CN110938580A

CN110938580A - 一种提高d-酪氨酸生产效率的方法

Info

Publication number: CN110938580A
Application number: CN201911363367.9A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 王金辉; 刘佳; 宋伟; 陈修来; 高聪; 罗秋玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明公开了一种提高D‑酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段构建了一株双质粒共表达的重组菌，同时实现三种酶的高效表达，将L‑酪氨酸转化为D‑酪氨酸，并通过偶联辅酶再生系统，将NADP⁺转化为NADPH，使得NADPH循环再生，转化能够高效进行。并通过优化全细胞转化条件，实现了D‑酪氨酸的高效生产。通过本发明生产的D‑酪氨酸产量可达8.4g/L，转化率达93％。

Description

一种提高D-酪氨酸生产效率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高D-酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-酪氨酸是一种非天然手性氨基酸，是多肽药物和抗肿瘤手性药物的重要中间体。以D-酪氨酸为手性前体可合成阿托西班、多肽、茴香霉素等物质，其中，阿托西班是一种保胎药；多肽在恶性肿瘤的治疗中具有特殊疗效；茴香霉素能够抗原虫、抗真菌、抗变形虫和抗肿瘤。

目前，D-酪氨酸的合成方法主要包括化学拆分法、生物拆分法和酶转化法。化学拆分法面临拆分试剂贵、反应条件苛刻、产物收率低的问题。生物拆分法是利用普通变性杆菌细胞为生物催化剂，选择性降解D/L-酪氨酸中的L-酪氨酸来制备D-酪氨酸，但收率也极低。而酶转化法反应条件温和、立体选择性高、效率高，且方便快捷易操作，具有广阔的工业化开发前景。但目前有关酶转化法生产D-酪氨酸的报道较少，有文献利用奇异变形杆菌来源的L-氨基酸脱氨酶、嗜热共生细菌来源的D-氨基酸脱氢酶转化L-酪氨酸来生产D-酪氨酸，并利用稳定伯克霍尔德菌来源的甲酸脱氢酶来实现辅酶NADPH的再生。但该级联系统对L-酪氨酸的转化率较低，只有45.3％。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)选自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码L-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述D-氨基酸脱氢酶(D-AADH)选自文献中报道的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述D-氨基酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶(GDH)选自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明第二个目的在于提供了一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，所述方法为利用上述重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生体系。

在本发明的一种实施方式中，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP⁺转化为NADPH的辅酶再生系统。

在本发明的一种实施方式中，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～1500mmol/L，NADP⁺浓度为0.4～0.6mmol/L，所述重组菌经培养后以菌液的形式添加，转化温度为15～37℃，转化pH为7～9，转化的时间为20～24h。

在本发明的一种实施方式中，所述菌液的制备方式为离心收集菌体后溶于pH为7.0～9.0的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，菌体的添加量为10～30g/L。

本发明的第三个目的在于提供上述重组菌在食品、制药或化工中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明所提供的利用重组菌转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法中，转化底物为价格低廉的L-酪氨酸，三种酶可在一种重组菌中同时高效表达，所述重组菌可大量培养，不需经过细胞破碎、冷冻干燥等处理过程，成本较低且操作简便，依据本发明可建立一个高效、低成本、易于工业化放大生产的生物酶法合成工艺。

(2)本发明所述的生产方法在将中间产物转化为D-酪氨酸的过程中利用辅酶再生系统，将NADP⁺转化为NADPH，使得NADPH在体系中能循环再生，转化能够高效进行。

(3)本方法具有专一性强、底物成本低、产物光学纯度高等优点，采用本方法制备D-酪氨酸，添加L-酪氨酸50mmol/L，D-酪氨酸产量为8.4g/L，转化率达93％以上，转化周期需24h。

附图说明

图1：转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的反应原理图。

图2：不同缓冲液种类对转化率的影响。

图3：不同缓冲液pH对转化率的影响。

图4：底物浓度对转化率的影响。

具体实施方式

种子培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L。

发酵培养基：胰蛋白胨12g，酵母膏24g，甘油4g，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g，蒸馏水定容至1L。

样品制备：取1mL转化后的溶液，离心机12000rpm离心10min，取上清液经一定倍数稀释后，过0.22μm水系膜过滤，滤液用来液相色谱分析。

D-酪氨酸含量的测定：安捷伦高效液相色谱仪，采用色谱柱:Daicel CrownpakCR-I(+)(150×3mm，5μm；Daicel Co.，Japan)色谱柱，流动相为pH 1.5HClO₄：乙腈＝4：1，流速0.4mL/min，紫外检测器，检测波长210nm，柱温25℃。

L-氨基酸脱氨酶的酶活定义及测定方法：L-氨基酸脱氨酶的酶活是在50mmol/LL-酪氨酸，200mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，pH 8.0，25℃条件下反应15min，通过HPLC测定L-酪氨酸的减少量。酶活单位U定义为1min内L-酪氨酸减少1μmol所需的酶量。

D-氨基酸脱氢酶的酶活定义及测定方法：D-氨基酸脱氢酶的酶活是在50mmol/L对羟基苯丙酮酸，500mmol/L氯化铵，0.5mmol/L NADPH，200mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，pH8.0，25℃条件下反应15min，通过测定340nm吸光度来检测NADPH的减少量。酶活单位U定义为1min内NADPH减少1μmol所需的酶量。

葡萄糖脱氢酶的酶活定义及测定方法：葡萄糖脱氢酶的酶活是在200mmol/L D-葡萄糖，0.5mmol/L NADP⁺，200mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，pH 8.0，25℃条件下反应15min，通过测定340nm吸光度来检测NADPH的增加量。酶活单位U定义为1min内NADPH增加1μmol所需的酶量。

转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的反应原理见图1。

实施例1：重组质粒pRSFDuet-1-PmLAAD的构建

人工合成的经过密码子优化的含有SacI和SalI酶切位点的PmLAAD基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，用限制性内切酶SacI和SalI将PmLAAD基因和质粒pRSFDuet-137℃酶切2h，用T₄连接酶将酶切并胶回收后的PmLAAD基因和质粒pRSFDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有卡纳霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pRSFDuet-1-PmLAAD。

实施例2：重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH的构建

人工合成的经过密码子优化的含有EcoRI和SalI酶切位点的CgDAPDH基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，用限制性内切酶EcoRI和SalI将CgDAPDH基因和质粒pACYCDuet-1 37℃酶切2h，用T₄连接酶将酶切并胶回收后的CgDAPDH基因和质粒pACYCDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氯霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH。

实施例3：重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH-BmGDH的构建

以巨大芽孢杆菌的基因组为模板，以5，gaagatctcatgtataaagatttagaagg3，为正向引物，以5，ccgctcgagttatccgcgtcctgcttg3，为反向引物(划线部分分别为BglⅡ和XhoⅠ的酶切位点)扩增获得BmGDH基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)，用限制性内切酶BglⅡ和XhoI将BmGDH基因和实施例2构得的质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH 37℃酶切2h，用T₄连接酶将酶切并胶回收后的BmGDH基因和质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氯霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH-BmGDH。

实施例4：双质粒重组大肠杆菌的构建和表达

将实施例1构得的质粒pRSFDuet-1-PmLAAD和实施例3构得的质粒pACYCDuet-1-CgDAPDH-BmGDH经化学转化法同时转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有卡那霉素和氯霉素两种抗性的LB平板中培养12h，将平板中长出的单菌落，接种于含有卡那霉素和氯霉素抗性的种子培养基中，37℃、200rpm过夜培养。以2％(v/v)的接种量转接到100mL含有卡那霉素和氯霉素抗性的发酵培养基中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，25℃、200rpm下诱导12h后收集菌体用于全细胞转化。将全细胞超声波碎，测定酶活，结果显示，L-氨基酸脱氨酶的酶活为0.423U/mg蛋白；D-氨基酸脱氢酶的酶活为0.028U/mg蛋白；葡萄糖脱氢酶的酶活为1.203U/mg蛋白。

实施例5：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化条件的优化

取实施例4中获得的湿菌体，离心收集菌体后作为催化剂进行全细胞转化。在L-酪氨酸浓度为50mmol/L，氯化铵浓度为500mmol/L，葡萄糖浓度为300mmol/L，NADP⁺浓度为0.5mmol/L时，分别在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液或Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液条件下25℃转化24h，结果如图2所示，当缓冲液为Na₂CO₃-NaHCO₃时，转化率为87％，产量为7.9g/L。

在L-酪氨酸浓度为50mmol/L，氯化铵浓度为500mmol/L，葡萄糖浓度为300mmol/L，NADP⁺浓度为0.5mmol/L时，分别在不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液条件下25℃转化24h，结果如图3所示，Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液pH为7.5～9.0时，转化率为76～93％，产量达6.9～8.4g/L；Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液pH为8.0时，转化率为93％，产量为8.4g/L。

在NADP⁺浓度为0.5mmol/L时，加入不同浓度的L-酪氨酸(50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L)，6倍L-酪氨酸摩尔浓度的葡萄糖，10倍L-酪氨酸摩尔浓度的氯化铵，25℃转化24h，结果如图4所示，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L时，转化率为50～93％，产量达8.4～16.9g/L；当L-酪氨酸浓度为50mmol/L时，转化率为93％，产量为8.4g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高D-酪氨酸生产效率的方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60

ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatctaga 120

gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180

ggtgccggta ttcaggggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240

actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300

attagttacc aaacatcacc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360

cgtggcatga atgagaaaat tggtgcagat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420

gcgctggcag atgaaaaagc attagataaa gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480

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cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600

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atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaaaat ctctgatgtg 720

gtgagtgaga aaggggcgat taaaacttct caagttgtac tcgccggggg tatctggtca 780

cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatctcaa 840

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

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20 25 30

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35 40 45

Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ala Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile

50 55 60

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65 70 75 80

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Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu

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His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly

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130 135 140

Glu Lys Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ala Trp Ile Lys Thr Ala Lys Glu

145 150 155 160

Ala Ala Gly Phe Asp Thr Pro Leu Asn Thr Arg Ile Ile Lys Gly Glu

165 170 175

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210 215 220

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225 230 235 240

Val Ser Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Gln Val Val Leu Ala Gly

245 250 255

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290 295 300

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<213> 人工序列

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Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Ile Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu

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<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌

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Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagatctca tgtataaaga tttagaagg 29

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgctcgagt tatccgcgtc ctgcttg 27

Claims

1.一种生产D-酪氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶选自奇异变形杆菌，所述D-氨基酸脱氢酶选自谷氨酸棒状杆菌，所述葡萄糖脱氢酶选自巨大芽孢杆菌。

4.根据权利要求1-3任一所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

5.一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1-4任一所述的重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生系统。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP⁺转化为NADPH。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化条件是：pH 7～9，转化温度为15～37℃，转化时间20～24h。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用权利要求1-4任一所述的重组菌的湿细胞进行转化。

9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～1500mmol/L，NADP⁺浓度为0.4～0.6mmol/L。

10.权利要求1-4任一所述的重组菌在食品、制药或化工领域的应用。