CN113817704B

CN113817704B - 一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法

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Publication number: CN113817704B
Application number: CN202111235303.8A
Authority: CN
Inventors: 韩瑞枝; 姜钰琳; 樊朝悦; 易灵凤; 倪晔
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2041-10-22
Also published as: CN113817704A

Abstract

本发明公开了一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法，属于酶工程和基因工程技术领域。本发明构建了两个有机溶剂(二甲基亚砜和乙醇)耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体。以染料木素为例，将这两个突变体运用在对染料木素的糖基化反应，结果显示，T599H/N600S/Y601G和T599D/N600D/Y601H产生的长链糖基化产物特异性明显优于野生型WT，分别是野生型的2.1倍及2.5倍。本发明获得了两个有机溶剂耐受性提高的环糊精糖基转移酶突变体，促进了糖基转移酶有机反应体系中的酶促效率，有助于拓展CGTase的工业应用范围，具有极大的应用前景。

Description

一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法，属于酶工程和基因工程技术领域。

背景技术

环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase，EC2.4.1.19)，属于α-淀粉酶家族，已被证实是一种多功能的酶，具有多种转糖基活力，包括环化、歧化、耦合活力以及部分水解活力。其特征反应的产物环糊精因其独特的疏水空腔结构，能有效地改善疏水客体在水相中的溶解与分布问题，在食品、化工、医药、纺织等多个领域都得到了广泛的应用，环糊精糖基转移酶也因此引起了大量研究者的关注。

随着研究的不断深入，对于环糊精糖基转移酶的结构，催化机理等都有了较好的认识。目前对于环糊精糖基转移酶的研究主要集中在两个方面：一是新来源的环糊精糖基转移酶的挖掘及表达优化；二是利用基因工程、分子改造等技术定向进化提高酶学特性；另外，也涉及酶固定化，多酶偶联等常规研究方向。环糊精糖基转移酶因其多样的糖基化活力，已被用于多种化合物的转糖基反应，如甜菊苷、芦丁、染料木素等。糖基化处理有效解决了这些物质在实际应用中溶解性差、不易储存、不稳定等多种问题，且糖基化产物多数保持了物质本身的优良性质和价值，从而在食品、化工等多个领域得到了较好的应用。

但在实际应用中，直接依靠挖掘的天然环糊精糖基转移酶往往很难满足生产要求。究其原因，天然酶多数都存在酶活低，不稳定，底物混杂性差等问题，且由于环糊精糖基转移酶复杂的催化机理，常产生多种产物，产物特异性差，因此，目前对于该酶的分子改造多集中于催化活性，热稳定性，专一性等方面，并取得了不错的进展。然而，对于酶学反应，其催化效率除酶本身外，与酶所处环境也有很大的关系。在工业生产中，有机溶剂的使用是极为重要的一环，很多疏水底物的生物转化都依赖于有机溶剂，但有机溶剂往往对多数酶存在不利影响，使酶活性降低甚至失活，严重限制了生产效率。

以染料木素为例，它是一类高活性功能的大豆异黄酮类物质，具有多种药理价值，包括抗癌、抗骨质疏松、预防心血管疾病等，但这类物质具有强疏水性，几乎不溶于水，仅能溶解在二甲基亚砜(DMSO)等极性有机溶剂中，故极大限制了其在医药领域的进一步开发利用，用环糊精糖基转移酶对其进行糖基化修饰后可以有效解决水不溶性难题，产物的水溶性较之前提高上千乃至上万倍。但天然的环糊精糖基转移酶在有机溶剂环境中的酶活及酶稳都会受到极大影响，因此，为了突破这一瓶颈，通过分子改造策略提高环糊精糖基转移酶的有机溶剂耐受性具有极大的意义。

发明内容

为了提高现有的环糊精糖基转移酶对有机溶剂的耐受力，本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位、第600位、第601位的氨基酸同时突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为组氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为丝氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为甘氨酸得到；命名为T599H/N600S/Y601G。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为天冬氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为组氨酸得到；命名为T599D/N600D/Y601H。

本发明还提供了一种编码上述突变体的基因。

本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为：pET系列载体、pUT系列载体或pBAD系列载体。

本发明还提供了一种表达上述突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以真菌或细菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为：大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了一种制备所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的方法，所述方法包括：

先设计定点突变的引物，待提取含有所述环糊精葡萄糖基转移酶基因的质粒后，以此作为模板进行全质粒PCR，获得携带突变基因的重组质粒，将其转入宿主菌中进行培养，诱导表达后离心破碎，收集上清液，即为粗酶液。

本发明还提供了一种重组大肠杆菌，表达了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET-28a(+)为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。

本发明还提供了上述重组大肠杆菌的构建方法，具体步骤如下：

1)首先设计引物得到大量的环糊精糖基转移酶突变体基因；

2)将克隆得到的基因片段连接到线性化的表达载体pET-28a(+)上，得到重组表达质粒pET-28a(+)-突变体；

3)将步骤2)中获得的重组表达质粒转入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到基因工程菌，得到能够表达环糊精糖基转移酶突变体的重组大肠杆菌。

本发明还提供了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶对有机溶剂的耐受性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为组氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为丝氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为甘氨酸；

或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为天冬氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为组氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为：二甲基亚砜DMSO和/或乙醇。

本发明还提供了一种生产长链糖基化染料木素的方法，所述方法为，向含有可溶性淀粉和染料木素的反应体系中加入上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，获得长链糖基化染料木素。

在本发明的一种实施方式中，所述底物可溶性淀粉的添加量为：30～40g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述染料木素的添加量为：5～10g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶及突变体(纯酶)的添加量为：0.1～0.2U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述反应条件为：将上述反应物及酶液混匀置于2mL带盖小管中，在40℃的摇床中反应16～20h，反应结束后加热终止反应。

在本发明的一种实施方式中，最终处理好的反应样品采用HPLC检测。

本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组质粒，或上述重组细胞在制备提高环糊精葡萄糖基转移酶对有机溶剂的耐受性的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。

本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组质粒，或上述重组细胞在生产长链糖基化染料木素中的应用。

有益效果

(1)本发明构建了两个有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，T599H/N600S/Y601G和T599D/N600D/Y601H。在10％的DMSO体系中孵育1h后测活，T599H/N600S/Y601G和T599D/N600D/Y601H相比于野生型CGTase(WT)的残余活力分别提高了17.8％和23.1％；在20％的DMSO体系中孵育1h后测活，两者的残余活力分别提高了10.9％和15.6％。

(2)本发明的突变体T599H/N600S/Y601G及T599D/N600D/Y601H在5％(v/v)的乙醇中孵育1h后的残余活力较WT分别提高了9.0％和14.8％左右；在10％(v/v)的乙醇中孵育后的残余活力分别提高了7.7％和10.4％。两个突变体的有机溶剂耐受性较WT都有明显的提高。

(3)以染料木素为例，研究本发明的这两个突变体对染料木素的糖基化反应，结果显示，T599H/N600S/Y601G和T599D/N600D/Y601H产生的长链糖基化产物特异性明显优于野生型WT，分别是野生型的2.1倍及2.5倍。

(4)本发明获得了两个有机溶剂耐受性提高的环糊精糖基转移酶突变体，促进了糖基转移酶有机反应体系中的酶促效率，有助于拓展CGTase的工业应用范围，具有极大的应用前景。

附图说明

图1：野生型及突变体粗酶液的蛋白胶图；其中，1：野生型WT；2：T599H/N600S/Y601G；3：T599D/N600D/Y601H；4：T599S/N600H/Y601S；5：T599R/N600S/Y601D；6：T599S/N600D/Y601G；M：Marker。

具体实施方式

本发明的具体实施例仅用作进一步的说明，不能作为本发明的限制内容和范围。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1。

LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加2％琼脂。

TB液体培养基：酵母粉24.0g·L^-1、胰蛋白胨12.0g·L^-1、KH₂PO₃ 2.3g·L^-1、K₂HPO₃16.4g·L^-1、甘油5g·L^-1。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

环糊精糖基转移酶的活力检测：

甲基橙法测环化活力：取50μL稀释至合适浓度的酶液，加入200μL麦芽糊精(预先用50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)配制的浓度为10g·L^-1)，在40℃的水浴摇床中反应10min，立即加入250μL盐酸(1.0M)终止反应，再加入150μL甲基橙(用50mM磷酸缓冲液配制成浓度为0.1mM)，室温(20℃)静置20min，在505nm下测定吸光度。以不加酶液组作为空白对照。

酶活定义：在该条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需的酶量定义为一个酶活力单位。

糖基化染料木素的产量的检测方法：检测条件如表1所示。

表1HPLC检测条件

糖基化效率的计算方法：

糖基化效率＝(底物减少量/底物初始量)×100％。

长链糖基化产物占比＝长链糖基化产物(四糖基、五糖基、六糖基化染料木素)产量之和/总糖基化产物产量×100％。

实施例1：野生型环糊精葡萄糖基转移酶的制备及表达

具体步骤如下：

取实验室保藏的甘油菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-cgt，所述菌株E.coliBL21(DE3)/pET-20b(+)-cgt，是将pET-20b(+)与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶cgt，酶切后连接制备得到重组质粒，将重组质粒导入到E.coli BL21(DE3)中，制备得到充足菌，其具体的构建过程可见参考文献：Han,R.,Ge,B.,Jiang,M.etal.High production of genistein diglucoside derivative using cyclodextringlycosyltransferase from Paenibacillus macerans.J Ind Microbiol Biotechnol44,1343–1354(2017)；

将E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-cgt将进行划线活化后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中，在37℃培养10h后，用试剂盒提取质粒pET-20b(+)-cgt。一步克隆更换载体：设计引物，引物序列为，F:CAGCAAATGGGTCGCGGATCCTCACCGGACACCTCAGTGGA

R:GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATTTTGCCAATCCACCGTCA；以质粒pET-20b(+)-cgt为模板利用PCR技术获得大量克隆目的片段，经胶回收后与经双酶切(BamH I和Xho I)后的质粒pET-28a(+)进行连接，转入大肠杆菌BL21后进行涂布培养，待菌落明显长出后挑取接入到LB液体培养基培养10h，提取质粒并送样测序，保留测序正确的菌株，将其标记为未进行突变的野生型菌株E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-cgt(WT)。

实施例2：环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备及表达

1、定点突变

本发明中的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，根据选定的突变位点设计引物，以提取的重组质粒pET28a(+)-cgt作为模板进行全质粒PCR，引物序列如下：

突变体T599H/N600S/Y601G所用引物：

正向引物：5'-AACCAAGCGAATCATAGCGGTGGCACG-3'，下划线为突变碱基；

反向引物：5'-AACATTCGTGCCACCGCTATGATTCGC-3'，下划线为突变碱基。

突变体T599D/N600D/Y601H所用引物：

正向引物：5'-AACCAAGCGAATGATGATCATGGCACG-3'，下划线为突变碱基；

反向引物：5'-AACATTCGTGCCATGATCATCATTCGC-3'，下划线为突变碱基。

突变体T599S/N600H/Y601S所用引物：

正向引物：5'-AACCAAGCGAATAGCCATAGCGGCACG-3'，下划线为突变碱基；

反向引物：5'-AACATTCGTGCCGCTATGGCTATTCGC-3'，下划线为突变碱基。

突变体T599R/N600S/Y601D所用引物：

正向引物：5'-AACCAAGCGAATCGCAGCGATGGCACG-3'，下划线为突变碱基；

反向引物：5'-AACATTCGTGCCATCGCTGCGATTCGC-3'，下划线为突变碱基。

突变体T599S/N600D/Y601G所用引物：

正向引物：5'-AACCAAGCGAATAGCGATGGCGGCACG-3'，下划线为突变碱基；

反向引物：5'-AACATTCGTGCCGCCATCGCTATTCGC-3'，下划线为突变碱基。

PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，2.5mM dNTPs 4μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，2.5U/μL PrimeSTAR Taq HS 0.5μL，加双蒸水补足至50μL；

PCR产物扩增条件均为：98℃预变性5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环后72℃保温10min，最后16℃保存。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测正确后加消化酶(Dpn I)消化模板，37℃下消化1h，将消化后的产物转入感受态大肠杆菌BL21，在含浓度为50mg/L的卡那霉素的LB固体培养基上过夜培养，挑取阳性克隆接入LB液体培养基中培养10h后，提取质粒送样测序，测序正确即获得可表达突变体的重组大肠杆菌，即制备得到重组大肠杆菌：E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-T599H/N600S/Y601G，E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-T599D/N600D/Y601H，E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-T599S/N600H/Y601S，E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-T599R/N600S/Y601D，E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-T599S/N600D/Y601G。

2、突变体的表达

分别将步骤1制备得到的含有突变体基因的重组大肠杆菌、及实施例1制备得到的野生型菌株E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-cgt接入LB液体培养基(含卡那霉素，50mg/L)，于37℃培养10h，制备得到种子液；

将所得种子液按1％(v/v)的接种量接入TB液体培养基(含卡那霉素，50mg/L)中，37℃摇床培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，加终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达，温度为16℃，发酵培养18h后，制备得到发酵液；

将制备得到的发酵液离心收菌，4℃、8000r/min离心10min，倒掉上清液，剩余的沉淀用磷酸盐缓冲液(pH 6.0，50mM)重悬后进行超声破碎，300W破碎15min，将破碎液于4℃，8000r/min离心30min，所得上清液，即为含有突变体的粗酶液，即得到含有野生型cgt的粗酶液、含有T599H/N600S/Y601G的粗酶液，含有T599D/N600D/Y601H的粗酶液，含有T599S/N600H/Y601S的粗酶液，含有T599R/N600S/Y601D的粗酶液，含有T599S/N600D/Y601G的粗酶液。

分别将上述突变体粗酶液和野生酶粗酶液进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，在74.01kDa(Marker的第三条带大小为70kDa)处有相应的条带，证明蛋白表达成功。

3、突变体酶和野生型酶的纯化

分别将上述粗酶液过膜处理，进行Ni柱亲和层析纯化。先用缓冲液A(含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4)平衡Ni柱，待平衡后进行蛋白样品上样，多次上样使之完全吸附后，依次用不同浓度(20～500mM)的咪唑溶液进行梯度洗脱并收集流穿，结束后配置10％的蛋白胶检测目的蛋白，合并含有目的蛋白的咪唑溶液，并用超滤管及pH 6.0的磷酸缓冲液进行浓缩置换，最后将获得的蛋白样品进行分装，并用液氮速冻，于-80℃保藏备用。

分别制备得到含有野生型cgt的纯酶液、含有T599D/N600D/Y601H的纯酶液、含有T599H/N600S/Y601G的纯酶液、含有T599S/N600H/Y601S的纯酶液、含有T599R/N600S/Y601D的纯酶液、含有T599S/N600D/Y601G的纯酶液。

实施例3：环糊精葡萄糖基转移酶的有机溶剂耐受性检测

在本发明的实施方案中，环糊精葡萄糖基转移酶的有机溶剂耐受性可以通过测定其在不同浓度的有机溶剂中孵育一定时间后的残余酶活进行分析。具体步骤如下：

1、环糊精葡萄糖基转移酶的有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)耐受性检测

将二甲基亚砜(DMSO)的浓度分别选用0％，10％，20％(v/v)。孵育时间控制在1h，利用甲基橙法(为方便检测，对甲基橙法进行了适当改进)对获得的纯酶进行测活。

具体方法如下：

(1)分别将实施例2制备得到的纯酶液稀释至酶活为0.01-0.02mg/mL后，取100μL，加入到装有100μL含DMSO的磷酸缓冲液(50mM，pH 6.0)中，其中，含DMSO的磷酸缓冲液中DMSO的初始体积分数分别为0％，20％，40％；

(2)配制麦芽糊精溶液：用50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)，将麦芽糊精配制成浓度为40g·L^-1的麦芽糊精溶液；

配制甲基橙溶液：用50mM磷酸缓冲液将甲基橙配制成浓度为0.1mM甲基橙溶液。

(3)分别将步骤(1)得到的体系于4℃孵育1h后，加入50μL步骤(2)制备得到的麦芽糊精溶液，在40℃下反应10min后，立即加入250μL盐酸(1.0M)终止反应，再加入150μL步骤(2)制备得到的甲基橙溶液后，室温静置20min，在505nm下测定吸光度。

以0％(v/v)的DMSO组中测得的酶活为原始活力，在10％(v/v)和20％(v/v)的DMSO中孵育后测得的野生型WT和突变体的残余活力及相对活力列于表2。

表2野生型WT与突变体的残余活力及相对活力比较

从表4可以看出：相比于WT，突变体T599D/N600D/Y601H的有机溶剂耐受性有所提高，在10％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力提高了23.1％左右；在20％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力提高了15.6％左右。

相比于WT，突变体T599H/N600S/Y601G的有机溶剂耐受性也有所提升，在10％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力提高了17.8％左右；在20％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力提高了10.9％左右。

但突变体T599S/N600H/Y601S，T599S/N600D/Y601G和T599R/N600S/Y601D相比于WT在10％(v/v)和20％(v/v)DMSO中孵育后的活力均下降。相比于WT，突变体T599S/N600H/Y601S在10％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力下降11.4％左右；在20％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力下降了18.7％左右；相比于WT，突变体T599R/N600S/Y601D在10％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力虽只下降5.7％左右；但在20％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力下降了14.2％左右；相比于WT，突变体T599S/N600D/Y601G在10％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力下降19.2％左右；在20％(v/v)的DMSO中孵育后的残余活力下降了17.2％左右。

2、环糊精葡萄糖基转移酶的有机溶剂乙醇耐受性检测

将乙醇的浓度分别选用0％，5％，10％(v/v)。孵育时间控制在1h，利用甲基橙法(为方便检测，对甲基橙法进行了适当改进)对获得的纯酶进行测活。

具体方法如下：

(1)分别将实施例2制备得到的纯酶液稀释至酶活为0.01-0.02mg/mL后，取100μL，加入到装有100μL含乙醇的磷酸缓冲液(50mM，pH 6.0)中，其中，含乙醇的磷酸缓冲液中乙醇的体积分数分别为0％，10％，20％；

以0％(v/v)的乙醇组中测得的酶活为原始活力，在5％(v/v)和10％(v/v)的乙醇中孵育后测得的野生型WT和突变体的残余活力及相对活力列于表3。

表3野生型WT与突变体的残余活力及相对活力比较

从上表可以看出：WT在5％(v/v)的乙醇中孵育1h后的残余活力剩38.6％，在10％(v/v)的乙醇中孵育后的残余活力仅剩21.7％。

相比于WT，突变体T599D/N600D/Y601H及T599H/N600S/Y601G在5％(v/v)的乙醇中孵育1h后的残余活力分别提高了14.8％和9.0％左右；在10％(v/v)的乙醇中孵育后的残余活力分别提高了10.4％和7.7％左右。

此外，突变体T599S/N600H/Y601S，T599R/N600S/Y601D及T599S/N600D/Y601G相较于WT在5％(v/v)的乙醇中孵育后的残余活力分别降低了14.9％，7.4％及10.7％左右；在10％(v/v)的乙醇中孵育后，T599S/N600H/Y601S已失活，T599R/N600S/Y601D及T599S/N600D/Y601G的残余活力分别降低了6.5％和13.4％左右。

实施例4：对染料木素的糖基化应用

分别将实施例2制备得到的突变体T599D/N600D/Y601H、T599H/N600S/Y601G、T599R/N600S/Y601D、T599S/N600D/Y601G纯酶液以及野生型WT的纯酶液，以可溶性淀粉为糖基供体，以染料木素为糖基受体进行糖基化反应。

具体步骤如下：

(1)用磷酸缓冲液(pH 6.0，50mM)配制浓度为40g/L的可溶性淀粉溶液；

(2)用DMSO溶液溶解染料木素，得到染料木素溶液，浓度为7.5g/L。

(3)按照可溶性淀粉溶液：染料木素溶液：纯酶液(v:v:v)＝6：2：2的比例进行混合(加酶量控制在0.15～0.2U/mL)，在40℃摇床中反应16～18h后加热终止反应。

对样品进行离心过膜处理后进行高效液相色谱(HPLC)分析，具体结果如表4所示；经检测，突变体T599D/N600D/Y601H和T599H/N600S/Y601G对染料木素的糖基化效率均比WT高，且生成的长链产物(主要为四糖基、五糖基及六糖基染料木素)占比也有所提高，而其余两个突变体较WT对于染料木素的糖基化生产差异不大。

表4野生型WT与突变体对染料木素的糖基化效率比较

由上表可知：突变体T599D/N600D/Y601H和T599H/N600S/Y601G对染料木素的转糖基效率与野生型WT差不多，但长链糖基化产物(四、五、六糖基化染料木素)占总产物的比例明显提高，达到了野生型的2.5倍和2.1倍。

而T599R/N600S/Y601D、T599S/N600D/Y601G的转化率以及产物特异性与WT差别不大。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法

<130> BAA211294A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 2

<211> 2061

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaccggaca cctcagtgga caataaagtt aacttcagca ccgatgttat ctaccagatc 60

gtcacggacc gttttgcgga tggtgaccgc accaacaatc cggcaggcga tgctttcagc 120

ggtgaccgtt ctaatctgaa actgtatttt ggcggtgatt ggcagggcat tatcgataaa 180

attaacgacg gttacctgac cggcatgggt gtgacggcgc tgtggatcag ccaaccggtg 240

gaaaacatca cctcagttat caaatactcg ggcgtcaaca atacgtctta tcatggttac 300

tgggcccgtg attttaaaca gaccaacgac gcgtttggcg atttcgccga ctttcaaaat 360

ctgattgata ccgcacatgc tcacaacatt aaagtggtta tcgatttcgc cccgaaccac 420

acctctccgg cagatcgcga caatccgggc tttgcagaaa atggtgctct gtatgataac 480

ggctcactgc tgggtgcata ctcgaatgac accgctggcc tgttccatca caacggcggt 540

acggatttta gtaccattga agacggtatc tataaaaatc tgtacgatct ggctgacatc 600

aaccataaca ataacgcgat ggatgcctat ttcaaatcag caattgacct gtggctgggc 660

atgggtgttg atggcatccg ctttgacgcg gtcaaacaca tgccgttcgg ttggcagaaa 720

tcgtttgtga gcagcattta tggcggtgat cacccggttt ttaccttcgg cgaatggtat 780

ctgggtgctg atcagacgga tggcgacaat atcaaatttg cgaacgaatc tggtatgaat 840

ctgctggatt ttgaatatgc acaagaagtc cgtgaagtgt ttcgcgataa aacggaaacc 900

atgaaagacc tgtacgaagt gctggcctca accgaatcgc agtatgatta cattaataac 960

atggtgacct tcatcgacaa tcacgatatg gaccgttttc aggttgcggg ctcaggtacg 1020

cgcgccaccg aacaagcgct ggcactgacg ctgacctcgc gtggcgttcc ggcgatttat 1080

tacggcaccg aacagtatat gacgggcgat ggtgacccga ataaccgcgc catgatgacg 1140

agtttcaata ccggcaccac ggcatataaa gtgattcaag cactggctcc gctgcgtaaa 1200

tccaacccgg caatcgccta cggcaccacc accgaacgtt gggtgaataa cgatgttctg 1260

attatcgaac gcaaatttgg tagttccgcg gccctggtcg ccattaatcg caactcatcg 1320

gcagcttatc cgatcagtgg tctgctgagc agcctgccag cgggcaccta ctccgatgtg 1380

ctgaatggcc tgctgaatgg taacagcatt accgtgggct ctggcggtgc ggttacgaac 1440

tttaccctgg cagcgggcgg caccgcagtt tggcagtata cggctccgga aaccagcccg 1500

gcgatcggta atgtcggtcc gacgatgggc caaccgggta acattgtgac gatcgatggt 1560

cgtggtttcg gcggtacggc tggcaccgtg tactttggta cgaccgcggt caccggcagt 1620

ggtattgtgt cctgggaaga tacgcagatt aaagcggtca tcccgaaagt ggcagctggc 1680

aaaaccggtg tcagcgtgaa aacgagttcc ggcaccgcca gtaatacgtt caaatccttt 1740

aacgttctga ccggtgatca ggttacggtc cgctttctgg tcaaccaagc gaataccaac 1800

tatggcacga atgtttacct ggtcggcaac gcggccgaac tgggttcctg ggacccgaat 1860

aaagccattg gtccgatgta taaccaggtt atcgcaaaat acccgagctg gtattacgat 1920

gtgagcgttc cggcgggcac caaactggac ttcaaattca ttaaaaaagg cggtggcacg 1980

gtgacctggg aaggtggcgg taaccatacc tacacgaccc cggcgagcgg cgttggcacg 2040

gtgacggtgg attggcaaaa t 2061

Claims

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为组氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为丝氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为甘氨酸得到；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为天冬氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为组氨酸得到。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组载体。

4.表达权利要求1所述突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述重组载体的重组细胞。

5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

6.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶对有机溶剂的耐受性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为组氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为丝氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为甘氨酸；

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为：二甲基亚砜（DMSO）和/或乙醇。

8.一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述方法为，向含有可溶性淀粉和染料木素的反应体系中加入权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，获得长链糖基化染料木素。

9.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4或5所述的重组细胞在生产长链糖基化染料木素中的应用。