CN111676203B

CN111676203B - 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN111676203B
Application number: CN202010601081.6A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 徐美娟; 陈佳杰; 张显; 杨套伟; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: CN111676203A

Abstract

本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，第72位氨基酸由赖氨酸突变为了丙氨酸，本发明首次对亮氨酸脱氢酶底物通道内碱性氨基酸残基进行定点突变，改造了酶可能底物结合位点附近的结构及环境，获得了更加高效制备L‑2‑氨基丁酸的亮氨酸脱氢酶。本发明提供的底物耐受性提高的亮氨酸脱氢酶突变体亮氨酸脱氢酶突变体K72A能耐受4.5g/L 2‑酮丁酸且对于底物2‑酮丁酸的催化活力提高了15％。

Description

一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

L-2-氨基丁酸在食品、农业、生物医药等方面有着很大的应用价值，如它是用于治疗抗癫痫药物左已拉西坦、布瓦西坦的直接前体，也是用于合成治疗结核病的药物盐酸乙胺丁醇的重要手性前体。亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase,LeuDH，EC 1.4.1.9)属于氧化还原酶家族，已被广泛用于非天然氨基酸的制备，如L-2-氨基丁酸(Tao,R.,Jiang,Y.,Zhu,F.et al.A one-pot system for production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine by L-threonine deaminase and a NADH-regeneration system based on L-leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase.Biotechnol Lett 36,835–841(2014))，L-叔亮氨酸(Li J,Pan J,Zhang J,et al.Stereoselective synthesis of L-tert-leucine by a newly cloned leucine dehydrogenase from Exiguobacteriumsibiricum[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic,2014,105(7):11-17)等。并且已有较多文献对亮氨酸脱氢酶偶联辅酶循环及苏氨酸脱氨酶的一锅法制备进行研究优化，但是，在其制备非天然氨基酸如L-2-氨基丁酸的过程中存在亮氨酸脱氢酶的底物不耐受性的缺点，因此，急需找到一种在L-2-氨基丁酸生产过程中对底物耐受性强的亮氨酸脱氢酶。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，第72位氨基酸由赖氨酸突变为了丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶来源于西伯利亚杆菌Exiguobacterium sibiricum。

本发明还提供了一种编码上述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-28a质粒。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α。

本发明还提供了产上述亮氨酸脱氢酶突变体的制备方法，所述方法为将上述基因工程菌的种子液接入到培养基中进行发酵，发酵结束后，收集菌液，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述基因工程菌的种子液按照将1-5％接种量接入到LB液体培养基中，于35-39℃，200-220r/min培养至菌密度OD达到0.5-0.8后，加入IPTG诱导剂于16-25℃，诱导10-14h后收集菌液，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。

本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体或上述基因或上重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法在制备L-2-氨基丁酸或含L-2-氨基丁酸的产品中的应用。

本发明还提供了一种制备L-2-氨基丁酸的方法，所述方法为以权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体或权利要求6或7所述宿主细胞为催化剂，以2-酮丁酸为底物，催化制备L-2-氨基丁酸。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种底物耐受性提高的亮氨酸脱氢酶突变体K72A，在同等蛋白浓度下，相较于野生型亮氨酸脱氢酶仅能耐受浓度为3.75g/L的2-酮丁酸，亮氨酸脱氢酶突变体K72A能耐受浓度为4.5g/L的2-酮丁酸。

(2)本发明提供了一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体K72A，在同等蛋白浓度下，亮氨酸脱氢酶突变体K72A对于底物2-酮丁酸的催化活力较野生型亮氨酸脱氢酶提高了15％。

附图说明

图1：亮氨酸脱氢酶突变体K72A、Q361N、R69A、N84L凝胶电泳SDS-PAGE分析；其中：M:marker；C:BL21/28a破碎上清对照；1:BL21/28a-EsLDH-K72A破碎上清；2：BL21/28a-EsLDH-K72A破碎沉淀；3：BL21/28a-EsLDH-Q361N破碎上清；4：BL21/28a-EsLDH-Q361N破碎沉淀；5：BL21/28a-EsLDH-R69A破碎上清；6：BL21/28a-EsLDH-R69A破碎沉淀；7：BL21/28a-EsLDH-N84L破碎上清；8：BL21/28a-EsLDH-N84L破碎沉淀。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET-28a(+)质粒购自Novagen公司。(上述菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)；下述实施例中涉及的PBS缓冲液粉末、2-酮丁酸、L-2-氨基丁酸、β-NADH购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉1.5％(m/v)。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

亮氨酸脱氢酶酶活的测定方法：

在浓度为900mM氯化铵-氨水缓冲液(pH 9.5)中加入0.3mg/mL NADH、0.75mg/mL底物2-酮丁酸，获得反应体系；在1600μl反应体系中加入2μL酶液启动反应，30℃反应3分钟，每隔30s测定340nm吸光度的值并记录数据，根据1min内反应液在340nm吸光值差值，计算出亮氨酸脱氢酶酶活；

其中，亮氨酸脱氢酶酶活(U/mL)＝吸光度变化值反应总体系(μL)/(酶液量(μL)×摩尔消光系数(6.22×10^-3mol/(L.cm^-2)×比色光径)。

酶活单位(U)的定义为：每分钟氧化1μmol NADH得到1μmol NAD⁺所需的酶量为1U。

亮氨酸脱氢酶比酶活的测定方法：

测定纯化后的亮氨酸脱氢酶的酶活(U/mL)，并且，采用Bradford法测定纯化后的亮氨酸脱氢酶的蛋白含量(mg/mL)，以计算亮氨酸脱氢酶的比酶活；

其中，亮氨酸脱氢酶比酶活的计算公式如下：

亮氨酸脱氢酶比酶活(U/mg)＝纯化后的亮氨酸脱氢酶的酶活(U/mL)/纯化后的亮氨酸脱氢酶的蛋白含量(mg/mL)。(Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.1976.Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248-254.”中)。

比酶活定义：每毫克蛋白所具有的酶活(U/mg)。

实施例1：亮氨酸脱氢酶野生酶的表达

(1)合成得到编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶。

(2)基因表达载体的构建及转化

将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶和pET-28a载体用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，酶切后产物用Solution I连接并将连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取4个转化子提质粒BamH I和Hind III进行酶切验证，得到重组大肠杆菌BL21/pET-28a-LeuDH。

实施例2：亮氨酸脱氢酶突变体的制备

具体步骤如下：

(1)亮氨酸脱氢酶突变体的制备

采用全质粒反向PCR方法，以含有突变点的寡核苷酸片段为同源臂设计上下游引物，以实施例1获得的重组质粒pET-28a-LeuDH为模板进行定点突变，获得携带编码亮氨酸脱氢酶突变体K72A、Q361N、R69A、N84L的基因的重组质粒pET-28a-LeuDH1～pET-28a-LeuDH4；

其中，突变K72A是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶的第72位氨基酸由赖氨酸突变为了天冬酰胺得到的，所用引物如下：

K72A-F：5’-CCGTCTGGCGGCGGGCATGACCTACAAGAATGCCGCGG-3’(SEQ ID NO.7)

K72A-R：5’-TCATGCCCGCCGCCAGACGGAGCGCGTCAATCAGCGC-3’(SEQ ID NO.8)

突变Q361N是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶的第361位氨基酸由谷氨酰胺突变为甘氨酸得到的，所用引物如下：

Q361N-F：5’-CCCGCAGTAACTTTCTGCGTCGCGATAAGAACATTCTGGGC-3’(SEQ ID NO.9)

Q361N-R：5’-ACGCAGAAAGTTACTGCGGGCGCTACCCATCGTGGCAA-3’(SEQ ID NO.10)

突变R69A是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶的第69位氨基酸由精氨酸突变为丙氨酸得到的，所用引物如下：

R69A-F：5’-CGCGCTCGCGCTGGCGAAAGGCATGACCTACAAGAATGCCGC-3’(SEQ IDNO.11)；

R69A-R：5’-CTTTCGCCAGCGCGAGCGCGTCAATCAGCGCCTCTTCATCACTC-3’(SEQ IDNO.12)；

突变N84L是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶的第84位氨基酸由天冬酰胺突变为亮氨酸得到的，所用引物如下：

N84L-F：5’-CCGGCCTCCTCCTCGGTGGCGGTAAAGCCGTGATTATCGGCG-3’(SEQ IDNO.13)；

N84L-R：5’-GCCACCGAGGAGGAGGCCGGCCGCGGCATTCTTGTAGG-3’(SEQ ID NO.14)；

PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.5μL，2×Phanta Max Master Mix聚合酶10μL，灭菌ddH₂O 8μL，总反应体系20μL。PCR反应条件：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，1min，30个循环；72℃充分延伸，10min。

PCR产物经过凝胶电泳检验，然后在15μL的PCR产物中加入1μL的Dpn I限制性内切酶对模板质粒进行消化，于25℃过夜或者37℃下温育3-4h。

将上述经过消化处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-LeuDH1～pET-28a-LeuDH4，涂布于含卡那霉素的平板上，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有亮氨酸脱氢酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。经测序验证，在突变成功的菌液种加入无菌甘油并于-40℃冰箱保藏。

最终获得亮氨酸脱氢酶突变体K72A、Q361N、R69A、N84L，核苷酸序列测序结果分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示，相应编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示。

实施例3：亮氨酸脱氢酶突变体的表达

将实施例1和实施例2制备的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-LeuDH以及重组大肠杆菌BL21/pET-28a-LeuDH1～pET-28a-LeuDH4分别接种在含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min培养过夜后，按1％接种量接入到转接于50mL的LB培养基中，培养温度37℃，转速180r/min，培养至OD600达到0.5-0.8后加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，诱导温度降低为25℃，诱导8-10h后，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，取收集的湿菌体细胞，用5mL的pH 7.5的50mM PBS缓冲液洗涤二次，重悬于5mL的pH 7.5的50mM PBS缓冲液中，振荡摇匀后置超声波下破碎，破1s，停3s，总时长15min。细胞破碎液于12000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清即获得野生型亮氨酸脱氢酶以及亮氨酸脱氢酶突变体K72A、Q361N、R69A、N84L的粗酶液。

将得到的含有亮氨酸脱氢酶突变体K72A、Q361N、R69A、N84L的粗酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，分析结果见图1。

由图1可知，突变体K72A、Q361N、R69A、N84L在41kDa附近均有很明显的条带，表明这些突变体蛋白均正常表达。

实施例4：不同亮氨酸脱氢酶突变体的分离纯化

具体步骤如下：

分别将实施例3获得的野生型亮氨酸脱氢酶及含有亮氨酸脱氢酶突变体K72A、Q361N、R69A、N84L的粗酶液利用0.22μm滤膜过滤后用于酶的后续分离纯化；纯化柱为Ni-NTA柱，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液M₀(20mM Tris，500mM NaCl，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，以0.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液M₀除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液M₇₀₀(20mM Tris，500mM NaCl和700mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白，所得的纯酶液于-40℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，结果表明得到电泳纯的重组亮氨酸脱氢酶及其突变体。

实施例5：不同亮氨酸脱氢酶突变体的比酶活测定

具体步骤如下：

对实施例3获得的野生型、突变体K72A、突变体Q361N、突变体R69A、突变体N84L进行比酶活的检测，检测结果为：野生型的比酶活为168U·mg^-1，突变体K72A的比酶活为194U·mg^-1，突变体Q361N的比酶活为180U·mg^-1，R69A的比酶活为48U·mg^-1，N84L的比酶活为5U·mg^-1，可见，K72A的比酶活较野生型有了明显的改善。

实施例6：不同亮氨酸脱氢酶突变体的底物耐受性

将实施例3得到的野生型、突变体K72A、突变体Q361N纯酶进行以2-酮丁酸为底物进行底物耐受性测定，通过紫外分光光度计在340nm处检测NADH吸光值变化以计算亮氨酸脱氢酶在同等蛋白浓度、不同底物浓度下的酶活来间接反映其底物耐受性。

其中反应体系为：(1.6mL):0.3mg/mL NADH，分别以2mg/mL、2.5mg/mL、3.125mg/mL、3.75mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL的2-酮丁酸，100mM的PB缓冲液(pH 7.5),100mM铵根离子和适量的纯酶。

结果如表1所示：

表1不同亮氨酸脱氢酶突变体的底物耐受性

由表1可知，对于底物2-酮丁酸，亮氨酸脱氢酶野生型(WT)的耐受底物浓度是3.75mg/mL，突变体K72A的耐受底物浓度有所提高为4.5mg/mL，突变体Q361N耐受的底物浓度为3.125mg/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用

<130> BAA200450A

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtggaaa ccaatgtgga agcgcgcttc agcatctttg agaccatggc gatggaggac 60

tacgagcaag ttgtgttctg ccatgacaaa gttagcggtc tgaaagccat catcgcgatc 120

cacgatacga ccctcggtcc agcgctgggt ggcctccgca tgtggaacta cgcgagtgat 180

gaagaggcgc tgattgacgc gctccgtctg gcgaaaggca tgacctacaa gaatgccgcg 240

gccggcctca atctcggtgg cggtaaagcc gtgattatcg gcgatgccaa gacccagaag 300

agcgaagcgc tgttccgcgc ctttggtcgc tacgtgcaga gtctgaacgg ccgttacatc 360

accgccgagg acgtgaacac gacggtggcc gacatggact acatccacat ggaaaccgac 420

ttcgtgaccg gcgttagccc agcctttggc agcagcggca acccgagccc agttaccgcg 480

tacggcgtgt accgcggtat gaaagcggcc gccaaagaag tttacggcac ggatagtctg 540

ggcggtaaaa ccgtggcgat ccaaggcgtt ggcaatgttg cgttcaatct gtgccgccat 600

ctgcatgaag aaggcgcgaa gctgattgtg accgacatta accaagatgc gctgcgtcgc 660

gccgaagaag cctttggtgc cctcgtggtt ggcccggacg agatttacag cgtggacgcc 720

gacatttttg cgccatgcgc gctgggtgcc acgctgaatg atgaaaccat cccgcagctc 780

aaggtgaaga tcatcgcggg cgccgcgaac aaccagctca aagaggatcg tcatggcgac 840

atgctgcaag aacgcggcat tctctacacg ccggacttcg ttatcaacgc gggcggcgtg 900

atcaatgttg cggacgaact ggacggttac aaccgcgaac gcgccatgaa gaaagtggaa 960

ctggtttacg acgccgtggc caaggttatc gaaattgcga agcgtgacca cctcccaacc 1020

tatcgcgcgg ccgagaaaat ggcggaggaa cgcattgcca cgatgggtag cgcccgcagt 1080

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<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met

1 5 10 15

Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser

20 25 30

Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala

35 40 45

Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu

50 55 60

Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala

65 70 75 80

Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala

85 90 95

Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val

100 105 110

Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr

115 120 125

Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly

130 135 140

Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly

165 170 175

Thr Asp Ser Leu Gly Gly Lys Thr Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Asn

180 185 190

Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu

195 200 205

Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala

225 230 235 240

Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr

245 250 255

Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln

260 265 270

Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu

275 280 285

Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala

290 295 300

Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu

305 310 315 320

Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp

325 330 335

His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile

340 345 350

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355 360 365

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<212> PRT

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35 40 45

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Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu

275 280 285

Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala

290 295 300

Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu

305 310 315 320

Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp

325 330 335

His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile

340 345 350

Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Gln Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn

355 360 365

Ile Leu Gly Ser Arg Gly

370

<210> 5

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtggaaa ccaatgtgga agcgcgcttc agcatctttg agaccatggc gatggaggac 60

tacgagcaag ttgtgttctg ccatgacaaa gttagcggtc tgaaagccat catcgcgatc 120

cacgatacga ccctcggtcc agcgctgggt ggcctccgca tgtggaacta cgcgagtgat 180

gaagaggcgc tgattgacgc gctccgtctg gcgaaaggca tgacctacaa gaatgccgcg 240

gccggcctca atctcggtgg cggtaaagcc gtgattatcg gcgatgccaa gacccagaag 300

agcgaagcgc tgttccgcgc ctttggtcgc tacgtgcaga gtctgaacgg ccgttacatc 360

accgccgagg acgtgaacac gacggtggcc gacatggact acatccacat ggaaaccgac 420

ttcgtgaccg gcgttagccc agcctttggc agcagcggca acccgagccc agttaccgcg 480

tacggcgtgt accgcggtat gaaagcggcc gccaaagaag tttacggcac ggatagtctg 540

ggcggtaaaa ccgtggcgat ccaaggcgtt ggcaatgttg cgttcaatct gtgccgccat 600

ctgcatgaag aaggcgcgaa gctgattgtg accgacatta accaagatgc gctgcgtcgc 660

gccgaagaag cctttggtgc cctcgtggtt ggcccggacg agatttacag cgtggacgcc 720

gacatttttg cgccatgcgc gctgggtgcc acgctgaatg atgaaaccat cccgcagctc 780

aaggtgaaga tcatcgcggg cgccgcgaac aaccagctca aagaggatcg tcatggcgac 840

atgctgcaag aacgcggcat tctctacacg ccggacttcg ttatcaacgc gggcggcgtg 900

atcaatgttg cggacgaact ggacggttac aaccgcgaac gcgccatgaa gaaagtggaa 960

ctggtttacg acgccgtggc caaggttatc gaaattgcga agcgtgacca cctcccaacc 1020

tatcgcgcgg ccgagaaaat ggcggaggaa cgcattgcca cgatgggtag cgcccgcagt 1080

aactttctgc gtcgcgataa gaacattctg ggcagtcgcg gctaa 1125

<210> 6

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met

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Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala

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Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu

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Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala

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Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala

85 90 95

Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val

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Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr

115 120 125

Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly

130 135 140

Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly

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Thr Asp Ser Leu Gly Gly Lys Thr Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Asn

180 185 190

Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu

195 200 205

Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala

225 230 235 240

Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr

245 250 255

Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln

260 265 270

Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu

275 280 285

Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala

290 295 300

Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu

305 310 315 320

Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp

325 330 335

His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile

340 345 350

Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Asn Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn

355 360 365

Ile Leu Gly Ser Arg Gly

370

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgtctggcg gcgggcatga cctacaagaa tgccgcgg 38

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcatgcccgc cgccagacgg agcgcgtcaa tcagcgc 37

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccgcagtaa ctttctgcgt cgcgataaga acattctggg c 41

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgcgctcgcg ctggcgaaag gcatgaccta caagaatgcc gc 42

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctttcgccag cgcgagcgcg tcaatcagcg cctcttcatc actc 44

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccggcctcct cctcggtggc ggtaaagccg tgattatcgg cg 42

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccaccgagg aggaggccgg ccgcggcatt cttgtagg 38

<210> 15

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

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<210> 16

<211> 1125

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<213> 人工序列

<400> 16

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tacggcgtgt accgcggtat gaaagcggcc gccaaagaag tttacggcac ggatagtctg 540

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gccgaagaag cctttggtgc cctcgtggtt ggcccggacg agatttacag cgtggacgcc 720

gacatttttg cgccatgcgc gctgggtgcc acgctgaatg atgaaaccat cccgcagctc 780

aaggtgaaga tcatcgcggg cgccgcgaac aaccagctca aagaggatcg tcatggcgac 840

atgctgcaag aacgcggcat tctctacacg ccggacttcg ttatcaacgc gggcggcgtg 900

atcaatgttg cggacgaact ggacggttac aaccgcgaac gcgccatgaa gaaagtggaa 960

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<210> 17

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met

1 5 10 15

Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser

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Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala

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Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu

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Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr

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Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu

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Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp

325 330 335

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370

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met

1 5 10 15

Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser

20 25 30

Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala

35 40 45

Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu

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Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala

65 70 75 80

Ala Gly Leu Leu Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala

85 90 95

Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val

100 105 110

Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr

115 120 125

Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly

130 135 140

Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly

165 170 175

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180 185 190

Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu

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Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala

225 230 235 240

Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr

245 250 255

Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln

260 265 270

Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu

275 280 285

Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala

290 295 300

Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu

305 310 315 320

Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp

325 330 335

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340 345 350

Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Gln Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn

355 360 365

Ile Leu Gly Ser Arg Gly

370

Claims

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，第72位氨基酸由赖氨酸突变为了丙氨酸。

2.如权利要求1所述的一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，出发质粒为pET-28a质粒。

6.携带权利要求3所述基因或权利要求4或5所述重组质粒的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌。

8.权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求6或7所述的宿主细胞的种子液接入到培养基中进行发酵，发酵结束后，收集菌液，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。

9.权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述重组质粒，或权利要求6或7所述宿主细胞，或权利要求8所述制备方法在制备L-2-氨基丁酸或含L-2-氨基丁酸的产品中的应用。

10.一种制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体，或权利要求6或7所述宿主细胞为催化剂，以2-酮丁酸为底物，催化制备L-2-氨基丁酸。