CN109777788B

CN109777788B - 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN109777788B
Application number: CN201910207909.7A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 张君轩; 付妍; 刘佳; 宋伟; 张灿
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN109777788A

Abstract

本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明在SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶氨基酸序列的基础上，将第47位的氨基酸残基M突变为V，且将第109位的氨基酸残基N突变为I，得到了一种亮氨酸脱氢酶突变体(突变点为M47V，N109I)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达该突变体的重组菌E.coli BL21‑pET28a‑BtLDH007单位菌体的亮氨酸脱氢酶酶活达到170.9U/g；以2‑酮丁酸为底物生产L‑2‑氨基丁酸的产量最高达到77.6g/L，转化率为96.0％。

Description

一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-2-氨基丁酸是一种非天然手性氨基酸，分子式为C₄H₉NO₂。L-2-氨基丁酸具有抑制人体神经信息传递、加强葡萄糖磷酸酯酶的活性和促进脑细胞代谢的作用。同时L-2-氨基丁酸也是一种重要的化工原料和医药中间体，已广泛用于药物的合成，如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成。

目前，L-2-氨基丁酸的合成方法包括化学法和生物法。化学法反应条件苛刻、易生成副产物，成本较高，不宜进行工业生产，同时大量使用有机溶剂易造成环境污染。生物法合成L-2-氨基丁酸具有立体选择性高、反应条件温和、环境污染少等特点，具有广阔的工业化开发前景。生物法又包括微生物发酵法和酶催化转化法。微生物发酵法专属性较强，条件温和，环境污染少，但发酵过程会产生与目标产物结构相似的副产物，反应产物成分复杂，后续分离困难。酶催化转化法其中一种是利用亮氨酸脱氢酶以2-酮丁酸为底物，合成L-2-氨基丁酸，这是一种高选择性反应，可达到定向转化的目的。但酶转化工艺多面临着酶活力低、产物浓度低、下游纯化成本高、工程放大难等问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第47位的氨基酸残基M突变为V，且将第109位的氨基酸残基N突变为I。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌，是以pET28a为表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种制备L-2-氨基丁酸的方法，所述方法是以所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，在NADH辅酶再生系统中以2-酮丁酸为底物制备L-2-氨基丁酸。

在本发明的一种实施方式中，所述辅酶再生体系是以甲酸铵为底物，通过甲酸脱氢酶将NAD⁺转化为NADH的辅酶再生系统。

在本发明的一种实施方式中，所述制备是用所述基因工程菌的湿细胞进行转化。

在本发明的一种实施方式中，所述制备是使用pH为7.0～8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液作为缓冲体系，湿细胞添加量15～20g/L，2-酮丁酸添加75～80g/L，甲酸铵浓度为20～40g/L，NAD⁺浓度为0.4～1.0g/L，甲酸脱氢酶酶活为1000～1500U/L，转化温度30～40℃，转化8～12h。

本发明还提供所述突变体或所述基因工程菌在医药生产、化工领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明将来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的亮氨酸脱氢酶进行蛋白质工程改造后，得到了亮氨酸脱氢酶突变体BtLDH007(突变点为M47V，N109I)。表达该突变体的重组菌E.coli BL21-pET28a-BtLDH007单位菌体的酶活达到170.9U/g，与表达原始酶的E.coli BL21-pET28a-BtLDH相比，酶活增加38.8％；将重组菌E.coli BL21-pET28a-BtLDH007作为细胞催化剂用于转化2-酮丁酸生产L-2-氨基丁酸，L-2-氨基丁酸产量最高达到77.6g/L，转化率为96.0％，生产强度显著增加，下游纯化简易，极大的降低了生产成本，能够满足工业化生产需求。

附图说明

图1：不同pH对L-2-氨基丁酸生产的影响。

图2：L-2-氨基丁酸转化过程曲线；其中■：2-酮丁酸的浓度；●：L-2-氨基丁酸的浓度；▲：转化率。

具体实施方式

样品预处理：取转化液12000rpm离心10min收集上清液，并以L-2-氨基丁酸作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法检测。

高效液相色谱法测定L-2-氨基丁酸的含量：以邻苯二甲醛(OPA)为衍生化试剂，色谱柱:ZORBAX SB-C18，流动相A为10mmol/L KH₂PO₄(4mol/L KOH调节pH 5.3)，流动相B为乙腈：甲醇：A相＝5:3:1(冰醋酸调pH 5.3)梯度洗脱，流速1mL/min，荧光检测器，检测波长330，460nm，柱温30℃。

亮氨酸脱氢酶酶活检测：分别取200μL终浓度为10g/L的亮氨酸脱氢酶产生菌的菌液和酶活为1000U/L的甲酸脱氢酶液加入1600μL底物(底物体系：采用50mmol/L pH8.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液溶解0.6g/L NAD⁺、20mmol/L的2-酮丁酸、40mmol/L的甲酸铵)，于30℃恒温水浴反应15min，然后煮沸以终止反应。样品稀释10倍，采用HPLC-OPA柱前衍生法测量L-2-氨基丁酸生成量。1U酶活单位定义为1min内L-2-氨基丁酸增加1μmol所需的酶量。

实施例1：工程菌株的构建

将苏云金芽孢杆菌(本实验室保藏菌株Bacillus thuringiensis serovarkurstaki YBT-1520)接种于LB培养基，37℃培养12h，离心收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取苏云金芽孢杆菌基因组DNA。使用引物BtLeuDH-1和BtLeuDH-2以苏云金芽孢杆菌基因组DNA为模板克隆得到苏云金芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶基因BtLeuDH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

用限制性内切酶BamHI和XhoI将BtLeuDH基因和表达载体pET28a在37℃酶切4h后，用T4连接酶连接；将构建好的重组质粒pET28a-BtLDH导入E.coli BL21(DE3)，在含有卡那霉素(Kan)的LB平板中培养过夜，得到工程菌E.coli BL21-pET28a-BtLDH。

表1引物序列表

实施例2：亮氨酸脱氢酶蛋白质工程改造

(1)突变文库的获得

易错PCR扩增BtLeuDH基因片段，易错PCR反应体系：50μL体系中含1×Taq DNA聚合酶缓冲液、0.2mmol/L dATP和dGTP、1mmol/L dCTP和dTTP、2～5mmol/L Mg²⁺、0.2～0.4mmol/L Mn²⁺、2pmol/μL上下游引物(参见实施例1中引物BtLeuDH-1和BtLeuDH-2)，以实施例1中的质粒pET28a-BtLDH为模板。易错PCR循环条件：94℃1.5min，60℃1min，72℃1min，29个循环；72℃延伸10min。其中，通过调整Mg²⁺和Mn²⁺的浓度，可以得到不同突变频率的文库。将纯化后的突变BtLeuDH基因片段用BamHI和XhoI双酶切，与同样双酶切后的质粒pET28a连接，获得突变重组质粒。将含突变基因的重组质粒转化进入E.coli BL21(DE3)中，通过含有Kan抗性的LB平板筛选获得突变文库。

(2)筛选高效的突变体

从步骤(1)中得到的LB平板中挑选95个菌落并转移到每孔含有600μLLB培养基的96深孔板中37℃培养12～16h，其中每孔的LB培养基均含有终浓度为100mg/L的抗生素Kan，将菌体按照30％接种量，转接到一个新的96深孔板中，将菌落在37℃下在高通量摇床中800rpm震荡培养6小时，然后加入0.1mmol/L IPTG在25℃下培养12～16h诱导目标蛋白表达，使用离心机离心96深孔板，8000rpm离心10min，收集细胞沉淀。使用0.6mL 50mmol/LpH8.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液重新悬浮菌体，使用高通量超声破碎仪破碎96深孔板中的菌体，8000rpm离心30min获得粗酶液。取粗酶液0.5mL加入到24孔板中，然后加入0.5mL40g/L 2-酮丁酸，1mL1.0mmol/L NADH，反应体积为2.0mL，反应30min，使用酶标仪(Molecular Devices)检测NADH在340nm处吸光值变化，吸光值变化越快，表明反应速率越快。

利用上述高通量筛选方法，从900株突变文库中筛选获得活性最高的突变株E.coli BL21-pET28a-BtLDH007(突变点为M47V，N109I)，该亮氨酸脱氢酶突变体BtLDH007氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例3：亮氨酸脱氢酶突变体BtLDH007的酶活测定

种子培养基配方：LB培养基，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

发酵培养基配方：甘油8g/L，酵母粉8g/L，大豆蛋白胨10g/L，K₂HPO₄·12H₂O6.0g/L，KH₂PO₄ 10.0g/L。

补料培养基的成分：甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O 10g/L。

辅酶再生体系：由于亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸过程中需要辅酶NADH，而该辅酶价格昂贵，因此偶联辅酶NADH再生体系以提高NADH的循环次数，从而节约成本并提高转化效率。该体系组成为：甲酸铵浓度为20g/L，NAD⁺浓度为0.6g/L，甲酸脱氢酶酶活为1000U/L，以甲酸铵为底物，通过甲酸脱氢酶将NAD⁺转化为NADH实现辅酶再生。

将E.coli BL21-pET28a-BtLDH和E.coli BL21-pET28a-BtLDH007按照5％接种量接种于发酵培养基，空气量2.0vvm，温度37℃，搅拌速率500rpm培养至OD₆₀₀为8.0，将温度下降至25℃，加入10g/L乳糖诱导亮氨酸脱氨酶的表达，当OD₆₀₀达到12.0～14.0时，溶氧突然上升，此时开始补料，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在30～45％，发酵培养22～24h结束发酵。

离心收集发酵菌体，分别获得菌株E.coli BL21-pET28a-BtLDH和E.coli BL21-pET28a-BtLDH007湿细胞。在NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH8.0)中，分别加入E.coli BL21-pET28a-BtLDH和E.coli BL21-pET28a-BtLDH007湿细胞15g/L，底物2-酮丁酸75g/L，在NADH辅酶再生体系中，30℃下转化至L-2-氨基丁酸浓度不再增加，结果如表1所示，E.coliBL21-pET28a-BtLDH007单位菌体的酶活达到170.9U/g，与产原始酶的E.coli BL21-pET28a-BtLD H相比，酶活增加38.8％；L-2-氨基丁酸产量达到72.7g/L；相同菌体添加量下，生产强度增加了66.5％。

表2野生型和突变体转化2-酮丁酸生产L-2-氨基丁酸

实施例4：pH对全细胞催化的影响

将实施例3中获得的E.coli BL21-pET28a-BtLDH007湿菌体，作为细胞催化剂用于转化2-酮丁酸生产L-2-氨基丁酸。菌体添加量为15g/L，2-酮丁酸浓度为75g/L，溶解于0.02mol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)中，在250mL三角瓶中转化12h。实验结果如表2和图1所示，在pH7.0～8.0条件下，L-2-氨基丁酸产量在72.0～74.0g/L。当pH小于7.0或者大于8.0时，L-2-氨基丁酸的产量均出现下降。

表3 pH对全细胞E.coli BL21-pET28a-BtLDH007催化的影响

实施例5：2-酮丁酸生产L-2-氨基丁酸的规模化制备

将实施例3中获得的E.coli BL21-pET28a-BtLDH007湿菌体，作为细胞催化剂用于转化2-酮丁酸生产L-2-氨基丁酸。在1L转化体系中，用0.015～0.02mol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 8.0)溶解2-酮丁酸80g/L，湿菌体添加20g/L，甲酸铵浓度为10g/L，NAD⁺浓度为1.0g/L，甲酸脱氢酶酶活为1500U/L，4mol/L NaOH溶液控制pH 8.0、温度30℃、通气3vvm、搅拌转速300rpm。转化过程曲线如图2所示。12h内底物2-酮丁酸急剧消耗，产物大量积累。12h时，L-2-氨基丁酸产量最高达到77.6g/L，转化率为96.0％。

表4反应时间对全细胞E.coli BL21-pET28a-BtLDH007催化的影响

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln

1 5 10 15

Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala

20 25 30

Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp

35 40 45

Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala

50 55 60

Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly

65 70 75 80

Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala

85 90 95

Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr

100 105 110

Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile

115 120 125

His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser

130 135 140

Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys

165 170 175

Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys

180 185 190

His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys

195 200 205

Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Ser Ala Val Glu

210 215 220

Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala

225 230 235 240

Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys

245 250 255

Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asn Arg His Gly

260 265 270

Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile

275 280 285

Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn

290 295 300

Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala

305 310 315 320

Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala

325 330 335

Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg

340 345 350

Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile Ser Arg Arg

355 360 365

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacattag aaatcttcga atacttagaa aaatatgatt atgagcaagt agtattttgt 60

caagataaag aatctggttt aaaagcaatt attgcaattc atgatacaac acttggaccg 120

gctcttggtg gaacaagaat gtggacatat gattctgaag aagcggcgat tgaagatgca 180

ttgcgtcttg caaaagggat gacatataaa aacgcagcag ctggtttaaa cttaggtggt 240

gcgaaaacag taattatcgg tgatcctcgt aaagataaga gcgaagcaat gttccgtgca 300

ctaggacgtt atatccaagg actaaacgga cgttacatta cagctgaaga tgttggtaca 360

acagtagatg atatggatat tatccatgaa gaaactgact ttgtaacagg tatctcacca 420

tcattcggtt cttctggtaa cccatctcca gtaactgcat acggtgttta ccgtggtatg 480

aaagcagctg caaaagaagc tttcggtact gacaatttag aaggaaaagt aattgctgtt 540

caaggcgttg gtaacgtagc atatcaccta tgcaaacatt tacacgctga aggagcaaaa 600

ttaatcgtta cagatattaa taaagaagct gtacaacgtg ctgtagaaga attcggtgca 660

tcagcagttg aaccaaatga aatttatggt gttgaatgcg atatttacgc accatgtgca 720

ttaggcgcaa cagttaatga tgaaactatt ccacaactta aagcaaaagt aatcgcaggt 780

tctgcaaata accaattaaa agaaaatcgt cacggtgaca tcattcatga aatgggtatt 840

gtatacgcac cagattatgt aattaatgca ggtggcgtaa ttaacgtagc agacgaatta 900

tatggataca atagagaacg tgcactaaaa cgtgttgagt ctatttatga cacaattgca 960

aaagtaatcg aaatttcaaa acgcgatggc atagcaactt atgtagcggc agatcgtcta 1020

gctgaagagc gcattgcaag cttgaaaaat tctcgtagca cttacttacg caacggtcac 1080

gatattatta gccgtcgcta a 1101

<210> 3

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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1 5 10 15

Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala

20 25 30

Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Val Trp

35 40 45

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Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly

65 70 75 80

Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala

85 90 95

Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Ile Gly Arg Tyr

100 105 110

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115 120 125

His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser

130 135 140

Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys

165 170 175

Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys

180 185 190

His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys

195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile

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Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala

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Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala

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Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg

340 345 350

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355 360 365

<210> 4

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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gctcttggtg gaacaagagt gtggacatat gattctgaag aagcggcgat tgaagatgca 180

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<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccaagcttt tagcgacggc taataatatc gtg 33

Claims

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第47位的氨基酸残基M突变为V，且将第109位的氨基酸残基N突变为I。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。

4.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。

6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以pET28a为表达载体。

7.一种制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，在NADH辅酶再生系统中以2-酮丁酸为底物制备L-2-氨基丁酸。

8.根据权利要求7所述的制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述辅酶再生体系是以甲酸铵为底物，通过甲酸脱氢酶将NAD⁺转化为NADH的辅酶再生系统。

9.根据权利要求7所述的制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述制备是以NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液作为缓冲体系。

10.权利要求1所述的突变体或权利要求4所述的基因工程菌在医药生产、化工领域的应用。