基因的PCR扩增：利用快速PCR技术，以表达载体pET20b(+)/cgt为模板(该载体上已包含启动子和信号肽，信号肽之后为目的基因序列)，表达载体pET20b(+)/cgt的构建方法记载于熊艳军《环糊精葡萄糖基转移酶合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的研究》的文献中。

引入L277M突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TCTGGCATGAGCCTGATGGATTTCCGTTTTGGT-3’(SEQ ID NO.6)；

反向引物：5’-ACCAAAACGGAAATCCATCAGGCTCATGCCAGA-3’(SEQ ID NO.7)；

引入L277F突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TCTGGCATGAGCCTGTTTGATTTCCGTTTTGGT-3’(SEQ ID NO.8)；

反向引物：5’-ACCAAAACGGAAATCAAACAGGCTCATGCCAGA-3’(SEQ ID NO.9)；

引入G282A突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CTGGATTTCCGTTTTGCTCAGAAACTGCGTCAG-3’(SED ID NO 10)；

反向引物：5’-CTGACGCAGTTTCTGAGCAAAACGGAAATCCAG-3’(SED ID NO 11)；

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Primerstar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后20个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。

(2)重组菌的制备

将步骤(1)得到的验证正确的PCR产物经DpnⅠ消化(消化体系为：DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×T Buffer 5μL)后，将DpnⅠ消化后的产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，得到转化产物，将转化产物涂布在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒并测序，结果正确，将测序正确的质粒化学转化法转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)得到可表达单突变体的重组大肠杆菌。

化学转化法具体步骤：

①将10μL同源重组产物导入100mL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；

②冰浴15-30min；

③42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；

④加入800μL无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；

⑤5000rpm离心2min收菌；

⑥移去上清，剩余100-200μL吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL氨苄青霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右；

⑦挑取单克隆于含0.05mg/mL氨苄青霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。

将通过测序的重组菌分别命名为：BL21(DE3)/pET20b(+)-L277M、BL21(DE3)/pET20b(+)-L277F和BL21(DE3)/pET20b(+)-G282A。

实施例3：环糊精葡萄糖基转移酶双突突变体重组菌的制备

在单突变体L277M和L277F的基础上，利用G282A突变的定点突变引物，构建双突突变体。具体实施方式参见实施例1，利用快速PCR技术，以表达载体pET20b(+)/cgt为模板(该载体上已包含启动子和信号肽，信号肽之后为目的基因序列)，表达载体pET20b(+)/cgt的构建方法记载于熊艳军《环糊精葡萄糖基转移酶合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的研究》的文献中。

引入G282A突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CTGGATTTCCGTTTTGCTCAGAAACTGCGTCAG-3’(SED ID NO 10)；

反向引物：5’-CTGACGCAGTTTCTGAGCAAAACGGAAATCCAG-3’(SED ID NO 11)；

重组菌的制备方法同实施例2，分别将测序正确的重组菌命名为BL21(DE3)/pET20b(+)-L277M/G282A和BL21(DE3)/pET20b(+)-L277F/G282A。

实施例4：环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力分析

挑取实施例2和3得到的重组菌株于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)在37℃，200rpm条件下，培养8-10h，得到种子液，按5％(v/v)的接种量将种子液接种到TB发酵培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在25℃，200rpm，摇床培养60h后，得到发酵液，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液得到粗酶液，分别获得含有突变体L277F、突变体G282A、突变体L277M/G282A和突变体L277F/G282A的粗酶液。

分别测定实施例1获得的环糊精葡萄糖基转移酶野生酶和上述突变体L277F、突变体G282A、突变体L277M/G282A和突变体L277F/G282A的歧化活力、水解活力及其比值，结果见表1，突变体L277F、突变体L277M/G282A的歧化水解比与环糊精葡萄糖基转移酶野生酶相比，分别提高了32.04％和183.33％。

其中，歧化水解比＝歧化活力/水解活力*100％，将得到的野生酶的比值定义为100％，分别计算各个突变体的歧化水解比，其结果如表1所示。

表1环糊精葡萄糖转移酶野生酶和突变体的歧化水解活力比值

实施例5：环糊精葡萄糖基转移酶歧化反应催化效率

1、环糊精葡萄糖基转移酶的纯化

(1)分别将实施例1中发酵得到的环糊精葡萄糖基转移酶野生酶的粗酶液、实施例4中发酵得到的含有突变体L277F、G282A、L277M/G282A和L277F/G282A的粗酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量分数26％的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4℃条件下静置8-10h沉淀蛋白，得到混合物。

(2)将步骤(1)得到的混合物经离心(8000rpm，10min)收集沉淀，再用最小体积的20mM pH6.5的KH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(缓冲液A)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清，得到复溶液，在4℃下将复溶液置于缓冲液A中透析24h，透析后在12000r·min-1，4℃离心5min，收集上清液。

(3)将步骤(2)得到的上清液经过0.22μm有机膜过滤制成上样样品。用Ni-NTA柱对CGTase进行纯化。蛋白洗脱步骤为：第一步，用2倍柱体积的A液(25mM Tris-HCl缓冲液，500mM NaCl，pH 7.4)以及含有15、30、45mM咪唑的A液梯度洗脱杂蛋白；第二步，用2倍柱体积的B液(25mM Tris-HCl缓冲液，500mM NaCl，300mM咪唑)洗脱CGTase并收集。然后将收集的酶液用30KDa的超滤管去除咪唑，将Tris-HCl缓冲液置换为50mM的磷酸盐缓冲液(pH5.5)即为纯化好的CGTase，即得到纯化后的环糊精葡萄糖基转移酶野生酶、突变体L277F、G282A、L277M/G282A和L277F/G282A。

2、纯酶的歧化反应动力学参数K_m、k_cat和k_cat/K_m的测定计算步骤(3)得到的纯化后的环糊精葡萄糖基转移酶野生酶、突变体L277F、突变体G282A、突变体L277M/G282A和突变体L277F/G282A的歧化反应动力学参数K_m、k_cat和k_cat/K_m；反应体系如下：向反应容器中加入300μL的4mM 4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷-4-6-O-亚乙基(EPS)和300μL的80mM麦芽糖(其中麦芽糖采用50mM pH 5.5的磷酸缓冲液配制)后，在50℃保温10min，得到反应体系；向反应体系中加入100μL纯酶液；反应10min，加热终止反应，然后加入100μL去离子水及100μLα-葡萄糖苷酶在60℃条件下反应1h后，加入100μL 1M Na₂CO₃终止反应，并调节pH至8.0左右显色，在401nm下测量样品的吸光度并计算反应V_max。

采用Graph Pad Prism 7.0软件中的非线性回归方法对数据进行拟合，分别得到米氏(Michaelis-Menten)方程的K_m和V_max值，再计算得到K_cat和K_cat/K_m值，计算结果见表2；

其中，K_cat值的计算公式为：K_cat＝V_max*M*0.001/60；其中，M为反应中加入的酶的质量，单位为mg。

测定结果如表2所示，突变体L277F、突变体G282A、突变体L277F/G282A的歧化反应催化效率与野生酶相比有所提高，分别是野生酶的1.128倍、1.186倍和1.253倍。

表2野生酶以及突变体的歧化反应动力学参数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法

<130> BAA200762A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr

1 5 10 15

Gln Ile Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro

20 25 30

Ser Gly Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys

35 40 45

Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu

50 55 60

Thr Asp Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn

65 70 75 80

Val Phe Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly

85 90 95

Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu

100 105 110

Ser Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys

115 120 125

Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr

130 135 140

Asn Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu

145 150 155 160

Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly

165 170 175

Gly Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe

180 185 190

Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu

195 200 205

Lys Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg

210 215 220

Met Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met

225 230 235 240

Asp Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe

245 250 255

Leu Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu

260 265 270

Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln

275 280 285

Val Leu Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile

290 295 300

Gln Asp Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe

305 310 315 320

Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro

325 330 335

Arg Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val

340 345 350

Pro Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp

355 360 365

Pro Asn Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala

370 375 380

Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala

385 390 395 400

Leu Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr

405 410 415

Val Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn

420 425 430

Arg Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu

435 440 445

Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn

450 455 460

Thr Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly

465 470 475 480

Pro Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro

485 490 495

Ile Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val

500 505 510

Thr Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe

515 520 525

Gly Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val

530 535 540

Val Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln

545 550 555 560

Ser Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu

565 570 575

Thr Asn Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr

580 585 590

Asn Leu Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly

595 600 605

Asn Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val

610 615 620

Tyr Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys

625 630 635 640

Thr Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr

645 650 655

Trp Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr

660 665 670

Gly Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn

675 680

<210> 2

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列

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<211> 681

<212> PRT

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<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列

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<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列

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atggcgggca acctgaacaa agtgaacttt acctctgacg ttgtttatca gatcgttgtt 60

gatcgctttg ttgatggtaa cacttctaac aacccgtctg gcgcactgtt ttcctctggc 120

tgtaccaacc tgcgtaaata ctgcggtggt gactggcagg gcattattaa caagattaac 180

gatggttacc tgaccgatat gggcgttact gcgatttgga tctctcagcc ggttgagaac 240

gttttctctg ttatgaacga cgcatccggt agcgcatctt atcacggtta ttgggcgcgt 300

gactttaaaa agccgaaccc gttctttggc accctgagcg atttccagcg tctggtggat 360

gcggcgcatg ctaaaggtat taaggtgatt atcgactttg caccgaacca cacctctccg 420

gcgagcgaaa ccaacccgag ctacatggaa aacggtcgtc tgtatgataa cggtactctg 480

ctgggtggtt acaccaacga tgcaaacatg tattttcatc ataacggtgg caccaccttc 540

tcttctctgg aagatggtat ttaccgtaac ctgttcgacc tggcggatct gaaccatcag 600

aacccggtta tcgatcgcta tctgaaagat gcggttaaaa tgtggatcga tatgggcatt 660

gacggtatcc gtatggatgc tgttaaacac atgccgtttg gttggcagaa atccctgatg 720

gatgaaatcg acaactaccg tccggtgttc acctttggcg aatggtttct gtctgaaaac 780

gaagttgatg cgaacaacca ctatttcgca aacgagtctg gcatgagcct gctggatttc 840

cgttttggtc agaaactgcg tcaggttctg cgcaacaact ctgacaactg gtacggtttt 900

aaccagatga tccaggacac cgcatctgcg tacgatgaag ttctggatca ggtgaccttc 960

attgataacc atgacatgga tcgttttatg attgatggtg gcgacccgcg taaggttgat 1020

atggctctgg cggtgctgct gacctctcgt ggtgttccga acatctatta tggtactgaa 1080

cagtacatga ccggtaacgg cgatccgaac aaccgtaaaa tgatgtcttc tttcaacaaa 1140

aacacccgtg cgtatcaggt tattcagaaa ctgtcctctc tgcgtcgtaa caacccggct 1200

ctggcgtatg gtgacaccga acagcgttgg atcaacggtg atgtgtacgt gtacgagcgt 1260

cagttcggta aggatgttgt gctggtggcg gtgaaccgta gctcttcctc taactattct 1320

atcaccggtc tgtttaccgc gctgccggct ggcacctaca ccgatcagct gggcggtctg 1380

ctggacggta acaccattca ggttggctct aacggttctg ttaacgcttt cgacctgggt 1440

ccgggtgaag ttggtgtttg ggcgtactct gcgaccgagt ctactccgat tatcggccac 1500

gttggcccga tgatgggtca ggtgggtcat caggtgacca tcgacggtga aggttttggc 1560

actaacactg gtaccgtgaa attcggtact actgcagcga acgttgtttc ctggagcaac 1620

aaccagatcg tggttgctgt tccgaacgtg tctccgggta aatataacat taccgttcag 1680

tcctctagcg gtcagacctc tgcggcttac gacaactttg aggtgctgac caacgatcag 1740

gtttccgtgc gctttgttgt gaacaacgcg actactaacc tgggccagaa catttacatc 1800

gtgggtaacg tttatgaact gggcaactgg gacacctcca aggcgattgg tccgatgttc 1860

aaccaggtgg tttattctta cccgacttgg tatatcgatg tttctgtgcc ggagggtaaa 1920

actatcgagt ttaaattcat caaaaaagac tctcagggca acgtgacttg ggaaagcggt 1980

tccaaccatg tttatactac cccgaccaac actaccggca aaattatcgt tgactggcag 2040

aactaa 2046

Claims

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(d)任一：

(a)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位氨基酸由亮氨酸突变为苯丙氨酸；

(b)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第282位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸；

(c)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位和第282位氨基酸由亮氨酸和甘氨酸分别突变为甲硫氨酸和丙氨酸；

(d)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位和第282位氨基酸由亮氨酸和甘氨酸分别突变为苯丙氨酸和丙氨酸。

2.编码权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体为pET质粒、Duet质粒、pGEX质粒、pHY300质粒、pHY300PLK质粒、pPIC3K质粒或pPIC9K质粒。

5.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体的细胞。

6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为细菌或真菌。

7.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶催化效率或环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力比值的方法，其特征在于，所述方法为：

8.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述重组载体，或权利要求5或6所述细胞在(a)～(c)至少一方面的应用：

(a)水解淀粉或水解麦芽糊精；

(b)提高环糊精葡萄糖基转移酶催化效率；

(c)提高环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力比值。

9.一种制备淀粉糖或糖苷化合物的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体或权利要求5或6所述的细胞添加至含有淀粉的反应体系中进行反应。