CN114107246B - 尿苷-胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了尿苷‑胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用，属于酶工程和生物催化领域。本发明通过采用定点突变技术对尿苷‑胞苷激酶进行定点突变，提高尿苷‑胞苷激酶的催化效率，并耦合乙酸激酶进行催化，高效催化5’‑胞苷生产5’‑胞苷酸，可以高效生产5’‑胞苷酸(5’‑CMP)。采用本发明获得的尿苷‑胞苷激酶突变体，并耦合乙酸激酶后，可以高效生产5’‑胞苷酸，催化2.5h时，转化率可达98％，可促进其在医药等领域中的应用。这种高效尿苷‑胞苷激酶可用于实现5’‑CMP的工业化生产，利于降低其生产成本及环境污染，实现绿色生物制造。

Description

尿苷-胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用
技术领域
本发明涉及尿苷-胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用，属于酶工程和生物催化领域。
背景技术
核苷酸主要参与构成核酸，且具有重要的生物学功能。核苷酸及其衍生物可广泛应用与农业生产、食品、医药等领域。化学法合成核苷酸通常以三氯氧磷为磷酸供体，将核苷直接磷酸化生产相应核苷酸。但此种化学法合成5’-胞苷酸时，需要在核糖的2’,3’-羟基上加上保护基团，再进行磷酸化反应。化学法合成核苷酸操作步骤多、路线长、立体选择性差、试剂昂贵且试剂有毒、可操作性差、生产成本高，不适合大规模绿色生产。
核糖核酸(RNA)降解也可以用于生产5’-胞苷酸，需要经分离纯化获得纯的5’-胞苷酸。该方法可以一次获得4种产物，但除了5’-胞苷酸外，其他三种均为反应的副产物。同时，作为降解的原料(RNA)也存在诸多限制，如RNA的来源并不广泛，而且该降解RNA生产5’-胞苷酸工艺中的分离操作复杂，目标产物收率降低。
采用酶催化方法，以胞苷为底物生产胞苷酸，酶催化反应具有诸多优点，例如较为温和、对环境、设备及操作人员均无害。重组表达酶的菌株，经过细胞破壁后，离心分离上清液，采用含有粗酶液的细胞破壁上清液直接催化底物生产胞苷酸，减少了酶蛋白的纯化、分离等操作步骤，极大的简化了生产工艺，节约了生产成本。例如，记载于公开号为CN111269870A的发明专利中，采用重组大肠杆菌表达胞苷激酶，采用粗酶液催化底物胞苷及ATP，转化生成胞苷酸的转化率可达85％。但其酶的催化效率没有达到足够高的水平，这将降低酶催化反应的效率，增加生产周期，通过蛋白质工程，因此，一种对酶蛋白进行分子改造，进而提高酶的催化效率的方法十分必要。
发明内容
为解决上述技术问题，采用定点突变技术对尿苷-胞苷激酶进行定点突变，提高尿苷-胞苷激酶的催化效率，并耦合乙酸激酶进行催化，高效催化5’-胞苷生产5’-胞苷酸，可以高效生产5’-胞苷酸(5’-CMP)，促进其在医药等领域中的应用。
本发明提供了一种尿苷-胞苷激酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的尿苷-胞苷激酶的第100位进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述尿苷-胞苷激酶来源于大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，编码所述尿苷-胞苷激酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为：
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷-胞苷激酶的第100位的组氨酸突变为苯丙氨酸得到的，突变体命名为H100F；
或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷-胞苷激酶的第100位的组氨酸突变为酪氨酸得到的，突变体命名为H100Y。
本发明还提供了编码上述尿苷-胞苷激酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET22b质粒、pET28a质粒或pRSFDuet-1质粒为表达载体。
本发明还提供了携带上述基因，或上述重组载体的微生物细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
本发明还提供了一种生产5’-胞苷酸(5’-CMP)的方法，所述方法为：将上述尿苷-胞苷激酶突变体，或上述微生物细胞添加至含有胞苷、磷酸盐、Mg2+、GTP、乙酸激酶的反应体系中，进行反应制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述乙酸激酶来源于保加利亚乳杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述乙酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，胞苷添加的终浓度为40～100mM。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，磷酸盐添加的终浓度为10～100mM。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐为：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，Mg2+添加的终浓度为1～50mM。
在本发明的一种实施方式中，所述Mg2+为：MgCl2或MgSO4。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，GTP添加的终浓度为0.1～6mM。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，尿苷-胞苷激酶突变体的添加量为1～10U/mL。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中，乙酸激酶的添加量为1～10U/mL。
本发明还提供了上述尿苷-胞苷激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述重组大肠杆菌在制备胞苷酸，或含有胞苷酸的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
有益效果
(1)本发明通过采用定点突变技术对尿苷-胞苷激酶进行定点突变，提高尿苷-胞苷激酶的催化效率，酶突变体的催化效率最高提高至对照的1.7倍；采用相同的质粒pRSFDuet共表达基因udk和ack，混合后实现尿苷-胞苷激酶耦合乙酸激酶的高效催化，减少单一质粒表达尿苷-胞苷激酶后酶的用量。
(2)本发明的尿苷-胞苷激酶突变体可高效催化5’-胞苷生产5’-胞苷酸，可以高效生产5’-胞苷酸(5’-CMP)，转化效率可达98％以上。采用本发明获得的尿苷-胞苷激酶突变体，并耦合乙酸激酶后，可以高效生产5’-胞苷酸，可促进其在医药等领域中的应用。
附图说明
图1：重组菌E.coli pRSFDuet-udk-ack和E.coli pRSFDuet-udk表达尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶的SDS-PAGE图。
图2：大肠杆菌来源的尿苷-胞苷激酶基因序列比对及其三级结构同源建模分析图。
图3：尿苷-胞苷激酶突变体H100F和H100Y表达的SDS-PAGE图。
图4：尿苷-胞苷激酶催化胞苷产5’-胞苷酸的HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所涉及的pRSFDuet质粒购自Novagen。下述实施例中所涉及的胞苷、GTP购自默克Sigma-Aldrich，下述实施例中所涉及的Mg2+可为：MgCl2、MgSO4中的任一种，本发明仅采用MgCl2，下述实施例中所涉及的磷酸盐可为：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾中的任一种，本发明仅采用磷酸氢二钠/磷酸二氢钠。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
TB液体培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/LKH2PO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g KH2PO4溶在足量的水中，使终体积为100mL)。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
尿苷-胞苷激酶酶活的检测：底物胞苷的浓度为45mM，磷酸盐浓度为30mM(pH7.0)，Mg2+浓度为25mM，GTP浓度为2.5mM，尿苷-胞苷激酶3.5U/mL，乙酸激酶7.0U/mL，催化温度为30℃，酶活力单位定义为：在酶活力测定条件下，每分钟催化底物胞苷生产1μmol/L胞苷酸所需的酶量为一个酶活力单位，U。
乙酸激酶酶活的检测：以4mM GDP和15mM ACP为底物，加入0.1mL乙酸激酶和25mMMg2+、磷酸盐缓冲液，37℃反应5min，取20μL反应液加入去离子水至1mL，沸水浴2min终止反应，将稀释后的反应液用HPLC测定成分，计算酶活力，酶活力单位定义为：酶催化底物，每分钟生产1μmol产物所需的酶量，为一个酶活力单位，U。
kcat和Km值的测定：
采用与乙酸激酶偶联的方法测定，kcat和Km值是通过使用NADH依赖型酶偶联测定。温度为30℃，胞苷浓度为30-320μM，Mg2+浓度为25mM，GTP浓度为2.5mM，磷酸盐浓度为30mM(pH 7.0)。
催化生产5’-胞苷酸(5’-CMP)方法为：其底物胞苷的浓度为45mM，磷酸盐浓度为30mM(pH 7.0)，Mg2+浓度为25mM，GTP浓度为2.5mM，尿苷-胞苷激酶1mL，乙酸激酶1mL，催化温度为30℃，时间为：2-3h。
胞苷酸含量的检测方法：液相色谱仪岛津10A，色谱柱：INERTSIL ODS-SP 5μm4.6*250mm，流动相：缓冲液配制：0.1mol/L磷酸二氢钾水溶液：0.01mol/L的四丁基氢氧化铵：甲醇＝95：95：10，然后磷酸调节pH至4.5，波长：276nm，流速：1.0ml/min。
5’-胞苷酸转化率的计算方法：实际生成5’-胞苷酸的量*100％/理论生成5’-胞苷酸的量。
实施例1：尿苷-胞苷激酶野生酶和乙酸激酶的制备
具体步骤如下：
(1)本实施例采用分子生物学手段，设计引物PCR扩增E.coli来源的尿苷-胞苷激酶基因udk(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中大肠杆菌来源的尿苷-胞苷激酶基因序列比对及其三级结构同源建模分析如图2所示)和保加利亚乳杆菌来源的乙酸激酶基因ack(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，采用质粒pRSFDuet共表达；同时，采用质粒pRSFDuet表达尿苷-胞苷激酶基因udk。
具体引物：
Ec-udk-FW：catgccatgggcactgatcagtctcatcagtg；
Ec-udk-RS：cgggatccttattcaaagaactgactta；
Lb-ack-FW：ggaattccatatggacaagattttagcaatcaa；
Lb-ack-RS：ggggtaccttacttaagcttggccaaac。
PCR扩增的条件：预变性98℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃(酶的延伸速度为1kb/min，具体时间根据扩增片段的长度来设置)；设置循环30次；再延伸72℃，10min；最后16℃保温。PCR扩增的体系：5×PS buffer 20μL，dNTP 10μL，上游/下游引物(10μmol·L-1)2μL，模板1μL，酶1μL，水66μL。
(2)尿苷-胞苷激酶基因udk采用酶切位点Nco I和BamH I连接在质粒pRSFDuet上获得重组质粒pRSFDuet-udk；
乙酸激酶基因ack采用酶切位点Nde I和Kpn I连接在质粒pRSFDuet-udk上获得重组质粒pRSFDuet-udk-ack。同时将该序列送至测序公司测序验证正确。
分别构建获得含有尿苷-胞苷激酶基因udk的重组质粒pRSFDuet-udk；
及同时含有尿苷-胞苷激酶基因udk和乙酸激酶基因ack的重组质粒pRSFDuet-udk-ack。
(3)分别将重组质粒pRSFDuet-udk、pRSFDuet-udk-ack导入大肠杆菌BL21(DE3)中，制备得到可同时表达尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶的重组菌E.coli pRSFDuet-udk-ack；及表达尿苷-胞苷激酶的重组菌E.coli pRSFDuet-udk。
(4)分别将步骤(3)制备得到重组菌E.coli pRSFDuet-udk-ack、E.colipRSFDuet-udk接种至LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养10h，制备得到种子液，将上述种子液按照1％(v/v)的接种量接种至TB液体培养基中，在37℃发酵培养至OD600＝0.8时，添加终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG 0.5mL，在25℃诱导发酵36h，制备得到发酵液。
将发酵液离心，获得菌体细胞，采用超声破碎方法破壁菌体细胞。将破壁后的菌体细胞离心后，取破壁细胞上清液进行琼脂糖-凝胶电泳分析，由图1可知，结果显示，在重组菌E.coli pRSFDuet-udk-ack的发酵液中成功表达尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶；在重组菌E.coli pRSFDuet-udk的发酵液中成功表达尿苷-胞苷激酶。
分别制备得到含有udk-ack的粗酶液和含有udk的粗酶液。
实施例2：尿苷-胞苷激酶突变体的制备
具体步骤如下：
(1)以实施例1制备得到的含有尿苷-胞苷激酶基因udk的重组质粒pRSFDuet-udk为模板，采用引物H100F_FW:cagctatgttgaattcacgcgtatgaaag和H100F_RS:ctttcatacgcgtgaattcaacatagctg，进行PCR扩增，获得含有udk突变体H100F基因的重组质粒pRSFDuet-H100F。
PCR扩增的条件：预变性98℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃，1min；设置循环29次；再延伸72℃，10min；最后16℃保温。PCR扩增的体系：5×PS buffer 20μL，dNTP 10μL，上游/下游引物(10μmol·L-1)2μL，模板1μL，酶1μL，水66μL。利用PCR获得重组质粒pRSFDuet-H100F，转化大肠杆菌JM109，涂布LB平板筛选获得阳性克隆，提取质粒进行基因测序验证正确。
(2)将构建获得的重组质粒pRSFDuet-H100F转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得可以表达突变体H100F的重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-H100F。
(3)将突变体基因H100F采用酶切位点Nco I和BamH I连接在实施例1制备得到的重组质粒pRSFDuet-ack上，获得重组质粒pRSFDuet-H100F-ack。将构建获得的重组质粒pRSFDuet-H100F-ack转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得可以共表达突变体H100F和乙酸激酶的重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-H100F-ack。
(4)采用(1)～(3)的方法，构建获得含突变体H100Y的重组质粒pRSFDuet-H100Y和pRSFDuet-H100Y-ack，同时构建获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-H100Y-ack和E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-H100Y；所涉及的引物如下：
H100Y_FW:cagctatgttgaatacacgcgtatgaaag，
H100Y_RS:ctttcatacgcgtgtattcaacatagctg。
(5)分别将步骤(3)～(4)制备得到重组菌接种至LB液体培养基中，在30℃和200rpm条件下培养10h，分别制备得到种子液；
分别将上述种子液按照1％(v/v)的接种量接种至TB液体培养基中，在37℃发酵培养至OD600＝0.8时，添加终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG 0.5mL，在25℃诱导发酵36h，制备得到发酵液；
将发酵液离心，获得菌体细胞，采用超声破碎方法破壁菌体细胞。将破壁后的菌体细胞离心后，取破壁细胞上清液进行琼脂糖-凝胶电泳分析，结果如图3所示，由图3可知，结果显示，尿苷-胞苷激酶突变体得到了表达。
分别制备得到含有H100Y-ack的粗酶液，含有H100Y的粗酶液，含有H100 F的粗酶液，含有H100F-ack的粗酶液。
分别检测上述制备得到的野生酶WT粗酶液及突变体粗酶液的酶活，其中，经检测，乙酸激酶酶活力为15U/mL；尿苷-胞苷激酶野生酶WT粗酶液及突变体酶活力的结果如表1所示：
表1粗酶液的酶活力
实施例3：尿苷-胞苷激酶突变体催化效率
分别采用含有野生型udk-ack的粗酶液，含有突变体H100Y-ack的粗酶液，含有突变体H100F-ack的粗酶液催化胞苷生产5’-胞苷酸，分别检测尿苷-胞苷激酶的动力学参数，结果如表2及图4所示。
表2尿苷-胞苷激酶及其突变体H100F和H100Y的动力学参数
参数 kcat(s-1) Km(μM) kcat/Km(M-1s-1)
WT 7.3 230 3.2*104
H100F 7.2 133 5.5*104
H100Y 3.5 91 3.8*104
经测定：
野生型的尿苷-胞苷激酶的动力学参数分别为kcat值为7.3s-1，Km值为230μM，kcat/Km值为3.2*104M-1·s-1。
尿苷-胞苷激酶突变体H100F的动力学参数：kcat值为7.2s-1，Km值为133μM，kcat/Km值为5.5*104M-1·s-1；
尿苷-胞苷激酶突变体H100Y的动力学参数：kcat值为3.5s-1，Km值为91μM，kcat/Km值为3.8*104M-1·s-1。
由HPLC图可知(图4)，催化3h时，已经产生了大量的5’-胞苷酸，突变体H100F的5’-胞苷酸转化率可达97.5％，证明异源表达获得的催化体系，催化效率较高。
由此可以看出，尿苷-胞苷激酶突变体H100F和H100Y的催化效率均显著提高，说明该突变方式对提高尿苷-胞苷激酶的催化效率具有促进作用。
实施例4：胞苷酸的制备
利用尿苷-胞苷激酶突变体H100F和H100Y制备胞苷酸，具体步骤如下：
(1)反应体系(5mL)：
向含有30mM(pH 7.0)的磷酸盐溶液中，分别添加终浓度为45mM的胞苷，终浓度为25mM的Mg2+，终浓度为2.5mM的GTP，得到反应体系；
(2)分别向上述反应体系中添加1mL实施例2制备得到的udk-ack的粗酶液，H100Y-ack的粗酶液，H100F-ack的粗酶液，在如下条件下进行催化胞苷生产得到胞苷酸：底物胞苷的浓度为45mM，磷酸盐浓度为30mM(pH 7.0)，Mg2+浓度为25mM，GTP浓度为2.5mM，尿苷-胞苷激酶1mL，乙酸激酶1mL，催化温度为30℃，时间为：2.5h，检测结果如表3所示：
表3尿苷-胞苷激酶催化胞苷产胞苷酸
参数 5’-胞苷酸转化率(％)
WT 96
H100F 98
H100Y 98
结果显示，催化2.5h时，产生了大量的5’-胞苷酸，尿苷-胞苷激酶突变体H100F和H100Y的5’-胞苷酸转化率可达98.0％，证明尿苷-胞苷激酶突变体H100F和H100Y及其催化体系，具有高效的5’-胞苷酸转化率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏香地化学有限公司
江南大学
<120> 尿苷-胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用
<130> BAA211254A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Asp Gln Ser His Gln Cys Val Ile Ile Gly Ile Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Gly Lys Ser Leu Ile Ala Ser Thr Leu Tyr Arg Glu Leu
20 25 30
Arg Glu Gln Val Gly Asp Glu His Ile Gly Val Ile Pro Glu Asp Cys
35 40 45
Tyr Tyr Lys Asp Gln Ser His Leu Ser Met Glu Glu Arg Val Lys Thr
50 55 60
Asn Tyr Asp His Pro Ser Ala Met Asp His Ser Leu Leu Leu Glu His
65 70 75 80
Leu Gln Ala Leu Lys Arg Gly Ser Ala Ile Asp Leu Pro Val Tyr Ser
85 90 95
Tyr Val Glu His Thr Arg Met Lys Glu Thr Val Thr Val Glu Pro Lys
100 105 110
Lys Val Ile Ile Leu Glu Gly Ile Leu Leu Leu Thr Asp Ala Arg Leu
115 120 125
Arg Asp Glu Leu Asn Phe Ser Ile Phe Val Asp Thr Pro Leu Asp Ile
130 135 140
Cys Leu Met Arg Arg Ile Lys Arg Asp Val Asn Glu Arg Gly Arg Ser
145 150 155 160
Met Asp Ser Val Met Ala Gln Tyr Gln Lys Thr Val Arg Pro Met Phe
165 170 175
Leu Gln Phe Ile Glu Pro Ser Lys Gln Tyr Ala Asp Ile Ile Val Pro
180 185 190
Arg Gly Gly Lys Asn Arg Ile Ala Ile Asp Ile Leu Lys Ala Lys Ile
195 200 205
Ser Gln Phe Phe Glu
210
<210> 2
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgactgatc agtctcatca gtgcgtcatt atcggtatcg ctggcgcatc ggcttccggc 60
aagagtctta ttgccagtac cctttatcgt gaattgcgtg agcaagtcgg tgatgaacac 120
atcggcgtaa ttcccgaaga ctgctattac aaagatcaaa gccatctgtc gatggaagaa 180
cgcgttaaga ccaactacga ccatcccagc gcgatggatc acagtctgct gcttgagcat 240
ttacaagcgt tgaaacgcgg ctcggcaatt gacctgccgg tttacagcta tgttgaacat 300
acgcgtatga aagaaacggt gacggttgag ccgaagaagg tcatcattct cgaaggcatt 360
ttgttgctga cggatgcgcg tttgcgtgac gaacttaact tctccatttt cgttgatacc 420
ccgctggata tctgcctgat gcgccgcatc aagcgtgacg ttaacgagcg tgggcgttca 480
atggattcag tgatggcgca atatcaaaaa accgtgcgcc cgatgttcct gcaattcatt 540
gagccttcta aacaatatgc ggacattatc gtgccgcgcg gcgggaaaaa ccgcatcgcg 600
atcgatatat tgaaagcgaa aataagtcag ttctttgaat aa 642
<210> 3
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Asp Lys Ile Leu Ala Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Phe Lys Tyr
1 5 10 15
Lys Leu Phe Ser Leu Ala Asp Glu Ser Val Leu Ala Ser Gly Leu Gly
20 25 30
Asp Arg Ile Gly Ile Asp Gly Ser Thr Phe Ser Met Lys Leu Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Lys His Glu Val Glu Val Asp Leu Pro Asn Gln Glu Val Ala
50 55 60
Val Gln Thr Leu Leu Asp Trp Leu Lys Glu Tyr Gly Val Ile Ala Asp
65 70 75 80
Leu Lys Glu Ile Val Gly Val Gly His Arg Ile Val Asn Gly Gly Glu
85 90 95
Leu Phe Pro Asp Ser Ala Ile Ile Asp Lys Asp Asn Ile His Lys Val
100 105 110
Phe Asp Leu Thr Asn Tyr Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Glu Gly Arg
115 120 125
Glu Ile Gln Ala Phe Met Asn Ile Leu Pro Asp Val Pro Gln Val Gly
130 135 140
Val Phe Asp Thr Ser Phe His Gln Ser Met Asp Glu Val His Tyr Ile
145 150 155 160
Tyr Ser Leu Pro Tyr Glu Tyr Tyr Glu Lys Tyr Lys Ala Arg Lys Tyr
165 170 175
Gly Ala His Gly Thr Ser Val Arg Tyr Val Ser Gly Lys Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Leu Gly Lys Asp Leu Lys Asp Leu Lys Leu Val Val Cys His Leu
195 200 205
Gly Ser Gly Ala Ser Val Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Cys Tyr Asp
210 215 220
Thr Ser Met Gly Phe Ser Pro Leu Ala Gly Val Thr Met Gly Thr Arg
225 230 235 240
Ser Gly Asp Val Asp Pro Ser Val Leu Gln Tyr Ile Met Lys Lys Glu
245 250 255
Gly Ile Thr Asp Phe Asn Glu Met Ile Asp Ile Leu Asn Arg Lys Ser
260 265 270
Gly Leu Leu Gly Leu Ser Gly Ile Ser Ser Asp Met Arg Asp Ile Arg
275 280 285
Asn Ser Asp Asp Lys Arg Ala Arg Leu Ala Glu Ala Val Phe Ile Asn
290 295 300
Arg Val Val Arg Tyr Val Gly Ser Tyr Ile Ala Glu Met Gly Gly Ala
305 310 315 320
Asp Ala Val Val Phe Thr Ala Gly Ile Gly Glu His Asp Asp Val Arg
325 330 335
Glu Gly Val Met Lys Ser Leu Ser Phe Met Gly Val Asp Phe Asp Asp
340 345 350
Ala Ala Asn Lys Ala Ala Asn Glu Gly Phe Ile Thr Lys Glu Asp Ser
355 360 365
Lys Leu Ala Gly Leu Ile Ile Pro Thr Asp Glu Glu Leu Met Ile Glu
370 375 380
Arg Asp Val Val Arg Leu Ala Lys Leu Lys
385 390
<210> 4
<211> 1188
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggacaaga ttttagcaat caactctggt tcatcttcat ttaagtataa gctgttctca 60
ttagctgatg agagtgtctt agcttccggg ctgggcgacc gtattggtat cgatggttca 120
accttttcaa tgaagttggc tgatgggacc aagcatgaag ttgaagttga cttgccaaat 180
caggaagtag ccgtgcaaac cctgcttgac tggctgaaag aatatggcgt tattgcagac 240
ctcaaggaaa ttgtcggcgt tggccaccgg atcgtgaacg gcggggaatt gttcccagac 300
tcagcaatca tcgacaagga caacatccac aaggtttttg acttgactaa ctacgctcct 360
ctgcacaacc cggcagaggg ccgcgaaatt caagccttca tgaacatcct gccggacgtg 420
ccgcaagtcg gcgtctttga cacttccttc caccagtcaa tggatgaagt acactacatc 480
tactccttgc catacgaata ttacgagaag tacaaggccc gcaagtacgg cgcccacggc 540
acttctgtcc gctacgtttc cggcaaggcg gctgaattgc tgggcaagga cctcaaggac 600
cttaagctgg ttgtctgcca cctgggttca ggcgcttcag ttactgcggt taaggatggc 660
aagtgctacg acacttccat gggcttctca cctttggctg gggtaaccat ggggacccgg 720
tcaggtgacg ttgatccgtc agttctgcag tacatcatga agaaggaagg catcactgac 780
ttcaatgaaa tgatcgacat tttgaaccgc aaatcaggcc ttttgggcct ctccggtatc 840
tccagcgaca tgcgggacat cagaaacagt gatgacaagc gcgccaggct ggctgaggct 900
gtcttcatca accgggtagt ccgctacgtt ggctcttaca ttgctgaaat gggcggggca 960
gacgcggttg tcttcactgc cgggatcggc gaacacgatg atgtagtccg tgaaggggtc 1020
atgaagtcac tgtccttcat gggcgttgac tttgacgacg cagctaacaa ggctgctaat 1080
gaaggcttta tcaccaagga agattccaag ctggctggtt tgattattcc aactgacgaa 1140
gaattgatga tcgaacgtga cgttgtccgt ttggccaagc ttaagtaa 1188

Claims (9)

1.一种尿苷-胞苷激酶突变体，其特征在于，所述突变体为：
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷-胞苷激酶的第100位的组氨酸突变为苯丙氨酸得到的，突变体命名为H100F；
或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷-胞苷激酶的第100位的组氨酸突变为酪氨酸得到的，突变体命名为H100Y。
2.编码权利要求1所述的尿苷-胞苷激酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体以pET22b质粒、pET28a质粒或pRSFDuet-1质粒为表达载体。
5.携带权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述的重组载体的微生物细胞。
6.如权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
7.一种生产5’-胞苷酸（5’-CMP）的方法，其特征在于，将权利要求1所述的尿苷-胞苷激酶突变体，或权利要求5或6所述的微生物细胞添加至含有胞苷、磷酸盐、Mg2+、GTP和乙酸激酶的反应体系中，进行反应制备得到。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的乙酸激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；反应体系中，胞苷的浓度为40~100 mM，磷酸盐浓度为10~100 mM，Mg2+浓度为1~50mM，GTP浓度为0.1~6 mM，尿苷-胞苷激酶突变体的添加量 1~10 U/mL，乙酸激酶的添加量1~10 U/mL。
9.权利要求1所述的尿苷-胞苷激酶突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3或4所述的重组载体，或权利要求5或6所述的微生物细胞在制备胞苷酸，或含有胞苷酸的产品中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161536A (zh) * 2018-08-20 2019-01-08 天津科技大学 制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法
CN111321103A (zh) * 2020-03-17 2020-06-23 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种高产胞苷的大肠杆菌突变株以及发酵生产胞苷的方法
EP3892731A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Enzymatic method for preparation of cmp-neu5ac

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161536A (zh) * 2018-08-20 2019-01-08 天津科技大学 制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法
CN111321103A (zh) * 2020-03-17 2020-06-23 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种高产胞苷的大肠杆菌突变株以及发酵生产胞苷的方法
EP3892731A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Enzymatic method for preparation of cmp-neu5ac

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecular mechanisms of substrate specificities of uridinecytidine kinase;Wataru Tanaka;Biophys Physicobiol .;第13卷;全文 *

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