CN108559735A - 一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用 - Google Patents

一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用，属于基因工程领域。本发明提供了SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.8三个亮氨酸脱氢酶突变体，以及上述突变体或产生突变体的基因工程菌在氨化还原α‑酮酸制备光学纯手性L‑α‑氨基酸中的应用。本发明在于：所述亮氨酸脱氢酶突变体或含有突变体基因工程菌氨化还原制备L‑α‑氨基酸具有高催化活性及稳定性，能够合成高光学纯度L‑α‑氨基酸(ee>99％)，如突变体酶催化L‑苯甘氨酸的转化速率提高了2.62倍，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。

Description

一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用
技术领域
本发明涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
光学纯L-α-氨基酸是重要的化工及医药原料，具有广阔的应用市场，如L-α-氨基丁酸可作为抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成，L-叔亮氨酸是瑞士罗氏公司研发的酪氨酸激酶JAK3抑制剂药物结构中的中心氨基酸等。亮氨酸脱氢酶(LeuDH，EC1.4.1.9)已被广泛用于L-α-氨基酸的制备(Krix,G.,Bommarius,A.S.,Drauz,K.,Kottenhahn,M.,
Schwarm,M.,Kula,M.R..Journal of Biotechnology,1997,53,29-39.)。并且已有部分研究对亮氨酸脱氢酶进行了定点突变改造其性质，但他们都集中改造位于底物催化区域附近、酶表面或特定的氨基酸残基，如徐建妙等选择了41为甘氨酸、77位亮氨酸、61位丙氨酸、347位蛋氨酸及358位谷氨酰胺进行了突变(中国专利:徐建妙,郑裕国,柳志强,傅芳田,胡海峰.亮氨酸脱氢酶突变体、编码基因、载体、工程菌及其应用.2017,CN106497895A.)。但是没有研究报道对于亮氨酸脱氢酶的底物通道进行改造，而底物通道对于酶的催化效率也有着极其重要的影响。
发明内容
本发明的目的是提供催化效率及稳定性提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其重组工程菌等，为L-α-氨基酸的高效制备提供具备工业价值的生物催化剂。
本发明的第一个目的是提供一种催化活性显著提高的亮氨酸脱氢酶的突变体，是基于改善亮氨酸脱氢酶底物通道疏水性的基础设计的，主要增加底物通道内β5折叠的刚性。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2的基础上，将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，或/和将第116位谷氨酸突变为缬氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体T45M由SEQ ID NO.3所示的基因编码。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体E116V由SEQ ID NO.5所示的基因编码。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，并将116位谷氨酸突变成缬氨酸，得到突变体Thr45Met/Glu116Val，即T45M/E116V。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的DNA。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，得到突变体Thr45Met，即T45M，含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体将116位谷氨酸突变成缬氨酸，得到突变体Glu116Val，即E116V。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体T45M/E116V由SEQ ID NO.7所示的基因编码。
本发明的第三个目的是提供携带所述DNA的载体，包括但不限于质粒、噬菌体或病毒载体等。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET系列载体，例如pET-28a。
本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞系。
本发明的第五个目的是提供一种提高亮氨酸脱氢酶催化活性的方法，是在SEQ IDNO.2的基础上，将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，或/和将第116位谷氨酸突变为缬氨酸。
本发明的第六个目的是提供一种表达所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以细菌或真菌细胞为宿主，其满足重组表达载体稳定自我复制的条件，且能够使所述亮氨酸脱氢酶突变体基因有效表达。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌包括但不限于大肠杆菌E.coliBL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)为宿主。
本发明的第七个目的是提供一种生产所述亮氨酸脱氢酶突变体蛋白的方法，是培养所述重组表达转化体，诱导获得重组亮氨酸脱氢酶突变体蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述培养是在LB培养基中进行。
在本发明的一种实施方式中，所述LB培养基含有蛋白脉10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。
在本发明的一种实施方式中，所述培养是控制培养液在28℃温度下培养至OD600达到0.6-0.9，加入终浓度为0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导，于28℃诱导培养12-16h。
本发明的第七个目的是提供所述亮氨酸脱氢酶突变体或其基因工程菌在偶联提供NADH循环的酶的条件下催化制备L-α-氨基酸中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是以α-酮酸为底物，所述的亮氨酸脱氢酶突变体或其重组细胞，以NADH为辅酶，并且偶联提供NADH循环的酶，在20-50℃下，于pH6.0-10.0的缓冲液或水构成的转化反应体系中反应1-4h。
在本发明的一种实施方式中，α-酮酸包括但不限于2-酮丁酸、2-酮戊酸、三甲基丙酮酸、苯甲酰甲酸、4-甲基-2-氧戊酸或3-甲基-2-氧丁酸。
在本发明的一种实施方式中，提供NADH循环的酶包括但不限于甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乙醇脱氢酶。
在本发明的一种实施方式中，所述转化体系中底物初始浓度为5-1000mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述转化体系中重组亮氨酸脱氢酶突变体纯酶在反应液中较佳的浓度为0.1-2.0mg蛋白/mL反应液。所述转化体系中菌体的质量用量以菌体湿重计为1-400g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中添加的提供NADH循环的酶在反应液中较佳的浓度为0.1-2.0mg蛋白/mL反应液；同时，反应体系中还添加了1-15％甲酸、糖或醇为辅底物，所述的辅底物包括但不限于：甲酸、葡萄糖、异丙醇。
在本发明的一种实施方式中，反应结束后还进行分离纯化；反应结束后，所述分离纯化包括通过加热去除沉淀蛋白或菌体，将反应液离心，取上清液通过活性炭吸附去除色素，经过减压蒸馏，利用饱和析晶或乙醇沉淀结晶法得到粗品。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还对粗品进行提纯；粗品提纯的方法为本领域公知技术，包括但不限于色谱分离和/或吸附分离。
本发明还要求保护所述突变体在制备含氨基酸的产品方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明首次对亮氨酸脱氢酶的底物通道内氨基酸残基进行定点突变，增加了底物通道的疏水性并增加了底物通道的刚性，获得了更加稳定并能更高效制备L-α-氨基酸的亮氨酸脱氢酶。本发明提供的催化效率及稳定性提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其重组工程菌，其中复合突变体T45M/E116V对于几类α-酮酸的催化效率提高了1.30-9.85倍，在60℃的半衰期从原始酶的3.4h提高到29.2h。利用亮氨酸突变体可以实现高效制备L-α-氨基酸，如对于L-苯甘氨酸的转化速率提高了2.62倍，摩尔转化率>99％，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
实施例1：亮氨酸脱氢酶突变体的构建
以含有来源于蜡样芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因的pET-28a重组质粒作为模板。
以含有突变点的寡核苷酸片段为上游引物，pET-28a质粒上2254附近的寡核苷酸片段为下游引物，具体引物如下(加粗及下划线为突变位点)：
PF-T45M：5’-CCGGCTCTTGGTGGA ATG AGAATGTGGACATAT-3’
PF-E116V：5’-CGTTACATTACAGCT GTT GATGTTGGTACAACA-3’
PR-28a2254：5’-GCCTTACTGGTTAGCAGAATG-3’
采用全质粒两步PCR方法构建突变体质粒(Sanchis,J.,Fernández,L.,Carballeira,J.D.,Drone,J.,Gumulya,Y.,&H.,et al.Appl MicrobiolBiotechnol,2008,81,387-397.)。PCR扩增体系：模板0.5μL，上下游引物各0.2μL，dNTP Mix2μL，HS DNA聚合酶Buffer 5μL，灭菌ddH2O 16.85μL，HS DNA聚合酶0.25μL，总反应体系25μL。PCR反应条件：95℃预变性，3min，一个循环；95℃变性，30s，55℃退火，1min，72℃延伸，3min，5个循环；95℃变性，30s，68℃延伸，6min 30s，20个循环；68℃，13min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR产物经过凝胶电泳检验，然后在20μL的PCR产物中加入1μL的Dpn I限制性内切酶对模板质粒进行消化，于25℃过夜或者37℃下孵化3-4h。吸取5μL酶切产物进行感受态细胞转化，其余酶切产物质粒于-20℃冰箱保存备用。
将上述经过酶切处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的平板上，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有亮氨酸脱氢酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。经测序验证突变成功的菌液加入甘油并于-70℃冰箱保藏。最终获得亮氨酸脱氢酶突变体T45M、E116V和T45M/E116V核苷酸序列测序结果分别如序列表中SEQID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示，相应编码的蛋白质氨基酸序列如序列表中SEQID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8所示。
实施例2：亮氨酸脱氢酶突变体的诱导表达
实施例1构建的亮氨酸脱氢酶突变体工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、160r/min培养过夜后转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8,000rpm离心10min收集菌体，于-70℃冰箱贮存备用。
实施例3：亮氨酸脱氢酶突变体的分离纯化
取实施例2收集的湿菌体细胞0.5g，用10mL的pH 7.5的50mM PB缓冲液洗涤二次，重悬于10mL的pH 7.5的50mM PB缓冲液中，振荡摇匀后置超声波下破碎，破1s，停3s，总时长15min。细胞破碎液于12,000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清液即粗酶液并利用0.22μm滤膜过滤后用于酶的后续分离纯化。纯化柱为Ni-NTA柱，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液M20(20mM磷酸钠，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，以0.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液M20洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液M500(20mM磷酸钠，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白。酶液用HiTrap脱盐柱进行脱盐，脱盐缓冲液为PB缓冲液(50mM,pH 7.5)，所得的纯酶液于4℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，结果表明得到电泳纯的重组亮氨酸脱氢及其突变体。
实施例4：亮氨酸脱氢酶野生酶及其突变体的比酶活及稳定性
将实施例3得到的纯酶进行以2-酮丁酸为底物的比酶活的测定，通过分光光度计在340nm处检测NADH吸光值变化以计算亮氨酸脱氢酶的氨化还原活力。酶活单位(U)的定义为：30℃下，每分钟催化1μmol NADH氧化所需的酶量；比酶活为每毫克蛋白所具有的酶活(U/mg)。其中反应体系为(1mL):0.3mM NADH，10mM 2-酮丁酸的PB缓冲液(50mM,pH 7.5)和适量的纯酶。对于2-酮丁酸底物，亮氨酸脱氢酶野生型(WT)的比酶活是119.4±1.1U/mg，突变体T45M、E116V及T45M/E116V的比酶活分别是97.3±3.7U/mg、147.0±2.6U/mg及156.8±1.8U/mg。
亮氨酸脱氢酶野生型及突变体的热稳定性是在不同温度下的PB缓冲液(50mM,pH7.5)中进行的，检测酶在不同温度下放置不同时间下残留的酶活，酶活测定方法参照实施例4的方法。酶的温度半衰期定义为在该温度下酶活残留为初始酶活50％时的孵化时间。经过测定，在60℃下，亮氨酸脱氢酶野生型(WT)的半衰期是3.4h，突变体T45M、E116V及T45M/E116V的半衰期分别是12.6h、22.3h及29.2h。
实施例5：亮氨酸脱氢酶野生酶及其突变体的动力学参数
在标准条件下，通过改变反应体系中底物的浓度进行酶活力测定，根据origin8.0软件的Michaelis-Menten方程对酶活数据进行曲线拟合，得到相应的动力学常数。动力学常数计算中所用的底物及其浓度如下：2-酮丁酸(0-3.0mM)，2-酮戊酸(0-10mM)，三甲基丙酮酸(0-5.0mM)，3-甲基-2-氧丁酸(0-10mM)，4-甲基-2-氧戊酸(0-10mM)，苯甲酰甲酸(0-2.0mM)，NADH(0-0.2mM)。亮氨酸脱氢酶野生型WT及其突变体催化相应底物的表观动力学参数如表1所示。
表1亮氨酸脱氢酶野生型及其突变体对于不同α-酮酸底物的表观动力学参数
实施例6：亮氨酸脱氢酶野生型及其突变体T45M/E116V工程菌制备L-α-氨基丁酸
将实施例2中的亮氨酸脱氢酶野生型及其突变体T45M/E116V工程菌进行2-酮丁酸底物的转化。转化体系是：4g湿菌体，90mL不同浓度的2-酮丁酸溶解在100mM的PB缓冲液中(pH 7.5)并利用氨水将pH重新调到7.5，10mL的异丙醇，0.1～0.3mg蛋白/mL反应液的亮氨酸脱氢酶野生型或突变体纯酶，2～5mg蛋白/mL反应液的乙醇脱氢酶，于30℃、300r/min进行转化，以50％氨水溶液以保持反应液pH为7.5。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。
HPLC分析条件：在EP管中依次加入待测样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的100mM硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 100mM KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：dimosoil C18(5μl,250mm×4.6mm)，流动相：50mM醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UVDetector，检测波长：338nm，柱温：40℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
HPLC检测结果表明野生型亮氨酸脱氢酶的全细胞催化效率明显低于突变体T45M/E116V，在100mM的2-酮丁酸底物浓度下反应1h后，突变体T45M/E116V全细胞催化反应转化率高达58.7％，而野生型的催化反应转化率为41.4％；同样条件下，野生型亮氨酸脱氢酶和突变体T45M/E116V全细胞催化该反应反应摩尔转化率达到99％所需的时间分别为2.6h和1.8h。同时野生酶及突变体T45M/E116V都展现出良好的立体选择性，产物的ee值保持在99％以上。
实施例7：亮氨酸脱氢酶野生型及其突变体T45M/E116V制备L-苯甘氨酸
将实施例3中的亮氨酸脱氢酶野生型及其突变体T45M/E116V纯酶分别与甲酸脱氢酶偶联进行苯甲酰甲酸底物的转化。转化体系是：400mM苯甲酰甲酸溶解在pH 7.5的100mMPB缓冲液中并利用氨水将pH重新调到7.5，2mM终浓度的NADH，终浓度0.4M的甲酸铵，亮氨酸脱氢酶或突变体T45M/E116V纯酶(0.2mg蛋白/mL反应液)，过量浓度的甲酸脱氢酶(4mg蛋白/mL反应液)，于30℃、300r/min进行转化，以20％甲酸及50％氨水溶液以保持反应液pH为7.5。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例6中的HPLC检测方法)。
HPLC检测结果表明野生型亮氨酸脱氢酶催化效率明显低于突变体T45M/E116V，反应1h后，突变体T45M/E116V催化反应转化率高达77.5％，而野生型的催化反应转化率仅有35.2％。同样条件下，野生型亮氨酸脱氢酶和突变体T45M/E116V催化底物苯甲酰甲酸制备L-苯甘氨酸的反应摩尔转化率达到99％所需的时间分别为3.4h和1.3h，同时野生酶及突变体T45M/E116V都展现出良好的立体选择性，产物的ee值保持在99％以上。表明该亮氨酸脱氢酶突变体具备广阔的工业化应用前景。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1101
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<213> 蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus
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His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser
130 135 140
Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met
145 150 155 160
Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys
165 170 175
Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys
180 185 190
His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys
195 200 205
Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Ser Ala Val Glu
210 215 220
Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys
245 250 255
Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly
260 265 270
Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile
275 280 285
Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn
290 295 300
Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala
305 310 315 320
Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala
325 330 335
Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg
340 345 350
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<210> 3
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgacattag aaatcttcga atacttagaa aaatatgatt atgagcaagt agtattttgt 60
caagataaag aatctggttt aaaagcaatt attgcaattc atgatacaac acttggaccg 120
gctcttggtg gaatgagaat gtggacatat gattctgaag aagcggcgat tgaagatgca 180
ttgcgtcttg caaaagggat gacatacaaa aacgcagcag ctggtttaaa cttaggtggt 240
gcgaaaacag taattatcgg tgatcctcgt aaagataaga gcgaagcaat gttccgtgca 300
ctaggacgtt atatccaagg actaaacgga cgttacatta cagctgaaga tgttggtaca 360
acagtagatg atatggatat tatccatgaa gaaactgact ttgtaacagg tatctcacca 420
tcattcggtt cttctggtaa cccatctccg gtaactgcat acggtgttta ccgtggtatg 480
aaagcagctg caaaagaagc tttcggtact gacaatttag aaggaaaagt aattgctgtt 540
caaggcgttg gtaacgtagc atatcaccta tgcaaacatt tacacgctga aggagcaaaa 600
ttaatcgtta cagatattaa taaagaagct gtacaacgtg ctgtagaaga attcggtgca 660
tcagcagttg aaccaaatga aatttacggt gttgaatgcg atatttacgc accatgtgca 720
ctaggcgcaa cagttaatga tgaaactatt ccacaactta aagcaaaagt aatcgcaggt 780
tctgcaaata accaattaaa agaagatcgt catggtgaca tcattcatga aatgggtatt 840
gtatacgcac cagattatgt aattaatgca ggtggcgtaa ttaacgtagc agacgaatta 900
tatggataca atagagaacg tgcactaaaa cgtgttgagt ctatttatga cacgattgca 960
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<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Claims (10)

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的DNA。
3.携带权利要求2所述DNA的载体，其特征在于，所述载体包括质粒、噬菌体或病毒载体。
4.表达权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的细胞。
5.一种提高亮氨酸脱氢酶催化活性的方法，其特征在于，在SEQ ID NO.2的基础上，将第45位苏氨酸替换为甲硫氨酸，或/和将第116位谷氨酸突变为缬氨酸。
6.一种基因工程菌，其特征在于，以细菌或真菌细胞为宿主，表达权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，宿主包括大肠杆菌E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。
8.一种生产权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的蛋白的方法，其特征在于，培养权利要求6所述的基因工程菌，诱导获得重组亮氨酸脱氢酶突变体蛋白。
9.一种制备L-α-氨基酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体或权利要求6所述的基因工程菌为底物，在偶联提供NADH循环的酶的条件下催化底物生产L-α-氨基酸。
10.权利要求1所述的突变体在制备含氨基酸的产品方面的应用。
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