CN111411128A - 一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用 - Google Patents

一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物催化与转化技术领域，尤其涉及一种生产α,ω‑二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用。本发明设计的生物合成途径分为三个模块分别在宿主细胞中共同表达几种不同的酶，然后利用整细胞分别级联反应催化从环烷烃、环烷醇、内酯生成α,ω‑二元羧酸。与化学法相比，本工艺在生产过程中不产生任何有害气体，不需要高温高压以及复杂金属催化剂等，是绿色环保的生产途径。与现有生物酶法相比，本工艺使用整细胞反应免去细胞破碎、酶纯化等复杂过程，与现有生物发酵法相比，所用细胞为静息细胞避免了发酵法存在的由于发酵培养基和代谢产物复杂带来的后期分离困难的问题，降低了成本，开辟了α,ω‑二元羧酸的新合成途径。

Description

一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用
技术领域
本发明属于生物催化与转化技术领域，尤其涉及一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用。
背景技术
脂肪族α,ω-二元羧酸(DCAs)是一类重要的平台化学产品，广泛应用于香水、聚合物、粘合剂、以及大环内酯类抗生素。在这一类化学品中己二酸倍受关注，己二酸(adipicacid或者adipate)又称肥酸，是一种重要的二元羧酸，它能够发生成盐反应、酯化反应、酰胺化反应等，并能与二元胺或二元醇缩聚成高分子聚合物。当前己二酸最重要的应用领域是合成尼龙类纤维(比如尼龙6，6)。预计到2018年，己二酸全球的市场价值将达到63亿美元，产量约为25.6亿公斤，而且还在不断增加，并且近两年新增产能主要在中国。其他的二元羧酸也都是重要的化学原料，在化学、医药、建筑、农业等方面有广泛应用。如戊二酸在塑料工业中可以作为增塑剂的中间体，在医药方面具有广谱的杀菌功能。庚二酸在工业上应用更为广泛可以用于合成润滑油、增塑剂、导热油、介电流体、表面活性剂、树脂等。辛二酸也可以用于塑料工业，制备醇酸树脂、燃料等。
目前，在这些α,ω-二元羧酸中最受关注的己二酸主要以石油化工材料为原料通过化学方法合成(如以环己醇和环己酮混合物KA油为原料的硝酸氧化工艺等)。然而化学法存在生产工艺冗长、反应条件苛刻、副产物多、“三废”排放严重、产生大量温室气体等问题。因此近些年来越来越多的人着眼于通过生物转化，利用不同底物不同菌株来生产己二酸，这些过程经常需要通过代谢工程和合成生物学技术对微生物进行复杂的工程化设计。与此同时仍然存在一些问题比如：氧化还原反应的约束，代谢途径中酶的鉴定及工程化，合适宿主菌以及代谢途径的选择，以及细胞培养，发酵液后期难以纯化等潜在问题。
因此，本领域急需一种绿色高效地生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，以促进二元羧酸的生物法工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用，解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，由包含催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因的重组细胞在常温常压及有氧条件下催化转化底物内酯得到α,ω-二羧酸。
进一步地，底物为环烷醇时，还包括催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因的重组细胞；
所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因与所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因位于同一细胞内，利用单细胞系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因与所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因分别构建于不同的细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化。
进一步地，底物为环烷烃时，还包括催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因的重组细胞；
所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因与所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因位于同一细胞内，利用单细胞系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因、所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因，三者分别位于不同的细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因、所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因，三者中的任意两种位于同一细胞内，另外一种位于一个细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化。
进一步地，所述α,ω-二元羧酸包括C5、C6、C7、C8、C10、C12及C15类不同的二元羧酸。
进一步地，所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因包括内酯酶基因、醇脱氢酶基因、醛脱氢酶基因和NADH氧化酶基因。所述内酯酶基因为lactonase，Rhodococcussp.HI-31，醇脱氢酶基因为ADH2，Acinetobacter sp.NCIMB9871，醛脱氢酶基因为ALDH,Acinetobacter sp.NCIMB9871，NADH氧化酶基因为NOX,Lactobacillus brevis DSM20054。
进一步地，所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因包括醇脱氢酶基因和Baeyer-Villiger单加氧酶基因。所述醇脱氢酶为ADH1,Lactobacillus brevis ATCC14869，Baeyer-Villiger单加氧酶基因为BVMO，Acinetobacter sp.NCIMB9871，并且含有双突变位点C376I/M400I。
进一步地，所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因包括P450BM319A12基因、P450BM3 A82F基因和P450BM3 A82F/A328F中的任一种，还包括葡萄糖脱氢酶基因GDH。
进一步地，催化底物为环烷烃时，催化反应液中加入葡萄糖溶液。
进一步地，将包含催化相应底物生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因的细胞在TB液体培养基中培养，并加入IPTG或乳糖诱导剂诱导表达；收集培养的菌体用于底物转化。
在优选的实施方式中，所述细胞是大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的任一种；最优选地，所述细胞是大肠杆菌(E.coli)。
进一步地，所述催化反应在常温常压及有氧条件下进行，在具体的实施方式中，所述催化反应在20-40℃的温度范围内；优选在25-30℃的温度范围内；更优选在25℃进行。
如上述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法在生产α,ω-二元羧酸中的应用。
如上述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法在生产C5、C6、C7或C8类二酸产品中的任一种中的应用。
如上述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法中的重组细胞在制备固定化细胞中的应用。
本发明以己二酸的生产为特征反应进行，使用整细胞一锅法分别以环己烷、环己醇、ε-己内酯为起始底物生产己二酸。以环己醇为底物进行反应的细胞命名为E.coli(M2E_M3J)包含模块二和模块三，在不经过任何优化的情况下50mM环己醇可以得到3mM己二酸，证明一个细胞可以实现环己醇到己二酸的转化；以环己烷为底物进行反应细胞命名为E.coli(M12A_M3J)包含模块一二三，在不经过任何优化的情况下50mM环己烷可以得到4mM己二酸，证明一个细胞可以实现从环己烷到己二酸的转化；以己内酯为底物进行反应的细胞只包含模块三，在不经过优化的情况下可以得到较高浓度的己二酸，因此我们对其进行了优化，通过分批补料，最终己二酸可以达到63g/L。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
A：与工业上传统化学法相比：
1、本发明整个反应在常温常压下进行避免高温高压造成的能耗问题，不涉及苛刻的反应条件。
2、本发明在整个反应中不使用任何有害原料如化学法需要用的硝酸等，避免了长时间生产对于设备仪器的损耗问题，降低成本。
3、化学法生产中会产生NO、NO2这一类含氮有毒性气体(中国目前可以对氮氧化物进行处理的工厂屈指可数)，也会产生N2O这样的比CO2等气体更为严重的温室气体。而本发明中不涉及任何有污染的气体和中间产物产生。
4、化学法有不同的副产物产生，本发明方法中没有额外的副产物生成。
B：与已经报道的生物发酵法相比：
1、代谢工程的方法相对于不同的产品需要每次对菌株进行不同的设计改造，本发明可以根据不同的底物进行组合，灵活应用。
2、目前没有通过发酵法实现庚二酸或辛二酸的生产或者产量非常低，本发明采用静息细胞催化可实现多种二酸(包括戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸，以及C10、C12及C15类等二酸)的高效生产。
3、免除由于发酵培养基和细胞代谢产生的不同代谢物带来的产品后期纯化困难的问题。
C：与已经报道的酶法相比：
1、使用整细胞做催化剂，免除细胞破碎、酶的纯化等繁琐的步骤。
2、相比酶液催化剂，细胞催化剂更易于大规模制备和保藏。
D：其他优势：
1、底物灵活，可以用不同底物进行某一种二元羧酸的生产。
2、具有普适性，相同的酶相同的反应，可以用于生产C5、C6、C7、C8以及C10、C12及C15类等各种不同二元羧酸。
3、产品提纯简单，只需要简单萃取和旋蒸即可获得。
4、没有反应完全的底物可以回收用于下次循环使用。
附图说明
图1是本发明技术思路流程图；
图2是模块一筛选的相关结构及数据；
图3是模块二筛选的相关结构及数据；
图4是模块三筛选的相关结构及数据；
图5是实施例4的数据图；
图6是实施例5的数据图；
图7是实施例7的数据图；
图8是实施例8的数据图；
图9是戊二酸衍生化后的硅烷化产物的GC-MS图；
图10是己二酸衍生化后的硅烷化产物的GC-MS图；
图11是庚二酸衍生化后的硅烷化产物的GC-MS图；
图12是辛二酸衍生化后的硅烷化产物的GC-MS图；
图13是戊二酸核磁图；
图14是己二酸核磁图；
图15是庚二酸核磁图；
图16是辛二酸核磁图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中涉及的蛋白或其片段可以是重组的、天然的、合成的蛋白或其片段；本发明中涉及的蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明中术语“片段”是指基本上保持本发明中涉及蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。鉴于本领域现有技术和本发明的教导，本领域技术人员不难获得本发明涉及蛋白的活性片段。例如，在本文中，“醇脱氢酶”的生物活性片段是指“醇脱氢酶”的片段，但其仍然能保持全长“醇脱氢酶”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“醇脱氢酶”的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“醇脱氢酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
本发明提出的二羧酸整细胞合成途径中涉及八种酶，基于现有技术知识本领域普通技术人员不难知晓，本发明涉及的八种酶并不局限于实施例中提到的某种具体来源的酶，每种酶可以分别使用具有相同或相似催化功能的不同来源的酶替换，或可以使用实施例中八种具体来源酶中某一种或多种酶的变异形式，所述变异形式具有与八种酶中的某一种酶相同或相似的功能，但其氨基酸序列与本发明提供的氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括但不限于：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-10个，更佳地1-6个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个或3个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签，例如，6×His标签通常不会改变所得蛋白质的功能。
鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。
初始残基 代表性的取代残基 优选的取代残基
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。在具体的实施方式中，所述菌株包括但不限于：大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌(E.coli)，本发明中也以大肠杆菌为例进行详细说明。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还可以明白，可以将本发明的重组细胞制成固定化细胞等其他利用形式。
本发明中，术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员可采用熟知的方法用于构建含外源酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本发明的目的是提出一种α,ω-二羧酸(DCA)的整细胞生物合成途径。涉及八种酶和六步反应。根据反应是氧化还原或者辅因子再生系统将其分为三个模块。以己二酸生物制备途径为例，模块一的功能：激活惰性碳氢键，实现环己烷到环己醇的转化；模块二的功能：实现环己醇/酮到ε-己内酯的转化；模块三的功能；实现己内酯到己二酸的转化。本发明中使用了两种体系，一种是使用一个细胞包含这三个模块作为催化剂来生产二元羧酸，另一种是使用多个细胞组合即每个模块在不同的宿主细胞中表达，然后进行工程化组合。产生一种只需要水和氧气就可以将环烷烃转化为DCA的多细胞生物催化系统(MBS)。同时每个模块又可以单独作为一类反应从不同类型底物(环烷醇，环烷酮，内酯)分别出发最终得到DCA。本发明的思路可以用图1来表示。
本发明以己二酸的生产反应为例进行具体说明，具体发明内容如下各实施例所示。
实施例1重组质粒的构建
本实施例中使用含有同源臂的引物PCR扩增编码各个酶的基因，并且PCR扩增载体质粒使其线性化。随后不同基因和线性化的载体在T5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起。具体如下所示：
1、模块一重组质粒构建M1D(pRSFDuet-I-P450BM319A12-GDH)
模块一是激活惰性碳氢键产生相应醇的关键步骤，对小分子环烷烃的羟化是非常具有挑战性的。此处本实施例为了解决这一问题使用来自巨大芽孢杆菌的P450 BM3突变体(A82F,A82F/A328F，19A12)进行探索与比较，相关质粒结构及数据见图2所示。根据目标产物表达效果，最终选择19A12与GDH构建重组菌株E.coli(M1D)实现环己烷的羟基化并外加葡萄糖实现辅因子循环系统的构建。
详细构建过程如下：
线性化载体pRSFDuet-I
引物：F:GCCAGGATCCGAATTCGAGCTC，SEQ ID NO.1；
R:GTGGTGATGATGGTGATGGCTGCTG，SEQ ID NO.2；
PCR体系(50μL)为：模板pRSFDuet-1质粒0.5～20ng，一对突变引物各1μL(10μM)，25μL Prime STAR Max DNA聚合酶，加灭菌蒸馏水至50μL。
PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸60sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
P450BM319A12基因扩增，该基因序列详见Yu HL,et al.Bioamination of alkanewith ammonium by an artificially designed multienzyme cascade.Metab.Eng.47,184-189(2018).
引物：19A12_homologous seq-Fwd:
CACCATCATCACCACGCAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACG，SEQ ID NO.3；
19A12_RBS-Rev:GATATATCTCCTTAGGTACCTTACCCAGCCCACACGTCTTTTGC，SEQ IDNO.4；
PCR体系及程序同上。其中，体系中的模板为pET28a-19A12质粒(该质粒可由将合成的19A12基因片段按照常规方法导入质粒pET28a中获得，其他PCR体系中模板的获取方法与此相同)。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。
GDH基因扩增，其中GDH基因来自Bacillus megaterium，并进行了密码子优化，序列见SEQ ID NO.27所示；
引物：RBS_GDH-Fwd:
GGTACCTaaggagATATATCatgTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTAGTAATT ACAGGTGGATC，SEQ ID NO.5；
R:GCTCGAATTCGGATCCTGGCTTATCCGCGTCCTGCTTGGAATG，SEQ ID NO.6；
PCR体系同上。其中，体系中的模板为pET28a-GDH质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸10sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
核酸电泳检测是否得到目的条带，检测正确后用Dpn I消化PCR产物中剩余的模板，体系(50μL)为：5μL CutSmart Buffer，2μL Dpn I，43μL PCR产物。在37℃消化5h，之后80℃灭活15min。用OMEGA回收试剂盒进行胶回收。
将线性化载体和PCR扩增的基因片段在T5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起。具体方法为：在5μL反应体系中按照摩尔比3:3:1加入目的片段和线性化载体(控制线性化载体的量为30～50ng)，再加入T5外切酶和buffer 4.0，不够5μL用水补足。加入T5外切酶后计时5min，时间到后立即加入50μL DH5α感受态细胞按照常规转化的基本步骤进行转化，加培养基复苏1h后转移到含有相应抗性Kan(50μg/mL)的LB固体培养基上过夜培养，并且取相应转化子送测序公司进行DNA测序最终得到正确重组子M1D(pRSFDuet-I-P450BM319A12-GDH)。
2、模块二重组质粒构建M2E(pRSFDuet-1-ADH1-BVMO)
为了实现中间步骤从环己醇或环己酮到ε-己内酯的催化过程，本实施例中设计了第二模块，构建了六种重组细胞。其中包括催化反应所必需的醇脱氢酶(ADH1,Lactobacillus brevis ATCC 14869)和Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO，Acinetobactersp.NCIMB9871，并且含有双突变位点C376I/M400I。相关质粒结构及数据见图3所示，其中E.coli(M2E)表现出最佳催化效果即50mM环己醇为底物可以在6小时内检测到生成37mMε-己内酯，同时可以检测到由于ε-己内酯在缓冲液中自发水解而生成的6-羟基己酸。最终选择E.coli(M2E)进行接下来的组合。
线性化载体pRSFDuet-I的处理方法同第1步。
ADH1基因扩增，其中ADH1基因来自Acinetobacter sp.NCIMB9871，并进行了密码子优化，序列见SEQ ID NO.28所示；
引物：ADH1_homologous seq-Fwd:
CACCATCATCACCACATGAGCAATCGTCTGGATGGTAAAGTTG，SEQ ID NO.7；
ADH1_RBS-Rev:
GATATATctccttAGGTACCTTACTGTGCGGTATAACCACCATCCAC，SEQ ID NO.8；
PCR体系和程序同第1步中的GDH基因扩增条件。其中，模板为pRSFDuet-1-ADH1质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。
BVMO基因扩增，其中BVMO基因来自Acinetobacter sp.NCIMB9871，并进行了密码子优化，序列见SEQ ID NO.29所示；
引物：RBS_BVMO-Fwd:GGTACCTaaggagATATATCatgtcacaaaaaatggattttgatgctatcgtg，SEQ ID NO.9；
BVMO_homologous seq-Rev:GAATTCGGATCCTGGCttaggcattggcaggttgcttgatatc，SEQ ID NO.10；
PCR体系同上。其中，模板为pET28a-BVMO质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸15sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
核酸电泳检测并回收，操作同上。
将线性化载体和PCR扩增的基因片段在T5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起。具体方法同上，进行DNA测序最终得到正确重组子M2E(pRSFDuet-1-ADH1-BVMO)。3、模块三重组质粒构建M3B(pETDuet-1-ADH2-ALDH),M3E(pRSFDuet-1-Lactonase-NOX)，M3J(pETDuet-1-ADH2-ALDH-Lactonase-NOX)
为了实现从ε-己内酯到己二酸的催化过程本发明设计了第三模块，并构建了八个重组细胞，其中包含必需的内酯酶(lactonase，Rhodococcus sp.HI-31)、醇脱氢酶(ADH2，Acinetobacter sp.NCIMB9871)，醛脱氢酶(ALDH,Acinetobacter sp.NCIMB9871)，为了提高NAD+的循环效率一定条件下还额外加入NADH氧化酶(NOX,Lactobacillus brevis DSM20054)。相关结构及数据见图4所示。经鉴定，所构建的八个重组细胞均有催化ε-己内酯生成己二酸的效果，其中E.coli(M3B_M3E)有最优生产率，即22小时内生成42mM己二酸(50mM底物),进一步以100mM底物浓度研究反应进程时发现底物可以在6小时内完全转化为己二酸并且没有中间产物积累。然而继续增加底物浓度随着反应进行中pH不断降低反应无法继续高效进行，因此采取分批补料并且在反应中调整pH的策略最终可以实现三次补料总共加入500mM底物26小时后得到450mM己二酸并且有极少中间产物积累。最终选择E.coli(M3B_M3E)进行接下来的组合。
线性化载体pRSFDuet-1，pETDuet-1，处理方法同第1步。
ADH2基因扩增，其中ADH2基因来自Acinetobacter sp.NCIMB9871，并进行了密码子优化，序列见SEQ ID NO.30所示；
引物：ADH2_homologous seq-Fwd:
GCCATCACCATCATCACCACCATTGTTATTGCGTTACCCATCATGG，SEQ ID NO.11；
ADH2_RBS-Rev:
GATATATctccttAGGTACCTTAGTTCTCGTGCATCAGAACGATACG，SEQ ID NO.12；
PCR体系同上。其中，模板为pRSFDuet-1-ADH2质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序同第1步中的GDH基因扩增条件。
ALDH基因扩增，其中ALDH基因来自Acinetobacter sp.NCIMB9871，并进行了密码子优化，序列见SEQ ID NO.31所示；
引物：RBS_ALDH-Fwd:
GGTACCTaaggagATATATCATGAACTATCCGAATATTCCGCTGTATATTAACG，SEQ ID NO.13；
ALDH_homologous seq-Rev:
GCTCGAATTCGGATCCTGGCTTAGTTCAGCTGGGTGATAAATTTGGTG，SEQ ID NO.14；
PCR体系同上。其中，模板为pETDuet-1-ALDH质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸20sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
Lactonase基因扩增，其中Lactonase基因来自Rhodococcus sp.HI-31，并进行了密码子优化，序列见SEQ ID NO.32所示；
引物：Lactonase_homologous seq-Fwd:
GCCATCACCATCATCACCACACCAATATTAGCGAAACCCTGAGCAC，SEQ ID NO.15；
Lactonase_RBS-Rev:
GATATATctccttAGGTACCTTATTCCAGGGCTTTCTGATACCATGCTG，SEQ ID NO.16；
PCR体系同上。其中，模板为pRSFDuet-1-Lactonase质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序同第1步中的GDH基因扩增条件。
NOX基因扩增，序列见SEQ ID NO.33所示；
引物：RBS_NOX-Fwd:
GGTACCTaaggagATATATCATGAAAGTTATCGTAATTGGTTGTACTCATGCCG，SEQ ID NO.17；
NOX_homologous seq-Rev:
GCTCGAATTCGGATCCTGGCTTATTCCGTCACTTTTTCAGCCGCATGAG，SEQ ID NO.18；
PCR体系同上。其中，模板为pRSFDuet-1-NOX质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸20sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
核酸电泳检测并回收。
将线性化载体和PCR扩增的基因片段在T5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起。具体方法为：在5μL反应体系中按照摩尔比3:3:1(ADH2:ALDH:pETDuet-1＝3:3:1，Lactonase：NOX:pRSFDuet-1＝3:3:1)加入目的片段和线性化载体(控制线性化载体的量为30～50ng)，再加入T5外切酶和buffer 4.0，不够5μL用水补足。加入T5外切酶，5min后立即加入50μLDH5α感受态细胞按照常规转化的基本步骤进行转化，加培养基复苏1h后转移到含有相应抗性Amp(100μg/mL)或Kan(50μg/mL)的LB固体培养基上过夜培养，并且取相应转化子送测序公司进行DNA测序最终得到正确重组子。得到M3B(pETDuet-1-ADH2-ALDH)，M3E(pRSFDuet-1-Lactonase-NOX)。
线性化M3B(pETDuet-1-ADH2-ALDH)
引物：F:GCCAGGATCCGAATTCGAGCTC，SEQ ID NO.19；
ALDH_RBS-Rev:GATATATctccttAGGTACCTTAGTTCAGCTGGGTGATAAATTTGGTG，SEQ IDNO.20；
PCR体系同上。其中，模板为pETDuet-1-ADH2-ALDH质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸2min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
扩增基因Lactonase-NOX
引物：RBS_Lactonase-Fwd:
GGTACCTaaggagATATATCATGACCAATATTAGCGAAACCCTGAGC，SEQ ID NO.21；
NOX_homologous seq-Rev:
GCTCGAATTCGGATCCTGGCTTATTCCGTCACTTTTTCAGCCGCATGAG，SEQ ID NO.22；
PCR体系同上。其中，模板为pRSF-Duet-1-Lactonase-NOX质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸30sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
核酸电泳检测并回收。
将线性化载体和PCR扩增的基因片段在T5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起。具体方法为：在5μL反应体系中按照摩尔比3:1加入目的片段Lactonase-NOX和线性化M3B(控制线性化载体的量为30～50ng)，后续操作同第1步。进行DNA测序最终得到正确重组子M3J(pETDuet-1-ADH2-ALDH-Lactonase-NOX)。
4、模块一二重组质粒构建(M12A)
线性化M1D(pRSFDuet-I-P450BM319A12-GDH)
引物：F:GCCAGGATCCGAATTCGAGCTC，SEQ ID NO.23；
GDH_RBS-Rev:GATATATCTCCTTAGGTACCTTATCCGCGTCCTGCTTGGAATG，SEQ ID NO.24；
PCR体系同上。其中，模板为pRSFDuet-I-P450BM319A12-GDH质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序同线性化M3B中的条件。
扩增基因ADH1-BVMO
引物：RBS_ADH1-Fwd:
GGTACCTaaggagATATATCATGAGCAATCGTCTGGATGGTAAAGTTG，SEQ ID NO.25；
BVMO_homologous seq-Rev:
GAATTCGGATCCTGGCttaggcattggcaggttgcttgatatc，SEQ ID NO.26；
PCR体系同上。其中，模板为pRSFDuet-I-ADH1-BVMO质粒。该基因片段也可以根据碱基序列直接通过第三方公司合成获得。PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火15sec，(4)72℃延伸30sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。
核酸电泳检测并回收。
将线性化载体和PCR扩增的基因片段在T5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端从而连接在一起。具体方法为：在5μL反应体系中按照摩尔比3:1加入目的片段ADH1-BVMO和线性化M1D(控制线性化载体的量为30～50ng)，后续操作同第1步。进行DNA测序最终得到正确重组子M12A(pRSFDuet-I-P450BM319A12-GDH-ADH1-BVMO)。
实施例2重组细胞构建
本发明的宿主细胞可以是如前文所述的原核细胞或是低等真核细胞，本实施例中以大肠杆菌为例进行具体说明。
1、E.coli(M3B_M3E)
将两种重组质粒M3B和M3E按照摩尔比1:1的比例，通过通用电转化方法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并在含有两种抗性Amp(100μg/mL)和Kan(50μg/mL)的LB固体培养培养，得到可以单独表达模块三中涉及的酶的重组细胞E.coli(M3B_M3E)。
2、E.coli(M2E)
将重组质粒M2E转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并在含有Kan(50μg/mL)的LB固体培养培养，得到可以单独表达模块二中涉及的酶的重组细胞E.coli(M2E)。
3、E.coli(M1D)
将重组质粒M1D转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并在含有Kan(50μg/mL)的LB固体培养培养，得到可以单独表达模块一种设计的酶的重组细胞E.coli(M1D)。
4、E.coli(M2E_M3J)
将两种重组质粒M2E和M3J按照摩尔比1:1的比例转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并在含有两种抗性Amp(100μg/mL)和Kan(50μg/mL)的LB固体培养培养，得到可以同时表达模块二三中涉及的酶的重组细胞E.coli(M2E_M3J)。
5、E.coli(M12A_M3J)
将两种重组质粒M12A和M3J按照摩尔比1:1的比例转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并在含有两种抗性Amp(100μg/mL)和Kan(50μg/mL)的LB固体培养培养，得到可以同时表达模块一二三中涉及的酶的重组细胞E.coli(M12A_M3J)。
实施例3蛋白质表达与整细胞催化剂的制备
将构建好的重组细胞接种于3mL含有相应抗性的LB液体培养基中在37℃，220rpm下培养大约6h，取1mL转接与50mL含有相应抗性的TB培养基中，37℃，220rpm下培养大约2-3h直到OD600＝0.6-0.8，加入IPTG使得终浓度为0.2mM。然后将温度调整为25℃诱导14-16h。其中含有模块三的细胞诱导条件调整为IPTG终浓度为0.1mM，在20℃诱导20h。
诱导结束后的菌体在15℃，3040g离心10min以收集菌体，菌体收集后用pH 8.0200mM磷酸钾缓冲液清洗菌体用作后续反应的催化剂。
本发明制备的重组细胞可以适用于各种(包括C5、C6、C7、C8、C10、C12、C15等类型)环烷、环醇及内脂的催化与转化，下面以实施例4-实施例9中的应用为例进行详细说明。
实施例4ε-己内酯到己二酸的生物转化
用200mM pH 8.0磷酸钾缓冲液悬浮表达模块三的重组细胞E.coli(M3B_M3E)使其OD600＝40。取4mL于100mL反应瓶加入己内酯开始反应。反应条件为：在100mL(磨口带盖子)三角瓶内在30℃220rpm下反应。反应中底物使用分批补料的方式加入(反应开始时加入己内酯使底物终浓度为200mM反应进行到6h和10h时补加200mM和100mM底物)。在反应过程中使用10M NaOH调pH使得反应体系维持在pH 8.0。
在设定的时间点为了检测己二酸和6-羟基己酸的生成量，取50μL反应液加入450μL水50μL 4M HCl，在加入500μL乙酸乙酯剧烈震荡进行萃取，13680g离心1min，取上层有机相，加入Na2SO4干燥用于后续的衍生化。为了检测己内酯的生成量取50μL反应液加入450μL水500μL乙酸乙酯(含有2mM正癸烷为内标)剧烈震荡进行萃取，13680g离心1min，取上层有机相，加入Na2SO4干燥直接用于GC分析。
本实施例设计了第三模块，其中包含必需的内酯酶(lactonase，Rhodococcussp.HI-31)、醇脱氢酶(ADH2，Acinetobacter sp.NCIMB9871)，醛脱氢酶(ALDH,Acinetobacter sp.NCIMB9871)，为了提高NAD+的循环效率一定条件下还额外加入NADH氧化酶(NOX，Lactobacillus brevis DSM 20054)。E.coli(M3B_M3E)在22小时内生成42mM己二酸(50mM底物)。进一步以100mM底物浓度研究反应进程时发现底物可以在6小时内完全转化为己二酸并且没有中间产物积累。然而继续增加底物浓度，随着反应进行中pH不断降低反应无法继续高效进行。因此本实施例采取分批补料并且在反应中调整pH的策略最终可以实现三次补料总共加入500mM底物26小时后得到450mM己二酸即63g/L己二酸并且有极少中间产物积累，数据折线图见图5所示。
实施例5环己醇到ε-己内酯的生物转化
用100mM pH 8.0磷酸钾缓冲液悬浮表达模块二的重组细胞E.coli(M2E)使其OD600＝20。取21.5μL(终浓度为50mM)环己醇加入到4mL反应液中开始反应。反应在25℃，220rpm下进行。在设定时间点为了检测由于自发水解产生的6-羟基己酸，取100μL反应液加入400μL水50μL 4M HCL，在加入500μL乙酸乙酯剧烈震荡进行萃取，13680g离心1min，取上层有机相，加入Na2SO4干燥用于后续的衍生化。为了检测环己醇、环己酮、己内酯的量，取100μL反应液加入400μL水500μL乙酸乙酯(含有2mM正癸烷为内标)剧烈震荡进行萃取，13680g离心1min，取上层有机相，加入Na2SO4干燥直接用于GC分析。
本实施例设计了第二模块，包括催化反应所必需的醇脱氢酶(ADH1,Lactobacillus brevis ATCC 14869)和Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO，Acinetobactersp.NCIMB9871，并且含有双突变位点C376I/M400I)。E.coli(M2E)催化效果为50mM环己醇为底物可以在6小时内检测到生成37mMε-己内酯，同时可以检测到由于ε-己内酯在缓冲液中自发水解而生成的6-羟基己酸，数据图见图6所示。实施例6环己烷到环己醇的生物转化
用100mM pH 8.0磷酸钾缓冲液悬浮表达模块一的重组细胞E.coli(M1D)使其OD600＝20。在4mL反应液中加入0.05g/L的葡萄糖用于辅因子循环，加入22μL环己烷(终浓度为50mM)在25℃，220rpm下进行反应。在设定时间点取100μL反应液加入400μL水稀释后加入500μL乙酸乙酯(含有2mM正癸烷为内标)剧烈震荡进行萃取，13680g离心1min，取上层有机相，加入Na2SO4干燥直接用于GC分析。
产物主要为环己醇，环己醇也会有部分转化为环己酮，产物均为下一模块的底物。
实施例7环烷醇到α，ω-二羧酸的生物转化
本发明不局限于环己醇到己二酸的转化也同样适用于其他类似环烷醇或环烷酮到二酸的转化。
将环烷醇(终浓度为50mM；18.3μL环戊醇，21.5μL环己醇，24.8μL环庚醇或28.4μL环辛醇)添加到4mL大肠杆菌MBS1悬浮液(最终OD600为40，表达模块二E.coli(M2E)和模块三E.coli(M3B_M3E)的重组细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(0.2M，pH 8.0)中比例为2：1)或E.coli(M2E_M3J)(最终OD600为40)中。反应在100mL摇瓶中于25℃，220rpm下进行。按照实施例4中的方法在设定时间内取样用于后续衍生化处理，和直接用于气相分析。
本实施例设计了单细胞系统和多细胞组合系统来实现环己醇或环己酮到己二酸的转化。单细胞系统E.coli(M2E_M3J)表现较差，但是也可以实现从环己醇到己二酸的转化，即在不经过任何优化的情况下50mM环己醇可以得到3mM己二酸。模块二E.coli(M2E)和模块三E.coli(M3B_M3E)组合形成多细胞组合系统MBS1，经过实验探究发现当模块二与模块三细胞量的比为2:1或者1:1时可以表现出最佳的催化效果，在考虑到反应成本的同时本发明列举总细胞密度为OD600＝40，比例为2:1时的反应过程，反应到达6小时时可以将50mM环己醇转化得到46mM己二酸，仅有4mM中间产物环己酮残留。数据图见图7所示。
其他几种环烷醇生产α,ω-二元羧酸的数据见下表。1：环烷烃；2：环醇；3：环酮；4：内酯；5：羟基酸；7：二酸。a-d与图1中结构式相互对应，分别代表五碳、六碳、七碳和八碳时代表的物质。
Figure BDA0002398487640000141
实施例8环烷烃到α，ω-二羧酸的生物转化
本发明不局限于环己烷到己二酸的转化也同样适用于其他类似环烷烃到二酸的转化。
将44μL环己烷(终浓度为100mM)添加到4mL用磷酸钾缓冲液(0.2M，pH 8.0)重悬的大肠杆菌MBS2悬浮液中(终OD600为30，用于表达模块一E.coli(M1D)、模块二E.coli(M2E)模块三E.coli(M3B_M3E)的重组细胞比例为2:1:2)或E.coli(M12A_M3J)(终OD600为30)置于100mL摇瓶中于25℃，220rpm下进行反应。值得注意的是此反应体系中需要额外加入0.05g/mL葡萄糖以促进NADPH的再生，并且通过在反应期间添加10M NaOH将pH维持在8.0左右。按照实施例4中的方法在设定时间内取样用于后续衍生化处理，和直接用于气相分析。
在研究其他环烷烃的转化为相应α，ω-二羧酸时加入底物使得终浓度均为50mM，即分别加入19.5μL环戊烷，22μL环己烷，24.7μL环庚烷，27.5μL环辛烷。其他反应条件均与上述条件一致。
以环己烷为底物进行反应细胞命名为E.coli(M12A_M3J)包含模块一二三即单细胞系统，在不经过任何优化的情况下50mM环己烷可以得到4mM己二酸，证明一个细胞可以实现从环己烷到己二酸的转化。模块一E.coli(M1D)、模块二E.coli(M2E)模块三E.coli(M3B_M3E)组合形成多细胞组合系统MBS2，经过实验探索发现当细胞总密度为OD600＝30，且模块一二三比例为2:1:2时表现出最佳催化效果。此过程中MBS2在催化过程进行到20小时时可以将100mM环己烷转化为32mM己二酸且没有中间产物的生成。没有反应完的环己烷可以通过简单的乙酸乙酯萃取来回收，反应液pH调到2左右时再用乙酸乙酯萃取可以轻松得到己二酸，数据图见图8所示。
其他几种环烷烃生产α,ω-二元羧酸的数据见下表。1：环烷烃；2：环醇；3：环酮；4：内酯；5：羟基酸；7：二酸。a-d与图1中结构式相互对应，分别代表五碳、六碳、七碳和八碳代表的物质。
Figure BDA0002398487640000151
实施例9不同的α，ω-二羧酸的制备
将终浓度为100mM的四种环烷烃(78μL环戊烷，87μL环己烷，99μL环庚烷，或109.8μL环辛烷)加入到8mL大肠杆菌MBS2悬浮液中(终OD600为30，用于单独表达模块一模块二模块三的重组细胞比例为2:1:2)置于250mL摇瓶中于25℃，200rpm下进行反应。其中加入0.05g/ml的葡萄糖用于NADPH循环。反应进行24h后，为了确保8-羟基辛醇能够完全转化为辛二酸，加入2mL用于表达模块三的大肠杆菌悬浮液(用200mM pH 8.0磷酸钾缓冲液重悬，使其OD600＝80)，反应期间用10M NaOH调整反应体系pH使其维持在8.0左右。反应结束后将反应混合物用30mL乙酸乙酯萃取三次，减压蒸馏以回收底物。之后加入2mL 4M HCL调水相pH大约为1～2之间，在用50mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机相用无水Na2SO4干燥后用旋转蒸发仪减压蒸馏出去溶剂，得到白色固体即为相应的α，ω-二羧酸，其纯度大于98％，最终得到戊二酸：13.4mg，产率＝13％；己二酸：38.5mg，产率＝33％；庚二酸：57.8mg产率＝45％；辛二酸：18.8mg产率＝13％。然后将分离出的产物进行GC-MS和NMR分析。实验图谱见图9-图16所示；其中，图9-图12为戊二酸、己二酸、庚二酸及辛二酸衍生化后的硅烷化产物的GC-MS图谱；图13为戊二酸的核磁图谱，7a:1H NMR(400MHz,CD3OD):δ2.35(t,J＝7.4Hz,4H),1.86(p,J＝7.4Hz,2H).图14为己二酸的核磁图谱，7b:1H NMR(400MHz,CD3OD):δ2.31(ddt,J＝7.5,5.7,2.1Hz,4H),1.68–1.59(m,4H).图15为庚二酸的核磁图谱，7c:1H NMR(400MHz,CD3OD):δ2.29(t,J＝7.4Hz,4H),1.62(p,J＝7.5Hz,4H),1.44–1.31(m,2H).图16为辛二酸的核磁图谱，7d:1H NMR(400MHz,CD3OD):δ2.28(t,J＝7.4Hz,4H),1.72–1.52(m,4H),1.36(m,4H).
其中，产率＝实际得到产物的质量/理论上底物全部转化完可以得到产物的质量*100％
产品检测方法：
样品衍生化处理：将实施例4-9得到的有机相样品在13860g离心10min以除去用于干燥的无水Na2SO4，取300μL样品于常温常压下置于通风厨中使乙酸乙酯挥发，挥发后出现在管底的白色固体溶于60μL吡啶中加入30μL衍生化试剂N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)。衍生化反应在65℃下进行1h，然后将混合物用于GC分析。
GC分析条件：为了检测羟基酸与DCAs，使用SH-Rtx-1柱对衍生化样品进行GC分析：将90μL含内标(25mM正癸烷)的乙酸乙酯添加到衍生物混合物中。之后，使用配备了FID检测器和SH-Rtx-1色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)的SHIMADZU Nexis GC-2030系统分析样品。进样器和检测器的温度分别为250℃和280℃。温度程序如下：以5℃/min从50℃到120℃，以40℃/min升到240℃，并在240℃保持1min。
为了检测环烷烃，环烷醇，环烷酮与内酯，使用SH-Rtx-WAX柱对所获得的样品进行GC分析：使用配备了FID检测器和SH-Rtx-1色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)的SHIMADZUNexis GC-2030系统分析样品。进样器和检测器的温度分别为250℃和280℃。温度程序如下：以5℃/min从50℃到120℃，以40℃/min升到240℃，并在240℃保持3min。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(pRSFDuet-I -F)
<400> 1
gccaggatcc gaattcgagc tc 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(pRSFDuet-I -R)
<400> 2
gtggtgatga tggtgatggc tgctg 25
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(19A12_homologous seq-Fwd)
<400> 3
caccatcatc accacgcaat taaagaaatg cctcagccaa aaacg 45
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(19A12_RBS-Rev)
<400> 4
gatatatctc cttaggtacc ttacccagcc cacacgtctt ttgc 44
<210> 5
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(RBS_GDH-Fwd)
<400> 5
ggtacctaag gagatatatc atgtatacag atttaaaaga taaagtagta gtaattacag 60
gtggatc 67
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(RBS_GDH-R)
<400> 6
gctcgaattc ggatcctggc ttatccgcgt cctgcttgga atg 43
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(ADH1_homologous seq-Fwd)
<400> 7
caccatcatc accacatgag caatcgtctg gatggtaaag ttg 43
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(ADH1_RBS-Rev)
<400> 8
gatatatctc cttaggtacc ttactgtgcg gtataaccac catccac 47
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(RBS_BVMO-Fwd)
<400> 9
ggtacctaag gagatatatc atgtcacaaa aaatggattt tgatgctatc gtg 53
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(BVMO_homologous seq-Rev)
<400> 10
gaattcggat cctggcttag gcattggcag gttgcttgat atc 43
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(ADH2_homologous seq-Fwd)
<400> 11
gccatcacca tcatcaccac cattgttatt gcgttaccca tcatgg 46
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(ADH2_RBS-Rev)
<400> 12
gatatatctc cttaggtacc ttagttctcg tgcatcagaa cgatacg 47
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(RBS_ ALDH-Fwd)
<400> 13
ggtacctaag gagatatatc atgaactatc cgaatattcc gctgtatatt aacg 54
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(ALDH_homologous seq-Rev)
<400> 14
gctcgaattc ggatcctggc ttagttcagc tgggtgataa atttggtg 48
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Lactonase_homologous seq-Fwd)
<400> 15
gccatcacca tcatcaccac accaatatta gcgaaaccct gagcac 46
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Lactonase_RBS-Rev)
<400> 16
gatatatctc cttaggtacc ttattccagg gctttctgat accatgctg 49
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(RBS_ NOX-Fwd)
<400> 17
ggtacctaag gagatatatc atgaaagtta tcgtaattgg ttgtactcat gccg 54
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(NOX_homologous seq-Rev)
<400> 18
gctcgaattc ggatcctggc ttattccgtc actttttcag ccgcatgag 49
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(M3B-F)
<400> 19
gccaggatcc gaattcgagc tc 22
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(ALDH_RBS-Rev)
<400> 20
gatatatctc cttaggtacc ttagttcagc tgggtgataa atttggtg 48
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(RBS_ Lactonase-Fwd)
<400> 21
ggtacctaag gagatatatc atgaccaata ttagcgaaac cctgagc 47
<210> 22
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(NOX_ homologous seq-Rev)
<400> 22
gctcgaattc ggatcctggc ttattccgtc actttttcag ccgcatgag 49
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(M1D-F)
<400> 23
gccaggatcc gaattcgagc tc 22
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(GDH_RBS-Rev)
<400> 24
gatatatctc cttaggtacc ttatccgcgt cctgcttgga atg 43
<210> 25
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(RBS_ ADH1-Fwd)
<400> 25
ggtacctaag gagatatatc atgagcaatc gtctggatgg taaagttg 48
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(BVMO_ homologous seq-Rev)
<400> 26
gaattcggat cctggcttag gcattggcag gttgcttgat atc 43
<210> 27
<211> 786
<212> DNA
<213> 基因序列(GDH)
<400> 27
atgtatacag atttaaaaga taaagtagta gtaattacag gtggatcaac aggtttagga 60
cgcgcaatgg ctgttcgttt cggtcaagaa gaagcaaaag ttgttattaa ctattacaac 120
aatgaagaag aagctttaga tgcgaaaaaa gaagtagaag aagcaggcgg acaagcaatc 180
atcgttcaag gcgacgtaac aaaagaagaa gatgttgtaa accttgttca aacagctatt 240
aaagaattcg gtacattaga cgttatgatt aataacgctg gtgttgaaaa cccagttcct 300
tctcatgagt tatctttaga caactggaat aaagttattg atacaaactt aacaggtgca 360
ttcttaggaa gccgtgaagc aatcaaatat tttgttgaaa acgacattaa aggaaacgtt 420
attaacatgt ctagtgttca tgaaatgatt ccttggccat tatttgttca ttacgcagca 480
agtaaaggcg gtatgaaact aatgacggaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt 540
atccgcgtaa ataacattgg accaggtgcg atgaacacac caattaacgc agagaaattt 600
gcagatcctg tacaacgtgc agacgtagaa agcatgattc caatgggtta catcggtaaa 660
ccagaagaag tagcagcagt tgcagcattc ttagcatcat cacaagcaag ctatgtaaca 720
ggtattacat tatttgctga tggtggtatg acgaaatacc catcattcca agcaggacgc 780
ggataa 786
<210> 28
<211> 759
<212> DNA
<213> 基因序列(ADH1)
<400> 28
atgagcaatc gtctggatgg taaagttgca attattaccg gtggcacctt aggtattggt 60
ctggcaattg caaccaaatt tgttgaagag ggtgccaaag ttatgattac cggtcgtcat 120
agtgatgttg gtgaaaaagc agcaaaaagc gttggtacac cggatcagat tcagtttttt 180
cagcatgata gcagtgatga agatggttgg accaaactgt ttgatgcaac cgaaaaagca 240
tttggtccgg ttagcaccct ggttaataat gcaggtattg cagtgaataa gagcgttgaa 300
gaaaccacca ccgcagaatg gcgtaaactg ctggcagtta atctggatgg cgtttttttt 360
ggtacacgtc tgggtattca gcgcatgaaa aacaaaggtc tgggtgcaag cattatcaac 420
atgagcagca ttgaaggttt tgttggtgat ccgagcctgg gtgcatataa tgcaagcaaa 480
ggtgcagttc gtattatgag caaaagcgca gcactggatt gtgcactgaa agattatgat 540
gttcgtgtga ataccgttca tccgggttat atcaaaacac cgctggttga tgatctgcct 600
ggtgccgaag aagcaatgag ccagcgtaca aaaaccccga tgggtcatat tggtgaaccg 660
aatgatattg cctatatctg tgtttatctg gccagcaacg aaagtaaatt tgcaaccggt 720
agcgaatttg ttgtggatgg tggttatacc gcacagtaa 759
<210> 29
<211> 1632
<212> DNA
<213> 基因序列(BVMO)
<400> 29
atgtcacaaa aaatggattt tgatgctatc gtgattggtg gtggttttgg cggactttat 60
gcagtcaaaa aattaagaga cgagctcgaa cttaaggttc aggcttttga taaagccacg 120
gatgtcgcag gtacttggta ctggaaccgt tacccaggtg cattgacgga tacagaaacc 180
cacctctact gctattcttg ggataaagaa ttactacaat cgctagaaat caagaaaaaa 240
tatgtgcaag gccctgatgt acgcaagtat ttacagcaag tggctgaaaa gcatgattta 300
aagaagagct atcaattcaa taccgcggtt caatcggctc attacaacga agcagatgcc 360
ttgtgggaag tcaccactga atatggtgat aagtacacgg cgcgtttcct catcactgct 420
ttaggcttat tgtctgcgcc taacttgcca aacatcaaag gcattaatca gtttaaaggt 480
gagctgcatc ataccagccg ctggccagat gacgtaagtt ttgaaggtaa acgtgtcggc 540
gtgattggta cgggttccac cggtgttcag gttattacgg ctgtggcacc tctggctaaa 600
cacctcactg tcttccagcg ttctgcacaa tacagcgttc caattggcaa tgatccactg 660
tctgaagaag atgttaaaaa gatcaaagac aattatgaca aaatttggga tggtgtatgg 720
aattcagccc ttgcctttgg cctgaatgaa agcacagtgc cagcaatgag cgtatcagct 780
gaagaacgca aggcagtttt tgaaaaggca tggcaaacag gtggcggttt ccgtttcatg 840
tttgaaactt tcggtgatat tgccaccaat atggaagcca atatcgaagc gcaaaatttc 900
attaagggta aaattgctga aatcgtcaaa gatccagcca ttgcacagaa gcttatgcca 960
caggatttgt atgcaaaacg tccgttgtgt gacagtggtt actacaacac ctttaaccgt 1020
gacaatgtcc gtttagaaga tgtgaaagcc aatccgattg ttgaaattac cgaaaacggt 1080
gtgaaactcg aaaatggcga tttcgttgaa ttagacatgc tgatactggc cacaggtttt 1140
gatgccgtcg atggcaacta tgtgcgcatg gacattcaag gtaaaaacgg cttggccatt 1200
aaagactact ggaaagaagg tccgtcgagc tatatgggtg tcaccgtaaa taactatcca 1260
aacatgttca tggtgcttgg accgaatggc ccgtttacca acctgccgcc atcaattgaa 1320
tcacaggtgg aatggatcag tgataccatt caatacacgg ttgaaaacaa tgttgaatcc 1380
attgaagcga caaaagaagc ggaagaacaa tggactcaaa cttgcgccaa tattgcggaa 1440
atgaccttat tccctaaagc gcaatcctgg atttttggtg cgaatatccc gggcaagaaa 1500
aacacggttt acttctatct cggtggttta aaagaatatc gcagtgcgct agccaactgc 1560
aaaaaccatg cctatgaagg ttttgatatt caattacaac gttcagatat caagcaacct 1620
gccaatgcct aa 1632
<210> 30
<211> 1059
<212> DNA
<213> 基因序列(ADH2)
<400> 30
atgcattgtt attgcgttac ccatcatggt cagccgctgg aagatgttga aaaagaaatt 60
ccgcagccga aaggcaccga agttctgctg catgttaaag cagcaggtct gtgtcatacc 120
gatctgcatc tgtgggaagg ttattatgat ttaggtggtg gtaaacgtct gagcctggca 180
gatcgtggtc tgaaaccgcc tctgacactg agccatgaaa ttaccggtca ggttgttgca 240
gttggtccgg atgcagaaag cgttaaagtt ggtatggtta gcctggttca tccgtggatt 300
ggttgtggtg aatgtaatta ttgtaaacgc ggtgaagaaa acctgtgtgc aaaaccgcag 360
cagctgggta ttgcaaaacc tggtggtttt gcagaataca ttattgttcc gcatccgcgt 420
tatctggttg atattgcagg tctggatctg gccgaagcag caccgctggc atgtgccggt 480
gttaccacct atagcgcact gaaaaaattc ggtgatctga ttcagagcga accggttgtt 540
attattggtg ccggtggtct gggtctgatg gcactggaac tgctgaaagc aatgcaggca 600
aaaggtgcaa ttgttgtgga tatcgatgat agcaaactgg aagcagcccg tgcagccggt 660
gcactgagcg tgattaatag ccgtagcgaa gatgcagcac agcagctgat tcaggccacc 720
gatggtggtg cacgtctgat tctggacctg gttggtagca atccgacact gagtctggca 780
ctggcaagcg cagcacgtgg tggtcatatt gttatttgtg gcctgatggg tggtgaaatc 840
aaactgagca ttccggttat tccgatgcgt ccgctgacca ttcagggtag ctatgttggc 900
accgttgaag aactgcgtga actggttgag ctggttaaag aaacccatat gagcgcaatt 960
ccggtgaaaa aactgccgat tagccagatt aatagtgcct ttggcgatct gaaagatggt 1020
aatgttattg gtcgtatcgt tctgatgcac gagaactaa 1059
<210> 31
<211> 1434
<212> DNA
<213> 基因序列(ALDH)
<400> 31
atgaactatc cgaatattcc gctgtatatt aacggcgaat ttctggatca taccaatcgt 60
gatgtgaaag aagtgtttaa cccggttaac catgaatgca ttggtctgat ggcatgtgca 120
agccaggcag atctggatta tgcactggaa agcagccagc aggcatttct gcgttggaaa 180
aaaaccagtc cgattacacg tagcgaaatt ctgcgtacct ttgcaaaact ggcacgtgaa 240
aaagcagcag aaattggtcg caatattacc ctggatcagg gcaaaccgct gaaagaagca 300
attgccgaag ttaccgtttg tgcagaacat gcagaatggc atgcagaaga atgtcgtcgt 360
atttatggtc gtgttattcc gcctcgtaat ccgaatgttc agcagctggt tgttcgtgaa 420
ccgctgggtg tttgtctggc atttagcccg tggaattttc cgtttaatca ggccattcgt 480
aaaatcagcg cagcaattgc agcaggttgt accattattg ttaaaggtag cggtgatacc 540
ccgagcgcag tttatgcaat tgcccagctg tttcatgaag caggtctgcc gaatggtgtt 600
ctgaatgtta tttggggtga tagcaacttc atcagcgact atatgattaa aagcccgatc 660
atccagaaaa tcagctttac cggtagcaca ccggttggta aaaaactggc cagccaggca 720
agcctgtata tgaaaccgtg taccatggaa ttaggtggtc atgcaccggt tattgtttgt 780
gatgatgcag atattgatgc agccgttgaa catctggttg gttacaaatt tcgtaatgca 840
ggtcaggttt gtgttagccc gacacgtttt tatgttcaag agggcatcta taaagagttt 900
agcgaaaaag ttgttctgcg tgccaagcag attaaagttg gttgtggtct ggatgcaagc 960
agcgatatgg gtccgctggc acaggcacgt cgtatgcatg caatgcagca gatcgttgaa 1020
gatgcagttc ataaaggtag taaactgctg ttaggtggca acaagattag cgataaaggc 1080
aacttttttg aaccgaccgt tctgggtgat ctgtgtaatg atacccagtt tatgaacgat 1140
gaaccgtttg gtccgattat cggtctgatt ccgtttgata ccattgatca tgttctggaa 1200
gaagcaaatc gtctgccgtt tggcctggca agctatgcat ttaccaccag tagcaaaaat 1260
gcacaccaga ttagctatgg tctggaagca ggtatggtta gcattaacca tatgggttta 1320
gcactggcag aaaccccgtt tggtggtatt aaagatagtg gttttggtag cgaaggtggc 1380
attgaaacct ttgatggtta tctgcgcacc aaatttatca cccagctgaa ctaa 1434
<210> 32
<211> 942
<212> DNA
<213> 基因序列(Lactonase)
<400> 32
atgaccaata ttagcgaaac cctgagcacc gcacctggtg gtgcagcagg tccggatgtt 60
ctgcgtgatc tgtatgcaga ttggagcgaa attatggcag caacaccgga tctgaccatt 120
cgtctgctgc gtagcctgtt tgatgaatgg catcagccga ccgttgaacc ggaaggtgtt 180
acctatcgtg aagaaaccgt tggtggtgtt cctggtattt ggtgtctgcc gcagggtgca 240
gatggtagca aagttctgct gtatacccat ggtggtggtt ttgcagttgg tagcgcagca 300
agccatcgta aactggcagg tcatgttgca aaagcactgg gtgccgttgg ttttgttctg 360
gattatcgtc gtgcaccgga atttcagcat ccggcacaga ttgaagatgg tgttgcagca 420
tttgatgcac tggttgcaaa tggtattgca ccgcaggata ttaccaccat tggtgatagt 480
gccggtggta atctggcagt tgcaattgcc ctgagcctgc gtgaacaggg taaacaaggt 540
ccgggtagcg ttattgcatt tagcccgtgg ctggatatgg aaaataaagg tgaaaccctg 600
gccaccaata atgataccga tgcactgatt acaccggaac tgctggaagg catgattgcc 660
ggtgtgctgg gtgataccat tgatccgaaa acaccgctgg caaatccgct gtatgccgat 720
tttaccggtt ttccgcgtct gtatatcacc gcaggtagcg ttgaaagcct gctggataat 780
gcaacccgtc tggaaaaatt agcagcatct gccggtgttg atgttaccct gagtattggt 840
gaaggtcagc agcatgttta tccgtttctg gcaggccgta gcgcactggt ggatgatgaa 900
tttgcaaagc tggcagcatg gtatcagaaa gccctggaat aa 942
<210> 33
<211> 1353
<212> DNA
<213> 基因序列(NOX)
<400> 33
atgaaagtta tcgtaattgg ttgtactcat gccggaactg ctgctgtaaa tcaaatcttg 60
gcgtcaaatc cagaaacaga cgtcacgatt tatgaacgga atgacaatgt gtcatttctc 120
tcctgtggga ttgccctcta tcttggtggc gaagttgccg atccacaagg gctcttctat 180
tccagtccag aacaattagc caaattaggc gcgaatgttc atatgcaaca tgatgtgacc 240
gacgtggata ccgaaaatca tgaaattacc gttactgatt tgaagaccgg cgaatccaag 300
aaagattatt acgacaaatt agttgtcaca actggttcat ggcctgtaat tccaccaatc 360
gatggtatcg acagcccgaa cgtttacctc tgcaagaact ggacgcatgc ccaaagttta 420
tgggaagctg ccaagccagc taagcgcgtc atcgttatcg gtgggggcta cattgggact 480
gaattagtcg aagcttatca gaagcaaggt aaggaagtta ccttaattga tggcttacca 540
cggattttaa acaagtattt agacaaaggc ttcactgacc gggtcgaaaa agacttcgtt 600
gaccatggca tcaagatggc cttaaatcag atggttaaag gcttcagtga tgatggcaag 660
gaagttaccg ttaagactga caagggcagc tacaccgctg atatggcaat tctctgtgtt 720
ggtttccggc caaacaccag cctattaaag ggcaaagttg acatgaaccc gaacggctct 780
attaagacaa atgactacat gcaaacatct gaccctgata tctacggtgc tggtgattcc 840
gttgcggttc actacaaccc aactaagaag gatgcctaca ttccattagc cactaacgcg 900
gttcgccaag ggactttagt tggtttgaac atcttcaagc caacccggaa gtacatgggg 960
acgcaatcaa cttctggttt aatgttattc ggcaagacga tcgtttcttc tgggatgacc 1020
ttggaacatg ctcaagctga aaaggtacct gcagaagccg ttacctttga agataactac 1080
cgtccagaat ttatgccaac cacgaaacca gttctgatgc aattggttta caacccagag 1140
acgcgtgaaa tcttaggggc ccaattcatg agtgaacatg acgtttcaca atcggctaac 1200
gtgatctcag tgatgattca aaatcacaac acgatcgatg acttaggctt tgttgacatg 1260
ttcttccagc caatctatga ccgtccattc aactacttga acttattagg ccaagcagcc 1320
atcgctcatg cggctgaaaa agtgacggaa taa 1353

Claims (13)

1.一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：由包含催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因的重组细胞在常温常压及有氧条件下催化转化底物内酯得到α，ω-二羧酸。
2.根据权利要求1所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：底物为环烷醇时，还包括催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因的重组细胞；
所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因与所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因位于同一细胞内，利用单细胞系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因与所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因分别构建于不同的细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化。
3.根据权利要求2所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：底物为环烷烃时，还包括催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因的重组细胞；
所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因与所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因位于同一细胞内，利用单细胞系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因、所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因，三者分别位于不同的细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因、所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因，三者中的任意两种位于同一细胞内，另外一种位于一个细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：所述细胞为原核细胞大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)或低等真核细胞酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞中的任一种。
5.根据权利要求4所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：所述α,ω-二元羧酸包括C5、C6、C7、C8、C10、C12及C15类不同的二元羧酸。
6.根据权利要求5所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因包括内酯酶基因、醇脱氢酶基因、醛脱氢酶基因和NADH氧化酶基因。
7.根据权利要求2所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因包括醇脱氢酶基因和Baeyer-Villiger单加氧酶基因。
8.根据权利要求3所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因包括细胞色素P450单加氧酶P450BM319A12基因、P450BM3 A82F基因和P450BM3 A82F/A328F中的任一种，包括葡萄糖脱氢酶GDH基因。
9.根据权利要求5-8任一所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：将包含催化相应底物生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因的细胞在TB液体培养基中培养，并加入诱导剂诱导表达；收集培养的菌体加入至含有底物的催化反应体系中进行催化与转化；催化底物为环烷烃时，催化反应体系中加入葡萄糖溶液。
10.根据权利要求9所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：所述催化反应在常温常压及有氧条件下进行，所述温度范围为20-40℃；优选在25-30℃的温度范围内；更优选在25℃进行。
11.如权利要求10所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法在生产α,ω-二元羧酸中的应用。
12.如权利要求10所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法在生产C5、C6、C7或C8类二酸产品中的任一种中的应用。
13.一种如权利要求1-3任一所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法中的重组细胞在制备固定化细胞中的应用。
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