CN113388627B - 还原酶lx05基因，含有该基因的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种还原酶LX05基因，含有该基因的工程菌及其应用。所述还原酶LX05基因的核苷酸序列为SEQID NO.1；所述还原酶LX05基因所编码的还原酶蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。将还原酶LX05基因构建重组质粒再导入E.coliBL21(DE3)即获得含有该基因的基因工程菌。所述还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质或含有该还原酶基因的基因工程菌在合成手性化合物(优选(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇)具有立体选择性好、催化活性高和产物光学纯度高等特性，且能实现高浓度(768g/L)底物的转化。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程，具体涉及还原酶LX05基因，含有该基因的基因工程菌及其应用。
背景技术
手性化合物是一类重要的手性模块化合物，广泛应用于医药、化工和农业等领域。利用还原酶或其全细胞不对称还原潜手性羰基化合物是制备光学活性手性化合物的有效途径。还原酶是一类以NAD(P)H为辅酶、在酶学分类上属于短链脱氢酶/还原酶类的氧化还原酶，因其具有高化学选择性、高区域选择性和立体选择性，被认为是一类极具潜力的用于不对称催化还原反应的生物催化剂。然而，大多数已知的还原酶在催化制备手性化合物时存在催化活性较低、反应效率低下、底物初始浓度不高、热稳定性差、适用底物种类有限、有机溶剂耐受性差、水相溶解度低等问题，这些问题的存在严重制约着当前生物催化在工业上广泛应用，这些存在的问题可以通过选择高效、合适的还原酶催化剂来克服。因此，寻找具有优良特性的新型还原酶催化剂已成为必要，而且开发出新型、高效的还原酶催化剂还可以丰富微生物还原酶库，为生物催化制备功能手性化合物提供新酶源，为手性药物中间体的制备提供高效、绿色的生物催化剂。
(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是合成用于治疗癌症病人化疗时减少呕吐和延迟性呕吐的药物阿瑞吡坦和NK-1受体拮抗剂的重要手性中间体。制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基] 乙醇的方法有化学法合成、酶法拆分和生物催化的不对称还原等，基于还原酶或其全细胞为生物催化剂的不对称还原法具有立体选择性高、反应条件温和，副产物少和产率高等优点，越来越备受研究者关注。近年来，一些具有不对称还原制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基] 乙醇的还原酶或含还原酶的微生物细胞已被报道，如Leifsonia xyli，Lactobacillus kefir、 Penicillium expansum、Microbacterium oxydans、Trichodermaasperellum ZJPH0801、 Chryseobacterium sp.CA49、Burkholderia cenocepacia和固定化的酮还原酶等。然而，这些还原酶或微生物在催化过程中大多数的底物浓度不高、产物浓度低和反应时间较长，不适合用于工业化生产(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
发明内容
针对已报道大多数还原酶催化制备手性化合物(如(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇)时存在催化活性偏低、底物耐受性差、底物初始浓度低、产物浓度不够高，以及需要额外添加昂贵辅酶、反应时间长等问题，本发明提供一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好、反应时间短、无需额外添加辅酶的还原酶LX05基因，含有还原酶LX05基因的基因工程菌，以及还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质，或含有还原酶LX05基因的基因工程菌在催化还原制备手性化合物中的应用。特别地，将该酶用于(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的制备中，不仅催化活性高、底物耐受性好、产物浓度高、催化反应时间短，而且实现了高浓度(768g/L) 底物的转化。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种还原酶LX05基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述还原酶LX05基因全长(从起始密码子到终止密码子)为756bp，G+C含量为70.94％，编码251个氨基酸，所述氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。
所述的还原酶LX05基因核苷酸序列所编码的还原酶蛋白质，所述还原酶蛋白质的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。
SEQID NO.1：
ATGGCCACCTACGACGTGACGGACCGCTCGGCGATCGTGACCGGAGCGGGCTCAGGC ATCGGACGGGCGATCGCCGCCACGCTCGCCGAGAACGGCGCGGCCGTCCTGGTCGCA GACCTCGACGAAGAAGCCGCCAACGTCGTCGTCAAGGAGATCGTCGCGGCCGGGGG CACGGCCGAGGCCTTCGTGGGCGACGTCGCCGACCCCGAGGTCGCGGAAGCCGCGGT GGCCGCCGCTGTGGAGCTCGCCCCGCTGCGCATCGCCGTCAACAACGCCGGCATCGG CGGTGCCGCCGCACCGGTCGGCGAGTACCCGATCGACAGCTGGCGCAAGGTCATCGA CGTCAACCTCAACGCCGTCTTCTACGGCATGCGGGCGCAGATCGACGCGATCGCCGGC AACGGCGGCGGCGCGATCGTCAACATGGCCTCGATCCTCGGCTCGGTGGGCATCGCCG GCTACTCGGCGTACGTCACCTCCAAGCACGCCCTGCTCGGCCTCACCAAGAACGCCG CCCTCGAGTACGCGGCGAAGAACGTTCGCGTCACCGCGGTCGGCCCCGGCTTCATCTC CACGCCGCTTCTCGAGTCCAACCTCGACGCCGATACGCAGCAGGCCCTGGCCGACAA GCACGCCGCCGGCCGCCTCGGCACCCCGGAGGAGGTCGCCGCGCTGGTCGCGTTCCT CGCCTCCGACGCCGCGAGCTTCATCACCGGCAGCTACCACCTCGTCGACGGCGGCTAC ACCGCCCAGTAA
SEQ ID NO.2：
MATYDVTDRSAIVTGAGSGIGRAIAATLAENGAAVLVADLDEEAANVVVKEIVAAGGTAE AFVGDVADPEVAEAAVAAAVELAPLRIAVNNAGIGGAAAPVGEYPIDSWRKVIDVNLNAV FYGMRAQIDAIAGNGGGAIVNMASILGSVGIAGYSAYVTSKHALLGLTKNAALEYAAKN VRVTAVGPGFISTPLLESNLDADTQQALADKHAAGRLGTPEEVAALVAFLASDAASFITGS YHLVDGGYTAQ
含有所述的还原酶LX05基因的基因工程菌，优选重组表达载体pET-28a(+)；优选与载体连接的酶切位点为NcoⅠ和HindⅢ；优选重组表达菌株的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)的构建方法：含有所述的还原酶LX05基因的pET-28a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)，再将所获得的基因工程菌E.coli BL21(DE3)转接到含50μg/mL卡那霉素的平板，37℃培养16h 后，挑取单菌落转化子，经测序验证基因序列无误后，保存。
所述的还原酶LX05基因的应用，就是利用所述的还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质，或含有所述的还原酶LX05基因的基因工程菌在制备手性化合物中的应用，所述的手性化合物优选(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
含有所述的还原酶LX05基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05，按如下方法培养获得：取一定量的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05加入到装有50mL L-B培养基的250mL摇瓶中，37℃、150-250rpm，培养8-12h；然后取1mL培养液转接至装有100mL新鲜L-B培养基的500mL摇瓶中，37℃、150-250rpm，培养1-2h(优选1.5h)后，无菌条件下往摇瓶中添加终浓度为0-0.7mmol/L(优选0.6mmol/L)的诱导剂IPTG，17-37℃(优选29℃)、150-250rpm，继续培养6-20h(优选14h)，将培养液离心，获得基因工程菌湿菌体。
含有所述的还原酶LX05基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05在制备手性化合物中的应用，所述的手性化合物优选(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。具体应用为：以[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮为底物，以还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质或上述方法获得的基因工程菌湿菌体为酶源，于体积分数为0-75％(优选25-69％)的异丙醇、0-5mmol/L(优选2-3.9 mmol/L)的NAD+、0-3mmol/L(优选0.5-1.5mmol/L)的MgCl2、20-400g/L(优选100-300g/L) 的湿菌体、100-3000mmol/L的底物[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮和pH为6.2-8.0的缓冲液或蒸馏水构成的反应体系中，在25-35℃条件下进行反应，反应结束后，向反应液加入乙酸乙酯或正己烷萃取10-30min，然后离心收集上层的乙酸乙酯萃取液，萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。
本发明的有益效果主要体现在：
本发明针对已报道大多数还原酶催化制备手性化合物(如(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇)时存在催化活性偏低、底物耐受性差、底物初始浓度低、产物浓度不够高，以及需要额外添加昂贵辅酶、反应时间长等问题，提供了一种新型的还原酶LX05基因，含有该基因的工程菌；及还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质，或含有还原酶LX05基因的基因工程菌可不对称还原制备手性化合物，从而在研究生物法制备NK-1受体拮抗剂类药物关键手性中间体 (R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇方面提供了有益的参考；采用该含新型还原酶LX05基因的基因工程菌不对称还原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮制备光学纯(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇具有立体选择性好、催化活性高和产物光学纯度高等特性，并实现了高浓度底物(768g/L) 的转化。本发明筛选和设计获得了一种新型的还原酶LX05基因，通过采用含该新型还原酶 LX05基因的基因工程菌经上述培养方法获得的湿菌体为催化剂，于体积分数为69％的异丙醇、3.9mmol/L的NAD+、1.0mmol/L的MgCl2、300g/L的湿菌体、3mol/L(质量浓度为768g/L) 的底物[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮和pH为7.4的缓冲液或蒸馏水构成的反应体系中，在32℃、 150rpm条件下反应15h，目的产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率达到94.1％，e.e.达到 99.9％。
附图说明
图1为还原酶LX05基因酶切图谱，其中，1为经NcoⅠ和HindⅢ酶切后的样品，2为标准 ladder。
图2为含还原酶LX05基因的基因工程菌生物还原反应萃取液气相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
还原酶基因的获得及功能验证：利用基因挖掘技术从GeneBank数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中通过序列比对筛选获得5个还原酶基因。再基于还原酶保守序列分析，对获得的5个还原酶基因进行设计得到5个新型还原酶(LX01，LX02、LX03，LX04和LX05)基因，并分别在其5’和3’端添加NcoⅠ和HindⅢ酶切位点，然后送于苏州金唯智生物科技有限公司进行基因全合成和构建其基因工程菌。对构建获得的5个工程菌进行不对称还原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮(底物浓度为100mmol/L)的功能验证，结果表明，还原酶LX01，LX02，LX03和LX04均没有不对称还原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮的还原活性，其产物产率为0，但还原酶LX05具有不对称还原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮制备(R)-[3,5- 二(三氟甲基)苯基]乙醇的性能，产物的产率为20.4％，e.e.值为99.8％。
实施例2
含还原酶基因LX05的工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05的培养及湿菌体的获得：取一定量的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05加入到装有50mL L-B培养基的250mL摇瓶中，37℃、 150rpm，培养12h；然后取1mL培养液转接至装有100mL新鲜L-B培养基的500mL摇瓶中，37 ℃、150rpm，培养1.5h后，无菌条件下往摇瓶中添加终浓度为0.6mmol/L的诱导剂IPTG，29 ℃、150rpm，继续培养14h，将培养液离心，所得沉淀用磷酸缓冲液洗涤，获得湿菌体，即为酶源。
实施例3
产物的气相检测分析：将反应结束后的反应液离心，取上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取。萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷进行分析。气相色谱条件：日本岛津GC-2014气相色谱仪；美国瓦里安CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比为15:1；检测器和进样口温度均为250℃；色谱柱温度80-150℃；升温速度8℃/min；检测器为FID。各物质的出峰时间约为：[3,5- 二(三氟甲基)苯基]乙酮4.569min，十二烷8.315min，(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇9.308min，(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇9.631min。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓度、产率和e.e.值。
实施例4-12
将实施例2所得的湿菌体悬浮一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH7.4)中，控制湿菌体以菌体湿重计浓度为40g/L；加入终浓度100mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入不同种类的辅助底物如甲醇、乙醇、异丙醇、甘油、葡萄糖、乳糖、蔗糖、乙二醇和1,4-丁二醇(固体终浓度为50g/L，液体浓度为10％)，置于30℃、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表1所示。
表1不同辅助底物种类对产率和e.e.值的影响
由表1可知，当辅助底物为异丙醇时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高，且相比不添加辅助底物有明显提升，为44.2％，且e.e.值为99.8％。
实施例13-20
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH7.4)中，控制湿菌体以菌体湿重计浓度为40g/L；加入终浓度100mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入不同浓度(体积分数)的异丙醇(v/v)(如0、2.5、5、 7.5、10、12.5、15、20、25、30％)，置于30℃、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表2所示。由表2可知，当异丙醇浓度为25％(v/v)时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高，为99.9％，且e.e.值为99.8％。
表2异丙醇浓度对产率和e.e.值的影响
实施例21-24
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，控制湿菌体以菌体湿重计浓度为40g/L；加入终浓度为25％(v/v)的异丙醇为辅助底物，再加入终浓度200mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，然后置于不同的温度(25、28、30、32、35℃)下、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e. 值见表3所示。由表3可知，当温度为32℃时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高，为61.1％，且e.e.值为99.8％。
表3反应温度对产率和e.e.值的影响
实施例25-29
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的不同的pH缓冲液(6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、 8.0)中，控制湿菌体以菌体湿重计浓度为40g/L；加入终浓度为25％(v/v)的异丙醇为辅助底物，再加入终浓度200mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，置于32℃、150rpm 的摇床中反应12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物 (R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表4所示。由表4可知，当缓冲液pH值为7.4时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高，为61.1％，且e.e.值为99.8％。
表4缓冲液pH值对产率和e.e.值的影响
实施例30-37
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，控制湿菌体以菌体湿重计浓度为40g/L；加入终浓度为25％(v/v)的异丙醇为辅助底物，加入终浓度200mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再分别加入终浓度为1mmol/L的硫酸锰、硫酸锌、硫酸亚铁、EDTA二钠、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙。置于32℃、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表5所示。由表5可知，当反应体系中添加了1mmol/L的氯化镁时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高，为68.3％，且e.e.值为99.9％。
表5金属离子对产率和e.e.值的影响
实施例38-41
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，控制湿菌体以菌体湿重计浓度为40g/L；加入终浓度为25％(v/v)的异丙醇为辅助底物，加入终浓度200mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再分别加入不同浓度(0、0.5、1、1.5、2.0和3.0mmol/L)的氯化镁。置于32℃、150rpm的摇床中反应 12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表6所示。由表6可知，当反应体系中添加了1mmol/L的氯化镁时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高，为68.3％，且e.e.值为99.9％。
表6氯化镁浓度对产率和e.e.值的影响
实施例42-46
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，控制湿菌体以菌体湿重计浓度为40g/L；加入终浓度为25％(v/v)的异丙醇为辅助底物，加入终浓度300mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，加入终浓度为1mmol/L的氯化镁，再分别加入不同浓度(0、0.5、1、2、3和4mmol/L)的NAD+。置于 32℃、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和 e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表7所示。由表7可知，当反应体系中添加了3mmol/L的NAD+时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高，为66.1％，且e.e.值为99.9％。
表7 NAD+浓度对产率和e.e.值的影响
实施例47-60
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，控制湿菌体以菌体湿重计浓度为40g/L；加入终浓度为25％(v/v)的异丙醇为辅助底物，加入终浓度为1mmol/L的氯化镁和终浓度为3.0mmol/L的NAD+。再加入不同浓度(100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、2000、2500、 3000mmol/L)的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，置于32℃、150rpm的摇床中反应 12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度、产率和e.e.值见表8所示。由表8可知，当[3,5-二(三氟甲基)苯基] 乙酮浓度为3000mmol/L时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，为943.7 mmol/L，此时产率为31.5％，e.e.值为99.9％。
表8[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮底物浓度对产物浓度、产率和e.e.值的影响
实施例61-67
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，加入终浓度为25％(v/v)的异丙醇为辅助底物，加入终浓度为1mmol/L的氯化镁和终浓度为3.0mmol/L的NAD+，加入终浓度3000mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入不同浓度(20、40、100、150、200、250、300、400g/L)的湿菌体，置于32℃、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表9所示。由表9可知，当湿菌体浓度为300g/L时，产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率为56.6％，e.e.值为99.9％。
表9湿菌体浓度对产率和e.e.值的影响
实施例68-84
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，加入终浓度为1mmol/L的氯化镁，加入终浓度3000mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再按照表10添加不同浓度的异丙醇、湿菌体浓度和NAD+，置于 32℃、150rpm的摇床中反应12h，以考察异丙醇、湿菌体浓度和NAD+这三个因素之间交互的影响。反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二 (三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表10所示，并对结果进行分析和预测获得最佳的异丙醇、湿菌体和NAD+浓度分别为69％(v/v)、300g/L和3.9mmol/L。此条件下预测的产物 (R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率为84.3％。
表10响应面实验设计及结果
实施例85
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，加入终浓度为1mmol/L的氯化镁，加入终浓度3000mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，加入300g/L的湿菌体、终浓度为69％(v/v)的异丙醇和终浓度为3.9mmol/L的NAD+，置于32℃、150rpm的摇床中反应12h，反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值，以验证响应面法获得的最优条件下的产物的产率和e.e. 值。结果表明，在此条件下产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值分别为88.1％，稍高于预期的产率，基本与预期的产率数值相符。
实施例86-90
将实施例2所得的湿菌体悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH 7.4)中，加入终浓度为1mmol/L的氯化镁，加入300g/L的湿菌体、终浓度为69％(v/v) 的异丙醇和终浓度为3.9mmol/L的NAD+，加入终浓度3000mmol/L的[3,5-二(三氟甲基) 苯基]乙酮作为底物，置于32℃、150rpm的摇床中反应不同的时间(3、6、9、12、15和 18h)，反应结束后，按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表11所示。由表11可知，反应时间为15h时，产物 (R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率为94.1％，e.e.值为99.9％
表11反应时间对产率和e.e.值的影响
序列表
<110> 湖南科技大学
<120> 还原酶LX05基因，含有该基因的基因工程菌及其应用
<130> 20210727
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQID NO.1)
<400> 1
atggccacct acgacgtgac ggaccgctcg gcgatcgtga ccggagcggg ctcaggcatc 60
ggacgggcga tcgccgccac gctcgccgag aacggcgcgg ccgtcctggt cgcagacctc 120
gacgaagaag ccgccaacgt cgtcgtcaag gagatcgtcg cggccggggg cacggccgag 180
gccttcgtgg gcgacgtcgc cgaccccgag gtcgcggaag ccgcggtggc cgccgctgtg 240
gagctcgccc cgctgcgcat cgccgtcaac aacgccggca tcggcggtgc cgccgcaccg 300
gtcggcgagt acccgatcga cagctggcgc aaggtcatcg acgtcaacct caacgccgtc 360
ttctacggca tgcgggcgca gatcgacgcg atcgccggca acggcggcgg cgcgatcgtc 420
aacatggcct cgatcctcgg ctcggtgggc atcgccggct actcggcgta cgtcacctcc 480
aagcacgccc tgctcggcct caccaagaac gccgccctcg agtacgcggc gaagaacgtt 540
cgcgtcaccg cggtcggccc cggcttcatc tccacgccgc ttctcgagtc caacctcgac 600
gccgatacgc agcaggccct ggccgacaag cacgccgccg gccgcctcgg caccccggag 660
gaggtcgccg cgctggtcgc gttcctcgcc tccgacgccg cgagcttcat caccggcagc 720
taccacctcg tcgacggcgg ctacaccgcc cagtaa 756
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(SEQID NO.2)
<400> 2
Met Ala Thr Tyr Asp Val Thr Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Ile Ala Ala Thr Leu Ala Glu Asn Gly
20 25 30
Ala Ala Val Leu Val Ala Asp Leu Asp Glu Glu Ala Ala Asn Val Val
35 40 45
Val Lys Glu Ile Val Ala Ala Gly Gly Thr Ala Glu Ala Phe Val Gly
50 55 60
Asp Val Ala Asp Pro Glu Val Ala Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Val
65 70 75 80
Glu Leu Ala Pro Leu Arg Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Pro Val Gly Glu Tyr Pro Ile Asp Ser Trp Arg Lys Val
100 105 110
Ile Asp Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Arg Ala Gln Ile
115 120 125
Asp Ala Ile Ala Gly Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser
130 135 140
Ile Leu Gly Ser Val Gly Ile Ala Gly Tyr Ser Ala Tyr Val Thr Ser
145 150 155 160
Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala
165 170 175
Ala Lys Asn Val Arg Val Thr Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Ser Thr
180 185 190
Pro Leu Leu Glu Ser Asn Leu Asp Ala Asp Thr Gln Gln Ala Leu Ala
195 200 205
Asp Lys His Ala Ala Gly Arg Leu Gly Thr Pro Glu Glu Val Ala Ala
210 215 220
Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser Asp Ala Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser
225 230 235 240
Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
Claims (7)
1.一种还原酶LX05基因，其特征在于，所述还原酶LX05基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1，所述基因全长为756 bp，G+C 含量为70.94%，编码251个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQID NO.2。
2.权利要求1所述的还原酶LX05基因所编码的还原酶蛋白质，其特征在于，所述还原酶蛋白质的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。
3.一种含有权利要求1所述的还原酶LX05基因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05，所述基因工程菌的重组表达载体为pET-28a(+)，与载体连接的酶切位点为NcoⅠ和HindⅢ，重组表达菌株的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3) 的构建方法为：含有权利要求1所述的还原酶LX05基因的pET-28a(+) 重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3) 获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)，再将所获得的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3) 转接到含50 μg/mL卡那霉素的平板，37℃培养16h 后，挑取单菌落转化子，经测序验证基因序列无误后，保存。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05，按如下方法培养获得：取一定量的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05加入到装有50mL L-B培养基的250mL摇瓶中，37℃、150-250rpm，培养8-12 h；然后取1mL培养液转接至装有100mL新鲜L-B培养基的500mL摇瓶中，37℃、150-250rpm，培养1-2h后，无菌条件下往摇瓶中添加终浓度为0-0.7 mmol/L的诱导剂IPTG，17-37℃、150-250rpm，继续培养6-20h，将培养液离心，获得基因工程菌湿菌体。
6.权利要求1所述的还原酶LX05基因、权利要求2所述的还原酶蛋白质或权利要求3所述的基因工程菌的应用，其特征在于，所述的还原酶LX05基因、还原酶蛋白质或基因工程菌用于制备手性化合物，所述的手性化合物为(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮为底物，以还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质或权利要求5所述的方法获得的基因工程菌湿菌体为酶源，于体积分数为0-75%的异丙醇、0-5 mmol/L的NAD+、0-3 mmol/L的MgCl2、20-400 g/L的湿菌体、100-3000 mmol/L的底物[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮和pH为6.2-8.0的缓冲液或蒸馏水构成的反应体系中，在25-35℃条件下进行反应，反应结束后，向反应液加入乙酸乙酯或正己烷萃取10-30min，然后离心收集上层的乙酸乙酯萃取液，萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2004261042A (ja) * | 2003-02-28 | 2004-09-24 | Sumitomo Chem Co Ltd | 還元酵素遺伝子及びその利用 |
| CN102102087A (zh) * | 2010-10-28 | 2011-06-22 | 浙江工业大学 | 雷弗松氏菌及在制备(r)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的应用 |
| CN103421823A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-12-04 | 浙江工业大学 | 源于雷氟松氏菌的短链脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及应用 |
-
2021
- 2021-07-27 CN CN202110851734.0A patent/CN113388627B/zh active Active
Patent Citations (3)
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| 不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮的羰基还原酶的挖掘与功能验证;黎小军等;《新余学院学报》;20181010(第05期);8-11 * |
| 生物催化不对称还原制备(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇研究进展;刘艳等;《应用与环境生物学报》;20191212(第04期);820-826 * |
| 雷弗松氏菌（Leifsonia xyli）HS0904源羰基还原酶的异源表达、定向进化及其应用研究;王能强;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20200515;第1页和第50-55页 * |
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