CN112226420A - 一种硝基还原酶突变体及其应用 - Google Patents

一种硝基还原酶突变体及其应用 Download PDF

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CN112226420A CN202011057803.2A CN202011057803A CN112226420A CN 112226420 A CN112226420 A CN 112226420A CN 202011057803 A CN202011057803 A CN 202011057803A CN 112226420 A CN112226420 A CN 112226420A
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王仲清
张琴
卢松泉
杨虎
罗忠华
黄芳芳
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Sunshine Lake Pharma Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种硝基还原酶突变体及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示的硝基还原酶突变体，及其核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示的编码基因；所述硝基还原酶突变体具有更高的硝基催化活力和可溶性蛋白含量，适用于需要将硝基催化为氨基的反应。

Description

一种硝基还原酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种硝基还原酶突变体及其应用。
背景技术
替格瑞洛，化学名为：(1S，2S，3R，5S)-3-[7-[(1R，2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺基]-5-(丙巯基)-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇，是一种选择性的小分子抗凝血药，用于非ST段抬高心肌梗死及急性冠脉综合征的治疗；其结构式如下式C化合物所示：
Figure BDA0002711320890000011
4,6-二氯-2-(丙硫基)-5-氨基嘧啶，是合成替格瑞洛的关键中间体，其结构式如式B化合物所示：
Figure BDA0002711320890000012
CN103130726和CN103896857公开了一种利用连二亚硫酸钠作为还原剂将底物分子结构中的硝基还原为氨基的方法，其缺点在于连二亚硫酸钠非常不稳定，遇水发生会发生强烈反应并燃烧，安全性差。
WO2019158655和US9056838公开了一种利用铁粉作为还原剂，将底物中的硝基还原成氨基的方法，但该方法在反应过程中容易导致嘧啶环上的两个氯原子被氢或羟基所取代，从而造成分离困难，收率低。
CN101851212公开了一种利用贵金属Pt/V/C(铂/钒/碳)作为催化剂，加氢还原成氨基。虽然目标产物收率较高，但催化剂价格昂贵、不易得，而且还存在重金属污染问题，不适合工业化生产。
因此，需要开发一种安全、高效、环保、经济、收率高的将硝基还原成氨基的方法，尤其是4,6-二氯-2-(丙硫基)-5-硝基嘧啶中的硝基还原为氨基的方法。
发明内容
发明概述
为解决上述污染重、危险性高、经济适用性不高等问题，本发明提供了以下技术方案。
本发明提供了一种硝基还原酶的突变体及基因，还提供了硝基还原酶及其突变体在将硝基催化为氨基上的应用，尤其是在制备式B化合物中的应用。本发明所述硝基还原酶的突变体相比野生型硝基还原酶具有更高的催化活力和可溶性蛋白含量；采用本发明所述硝基还原酶及其突变体在将硝基催化为氨基时，具有操作简单、安全、高效、环保、成本低、收率高等优点。
发明详述
第一方面，本发明提供了一种硝基还原酶突变体。
所述硝基还原酶突变体命名为Ah-NRT/G130E。
所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
用于编码所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
第二方面，本发明提供了另一种硝基还原酶突变体。
所述硝基还原酶突变体命名为Ah-NRT/F13L/G28R。
所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
用于编码所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R的基因的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。
本发明还提供一种基因，所述基因编码前述的硝基还原酶突变体。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，或者所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在一些实施方式中，一种基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，可以编码所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E。
在一些实施方式中，一种基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，可以编码所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R。
第三方面，本发明还提供一种质粒。
所述的质粒携带有核苷酸序列号如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：2所示的基因。
第四方面，本发明提供了一种基因工程菌。
所述基因工程菌含有氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示硝基还原酶Ah-NRT，所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E，所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R，或者所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的基因。
第五方面，本发明提供了一种所述硝基还原酶Ah-NRT、所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E，硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6所示的基因，或者第四方面中所述基因工程菌在将硝基催化为氨基的应用。
第六方面，本发明提供了一种式B化合物的制备方法。
一种式B化合物的制备方法，
Figure BDA0002711320890000031
其包括：式A化合物在酶催化体系存在下，在缓冲溶液中进行反应，得到式B化合物，采用本方式制备式B化合物，相比现有技术，具有更安全、环保、经济等优点。
所述酶催化体系可以包含所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E，所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R，所述硝基还原酶Ah-NRT，或者第四方面中所述基因工程菌。在一些优选的实施方式中，所述酶催化体系包含所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R、核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的基因，或者含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R或核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示基因的基因工程菌。在一些更优选的实施方式中，所述酶催化体系包含所述的硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E、核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示基因，或者含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E或核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示基因的基因工程菌。
所述酶催化体系还可以包含辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：(1)乳酸脱氢酶辅酶循环系统：包括乳酸脱氢酶，乳酸和辅酶；(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶。
所述辅酶可以包括还原型辅酶Ⅰ或还原型辅酶Ⅱ。在一些优选的实施例中，所述辅酶为还原型辅酶Ⅰ。
所述反应的温度可以为15-45℃。在一些实施例中，所述反应的温度为20-40℃。在一些实施例中，所述反应的温度为25-37℃。在一些实施例中，所述反应的温度为30-35℃。在一些实施例中，所述反应的温度为35-37℃。在一些优选的实施例中，所述反应的温度为35℃。
所述缓冲溶液的pH可以为6.0-10.0。在一些实施例中，所述缓冲溶液的pH为6.0-9.0。在一些实施例中，所述缓冲溶液的pH为7.0-8.0。在一些优选的实施例中，所述缓冲溶液的pH为7.5。
所述缓冲溶液可以包括或为磷酸盐缓冲液。
所述式A化合物的浓度可以为45mmol/L-200mmol/L。
在本发明的一些实施例中，一种式B化合物的制备方法，
Figure BDA0002711320890000041
其包括：式A化合物在酶催化体系存在下，在缓冲溶液中进行反应，得到式B化合物；所述酶催化体系可以包含所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E，所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R，所述硝基还原酶Ah-NRT，或者第四方面中所述基因工程菌，采用本方式制备式B化合物，相比现有技术，具有更安全、环保、经济等优点。
在本发明的一些实施例中，一种式B化合物的制备方法，
Figure BDA0002711320890000042
其包括：式A化合物在酶催化体系存在下，在缓冲溶液中进行反应，得到式B化合物；所述酶催化体系包含所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R，或者含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R或核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示基因的基因工程菌，采用本方式制备式B化合物，相比现有技术，具有更安全、环保、经济、催化速度更快更充分等优点。
在本发明的一些实施例中，一种式B化合物的制备方法，
Figure BDA0002711320890000043
其包括：式A化合物在酶催化体系存在下，在缓冲溶液中进行反应，得到式B化合物；所述酶催化体系包含所述酶催化体系包含所述的硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E，或者含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E或核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示基因的基因工程菌，采用本方式制备式B化合物，相比采用其他催化体系，催化速度更快更充分，底物转化率和产物收率更高。
在本发明的一些实施例中，一种式B化合物的制备方法，
Figure BDA0002711320890000044
其包括：式A化合物在酶催化体系存在下，在缓冲溶液中进行反应，得到式B化合物；所述酶催化体系可以包含所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E，所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R，所述硝基还原酶Ah-NRT，或者第四方面中所述基因工程菌；所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：(1)乳酸脱氢酶辅酶循环系统：包括乳酸脱氢酶，乳酸和辅酶；(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶；所述辅酶包括还原型辅酶Ⅰ或还原型辅酶Ⅱ；所述反应的温度为35-37℃；所述缓冲溶液的pH为7.0-8.0；所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液；所述式A化合物的浓度为45mmol/L-200mmol/L，本方式采用优选的反应温度和pH，能使反应更快，底物转化率更高，产物产率更高。
在本发明的一些实施例中，一种式B化合物的制备方法，
Figure BDA0002711320890000051
其包括：式A化合物在酶催化体系存在下，在缓冲溶液中进行反应，得到式B化合物；所述酶催化体系包含所述的硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E，或者含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E或核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示基因的基因工程菌；所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：(1)乳酸脱氢酶辅酶循环系统：包括乳酸脱氢酶，乳酸和辅酶；(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶；所述辅酶为还原型辅酶Ⅰ；所述反应的温度为35-37℃；所述缓冲溶液的pH为7.0-8.0；所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液；所述式A化合物的浓度为45mmol/L-200mmol/L，本方式采用优选的反应温度和pH，能使反应更快，底物转化率更高，产物产率更高；采用优选的硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E或其基因工程菌，底物转化率更高，产物产率更高；采用优选的还原型辅酶Ⅰ，使得反应更高效，更充分。
在本发明的一些实施例中，一种式B化合物的制备方法，
Figure BDA0002711320890000052
其包括：式A化合物在酶催化体系存在下，在缓冲溶液中进行反应，得到式B化合物；所述酶催化体系为所述的硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E，或者含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E或核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示基因的基因工程菌；所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：(1)乳酸脱氢酶辅酶循环系统：包括乳酸脱氢酶，乳酸和辅酶；(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶；所述辅酶为还原型辅酶Ⅰ；所述反应的温度为35-37℃；所述缓冲溶液的pH为7.0-8.0；所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液；所述式A化合物的浓度为45mmol/L-200mmol/L，本方式采用优选的反应温度和pH，能使反应更快，底物转化率更高，产物产率更高；采用优选的硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E或其基因工程菌，底物转化率更高，产物产率更高；采用优选的还原型辅酶Ⅰ，使得反应更高效，更充分。
技术效果
相比现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)相比硝基还原酶Ah-NRT和含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT或核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示基因的基因工程菌，本发明所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E、硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R和含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E或硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R或核苷酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示基因的基因工程菌均具有更高的催化活力和蛋白可溶性，能高效催化硝基为氨基，其底物转化率高、产物收率高。其中，优选硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E和含有所述硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E或核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示基因的基因工程菌。
(2)采用优选的反应温度35-37℃和优选的pH 7.0-8.0，能使反应更快，底物转化率更高，产物产率更高。
(2)本发明所述的式B化合物的制备方法，其反应条件温和、环境友好、工艺简便、经济性高，有利于式B化合物及替格瑞洛的工业化生产。
(3)相比还原型辅酶Ⅱ，还原型辅酶Ⅰ在本发明所述的式B化合物的制备方法中催化活力更高。
术语说明
本发明中，NADH表示还原型辅酶Ⅰ；NADPH表示还原型辅酶Ⅱ；mmol/L或mM表示毫摩尔每升；μM表示微摩尔每升；μL表示微升；℃表示摄氏度；pH表示酸碱度；s表示秒，min表示分钟；h表示小时；rpm表示转/分钟；U表示酶活力单位；SDS-PAGE表示十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；pET26b(+)为一种表达载体；T7 promoter表示T7通用引物上游引物；T7terminator表示T7通用引物下游引物；PCR表示聚合酶链式反应；OD600表示在600nm波长处的吸光值；LB液体培养基表示Luria-Bertani液体培养基；dNTP表示脱氧核糖核苷三磷酸；Taq Buffer表示Taq酶缓冲液；MgCl2表示二氯化镁。
本发明中，“辅酶循环系统”表示辅酶参与硝基还原酶的催化反应时消耗氢原子，由NADH或NADPH变成NAD+或NADP+，乳酸脱氢酶通过催化底物乳酸或葡萄糖脱氢酶通过催化底物葡萄糖，脱氢产生游离氢原子，给予NAD+或NADP+，NAD+或NADP+重新变成NADH或NADPH，可以再次参与硝基还原酶的催化反应的一种循环系统。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
附图说明
图1示实施例3中的硝基还原酶及其突变体的SDS-PAGE图谱；其中，M为蛋白质分子量标记；泳道1和2分别是野生型硝基还原酶Ah-NRT的全细胞和破碎上清液的SDS-PAGE图谱；泳道3和4分别是硝基还原酶突变体Ah-NRT/F13L/G28R的全细胞和破碎上清液的SDS-PAGE图谱；泳道5和6分别是硝基还原酶突变体Ah-NRT/G130E的全细胞和破碎上清液的SDS-PAGE图谱。
图2示实施例4中含突变体Ah-NRT/G130E的反应体系的吸光度随反应时间的变化；吸光度越小，说明NADPH或NADH含量越低。
图3示实施例1步骤(3)中所测的高效液相色谱图，其中3.065min的峰为式B化合物的峰，3.645min的峰为式A化合物的峰。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
实施例1：硝基还原酶Ah-NRT的筛选及酶活测定
(1)硝基还原酶Ah-NRT的来源和基因合成
选取来源于极端嗜盐嗜碱芽孢杆菌(Alkalihalobacillus halodurans)的硝基还原酶基因Ah-NRT(NCBI Reference Sequence:WP_010898392.1)，所属硝基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。随后，以全基因合成的方法合成了Ah-NRT的编码基因(对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，并在两端设计加入酶切位点Nde I和Xho I，将该基因克隆至pET26b(+)对应的Nde I和Xho I，获得重组表达质粒pET26b-Ah-NRT。
(2)重组工程菌的构建及诱导表达
将构建得到的重组表达质粒pET26b-Ah-NRT转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性(终浓度为50μg/mL)的LB琼脂平板上，37℃下培养10h后，于平板上挑取单菌落转接至LB液体培养基中培养8h，收集菌体并提取质粒进行测序验证。
将测序正确的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT接种至含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm条件下培养8h，获得种子液。随后，以2％(V/V)接种量转接种子液至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃，200rpm条件下培养菌浓度(OD600)至0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，对硝基还原酶蛋白进行诱导表达，在25℃的温度和200rpm的转速下培养15h，再在4℃和12000rpm的条件下离心10min，收集菌体细胞。随后，用0.85％的生理盐水对收集的菌体细胞进行洗涤，再次离心，得到诱导表达后的菌体细胞E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT，将其放置于-20℃保藏待用。
(3)重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT催化合成式B化合物
取1.0g重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT，用10mL磷酸盐缓冲液(pH7.5)重悬细胞，再加入1.0g葡萄糖、5.0mg NADH和10mg葡萄糖脱氢酶冻干粉；35℃水浴孵育5min后，加入0.13g的式A化合物，再在35℃和200rpm条件下反应6h，取样，用高效液相色谱对反应过程中式B化合物的生成情况进行检测，发现有目标产物式B化合物的色谱峰出现(见图3中3.065min的峰)。
实施例2：硝基还原酶突变体的构建及筛选
(1)硝基还原酶突变体文库的构建
以实施例1中获取的重组表达质粒pET26b-Ah-NRT为模板，利用T7 promoter“TAATACGACTCACTATAGGG”和T7 terminator“TGCTAGTTATTGCTCAGCGG”为引物进行PCR扩增，引入突变位点。PCR扩增体系(100μL)包含：10μL 10×Taq Buffer(不含Mg2+)，模板约56ng；30μM的T7 promoter和30μM的T7 terminator各1μL；1U/μL的Taq DNA聚合酶2μL；2.5mM的dNTP 4μL；100mM的MgCl2 2μL；100mM的MnCl2 0.5μL；其余用无菌水补充至100μL。PCR反应程序：94℃3min；{98℃10s；58℃30s；72℃60s}循环30次，72℃5min。经PCR反应后，得PCR产物。取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带约650bp，与Ah-NRT基因的电泳条带大小一致。利用PCR Clean Up试剂盒回收扩增的目标片段，并利用限制性内切酶QuickCutTMNde I和QuickCutTM Xho I对目标片段进行双酶切处理，得酶切产物。随后直接利用琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切产物，并利用DNA Ligation Kit Ver.2.1与经QuickCutTM Nde I和QuickCutTM Xho I双酶切处理的pet26(+)空载体进行连接。将连接产物热击转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃培养10h。
(2)硝基还原酶有益突变体的筛选
挑取上述LB琼脂平板上的单菌落至96孔深孔板中培养，每个孔板中加入1mL的LB液体培养基(含有终浓度为0.5mmol/L的IPTG和50μg/mL的卡那霉素)，于37℃和150rpm条件下培养14h。用离心机(3000rpm，4℃，10min)收集96孔深孔板中的菌体细胞，添加溶菌酶释放细胞内的硝基还原酶蛋白。再次离心后，取100μL裂解上清液转移至96孔酶标仪板中，各孔中分别添加50μL由式A化合物(终浓度为5mmol/L)和NADPH(终浓度为10mmol/L)组成的混合液。将上述96孔酶标仪板放置于酶标仪中，立即振荡5s后，于340nm处测定不同时间段混合液的吸光值，以此来筛选出有益的突变体(突变体活力越高，吸光值变化越大)。将筛选得到的突变株用HPLC分析方法进行复筛，确定为正向突变株后提取质粒并送去测序，验证得到含Ah-NRT/G130E的突变株和含Ah-NRT/F13L/G28R的突变株，其催化活力分别是野生型Ah-NRT的2.6倍和1.4倍。Ah-NRT/G130E的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。Ah-NRT/F13L/G28R的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
(3)硝基还原酶突变体的诱导表达
将获取的含Ah-NRT/G130E的突变株和含Ah-NRT/F13L/G28R的突变株分别按以下步骤进行操作：将获取的突变株接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养8h，得种子液。随后，分别以2％(V/V)接种量转接种子液至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃，200rpm条件下培养菌浓度至OD600为0.6-0.8。加入IPTG至其终浓度为0.5mmol/L，对硝基还原酶蛋白进行诱导表达，在25℃，200rpm的条件下培养15h，再在4℃，12000rpm的条件下离心10min，收集菌体细胞。随后，用0.85％的生理盐水对收集的菌体细胞进行洗涤，再次离心，得到诱导表达后的菌体细胞E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/G130E和E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/F13L/G28R，将其放置于-20℃保藏待用。
实施例3：硝基还原酶及其突变体的蛋白可溶性表达研究
将实施例1和2中得到的诱导表达后的菌体细胞分别溶解于pH为7.5的磷酸盐(20mmol/L)缓冲液中，重悬菌体后，配制成OD600浓度为10的菌悬液，并利用超声波破碎细胞。离心(12000rpm，10min，4℃)得到破碎细胞上清液。将实施例1和实施例2所得诱导表达后的菌体细胞分别配置成OD600浓度为10的菌悬液，再与破碎细胞上清液一起进行高温(95℃，10min)变性处理后，取相同体积样品用SDS-PAGE凝胶电泳验证蛋白的可溶性表达水平。
由图1的SDS-PAGE凝胶电泳结果可知，突变体Ah-NRT/G130E的可溶性表达水平相比野生型Ah-NRT有大幅度的提高。由此可知，G130E突变位点的引入提高了硝基还原酶的可溶性表达，F13L/G28R突变位点的引入未对蛋白可溶性表达产生影响。
实施例4：硝基还原酶的辅酶偏好性
取实施例3中所得的破碎细胞上清液用于辅酶偏好性研究，取NADPH和NADH作为辅酶在以下反应体系中分别进行反应。反应体系:在3mL的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入5μL式A化合物；20μL破碎细胞上清液和50μL 10mmol/L辅酶。混匀后，于340nm的吸光度值处(NADPH或NADH在340nm处具有吸收峰，参与反应后生成的NADP或NAD在340nm处没有吸收峰)测定Ah-NRT及其两个突变体的辅酶偏好性。通过对比发现，硝基还原酶Ah-NRT及其突变体Ah-NRT/G130E和Ah-NRT/F13L/G28R的辅酶偏好性一致，均优先选择NADH作为氢供体参与催化反应。
实施例5：重组菌全细胞在催化合成式B化合物中的应用
分别将实施例1和2所获取的菌体细胞E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT、E.coliBL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/G130E或E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/F13L/G28R的湿菌体细胞(含水量约为70％-80％)作为生物催化剂，用于催化合成式B化合物的反应。反应体系如下：在5mL的磷酸盐缓冲液中加入0.2g底物，0.1g湿菌体细胞，及乳酸脱氢酶辅酶循环系统(0.045g乳酸、20mg乳酸脱氢酶及5μg NADH)。反应条件为：30℃，150rpm，通过补加氨水的方式控制pH值为7.0。反应10h后，利用HPLC分析样品，测得E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT、E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/G130E和E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/F13L/G28R参与的反应中底物转化率分别为72.0％、90.3％和85.7％，E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT、E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/G130E和E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/F13L/G28R参与的反应中产物收率分别为80.4％、91.0％和88.6％。E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/G130E和E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/F13L/G28R具有更高的底物转化率和产物收率。由此可知，重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/G130E及E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/F13L/G28R在催化制备式B化合物的工艺中相比E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT更具有应用潜力，尤其是重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/G130E。
实施例6：产物式B化合物的分离与鉴定
酶催化体系组成:在50mL pH为8.0的磷酸盐缓冲液(50mmol/L)中加入3.0gE.coli BL21(DE3)/pET26b-Ah-NRT/G130E湿菌体细胞(含水量约为70％-80％)作为生物催化剂，加入2.67g(浓度为200mmol/L)的式A化合物作为底物，加入乳酸脱氢酶和辅酶I(80mg乳酸脱氢酶，10μg NADH及4.0g乳酸)构成循环体系，室温下反应20h，氨水控制pH在7.0。反应停止后，利用HPLC测定底物转化率为95.2％。离心，收集上清液，用乙酸乙酯萃取2次，每次100ml，合并乙酸乙酯相，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压浓缩后得到式B化合物2.14g，收率为90.5％，纯度99.0％以上；取式B化合物进行氢谱检测，结果为：1HNMR(DMSO-d6,400MHz,ppm):5.85(s,2H),2.97(t,J＝6.8Hz,2H),1.65-1.61(m,2H),0.94(t,J＝7.6Hz,3H)。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东东阳光药业有限公司
<120> 一种硝基还原酶突变体及其应用
<130> PP1206CN
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 213
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acagctgccg cgttggcacc atcatcgtgg aatttacaac attggaagtt tctcgtgatt 180
gaggatgaaa agaaaaaaga acaattatta ccgattgcat acaatcagtc tcaggtggta 240
gacagctcgt tcaccgttgc ggtacttggt gacttagagg cgaataaaaa tgctgaggct 300
gtttatcaga cagctgttga caatggattt atgacagaag aagtgaaaaa tactcttgtc 360
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tgtccgatgg ggggctttaa tggagcagaa tttgtcaaag cgtttaacgt tcctgaacgg 540
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cggttttcat tagaagaagt tgtcgttaaa aattcattt 639
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cggttttcat tagaagaagt tgtcgttaaa aattcattt 639

Claims (12)

1.一种硝基还原酶突变体，其特征在于，所述硝基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO：3所示，或者所述硝基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.一种基因，所述基因编码权利要求1所述的硝基还原酶突变体。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，或者所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
4.一种质粒，其特征在于，所述的质粒携带有权利要求2-3任一项所述的基因。
5.一种基因工程菌，所述基因工程菌含有权利要求1所述硝基还原酶突变体或权利要求2-3任一项所述的基因或权利要求4所述质粒。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。
7.一种权利要求1所述硝基还原酶突变体或权利要求2所述基因或权利要求5所述基因工程菌在将硝基催化为氨基的应用。
8.一种式B化合物的制备方法，
Figure FDA0002711320880000011
其包括：式A化合物在酶催化体系的存在下，在缓冲溶液中进行反应，得到式B化合物；其中，所述酶催化体系包含权利要求1所述硝基还原酶突变体或权利要求5所述基因工程菌。
9.根据权利要求8所述的方法，所述酶催化体系还包含辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：(1)乳酸脱氢酶辅酶循环系统：包含乳酸脱氢酶，乳酸和辅酶；(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包含葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶。
10.根据权利要求9所述的方法，所述辅酶包括还原性辅酶Ⅰ或还原性辅酶Ⅱ；或者所述辅酶包括还原性辅酶Ⅰ。
11.根据权利要求7-10任一项所述的方法，所述反应的温度为15-45℃；或者所述反应的温度为35℃。
12.根据权利要求7-11任一项所述的方法，所述缓冲溶液的pH为6.0-10.0；和/或所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液；和/或所述式A化合物的浓度为45mmol/L-200mmol/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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