CN110656095B - 亮氨酸脱氢酶突变体及其在芳香族手性胺合成中的应用 - Google Patents

亮氨酸脱氢酶突变体及其在芳香族手性胺合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了亮氨酸脱氢酶突变体及其在芳香族手性胺合成中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶(Leucine Dehydrogenase，LeuDH，EC 1.4.1.9)的第70位赖氨酸和第263位天冬酰胺，以及，第115位丙氨酸、第136位苏氨酸和/或第42位亮氨酸进行突变，使得亮氨酸脱氢酶获得了对4‑苯基‑2‑丁酮以及苯基丙酮等芳香族手性酮的催化活性。

Description

亮氨酸脱氢酶突变体及其在芳香族手性胺合成中的应用
技术领域
本发明涉及亮氨酸脱氢酶突变体及其在芳香族手性胺合成中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。
背景技术
地瓦洛尔作为新型的β-阻滞和β2-激动药物，具有良好的血流动力学效应和理想的抗高血压作用，在抗高血压的治疗中能改善大动脉的顺应性，并对血管起到一定的保护作用，尤其适用于轻至中高度原发性高血压的治疗。
光学纯的(R)-4-苯基-2-丁胺是合成地瓦洛尔的关键中间体。鉴于地瓦洛尔在抗高血压药物中的重要地位，(R)-4-苯基-2-丁胺的合成也具有极大的实际应用价值。
目前，由于氨基酸脱氢酶突变获得的胺脱氢酶只需消耗廉价的还原剂即可一步催化4-苯基-2-丁酮生成(R)-4-苯基-2-丁胺，其副产物仅为水，十分绿色，且其产物的光学纯度(ee值)可达95％以上，因此，利用氨基酸脱氢酶突变获得的胺脱氢酶对4-苯基-2-丁酮进行不对成还原胺化是最具潜力的生产(R)-4-苯基-2-丁胺的方法。
但是，上述通过胺脱氢酶合成(R)-4-苯基-2-丁胺的方法仍存在许多问题，其中，最主要问题是现有的胺脱氢酶对4-苯基-2-丁酮的催化活力均十分低，这大大影响了通过胺脱氢酶合成(R)-4-苯基-2-丁胺的转化率。例如，Zhi Li等人通过将来源于红球菌属(Rhodococcus sp. M4)的苯丙氨酸脱氢酶突变为胺脱氢酶，实现了将4-苯基-2-丁酮高度不对称还原胺化为(R) -4-苯基-2-丁胺，其产物的光学纯度(ee值)超过98％，但是，其突变获得的苯丙氨酸脱氢酶双突变体K66Q/N262C对4-苯基-2-丁酮的催化活性仅有6.2U/g，其在双突变体基础上进一步突变获得的苯丙氨酸脱氢酶三突变体K66Q/N262C/S149G对4-苯基-2-丁酮的催化活性也仅有 8.8U/g；Schell等人通过将来源于巴氏芽孢杆菌(Bacillusbadius)的苯丙氨酸脱氢酶突变为胺脱氢酶，实现了将4-苯基-2-丁酮高度不对称还原胺化为(R)-4-苯基-2-丁胺，但是，其突变获得的苯丙氨酸脱氢酶双突变体K78S/N276L对4-苯基-2-丁酮的催化活性仅有11.3U/g，其在双突变体基础上进一步突变获得的苯丙氨酸脱氢酶四突变体L50F/K78S/N276L/L306A 对4-苯基-2-丁酮的催化活性也仅有21.7U/g。
因此，急需获得对4-苯基-2-丁酮的催化活性更高的胺脱氢酶以解决现有(R)-4-苯基-2- 丁胺生产方法存在的缺陷。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种对4-苯基-2-丁酮的催化活性高的亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶)。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶，AmDH)，所述亮氨酸脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶(Leucine Dehydrogenase，LeuDH，EC 1.4.1.9)的第70位赖氨酸、第263位天冬酰胺、第 115位丙氨酸以及第136位苏氨酸进行突变得到的；
或者，所述亮氨酸脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶的第70位赖氨酸、第263位天冬酰胺、第115位丙氨酸、第136位苏氨酸以及第42 位亮氨酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第70位赖氨酸突变为丝氨酸、第263位天冬酰胺突变为亮氨酸、第115位丙氨酸突变为甘氨酸 以及第136位苏氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为A115G/T136A；
或者，所述亮氨酸脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第70位赖氨酸突变为丝氨酸、第263位天冬酰胺突变为亮氨酸、第115位丙氨酸突变为甘氨酸 、第136位苏氨酸突变为丙氨酸以及第42位亮氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为 A115G/T136A/L42A；
或者，所述亮氨酸脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第70位赖氨酸突变为丝氨酸、第263位天冬酰胺突变为亮氨酸、第115位丙氨酸突变为甘氨酸 、第136位苏氨酸突变为丙氨酸以及第42位亮氨酸突变为甘氨酸得到的，命名为 A115G/T136A/L42G。
在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶来源于蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus) (具体可见参考文献：杨兴龙,穆晓清,聂尧,et al.亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶高效共表达制备L-叔亮氨酸[J].微生物学报,2016,56(11):1709-1718.)。
本发明还提供了编码上述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pET质粒为载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒载体为pET28a(+)。
本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在制备芳香族手性胺中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述芳香族手性胺为(R)-4-苯基-2-丁胺或(R)-苯丙胺。
本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在制备地瓦洛尔或坦索洛新中的应用。
本发明还提供了一种生产芳香族手性胺的方法，所述方法为以芳香族手性酮为底物，将上述亮氨酸脱氢酶突变体加入含有芳香族手性酮的反应体系中进行反应，得到芳香族手性胺。
在本发明的一种实施方式中，所述芳香族手性酮的结构式如下：
Figure BDA0002236979480000031
式中，R1＝(CH2)n，n＝1或2，R2＝CH3或CH2CH3。
在本发明的一种实施方式中，所述芳香族手性胺的结构式如下：
Figure BDA0002236979480000032
式中，R1＝(CH2)n，n＝1或2，R2＝CH3或CH2CH3。
在本发明的一种实施方式中，所述芳香族手性酮为4-苯基-2-丁酮或苯基丙酮。
本发明还提供了一种生产(R)-4-苯基-2-丁胺的方法，所述方法为以4-苯基-2-丁酮为底物，将上述亮氨酸脱氢酶突变体加入含有4-苯基-2-丁酮的反应体系中进行反应，得到(R) -4-苯基-2-丁胺。
在本发明的一种实施方式中，所述4-苯基-2-丁酮的结构式如下：
Figure BDA0002236979480000041
所述(R)-4-苯基-2-丁胺的结构式如下：
Figure BDA0002236979480000042
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系为含有4-苯基-2-丁酮、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖以及辅酶的缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为NAD+或NADH。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为NAD+。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为NH4Cl-NH4OH缓冲液、Tris-HCL缓冲液或 PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为NH4Cl-NH4OH缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述NH4Cl-NH4OH缓冲液的浓度为0.5～5mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述NH4Cl-NH4OH缓冲液的浓度为1mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为10～70℃、pH为7～11、转速为50～300 rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为30℃、pH为9.0、转速为200rpm。
本发明还提供了一种生产(R)-苯丙胺的方法，所述方法为以苯基丙酮为底物，将上述亮氨酸脱氢酶突变体加入含有苯基丙酮的反应体系中进行反应，得到(R)-苯丙胺。
在本发明的一种实施方式中，所述苯基丙酮的结构式如下：
Figure BDA0002236979480000051
所述(R)-苯丙胺的结构式如下：
Figure BDA0002236979480000052
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系为含有苯基丙酮、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖以及辅酶的缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为NAD+或NADH。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为NAD+。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为NH4Cl-NH4OH缓冲液、Tris-HCl缓冲液或 PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述Tris-HCL缓冲液的浓度为0.1～1mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述Tris-HCL缓冲液的浓度为0.1mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为10～70℃、pH为7～11、转速为50～300 rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为30℃、pH为9.0、转速200rpm。
[有益效果]
(1)本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶(LeucineDehydrogenase，LeuDH，EC 1.4.1.9)的第70位赖氨酸和第263位天冬酰胺，以及，第115 位丙氨酸、第136位苏氨酸和/或第42位亮氨酸进行突变，使得亮氨酸脱氢酶获得了对4-苯基-2-丁酮以及苯基丙酮等芳香族手性酮的催化活性。
(2)本发明的亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶，AmDH)对4-苯基-2-丁酮的催化活性高，其中，突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A和A115G/T136A/L42G对4-苯基-2- 丁酮的催化活性分别可达9.1U/g、110.8U/g和138.4U/g。
(3)本发明的亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶，AmDH)可以芳香族手性酮为底物，生产芳香族手性胺，例如，以4-苯基-2-丁酮为底物催化生产(R)-4-苯基-2-丁胺以及以苯基丙酮为底物催化生产(R)-苯丙胺，而(R)-4-苯基-2-丁胺以及(R)-苯丙胺等芳香族手性胺分别为地瓦洛尔和坦索洛新等药物的重要中间体，因此，本发明的亮氨酸脱氢酶突变体在地瓦洛尔和坦索洛新等药物的制备中具有极大的应用前景。
(4)以浓度为100mmol//L的4-苯基-2-丁酮为底物，利用本发明的亮氨酸脱氢酶突变体 (胺脱氢酶，AmDH)催化生产(R)-4-苯基-2-丁胺，底物转化率高达95％，所得产物的光学纯度(ee值)高达99％，因此，本发明的亮氨酸脱氢酶突变体可在高底物浓度下高效生产(R)-4-苯基-2-丁胺，适用于大规模工业化生产。
(5)本发明的亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶，AmDH)温度稳定性好，其中，突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G在pH为9.0的条件下保存1h 后的残留活性分别为43％、56％和38％，远高于野生型的28％。
(6)本发明的亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶，AmDH)pH度稳定性好，其中，突变体A115G/T136A/L42G的T50 15值为66℃，远高于野生型的61℃。
附图说明
图1：芳香族手性酮的结构式。
图2：芳香族手性胺的结构式。
图3：4-苯基-2-丁酮的结构式。
图4：(R)-4-苯基-2-丁胺的结构式。
图5：苯基丙酮的结构式。
图6：(R)-苯丙胺的结构式。
图7：野生型及突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的最适反应pH测定结果。
图8：野生型及突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的pH稳定性测定结果。
图9：野生型及突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的最适反应温度测定结果。
图10：野生型及突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的温度稳定性测定结果。
图11：反应液中(R)-4-苯基-2-丁胺的气相色谱检测结果。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET-28a(+)质粒购自Novagen公司，葡萄糖脱氢酶(GluDH)购自Merck公司，NAD+、NADH购自索莱宝生物科技有限公司(上述菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、卡那霉素50mg·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉20g·L-1、卡那霉素50mg·L-1。
实施例1：不同亮氨酸脱氢酶突变体的制备及表达
具体步骤如下：
化学合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶的基因(基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；参照文献“Chen F F,Liu Y Y,Zheng G W,etal.Asymmetric Amination of Secondary Alcohols by using a Redox-Neutral Two-Enzyme Cascade[J]. ChemCatChem,2015,7(23):3838-3841.”将亮氨酸脱氢酶的第70位赖氨酸突变为丝氨酸、第 263位天冬酰胺突变为亮氨酸，使得亮氨酸脱氢酶获得对脂肪酮的活性(此处第70位即对应文献中的第77位，此处第263位即对应文献中的第270位)，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3 所示的亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶)以及编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶)的基因(基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)；将获得的编码亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶)的基因与pET-28a(+)质粒经双酶切(Xho I、BamH I)后进行连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，转化产物涂布于LB固体培养基，于 37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，测序正确即获得重组质粒pET28a-AmDH以及重组大肠杆菌pET28a-AmDH/E.coli BL21。
利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pET28a-AmDH为模板进行定点突变，获得突变体A115G、T136A、A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/T45A、 A115G/T136A/T114A、A115G/T136A/E116A以及A115G/T136A/L42G；
其中，突变A115G所用引物如下：
A115G-For：GACGTTACATTACAGGTGAAGATGTTGGTA(SEQ ID No.5)；
A115G-Rev：ATCTTCACCTGTAATGTAACGTCCGTTTAA(SEQ ID No.6)；
突变T136A所用引物如下：
T136A-For：AAACTGACTTTGTAGCCGGGATTTCACC(SEQ ID No.7)；
T136A-Rev：TGAAATCCCGGCTACAAAGTCAGTTTCTTC(SEQ ID No.8)；
突变L42A所用引物如下：
L42A-For：ACCGGCTGCAGGTGGAACAAGAAT(SEQ ID No.9)；
L42A-Rev：ACATTCTTGTTCCACCTGCAGCCG(SEQ ID No.10)；
突变L42G所用引物如下：
L42G-For：ACCGGCTGGCGGTGGAACAAGAAT(SEQ ID No.11)；
L42G-Rev：ACATTCTTGTTCCACCGCCAGCCG(SEQ ID No.12)；
突变T45A所用引物如下：
T45A-For：TCTTGGTGGAGCAAGAATGTGGACATATG(SEQ ID No.13)；
T45A-Rev：AATCATATGTCCACATTCTTGCTCCACCA(SEQ ID No.14)；
突变T114A所用引物如下：
T114A-For：GACGTTACATTGCAGGTGAAGATGTTGGTA(SEQ ID No.15)；
T114A-Rev：ATCTTCACCTGCAATGTAACGTCCGTTTAA(SEQ ID No.16)；
突变E116A所用引物如下：
E116A-For：GACGTTACATTACAGGTGCCGATGTTGGTA(SEQ ID No.17)；
E116A-Rev：ATCGGCACCTGTAATGTAACGTCCGTTTAA(SEQ ID No.18)，
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为94℃预变性4min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸8min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入 0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将Dpn I处理后的扩增产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取20个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，测序正确即获得含有编码突变体A115G、T136A、A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/T45A、A115G/T136A/T114A、 A115G/T136A/E116A以及A115G/T136A/L42G的基因的重组大肠杆菌。
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的亮氨酸脱氢酶突变体(胺脱氢酶)为野生型，将获得的重组大肠杆菌pET28a-AmDH/E.coli BL21以及含有编码突变体A115G、T136A、A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/T45A、A115G/T136A/T114A、A115G/T136A/E116A以及A115G/T136A/L42G的基因的重组大肠杆菌涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃、200rpm培养 6～8h，获得种子液；将种子液按照2％(v/v)的接种量接入LB液体培养基，于37℃、200rpm 培养2～3h后，在发酵液中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，于17℃、200rpm继续诱导培养12～17h，得到发酵液；将发酵液于4℃、8000rpm离心5min，弃上清，将沉淀用9％的生理盐水洗涤菌体两遍；将洗涤后的细胞重悬于缓冲液A(100mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、 20mmol/L咪唑，pH 7.5)中并进行超声破碎，于10000rpm、4℃离心30min，获得粗酶液；用0.22um水系滤膜过滤后缓慢加样至Ni-NAT亲和层析柱，加样完毕先用缓冲液A洗涤，再用缓冲液B(100mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑，pH 7.5)梯度洗脱，收集300mmol/L咪唑对应的洗脱峰，得到野生型、突变体A115G、T136A、A115G/T136A、 A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/T45A、A115G/T136A/T114A、A115G/T136A/E116A以及A115G/T136A/L42G的纯酶，随后用脱盐柱除去纯酶中的咪唑，用超滤管(截留分子量 30kDa)于4000rpm下进行离心浓缩，得到野生型、突变体A115G、T136A、A115G/T136A、 A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/T45A、A115G/T136A/T114A、A115G/T136A/E116A以及A115G/T136A/L42G的浓缩纯酶。
实施例2：不同亮氨酸脱氢酶突变体对4-苯基-2-丁酮的催化活性
具体步骤如下：
在NH4Cl-NH4OH缓冲液(1mol/L，pH 9.0)中加入4-苯基-2-丁酮(5mmol/L)以及NADH(0.2mmol/L)，得到反应体系；将反应体系于30℃下保温2min后加入20ul实施例1获得的野生型、突变体A115G、T136A、A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/T45A、 A115G/T136A/T114A、A115G/T136A/E116A以及A115G/T136A/L42G的浓缩纯酶开始反应，对照组中不含浓缩酶液，其他成分相同；使反应在30℃下进行5min，每隔10s记录340nm 处的吸光度变化，得到野生型、突变体A115G、T136A、A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、 A115G/T136A/T45A、A115G/T136A/T114A、A115G/T136A/E116A以及A115G/T136A/L42G 对4-苯基-2-丁酮的催化活性；催化活性(U/g)＝Ew×V×1000/6220/L×浓缩酶液的蛋白浓度；其中，Ew为1min内340nm处的吸光度变化值；V为酶活测定反应体系的体积，单位为mL，此处为0.2；6200为摩尔消光系数，单位为L/mol/cm；L为光程距离，单位为cm，此处为0.5；浓缩酶液的蛋白浓度用Bradford蛋白试剂盒测定(Bradford蛋白试剂盒测定蛋白浓度可参考文献：Zhou-PanX R,E Sérée,Zhou X J,et al.Involvement of Human Liver Cytochrome P450 3A inVinblastine Metabolism:Drug Interactions1[J].Cancer Research,1993,53(21):5121-5126.)。
检测结果为：野生型及突变体A115G、T136A对4-苯基-2-丁酮未检测到可测量的催化活性；突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A和A115G/T136A/L42G对4-苯基-2-丁酮的催化活性分别可达9.1U/g、110.8U/g和138.4U/g；而突变体A115G/T136A/T45A、 A115G/T136A/T114A和A115G/T136A/E116A对4-苯基-2-丁酮的催化活性仅分为有2.1U/g、 1.8U/g和6.4U/g。
实施例3：不同亮氨酸脱氢酶突变体对苯基丙酮的催化活性
具体步骤如下：
在Tris-HCL缓冲液(100mmol/L，pH 9.0)中加入NH4Cl(1mol/L)、苯基丙酮(5mmol/L) 以及NADH(0.2mmol/L)，得到反应体系；将反应体系于30℃下保温2min后加入20ul实施例1获得的野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的浓缩纯酶开始反应，对照组中不含浓缩酶液，其他成分相同；使反应在30℃下进行5min，每隔10s记录340nm处的吸光度变化，得到野生型、突变体A115G/T136A、 A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G对苯基丙酮的催化活性；催化活性(U/g) ＝Ew×V×1000/6220/L×浓缩酶液的蛋白浓度；其中，Ew为1min内340nm处的吸光度变化值； V为酶活测定反应体系的体积，单位为mL，此处为0.2；6200为摩尔消光系数，单位为 L/mol/cm；L为光程距离，单位为cm，此处为0.5；浓缩酶液的蛋白浓度用Bradford蛋白试剂盒测定(Bradford蛋白试剂盒测定蛋白浓度可参考文献：Zhou-Pan X R,E Sérée,Zhou X J, et al.Involvement of Human LiverCytochrome P450 3A in Vinblastine Metabolism:Drug Interactions1[J].CancerResearch,1993,53(21):5121-5126.)。
检测结果为：野生型对苯基丙酮未检测到可测量的催化活性；突变体A115G/T136A、 A115G/T136A/L42A和A115G/T136A/L42G对苯基丙酮的催化活性分别可达34.2U/g、238.9 U/g和327.3U/g。
实施例4：不同亮氨酸脱氢酶突变体的酶学性质
具体步骤如下：
(1)不同亮氨酸脱氢酶突变体的最适pH及pH稳定性
配制如下pH缓冲液：100mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0～6.0)、100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0～8.0)、100mmol/L氯化铵-氨水缓冲液(pH 8.0～10.0)、100mmol/L磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液(pH 11.0～12.0)；参照实施例2，以配置得到的pH缓冲液代替亮氨酸脱氢酶突变体活性测定方法中的Tris-HCL 缓冲液(100mmol/L，pH9.0)，在30℃下测定实施例1获得的野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G对4-苯基-2-丁酮的催化活性，以活性最高的为100％，其余活性与之相比计算相对活性，以考察野生型、突变体A115G/T136A、 A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的最适作用pH(检测结果见图7)；
配制pH值分别为6.5～10.0的pH缓冲液；参照实施例2，以配置得到的pH缓冲液代替亮氨酸脱氢酶突变体活性测定方法中的Tris-HCL缓冲液(100mmol/L，pH 9.0)，将实施例1获得的野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G 分别在上述缓冲体系下于30℃保存1h后，在30℃下测定野生型、突变体A115G/T136A、 A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的催化活性，以在不同pH的缓冲中保存前的活性为100％，保存后的剩余活性与之相比计算残留活性，以考察野生型、突变体A115G/T136A、 A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的pH稳定性(检测结果见图8)。
由图2可知，突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的最适pH和野生型相同，都是9.0。
由图3可知，突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G在pH 为9.0的条件下保存1h后的残留活性分别为43％、56％和38％，而野生型在相同条件下的残留活性仅为28％，可见，突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、 A115G/T136A/L42G的pH稳定性优于野生型。
(2)不同亮氨酸脱氢酶突变体的最适温度及温度稳定性
将实施例1获得的野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、 A115G/T136A/L42G浓缩酶液在温度范围10-90℃的水浴锅中温浴2min，参照实施例2，在 30℃下测定温浴2min后的野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G对4-苯基-2-丁酮的催化活性，以活性最高的为100％，其余活性与之相比计算相对活性，以考察野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、 A115G/T136A/L42G的最适作用温度(检测结果见图9)；
将实施例1获得的野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、 A115G/T136A/L42G浓缩酶液在温度范围30-70℃的水浴锅中温浴15min，在30℃下测定温浴 15min后的野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G对4- 苯基-2-丁酮的催化活性，以不同温度温浴前的活性为100％，温浴后的剩余活性与之相比计算相对活性，以考察野生型、突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、 A115G/T136A/L42G的温度稳定性(检测结果见图10)。
由图4可知，突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的最适pH和野生型相同，都是60℃。
由图3可知，突变体A115G/T136A、A115G/T136A/L42A、A115G/T136A/L42G的T50 15(温浴15min后的活性为温浴前活性一半所对应的温度)值分别为63℃、64℃和66℃，而野生型在相同条件下的T50 15值为61℃，可见，突变体A115G/T136A/L42A 的温度稳定性优于野生型。
实施例5：亮氨酸脱氢酶突变体A115G/T136A/L42G的应用
在NH4Cl-NH4OH缓冲液(1mol/L，pH 9.0)中加入实施例1获得的突变体 A115G/T136A/L42G的浓缩纯酶(1U)、葡萄糖脱氢酶(1.5U)、4-苯基-2-丁酮(100mmol/L)、葡萄糖(150mmol/L)以及NAD+(1mmol/L)，得到1mL的反应体系；将反应体系在30℃、 200rpm的条件下反应10h，得到反应液；每隔2h取样，样品用NaOH水溶液(200μL，10 mol/L)淬灭，并用甲基叔丁基醚(500μL，两次)萃取后通过GC-MS(气相色谱)测定反应液中底物4-苯基-2-丁酮的转化率，转化率为95％；测定条件为：安捷伦J&W CP-Chiralsil-DEX CB GC色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)；柱温程序为：从90℃开始，保持0min，20℃ min-1上升至170℃，保持2min，然后以10℃ min-1上升至200℃，保持1min。
通过GC-FID(气相色谱)得到反应液中产物(R)-4-苯基-2-丁胺的气相色谱图(检测结果见图11)；测定条件为：安捷伦J&W CP-Chiralsil-DEX CB GC色谱柱(25 m×0.32mm×0.25μm)；柱温程序为：从90℃开始，保持0min，20℃ min-1上升至170℃，保持2min，然后以10℃ min-1上升至200℃，保持1min。
通过GC-FID(气相色谱)测定反应液中产物(R)-4-苯基-2-丁胺的光学纯度，光学纯度 (ee值)为99％；测定条件为：安捷伦J&W CP-Chiralsil-DEX CB GC色谱柱(25 m×0.32mm×0.25μm)；柱温程序为：从90℃开始，保持0min，20℃ min-1上升至170℃，保持2min，然后以10℃ min-1上升至200℃，保持1min。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 亮氨酸脱氢酶突变体及其在芳香族手性胺合成中的应用
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 366
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 1
Met Ala Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala
20 25 30
Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp
35 40 45
Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala
50 55 60
Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly
65 70 75 80
Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala
85 90 95
Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr
100 105 110
Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile
115 120 125
His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser
130 135 140
Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met
145 150 155 160
Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys
165 170 175
Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys
180 185 190
His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys
195 200 205
Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Thr Ala Val Glu
210 215 220
Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys
245 250 255
Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly
260 265 270
Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile
275 280 285
Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn
290 295 300
Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala
305 310 315 320
Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala
325 330 335
Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Thr Arg
340 345 350
Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly Arg Asp Ile Ile Ser Arg Arg
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<211> 1101
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 2
atggcattag aaatcttcga atacttagaa aaatatgatt atgagcaagt agtattttgt 60
caagataaag aatcaggttt aaaagcaatt attgcaattc atgatacaac acttggaccg 120
gctcttggtg gaacaagaat gtggacatat gattctgaag aagcggcgat tgaagatgca 180
ttgcgtcttg caaaagggat gacatacaaa aacgcagcag ctggtttaaa cttaggtggt 240
gcaaaaacag taattatcgg tgatccacgt aaagataaga gcgaagcaat gttccgtgcg 300
ttaggccgtt acattcaagg attaaacgga cgttacatta cagctgaaga tgttggtaca 360
actgtagatg atatggatat tatccacgaa gaaactgact ttgtaacagg gatttcacca 420
tcattcggtt cttctggtaa cccatctcca gtaactgcat acggtgttta ccgtggtatg 480
aaagcagctg caaaagaagc tttcggtact gataatttag aaggaaaagt aattgctgtt 540
caaggtgttg gtaacgtagc atatcaccta tgcaaacatt tacacgctga aggagcaaaa 600
ttaatcgtta cagatattaa taaagaagct gtacaacgtg cggtagaaga atttggtgcg 660
acagctgttg aaccaaatga gatttacggt gttgaatgtg atatttacgc accatgtgca 720
ttaggcgcaa cagtaaatga tgaaactatt ccacaactta aagcaaaagt aatcgcaggt 780
tctgcaaata accaattaaa agaagatcgt cacggcgaca tcattcatga aatgggtatt 840
gtatacgcgc cagactatgt tattaatgca ggtggcgtaa ttaacgtagc agacgagtta 900
tatggatata atagagaacg tgcattaaaa cgcgttgagt caatttatga cacaattgca 960
aaagtaatcg aaatttcaaa acgcgatggc attgcaactt atgtagcagc agatcgtcta 1020
gctgaagagc gcattgcaag cttgaaaaac actcgtagca catacttacg caacggtcgc 1080
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
accggctgca ggtggaacaa gaat 24
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acattcttgt tccacctgca gccg 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
accggctggc ggtggaacaa gaat 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acattcttgt tccaccgcca gccg 24
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcttggtgga gcaagaatgt ggacatatg 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
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aatcatatgt ccacattctt gctccacca 29
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<213> 人工序列
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gacgttacat tgcaggtgaa gatgttggta 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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atcttcacct gcaatgtaac gtccgtttaa 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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gacgttacat tacaggtgcc gatgttggta 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atcggcacct gtaatgtaac gtccgtttaa 30

Claims (9)

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第70位赖氨酸突变为丝氨酸、第263位天冬酰胺突变为亮氨酸、第115位丙氨酸突变为甘氨酸、第136位苏氨酸突变为丙氨酸以及第42位亮氨酸突变为丙氨酸得到的；
或者，所述亮氨酸脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亮氨酸脱氢酶的第70位赖氨酸突变为丝氨酸、第263位天冬酰胺突变为亮氨酸、第115位丙氨酸突变为甘氨酸、第136位苏氨酸突变为丙氨酸以及第42位亮氨酸突变为甘氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒的宿主细胞。
5.权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体或权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒或权利要求4所述宿主细胞在制备芳香族手性胺中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述芳香族手性胺为（R）-4-苯基-2-丁胺或（R）-苯丙胺。
7.权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体或权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒或权利要求4所述宿主细胞在制备地瓦洛尔或坦索洛新中的应用。
8.一种生产芳香族手性胺的方法，其特征在于，所述方法为以芳香族手性酮为底物，将权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体加入含有芳香族手性酮的反应体系中进行反应，得到芳香族手性胺。
9.如权利要求8所述的一种生产芳香族手性胺的方法，其特征在于，所述芳香族手性酮为4-苯基-2-丁酮或苯基丙酮。
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