CN112760298B - 一种细胞色素p450bm3氧化酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种细胞色素p450bm3氧化酶突变体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种细胞色素P450BM3氧化酶突变体，所述细胞色素P450BM3氧化酶突变体氧化结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明还公开了表达该细胞色素P450BM3氧化酶突变体氧化结构域的重组基因及表达载体。本发明同时还公开了利用该细胞色素P450BM3氧化酶突变体在催化芳香基化合物硝化反应中的应用。本发明提供的细胞色素P450BM3氧化酶突变体可以利用绿色能源H2O2作为氧化剂，从而构建了P450/NaNO2/H2O2催化体系，进而实现P450酶对芳香化合物的高活性的催化硝化。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，涉及一种细胞色素P450BM3氧化酶突变体及其在催化芳基化合物硝化反应中的应用。
背景技术
细胞色素P450酶广泛存在于动物、植物、细菌以及真菌等生物体中，其被公认为应用广泛的生物催化剂，能催化杂原子氧化、环氧化、惰性C-H键羟化以及脱烷基化等多种氧化反应。近年来，工程化P450酶在合成应用方面的潜力被进一步发掘，在天然产物如青蒿素前体青蒿酸等的生物合成、环丙化反应、C-N键和C-B键生成等反应上取得重要进展。
硝基芳香化合物是有机合成中重要的中间体，广泛的应用在爆炸品、医药、杀虫剂以及其他工业领域。目前工业中硝基芳香化合物的合成方法，通常使用高浓度的硫酸和硝酸，但是在反应过程中产生大量废液，对环境造成严重危害。随着绿色化学的发展，环境友好型的酶催化硝化反应受到广泛关注。但从目前研究结果来看，仅有辣根过氧化物酶HRP通过构建HRP/NaNO2/H2O2体系实现了芳香化合物的硝化反应且活性较低，而尚未发现可以催化芳香化合物硝化反应的P450酶。
目前绝大多数P450酶在催化过程中严重依赖昂贵的NADPH辅酶因子和复杂的氧化还原系统，大大限制了P450酶在生物化工和有机合成中的进一步应用。研究表明，在P450的催化循环中发现过氧化氢支路(H2O2 shunt)，无需辅因子NAD(P)H和还原伴侣蛋白(酶)，可极大地简化催化路径，提高催化效率；且过氧化氢价格低廉、反应中仅生成副产物水具有环境友好性。但仅有少数P450酶可以利用这一催化途径，限制其应用范围。
综上所述，通过构建P450/NaNO2/H2O2体系催化芳香化合物的硝化反应，为丰富P450催化类型，提高生物酶催化芳香化合物硝化反应的活性具有十分重要的价值和应用前景。
在申请号为201810126862.7的中国专利申请中公开了用于激活细胞色素P450酶催化活性的双功能小分子，其公开的双功能小分子能够激活P450酶利用H2O2对底物进行催化反应的应用，反应过程中不需要额外添加辅因子NAD(P)H及还原伴侣蛋白(酶)就能实现催化氧化。
目前仅有过氧化物酶HRP通过构建HRP/NaNO2/H2O2体系可以实现芳香化合物的硝化反应且活性较低，而尚未发现可以催化芳香化合物硝化反应的P450酶。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种突变的细胞色素P450酶，该细胞色素P450酶能够催化芳香化合物硝化反应的方法，解决了现有技术中存在的问题。
本发明的第一方面在在于，提供了一种细胞色素P450BM3氧化酶突变体，所述细胞色素P450BM3氧化酶突变体氧化结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；其中，
第47位氨基酸残基选自R或L；
第75位氨基酸残基选自L、Y、F、M、Q或K；
第78位氨基酸残基选自V、C、S、A、F、I、L、T、G、N、D、E、M或V；
第82位氨基酸残基选自I、V、F、L、W、T、S、C、G或M中的一种；
第87位的氨基酸残基选自A、V、I、G或L中的一种；
第88位氨基酸残基选自T或M；
第100位氨基酸残基选自H或R；
第181位氨基酸残基选自L、M、F、I、T或Q；
第184位氨基酸残基选自A、V、I、L、M、F、Q、T或N；
第263位氨基酸残基选自I、V或G；
第255位氨基酸残基选自R或S；
第264位氨基酸残基选自A、C、S、T、D、E或V；
第328位氨基酸残基选自A、V或S；
第330位氨基酸残基选自A或W；以及
第401位氨基酸残基选自I或P。
细胞色素P450BM3的氧化酶结构域上的第87位苯丙氨酸和第82位丙氨酸处的两个位点突变；这两个位点的氨基酸可相同或不同的突变体为F87A-A82I/V/F/L/W、F87V-A82I/V、F87I-A82I/V、F87G-A82I/V和F87L-A82I/V/T/L/S/C/F/G/M。
在P450BM3的F87和A82位基础上，对P450BM3血红素结构域上的一些氨基酸进行突变，如Arg47、Leu75、Val78、Thr 88、H100、Tyr160、Leu181、Ala184、Leu188、Tyr160、Met237、Arg255、Tyr256、Ile263、Ala264、Glu267、Ala330、Ala328或Ile401，得到的P450BM3的突变体可以是相同的氨基酸或不同的氨基酸，主要的突变体为：F87L-A82T-R47L、F87L-A82T-L75Y/F/M/Q/K；F87L-A82T-V78C/S/A/F/I/L/T/M/V、F87L-A82T-V78M/G/N/F/I/C/D/E/L/V/S/T、F87L-A82T-T88M、F87L-A82T-H100R、F87L-A82T-L181M/F/I/T/Q、F87L-A82T-A184V/I/L/M/F/Q/T/N、F87L-A82T-I263V/G、F87L-A82T-R255S、F87L-A82T-A264C/S/T/D/E/V、F87L-A82T-A328V/S、F87L-A82T-A330W、F87L-A82T-I401P。
优选地，所述突变体为F87L-A82T、F87L-A82T-V78L、F87L-A82T-V78C、F87L-A82T-V78A或F87L-A82T-L181T。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的细胞色素P450BM3氧化酶突变体的氧化结构域具有三个突变位点，其中，第一突变位点为第82位的氨基酸残基，第二突变位点为第87位的氨基酸残基，所述第三突变位点选自第47位、第75位、第78位、第88位、第100位、第181位、第184位、第263位、第255位、第264位、第328位、第330位或第401位中的任一个氨基酸残基。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的细胞色素P450BM3氧化酶突变体的氧化结构域，其特征在于，所述第三突变位点选自：
第47位氨基酸残基突变为L；
第75位氨基酸残基突变为Y、F、M、Q或K；
第78位氨基酸残基突变为C、S、A、F、I、L、T、G、N、D、E、M或V；
第88位氨基酸残基突变为M；
第100位氨基酸残基突变为R；
第182位氨基酸残基突变为M、F、I、T或Q；
第184位氨基酸残基突变为V、I、L、M、F、Q、T或N；
第263位氨基酸残基突变为V或G；
第255位氨基酸残基突变为S；
第264位氨基酸残基突变为C、S、T、D、E或V；
第328位氨基酸残基突变为V或S；
第330位氨基酸残基突变为W；或者
第401位氨基酸残基突变为P中的任意一个位点。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的细胞色素P450BM3氧化酶突变体的氧化结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7。
本发明进一步提供了一种用于表达上述的细胞色素P450BM3氧化酶突变体的氧化结构域的重组基因。
本发明还提供了一种用于表达上述的细胞色素P450BM3氧化酶突变体的氧化结构域的表达载体，包含骨架质粒和如上述的重组基因，所述骨架质粒选自pET28a。
本发明进一步提供了一种用于表达细胞色素P450BM3氧化酶突变体氧化结构域的重组工程菌，包含宿主菌和如上所述的表达载体，所述宿主菌选自巨大芽孢杆菌。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的细胞色素P450BM3氧化酶突变体的氧化结构域在催化芳香基化合物硝化反应中的应用。
本发明进一步提供了一种催化芳香基化合物硝化反应的方法，其包括，通过双功能小分子化合物诱导含有上述氧化结构域的细胞色素P450BM3氧化酶突变体催化H2O2对底物进行硝化反应；其中，所述底物为芳香基化合物；优选地，所述双功能小分子化合物为Im-C6-Phe；优选地，所述底物选自
本发明所采用的技术方案是，一种细胞色素P450酶催化芳香化合物的硝化反应，双功能小分子(Im-C6-Phe)促进P450突变体利用H2O2催化芳基化合物获得硝基芳香化合物。该双功能小分子为申请号为201810126862.7、发明名称为“一种激活酶催化反应的双功能小分子化合物及其应用”的中国专利申请中公开的化合物。
Im-C6-Phe
所述的不同突变体的BMP，其浓度为0.01μM～1mM与0.1μM～300mM底物、1mM～6M亚硝酸钠加入至pH4～10的缓冲溶液中，再添加1μM～300mM的(Im-C6-Phe)和1μM～600mM H2O2在0℃～60℃反应1min～24h来实现底物的催化氧化。
所述缓冲液为PBS缓冲液。
所述底物为：
所述反应后加入乙酸乙酯对反应体系进行萃取分析，反应的TON为10～20000。
本发明的具有以下有益效果：
本发明通过对P450BMP的理性设计，在双功能小分子(Im-C6-Phe)的协助下，利用绿色能源H2O2作为氧化剂，构建P450/NaNO2/H2O2催化体系，进而实现P450酶对芳香化合物的高活性的催化硝化。
具体实施方式
下面将结合本发明的具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1突变体的设计和筛选步骤
BMP酶野生型的核苷酸序列为SEQ ID No：1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2根据含有BMP野生型基因的载体pET28a-BMP(Ma et al.,2018)载体设计突变位点的引物序列。而后以野生型(或，单突变体，双突变体等)为模板，利用设计的不同突变位点的引物序列进行PCR扩增获得单突变体；而后再以单突变体为模板获得双突变。
1)pET28a-F87L的突变的扩增引物如表1所示
表1pET28a-F87L的突变体的扩增引物
| NO. | Primer | Sequence(5’-3’) |
| SEQ ID NO:6 | F87L-F | <u>CTG</u>ACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTG |
| SEQ ID NO:7 | F87L-R | TAACCCGTCTCCTGCAAAATCACGTACAA |
2)在pET28a-F87L的基础上，构建A82位的双突变体。其反向引物不变(A82-R)，通过更换正向引物获得基于F87L-A82位的双突变体，具体为：表达突变位点分别为F87L-A82I、F87L-A82V、F87L-A82T、F87L-A82L、F87L-A82S、F87L-A82C、F87L-A82F、F87L-A82G和F87L-T268M的突变体的基因。具体引物如表2：
表2双突变体扩增引物
3)在pET28a-F87L-A82T双突变的基础上，分别构建Y160、Y198、M237、Y256的三突变体。其F87L-A82T-Y160反向引物不变(Y160-R)，通过更换正向引物(Y160-F)获得F87L-A82T-Y160位的三突变体，具体为：F87L-A82T-Y160A、F87L-A82T-Y160V、F87L-A82T-Y160I、F87L-A82T-Y160L、F87L-A82T-Y160F和F87L-A82T-Y160G。其F87L-A82T-Y198位的正向引物为Y198I-F，反向引物为Y198I-R获得F87L-A82T-Y198位的三突变体，具体为F87L-A82T-Y198I。其F87L-A82T-M237反向引物不变(M237-R)，通过更换正向引物(M237-F)获得F87L-A82T-M237位的三突变体，具体为：F87L-A82T-M237A、F87L-A82T-M237V、F87L-A82T-M237I、F87L-A82T-M237L。其F87L-A82T-Y256位的正向引物为Y256I-F，反向引物为Y256I-R获得F87L-A82T-Y256位的三突变体，具体为F87L-A82T-Y256I。具体引物如下：
| NO. | Primer | Sequence(5’-3’) |
| SEQ ID NO:18 | Y160A-F | GCGCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATC |
| SEQ ID NO:19 | Y160I-F | ATTCGCTTTAACAGCTTTTACCGAG |
| SEQ ID NO:20 | Y160L-F | CTGCGCTTTAACAGCTTTTACCGAG |
| SEQ ID NO:21 | Y160V-F | GTGCGCTTTAACAGCTTTTACCGAG |
| SEQ ID NO:22 | Y160F-F | TTTCGCTTTAACAGCTTTTACCGAG |
| SEQ ID NO:23 | Y160G-F | GGTCGCTTTAACAGCTTTTACCGAG |
| SEQ ID NO:24 | Y160-R | GTTAAAGCCGCAAAGACCAATTG |
| SEQ ID NO:25 | Y198I-F | ATTGATGAAAACAAGCGCCAGTTTC |
| SEQ ID NO:26 | Y198-R | AGCTGGGTCGTCTGGATTTGC |
| SEQ ID NO:27 | M237A-F | GCGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAAC |
| SEQ ID NO:28 | M237I-F | ATTCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGG |
| SEQ ID NO:29 | M237L-F | GTGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACG |
| SEQ ID NO:30 | M237V-F | CTGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACG |
| SEQ ID NO:31 | M237-R | ATGCGTTAATAAATCATCGCTTTGTTCACC |
| SEQ ID NO:32 | Y256I-F | ATTTTCCTGGTGAAGAATCCACATG |
| SEQ ID NO:33 | Y256I-R | CAGCGCAAATGATAAAAGACCAC |
PCR体系
PCR反应条件
PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完后在紫外灯下分别切下目的条带，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段。
将胶回收的不同突变体的序列末端进行磷酸化处理，磷酸化体系如表3所示；
表3目的序列末端磷酸化体系
将磷酸化后的不同突变体的序列进行连接，连接体系如表4所示
表4连接体系
16℃过夜连接。
将10μL连接体系转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，冰浴5min；加入600μL新鲜LB液体培养基，37℃、200rpm震荡培养1h；取200μL菌液涂布到含50μg/ml Kana的LB平板上，37℃过夜培养。
待平板上长出单菌落，测定分析基因序列。
测序成功的质粒即是不同的BMP突变体。
实施例2：F87L催化苯酚硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体请见表5，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化苯酚的硝化反应。
反应体系如下：将8mM苯酚(pH为7.0PBS助溶)，0.5μM酶F87L，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表5)。
苯酚硝化反应式如下：
反应结果如下：
表5
由表5可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L对苯酚的硝化反应。
实施例3：F87L/A82T催化苯酚硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体请见表6，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化苯酚的硝化反应。
反应体系如下：将8mM苯酚(pH为7.0PBS助溶)，0.5μM酶F87L/A82T，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表6)。
苯酚硝化反应式如下：
反应结果如下：
表6
由表6可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L/A82T对苯酚的硝化反应。
实施例4：F87L/A82T催化邻甲苯酚硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体请见表7，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化邻甲苯酚的硝化反应。
反应体系如下：将8mM邻甲苯酚(pH为7.0PBS助溶)，0.5μM酶F87L/A82T，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表7)。
邻甲苯酚硝化反应式如下：
反应结果如下：
表7
由表7可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L/A82T对邻甲苯酚的硝化反应。
实施例5：F87L/A82T催化间甲苯酚硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体请见表8，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化间甲苯酚的硝化反应。
反应体系如下：将8mM间甲苯酚(pH为7.0PBS助溶)，0.5μM酶F87L/A82T，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表8)。
间甲苯酚硝化反应式如下：
反应结果如下：
表8
由表8可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L/A82T对间甲苯酚的硝化反应。
实施例6：F87L/A82T催化对甲苯酚硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体参考表7，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化对甲苯酚的硝化反应。
反应体系如下：将10mM对甲苯酚(pH为7.0PBS助溶)，0.5μM酶F87L/A82T，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表9)。
对甲苯酚硝化反应式如下：
反应结果如下：
表9
由表9可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L/A82T对对甲苯酚的硝化反应。
实施例7：F87A/Y160I/M237I催化愈创木酚硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体参见表10，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化愈创木酚的硝化反应。
反应体系如下：将10mM愈创木酚(2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87A/Y160I/M237I，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表10)。
愈创木酚硝化反应式如下：
反应结果如下：
表10
由表10可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87A/Y160I/M237I对愈创木酚的硝化反应。
实施例8：F87L/A82V催化苯胺硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体请见下表11，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化苯胺的硝化反应。
反应体系如下：将10mM苯胺(2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87L/A82V，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表11)。
苯胺硝化反应式如下：
反应结果如下：
表11
由表11可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L/A82V对苯胺的硝化反应。
实施例10：F87L/A82V催化邻甲苯胺硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体请见表10，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化邻甲苯胺的硝化反应。
反应体系如下：将8mM邻甲苯胺(2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87L/A82V，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表12)。
邻甲苯胺硝化反应式如下：
反应结果如下：
表12
由表10可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L/A82V对邻甲苯胺的硝化反应。
实施例10：F87L/A82V催化间甲苯胺硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体请见表13，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化邻甲苯胺的硝化反应。
反应体系如下：将10mM间甲苯胺(2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87L/A82V，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表13)。
间甲苯胺硝化反应式如下：
反应结果如下：
表13
由表13可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L/A82V对间甲苯胺的硝化反应。
实施例11：F87L/A82T催化对甲苯胺硝化反应实验
以上述获得的BMP突变体请见表14，利用H2O2和Im-C6-Phe，催化对甲苯胺的硝化反应。
反应体系如下：将8mM对甲苯胺(2％DMSO助溶)，0.5μM酶F87L/A82T，0.5mM的Im-C6-Phe小分子，200mM NaNO2，40mM H2O2加入到终体积为1mL的pH7.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用乙酸乙酯(1mL)萃取1min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，然后进行GC测定，GC条件：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为19.33min，同时以不加小分子化合物的催化反应作为对照(表14)。
对甲苯胺硝化反应式如下：
反应结果如下：
表14
由表14可见Im-C6-Phe的加入，可以实现F87L/A82T对对甲苯胺的硝化反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种细胞色素P450BM3氧化酶突变体及其制备方法和应用
<130> 11531
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1368
<212> DNA
<213> P450BM3
<400> 1
atgacaatta aagaaatgcc tcagccaaaa acgtttggag agcttaaaaa tttaccgtta 60
ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc 120
tttaaattcg aggcgcctgg tcgtgtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa 180
gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aagcgcttaa atttgtacgt 240
gattttgcag gagacgggtt atttacaagc tggacgcatg aaaaaaattg gaaaaaagcg 300
cataatatct tacttccaag cttcagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg 360
gtcgatatcg ccgtgcagct tgttcaaaag tgggagcgtc taaatgcaga tgagcatatt 420
gaagtaccgg aagacatgac acgtttaacg cttgatacaa ttggtctttg cggctttaac 480
tatcgcttta acagctttta ccgagatcag cctcatccat ttattacaag tatggtccgt 540
gcactggatg aagcaatgaa caagctgcag cgagcaaatc cagacgaccc agcttatgat 600
gaaaacaagc gccagtttca agaagatatc aaggtgatga acgacctagt agataaaatt 660
attgcagatc gcaaagcaag cggtgaacaa agcgatgatt tattaacgca tatgctaaac 720
ggaaaagatc cagaaacggg tgagccgctt gatgacgaga acattcgcta tcaaattatt 780
acattcttaa ttgcgggaca cgaaacaaca agtggtcttt tatcatttgc gctgtatttc 840
ttagtgaaaa atccacatgt attacaaaaa gcagcagaag aagcagcacg agttctagta 900
gatcctgttc caagctacaa acaagtcaaa cagcttaaat atgtcggcat ggtcttaaac 960
gaagcgctgc gcttatggcc aactgctcct gcgttttccc tatatgcaaa agaagatacg 1020
gtgcttggag gagaatatcc tttagaaaaa ggcgacgaac taatggttct gattcctcag 1080
cttcaccgtg ataaaacaat ttggggagac gatgtggaag agttccgtcc agagcgtttt 1140
gaaaatccaa gtgcgattcc gcagcatgcg tttaaaccgt ttggaaacgg tcagcgtgcg 1200
tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa 1260
cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctggata ttaaagaaac tttaacgtta 1320
aaacctgaag gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaaaaaa ttccgctt 1368
<210> 2
<211> 455
<212> PRT
<213> P450BM3
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (47)..(47)
<223> 选自R或L
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (75)..(75)
<223> 选自L、Y、F、M、Q或K
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (78)..(78)
<223> 选自V、C、S、A、F、I、L、T、M、V、G、D、E或N
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (82)..(82)
<223> 选自I、V、F、L、W、T、S、C、G或M
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (87)..(87)
<223> 选自A、V、I、G或L
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 选自T或M
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (100)..(100)
<223> 选自H或R
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (181)..(181)
<223> 选自L、M、F、I、T或Q
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (184)..(184)
<223> 选自A、V、I、L、M、F、Q、T或N
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (255)..(255)
<223> 选自R或S
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (263)..(263)
<223> 选自I、V或G
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (264)..(264)
<223> 选自A、C、S、T、D、E或V
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (328)..(328)
<223> 选自A、V或S
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (330)..(330)
<223> 选自A或W
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (401)..(401)
<223> 选自I或P
<220>
<221> UNSURE
<222> (47)..(47)
<223> The 'Xaa' at location 47 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (75)..(75)
<223> The 'Xaa' at location 75 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (78)..(78)
<223> The 'Xaa' at location 78 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (82)..(82)
<223> The 'Xaa' at location 82 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (87)..(87)
<223> The 'Xaa' at location 87 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (88)..(88)
<223> The 'Xaa' at location 88 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (100)..(100)
<223> The 'Xaa' at location 100 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (181)..(181)
<223> The 'Xaa' at location 181 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (184)..(184)
<223> The 'Xaa' at location 184 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (255)..(255)
<223> The 'Xaa' at location 255 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (263)..(263)
<223> The 'Xaa' at location 263 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (264)..(264)
<223> The 'Xaa' at location 264 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (328)..(328)
<223> The 'Xaa' at location 328 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (330)..(330)
<223> The 'Xaa' at location 330 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (401)..(401)
<223> The 'Xaa' at location 401 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 2
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn
1 5 10 15
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile
20 25 30
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Xaa Val
35 40 45
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu
50 55 60
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Xaa Lys Phe Xaa Arg Asp
65 70 75 80
Phe Xaa Gly Asp Gly Leu Xaa Xaa Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp
85 90 95
Lys Lys Ala Xaa Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met
100 105 110
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp
130 135 140
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser
165 170 175
Met Val Arg Ala Xaa Asp Glu Xaa Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn
180 185 190
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp
195 200 205
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys
210 215 220
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly
225 230 235 240
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Xaa Tyr
245 250 255
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Xaa Xaa Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu
260 265 270
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln
275 280 285
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser
290 295 300
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu
305 310 315 320
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Xaa Pro Xaa Phe Ser Leu Tyr Ala Lys
325 330 335
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu
340 345 350
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly
355 360 365
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala
370 375 380
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys
385 390 395 400
Xaa Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met
405 410 415
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp
420 425 430
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala
435 440 445
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu
450 455
<210> 3
<211> 455
<212> PRT
<213> TIKP450BM3
<400> 3
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn
1 5 10 15
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile
20 25 30
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val
35 40 45
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu
50 55 60
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp
65 70 75 80
Phe Thr Gly Asp Gly Leu Leu Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp
85 90 95
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met
100 105 110
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp
130 135 140
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser
165 170 175
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn
180 185 190
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp
195 200 205
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys
210 215 220
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly
225 230 235 240
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr
245 250 255
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260 265 270
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln
275 280 285
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser
290 295 300
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala
370 375 380
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys
385 390 395 400
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met
405 410 415
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp
420 425 430
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala
435 440 445
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu
450 455
<210> 4
<211> 455
<212> PRT
<213> P450BM3
<400> 4
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Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala
370 375 380
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys
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405 410 415
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<211> 455
<212> PRT
<213> P450BM3
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Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn
1 5 10 15
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile
20 25 30
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35 40 45
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Phe Thr Gly Asp Gly Leu Leu Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp
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Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met
100 105 110
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Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp
130 135 140
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn
180 185 190
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp
195 200 205
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys
210 215 220
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly
225 230 235 240
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr
245 250 255
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu
260 265 270
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln
275 280 285
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser
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Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu
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Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys
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Claims (7)
1.一种细胞色素P450BM3氧化酶突变体，其特征在于，所述细胞色素P450BM3氧化酶突变体氧化结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO 3；或者，在野生型SEQ ID NO:2的野生型序列基础上仅存的突变组合F87L/A82V；或者，在野生型SEQ ID NO:2的野生型序列基础上仅存的突变组合F87A/Y160I/M237I；其中，所述SEQ ID NO:2的野生型序列为第47位氨基酸残基为R；第75位氨基酸残基为L；第78位氨基酸残基为V；第82位氨基酸残基为A；第87位的氨基酸残基为F；第88位氨基酸残基为T；第100位氨基酸残基为H；第181位氨基酸残基为L；第184位氨基酸残基为A；第263位氨基酸残基为I；第255位氨基酸残基为R；第264位氨基酸残基为A；第328位氨基酸残基为A；第330位氨基酸残基为A；以及第401位氨基酸残基为I 。
2.一种用于表达如权利要求1所述的细胞色素P450BM3氧化酶突变体的氧化结构域的重组基因。
3.一种用于表达如权利要求1所述的细胞色素P450BM3氧化酶突变体的氧化结构域的表达载体，其特征在于，包含骨架质粒和如权利要求2所述的重组基因，所述骨架质粒选自pET28a。
4.一种用于表达细胞色素P450BM3氧化酶突变体氧化结构域的重组工程菌，其特征在于，包含宿主菌和如权利要求3所述的表达载体，所述宿主菌选自巨大芽孢杆菌。
5.一种催化芳香基化合物硝化反应的方法，其特征在于，通过双功能小分子化合物诱导含有如权利要求1所述氧化结构域的细胞色素P450BM3氧化酶突变体催化H2O2对底物进行硝化反应；其中，所述底物为芳香基化合物； 所述双功能小分子化合物为Im-C6-Phe；所述底物选自
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将0.01μM～1mM突变体与0.1μM～300mM底物加入至pH4～10的缓冲溶液中，再添加1μM～300mM的所述双功能小分子化合物和1μM～600mM H2O2在0℃～60℃反应1min～24h来实现底物的催化氧化。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为Tris-HCl或PB缓冲液。
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