CN115725614A - 一种生产雌马酚的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产雌马酚的菌株及其应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明提供了6‑磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA和/或GNAT家族N‑乙酰转移酶基因elaA的新用途，通过对大肠杆菌基因组内源的pfkA，sthA，elaA中的一个或多个基因进行敲除，提高了雌马酚的生产能力，使摇瓶水平的雌马酚产量由90mg/L提高至110.6～224.1mg/L不等。

Description

一种生产雌马酚的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种生产雌马酚的菌株及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

异黄酮类物质是豆科植物中的重要功能物质，在植物的抗病虫害等方面扮演着重要的角色，对人类健康也具有积极的作用。大豆苷元广泛存在于大豆等豆类植物中，可以较容易地从豆类植物中提取得到。但其对人体的主要功效是通过它的还原形式-雌马酚所体现的，雌马酚的功能性强于大豆苷元数倍，并具有许多大豆苷元不具备的功效，这使得雌马酚在药物、化妆品和食品工业领域具有巨大的应用潜力。

由于雌马酚是由肠道菌群转化大豆苷元生成的，并不能从植物中提取。目前对雌马酚的生产主要是利用传统的化学方法，通过对大豆苷元进行一系列的还原，保护与脱保护反应而制备。对于手性化合物的合成，通常存在着反应能耗高，分离难度大，催化剂昂贵等问题，而且通常会产生较多的副产物，导致目标产物的得率低。而通过微生物转化的方式生产雌马酚则可以很好的避免这些问题，且微生物转化生成的雌马酚全为S型，正好是我们所需要的。因此，针对化学合成雌马酚在产品稳定性、质量安全和价格等方面的局限，绿色，安全，产物单一的微生物转化方式为雌马酚的合成提供可行的思路。

发明内容

本发明提供了6-磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA和/或GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA在提高大肠杆菌雌马酚产量方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是抑制6-磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA，GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA中的一个或多个基因的表达。

在一种实施方式中，所述基因pfkA的核苷酸序列如Gene ID：948412所示；所述基因elaA的核苷酸序列如Gene ID：946750所示；所述基因sthA的核苷酸序列如Gene ID：948461所示。

本发明还提供了用于生产雌马酚的重组大肠杆菌，以大肠杆菌为出发菌株，对如下一个或多个基因进行了基因表达抑制：编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA，GNAT家族N-乙酰转移酶基因。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌缺失或沉默了大肠杆菌内源编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA，GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA中的一个或多个。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌内源编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA，GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA中的一个或多个。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌缺失或沉默了6-磷酸果糖激酶基因pfkA和NAD(P)⁺转氢酶基因sthA。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌缺失或沉默了6-磷酸果糖激酶基因pfkA和GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌缺失或沉默了NAD(P)⁺转氢酶基因sthA和GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌缺失或沉默了大肠杆菌内源的6-磷酸果糖激酶基因pfkA、NAD(P)⁺转氢酶基因sthA和GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌还进行了如下至少一种改进：

(1)表达了Asaccharobacter celatus来源的大豆苷元还原酶Ac_DZNR；

(2)表达了Lactococcus garvieae来源的二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC；

(3)表达了Slackia isoflavoniconvertens来源的二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR和四氢大豆苷元还原酶Si_THDR。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。

在一种实施方式中，所述大豆苷元还原酶Ac_DZNR的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述四氢大豆苷元还原酶Si_THDR的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，以pRSFDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1作为表达载体表达所述大豆苷元还原酶Ac_DZNR、二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC、二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR或四氢大豆苷元还原酶Si_THDR。

本发明还提供了一种微生物转化大豆苷元生产雌马酚的方法，所述方法是以所述大肠杆菌为发酵菌株，在含大豆苷元的培养基中，于25～37℃发酵至少24h。

在一种实施方式中，所述方法还采用IPTG诱导。

在一种实施方式中，所述发酵采用分阶段发酵，所述分阶段包括：

第一阶段：控制温度35～37℃、溶解氧浓度35-45％促进细胞生长；

第二阶段：添加终浓度0.1-0.2mM的诱导剂，并控制温度23-28℃，氧气浓度25-35％，诱导5-7h后流加大豆苷元；

第三阶段：控制温度23-28℃发酵至少23-26h。

在一种实施方式中，所述方法是将20g/L终浓度的葡萄糖于30℃，150rpm继续发酵24h。

在一种实施方式中，所述方法是将所述重组大肠杆菌接种于LB培养基中培养8～12h作为种子液，以1％～4％的接种量接种于TB培养基中，35～37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～1.0，加入0.1～0.5mM终浓度的IPTG并降温诱导8-12h，补加大豆苷元于22～28℃，并补加20g/L终浓度的葡萄糖继续发酵12～48h。

在一种实施方式中，所述方法是将所述大肠杆菌种子液接种于TB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8，加入终浓度0.1mM的IPTG并降温诱导10h，再向发酵培养基中补加大豆苷元和葡萄糖，于28～30℃，120-180rpm继续发酵至少24h。

在一种实施方式中，所述种子液是将所述大肠杆菌接种于LB培养基中培养10h获得。

本发明还要求保护所述大肠杆菌在生产含雌马酚产品方面的应用。

有益效果：

(1)本发明筛选获得了来源于Asaccharobacter celatus的大豆苷元还原酶，该酶的转化率高达58％。

(2)本发明将Asaccharobacter celatus的大豆苷元还原酶在大肠杆菌中表达，并表达Lg_DDRC，Si_DHDR，Si_THDR，实现了雌马酚在大肠杆菌中的合成，为雌马酚的合成提供了良好的基础。

(3)本发明通过敲除了大肠杆菌内源编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA，GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA中的一个或多个基因，使雌马酚的产量由91.9mg/L提高至110.6～224.1mg/L不等。

附图说明

图1为携带大豆苷元还原酶的表达载体构建图。

图2为全细胞催化的色谱图。

图3为转化产物二氢大豆苷元的质谱图。

图4为全细胞催化验证催化能力的产量比较图。

图5为雌马酚的质谱柱状图。

图6为工程菌株在转化条件下的雌马酚摇瓶水平产量图。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入15g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。

TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，4mL甘油、KH₂PO₄ 2.31g/L、K₂HPO₄ 12.54g/L。

发酵培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，5g/L葡萄糖、KH₂PO₄ 2.31g/L、K₂HPO₄12.54g/L。

补充培养基：D-葡萄糖500g/L、MgSO₄·7H₂O 7.5g/L、酵母提取物10g/L。

200g/L葡萄糖母液：称取200g无水葡萄糖溶于500mL去离子水中，完全溶解后定容至1L。

100mM大豆苷元的DMSO母液：称取100mmol大豆苷元溶于500mL DMSO中，完全溶解后用DMSO定容至1L。

200mM大豆苷元的DMSO母液：称取200mmol大豆苷元溶于500mL DMSO中，完全溶解后用DMSO定容至1L。

(二)大肠杆菌的化学转化感受态制备：

将E.coli BL21(DE3)划线于LB固体平板中培养12h。挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中培养8-10h，以1.5-2.5％接种量接种于50mL LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0。

感受态试剂盒采用TAKRA公司的高效感受态制备试剂盒。感受态制备过程按其说明书进行操作。

(三)大肠杆菌电转化感受态制备：

将E.coli BL21(DE3)划线于LB固体平板中培养12h。挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中培养8-10h，以2％接种量接种于50mL LB培养基中(用于基因敲除时添加终浓度1mM的阿拉伯糖)，培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0。冰上冷却菌体30min，4000rpm，4℃收集菌体，用10％的预冷甘油溶液重悬洗涤菌体，重复洗涤一次，用10％的预冷甘油溶液重悬菌体后分装至无菌EP管中，即得大肠杆菌电转化感受态。

(四)大肠杆菌的化学转化：

1)取制备好的感受态细胞于冰上放置冻融，加入相应构建好的表达载体，冰上放置30min。

2)将放置后的含目标载体的感受态于42℃水浴锅热激90s，之后置于37℃摇床后培养40min左右。

3)将感受态低速离心后去除部分上清，吹吸悬浮细胞，涂布于含相应抗性的LB平板上，进行抗性筛选，并做菌落PCR及测序验证重组转化子。

(五)大肠杆菌的电转化：

1)取制备好的感受态细胞于冰上放置冻融，加入相应构建好的载体或片段混匀，冰上放置5-15min。

2)吸取含目的载体或片段的感受态至预冷的0.2mm电转杯中，在1.25kV/mm，25μF，200Ω条件下电激。

3)立即吸取1mL的LB培养基重悬电激后的大肠杆菌，转移至无菌EP管中，置于37℃摇床后培养1-2h左右。

4)将感受态低速离心后去除部分上清，吹吸悬浮细胞，涂布于含相应抗性的LB平板上，进行抗性筛选，并做菌落PCR及测序验证重组转化子。

(六)雌马酚的HPLC测定：

使用岛津高效液相色谱检测，液相检测条件为：大曹色谱柱CAPCELL PAK UG120250mm×4.6mm column(particle size 5μm)；流动相A，含有1‰甲酸的超纯水；流动相B，含有1‰甲酸的甲醇；流动相比例条件，0-2min，5％B，2-13min，5-100％B，13-15min，100％B，15-18min，100-5％B，18-20min，5％B；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器波长：280nm。

(七)菌株信息如表1所示。

表1实施例涉及的菌株

实施例1大肠杆菌内源基因的单敲除及组合敲除

为了提高底盘细胞生产雌马酚的能力，利用CRISPR/Cas9系统对E.coli BL21(DE3)相关内源基因进行敲除。分别用引物sg-pfkA-F/sg-pfkA-R、sg-sthA-F/sg-sthA-R、sg-elaA-F/sg-elaA-R扩增质粒pEcgRNA，利用热激法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有链霉素的抗性平板筛选阳性转化子，挑取单菌落接种于含相应抗性的5mL液体LB中，提取质粒，即得质粒pEcgRNA-pfkA、pEcgRNA-elaA、pEcgRNA-sthA；用引物pfkA-armup-F/pfkA-armup-R和pfkA-armdown-F/pfkA-armdown-R分别扩增基因pfkA得上下由同源臂pfkA-armup、pfkA-armdown，再以pfkA-armup、pfkA-armdown为模板，用引物pfkA-armup-F/pfkA-armdown-R进行融合PCR，得到片段pfkA-arm；用引物elaA-armup-F/elaA-armup-R和elaA-armdown-F/elaA-armdown-R分别扩增基因elaA得上下由同源臂elaA-armup、elaA-armdown，再以elaA-armup和elaA-armdown为模板，用引物elaA-armup-F/elaA-armdown-R进行融合PCR，得到片段elaA-arm；用引物sthA-armup-F/sthA-armup-R和sthA-armdown-F/sthA-armdown-R分别扩增基因sthA得上下由同源臂sthA-armup、sthA-armdown，再以sthA-armup和sthA-armdown为模板，用引物sthA-armup-F/sthA-armdown-R进行融合PCR，得到片段sthA-arm；将PCR产物sthA-arm通过试剂盒回收并测序验证。

取100ng的pEcCas质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)的化学感受态细胞中，得到菌株BL21(DE3)-Cas,利用菌株BL21(DE3)-Cas制备电转化感受态。取100ng pEcgRNA-pfkA和400ng pfkA-arm电转入BL21(DE3)-Cas感受态中进行pfkA基因的敲除，将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNA-pfkA，获得菌株BL21(DE3)ΔpfkA-Cas，进一步消除质粒pCas质粒，获得菌株EqC_No1。

以上述相同的策略，取100ng pEcgRNA-sthA和400ng sthA-arm电转入BL21(DE3)-Cas感受态中进行Gene ID 948461所示sthA基因的敲除，将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNA-sthA，获得菌株BL21(DE3)ΔsthA-Cas，进一步消除质粒pEcCas后，得到菌株EqC_No2。

以上述相同的策略，取100ng pEcgRNA-elaA和400ng elaA-arm电转入BL21(DE3)-Cas感受态中进行Gene ID 946750所示elaA基因的敲除，将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNA-elaA和pEcCas后，得到菌株EqC_No2-1。

所用引物序列均列在表2中。

表2引物及序列

实施例2大肠杆菌内源基因的双敲除

按照实施例1相同的策略，区别在于，取100ng pEcgRNA-sthA和400ng sthA-arm电转入BL21(DE3)ΔpfkA-Cas(含有pCas质粒的EqC_No1)感受态中进行Gene ID 948461所示sthA基因的敲除，将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNA-sthA，获得菌株BL21(DE3)ΔpfkAΔsthA-Cas，进一步消除pEcCas后，得到同时敲除pfkA和sthA的菌株，命名为EqC_No3。

以上述相同的策略，区别在于，取100ng pEcgRNA-elaA和400ng elaA-arm电转入BL21(DE3)ΔpfkA-Cas(含有pCas质粒的EqC_No1)感受态中进行Gene ID 946750所示elaA基因的敲除，将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNA-elaA和pEcCas后，得到敲除pfkA和elaA菌株，命名为EqC_No3-1。

以上述相同的策略，区别在于，取100ng pEcgRNA-elaA和400ng elaA-arm电转入BL21(DE3)ΔsthA-Cas感受态(含有pCas质粒的EqC_No2)中进行Gene ID 948461所示elaA基因的敲除，将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNA-elaA和pEcCas后，得到敲除elaA和sthA菌株，命名为EqC_No3-2。

实施例3大肠杆菌内源基因的三敲除

按照实施例1相同的策略，区别在于，取100ng pEcgRNA-elaA和400ng elaA-arm电转入BL21(DE3)ΔpfkAΔsthA-Cas感受态中进行Gene ID 946750所示elaA基因的敲除，将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNA-elaA，获得菌株BL21(DE3)ΔpfkAΔsthAΔelaA-Cas，进一步消除pEcCas后，得到同时敲除pfkA、sthA、elaA三个基因的菌株，命名为EqC_No4。

实施例4表达大豆苷元还原酶的质粒构建及酶的表达

1)表达载体构建

来源于Slackia isoflavoniconvertens的大豆苷元还原酶Si_DZNR，其氨基酸序列如Genbank登录号WP_123220034.1所示，经密码子优化后得到编码Si_DZNR的基因片段，并构建于pET28a(+)表达载体的多克隆位点，获得重组质粒pET28a(+)-1，其质粒图谱如图1所示，其N端保留了His标签和thrombin位点，以双酶切方式构建。密码子优化，基因合成，载体构建均由上海生工生物工程有限公司完成。

将来源于Adlercreutzia celatus的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的酶，通过密码子优化获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1的基因片段，采用与重组质粒pET28a(+)-1同样的方法，构建至pET28a(+)表达载体，获得重组质粒pET28a(+)-2。

按照上述相同策略，分别将来源于Adlercreutzia mucosicola(氨基酸序列如Genbank登录号：WP_160344852.1所示)、Sharpea porci(氨基酸序列如Genbank登录号：WP_154515424.1所示)、Sharpea azabuensis(氨基酸序列如Genbank登录号：WP_074782075.1所示)、Traorella massiliensis(氨基酸序列如Genbank登录号：WP_071441835.1所示)、Catenisphaera adipataccumulans(氨基酸序列如Genbank登录号：WP_183327643.1所示)、Clostridium saccharogumia(氨基酸序列如Genbank登录号：WP_027090791.1所示)、Intestinibaculum porci(氨基酸序列如Genbank登录号：WP_179951177.1所示)、Holdemania massiliensis(氨基酸序列如Genbank登录号：WP_020223358.1所示)的酶分别进行密码子优化，采用与重组质粒pET28a(+)-1相同的策略，构建至pET28a(+)表达载体，分别获得重组质粒pET28a(+)-3～pET28a(+)-10。

2)蛋白表达

将步骤(1)构建的重组质粒pET28a(+)-1～pET28a(+)-10分别转化至大肠杆菌感受态细胞中，并将转化液涂布至LB平板上，37℃培养过夜，利用菌落PCR验证转化子，获得重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-1～E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-10。

将验证正确的转化子转移至含有50mg/L硫酸卡那霉素的5mL LB培养基中37℃过夜培养，制备种子液。将培养好的种子液以一定比例转接至含有50mg/L硫酸卡那霉素的50mL TB培养基中，控制初始OD₆₀₀＝0.02～0.04，37℃，220rpm培养至菌体浓度达到OD₆₀₀＝0.8后，降温至22-28℃，并添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mM进行诱导表达8-12h，获得菌液。

实施例5全细胞催化验证酶的催化能力

将实施例4中重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-1～E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-10的菌液分别于4000rpm，4℃离心收集菌体，并用PBS溶液清洗菌体2次，收集细胞重悬于KPB(pH＝8.0)溶液中，并控制细胞重悬液的菌体量为OD₆₀₀＝10，随后，往细胞重悬液中添加体积分数6‰的100mM大豆苷元DMSO储备液，混合均匀后，置于25℃，150rpm的反应条件下进行全细胞催化。

通过全细胞催化大豆苷元以比较和验证氨基酸序列如Genbank登录号WP_123220034.1所示的Si_DZNR和实施例1筛选的大豆苷元还原酶活性，定时取样用于液相检测产物的生成及底物消耗情况。转化率(％)按如下公式计算：实际生成的二氢大豆苷元摩尔数/理论完全转化生成二氢大豆苷元摩尔数×100％。

结果如图2～图4所示，来源于Adlercreutzia celatus、Adlercreutziamucosicola、Sharpea porci、Sharpea azabuensis、Traorella massiliensis的酶具有大豆苷元还原酶活性，可以将大豆苷元还原为二氢大豆苷元。而来源于Catenisphaeraadipataccumulans、Clostridium saccharogumia、Intestinibaculum porci、Holdemaniamassiliensis的酶不具有催化大豆苷元还原为二氢大豆苷元的能力，转化率为0。

实施例筛选的10个酶在分别加入底物反应12h后表现出最大转化率，其中，以氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的酶的转化率为58％，约为Si_DZNR的转化率的3倍，来源于Adlercreutzia mucosicola、Sharpea porci、Sharpea azabuensis、Traorellamassiliensis的酶也具有催化大豆苷元还原为二氢大豆苷元的酶活性，转化率分别为6％、3％、8％、7％。

实施例6转化大豆苷元生产雌马酚的大肠杆菌工程菌株的构建

为构建转化大豆苷元合成雌马酚的工程菌株，以pCDFDuet-1、pRSFDuet-1质粒为模板，用引物对pCDF-cz1-F/pCDF-cz1-R扩增pCDFDuet-1的除MCS1位点的其他片段，命名为pcdf1；用引物对pCDF-DDRC-F/pCDF-DDRC-R扩增SEQ ID NO.2所示的DDRC编码基因片段ddrc；利用Gibson组装将pcdf1和ddrc顺序组装，经抗性筛选验证克隆子，挑取阳性克隆子提取质粒后送测序，将测序正确的质粒命名为pCDF-c。用引物对pCDF-cz2-R/pCDF-cz2-F扩增pCDF-c的除MCS2位点的其他片段，命名为pcdf2；用引物对pCDF-DZNR-F/pCDF-DZNR-R扩增SEQ ID NO.1所示的Ac_DZNR的编码基因片段dznr；利用Gibson组装将pcdf2和dznr顺序组装，即得质粒pCDF-cz。按照上述相同的策略，对于质粒pRSFDuet-dt的构建，用引物对pRSF-dt1-F/pRSF-dt1-R扩增pRSFDuet-1的除MCS1位点的其他片段，命名为pRSF1；用引物对pRSF-DHDR-F/pRSF-DHDR-R扩增SEQ ID NO.3所示的DHDR编码基因片段dhdr；利用Gibson组装将pRSF1和dhdr顺序组装，经抗性筛选验证克隆子，挑取阳性克隆子提取质粒后送测序，将测序正确的质粒命名为pRSF-d。用引物对pRSF-dt2-R/pRSF-dt2-F扩增pRSF-d的除MCS2位点的其他片段，命名为pRSF2；用引物对pRSF-THDR-F/pRSF-THDR-R扩增如SEQ IDNO.4所示THDR的编码基因片段thdr；利用Gibson组装将pRSF2和thdr顺序组装，即得质粒pRSF-dt。引物、基因合成、测序均由上海生工生物工程有限公司完成。将pCDF-dt和pET-cz转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到菌株WT_EqC。将pCDF-dt和pET-cz分别转到EqC_No1、EqC_No2、EqC_No3和EqC_No4中，得到的菌株分别命名为EqC_No5、EqC_No6、EqC_No7和EqC_No8。

所有引物及基因序列均列在表3中。

表3引物及序列

实施例7转化大豆苷元生产雌马酚的大肠杆菌工程菌株的摇瓶水平生产

分别将实施例6构建的菌株WT_EqC、EqC_No5～EqC_No8划线于含有链霉素、氨苄青霉素、氯霉素的LB平板上于37℃过夜培养12h，挑取菌落接种于含有链霉素，氨苄青霉素，氯霉素的LB液体中，于37℃，220rpm培养8-10h作为种子液，以1.5-2.5％的接种量接种于含有5％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)的25mL TB培养基(含链霉素，氨苄青霉素，氯霉素)中，培养1.5-3h，待菌体OD₆₀₀＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，并降温22-28℃，220rpm诱导，诱导10-12h后，添加10％200g/L的葡萄糖母液，并添加5％的100mM大豆苷元母液，于25℃，120-180rpm继续培养24h，并取样进行HPLC检测雌马酚的含量。液相结果分析显示(图5～图6)对照菌株WT_EqC的雌马酚产量为53.2mg/L；各改造菌株产量分别为EqC_No5：91.9mg/L，EqC_No6：110.6mg/L，EqC_No7：224.1mg/L，EqC_No8：201.6mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.6-磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA和/或GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA在提高大肠杆菌雌马酚产量方面的应用，其特征在于，所述基因pfkA的核苷酸序列如Gene ID：948412所示；所述基因elaA的核苷酸序列如Gene ID：946750所示；所述基因sthA的核苷酸序列如Gene ID：948461所示。

2.一种用于生产雌马酚的重组大肠杆菌，其特征在于，包含对出发菌株的如下一个或多个基因进行了基因表达抑制：编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA，NAD(P)⁺转氢酶基因sthA，GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，缺失或沉默了(a)～(c)任一组大肠杆菌内源基因：

(a)6-磷酸果糖激酶基因pfkA和NAD(P)⁺转氢酶基因sthA；

(b)6-磷酸果糖激酶基因pfkA和GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA；

(c)NAD(P)⁺转氢酶基因sthA和GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA。

4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，缺失或沉默了大肠杆菌内源的6-磷酸果糖激酶基因pfkA、NAD(P)⁺转氢酶基因sthA和GNAT家族N-乙酰转移酶基因elaA。

5.根据权利要求2～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因pfkA的核苷酸序列如Gene ID：948412所示，Gene ID为948412；所述基因elaA的Gene ID为946750；所述基因sthA Gene ID为948461。

6.根据权利要求2～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还进行了如下至少一种改进：

(1)表达了Asaccharobacter celatus来源的大豆苷元还原酶Ac_DZNR；

(2)表达了Lactococcus garvieae来源的二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC；

(3)表达了Slackia isoflavoniconvertens来源的二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR和四氢大豆苷元还原酶Si_THDR。

7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大豆苷元还原酶Ac_DZNR含有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC含有如SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列；所述二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR含有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；所述四氢大豆苷元还原酶Si_THDR含有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求2～7任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

9.一种微生物转化大豆苷元生产雌马酚的方法，其特征在于，以权利要求2～8任一所述的重组大肠杆菌为发酵菌株。

10.权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌或权利要求5～9任一所述的方法在生产含雌马酚产品方面的应用。

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