CN116024148B - 重组嗜盐菌及其制备方法、应用和用其生产的聚羟基脂肪酸酯 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种重组嗜盐菌及其制备方法、应用和用其生产的聚羟基脂肪酸酯，该组嗜盐菌，其包含以6‑羟基己酸和葡萄糖为原料生产聚羟基脂肪酸酯的代谢路径，所述聚羟基脂肪酸酯的结构如下式所示：m和n均为正整数。本发明为聚羟基脂肪酸酯及其生产工程菌的开发提供新的解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及微生物代谢工程和发酵工程领域，特别涉及一种重组嗜盐菌及其制备方法、应用和用其生产的聚羟基脂肪酸酯。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)，是很多微生物合成的一种细胞内聚酯，是一种天然的高分子生物材料。由于PHA同时具有良好的生物相容性能、生物可降解性和塑料的热加工性能，所以它同时可作为生物医用材料和生物可降解包装材料，因此它已经成为近年来生物材料领域最为活跃的研究热点。PHA还具有非线性光学性、压电性、气体相隔性很多高附加值性能。
传统的聚羟基脂肪酸酯的合成技术方案例如：CN111705029 A记载了一种基于嗜盐菌高效生产3-羟基丙酸(3HP)及其衍生物的方法，涉及重组嗜盐菌(Halobacteriaceae)，其包含生产3-羟基丙酸(3HP)或其衍生物的代谢路径，其中所述3-羟基丙酸的衍生物为聚3-羟基丙酸酯(P3HP)或3-羟基丙酸与选自以下的单体的共聚物：3-羟基丁酸(3HB)、4-羟基丁酸(4HB)、3-羟基戊酸(3HV)、或其组合，优选为聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸)(P3HB3HP)。然而，目前聚羟基脂肪酸酯的种类以及工程菌的种类有限，开发新的聚羟基脂肪酸酯及其生产工程菌是亟待解决的技术问题。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请的目的之一包括提供重组嗜盐菌，该重组嗜盐菌能够以6-羟基己酸和葡萄糖为原料生产聚羟基脂肪酸酯。
在本申请的第一方面，提供一种重组嗜盐菌，其包含以6-羟基己酸和葡萄糖为原料生产聚羟基脂肪酸酯的代谢路径，所述聚羟基脂肪酸酯的结构如下式所示：
m和n均为正整数。
在本申请的一些实施方式中，其表达外源的6HHx-coA转移酶基因，所述6HHx-coA转移酶基因选自orfz基因、alkK基因、prpE基因、pct540基因、hadA基因或者其组合。
在本申请的一些实施方式中，其还包含以ε-己内酯为原料生产6-羟基己酸的代谢路径。
在本申请的一些实施方式中，其表达外源的lactonase基因。
在本申请的一些实施方式中，其还包含以环己烷为原料生产ε-己内酯的代谢路径。
在本申请的一些实施方式中，其表达外源的p450基因、ADH1基因和BVMO基因。
在本申请的一些实施方式中，其还包含以己二醇为原料生产6-羟基己酸的代谢路径。
在本申请的一些实施方式中，其表达外源的aldD基因和dhaT基因。
在本申请的一些实施方式中，其表达外源的PHA聚合酶基因。
在本申请的一些实施方式中，所述PHA聚合酶基因选自phaC1437基因、phaC61-3基因、phaC4AK4基因、phaCAR基因或者其组合。
在本申请的一些实施方式中，所述嗜盐菌为Halomonas TD1.0、Halomonassp.LY01或者其衍生菌，
所述Halomonas sp.LY01的保藏编号为GDMCC No.62635，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
在本申请的第二方面，提供第一方面所述的重组嗜盐菌的制备方法，所述制备方法包括在嗜盐菌中构建所述代谢路径的步骤。
在本申请的第三方面，提供一种聚羟基脂肪酸酯的生产方法，所述生产方法包括如下步骤：对第一方面中所述的重组嗜盐菌进行发酵，收集菌体，制备聚羟基脂肪酸酯。
在本申请的第四方面，提供一种聚羟基脂肪酸酯，所述聚羟基脂肪酸酯的结构如下式所示：
m和n均为正整数。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请提供一种重组嗜盐菌，该重组嗜盐菌能够以6-羟基己酸和葡萄糖为原料生产聚羟基脂肪酸酯，并且，所生产的聚羟基脂肪酸酯结构新颖，具有良好的生物相容性能、生物可降解性和塑料的热加工性能，能作为生物医用材料和生物可降解包装材料。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中的6-羟基己酸合成聚羟基脂肪酸酯(PHA(P(3HB-co-6HHx)))路径图；
图2为实施例2中的ε-己内酯合成聚羟基脂肪酸酯(PHA(P(3HB-co-6HHx)))路径图；
图3为实施例4中的含有6HHx的1HNMR图；
图4为实施例4中的环己烷生成ε-己内酯路径图；
图5为实施例5中的己二醇生成6-羟基己酸路径图。
本发明提供的Halomonas sp.LY01，其分类命名为Halomonas sp.，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No.62635；该菌株于2022年7月19日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2022年7月19日检测为存活菌株。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请的第一方面
本申请提供一种重组嗜盐菌，其包含以6-羟基己酸和葡萄糖为原料生产聚羟基脂肪酸酯的代谢路径，所述聚羟基脂肪酸酯的结构如下式所示：
m和n均为正整数。
可选地，其表达外源的6HHx-coA转移酶基因，所述6HHx-coA转移酶基因选自orfz基因、alkK基因、prpE基因、pct540基因、hadA基因或者其组合。
可选地，其还包含以ε-己内酯为原料生产6-羟基己酸的代谢路径。
可选地，其表达外源的lactonase基因。
可选地，其还包含以环己烷为原料生产ε-己内酯的代谢路径。
可选地，其表达外源的p450基因、ADH1基因和BVMO基因。
可选地，其还包含以己二醇为原料生产6-羟基己酸的代谢路径。
可选地，其表达外源的aldD基因和dhaT基因。
可选地，其表达外源的PHA聚合酶基因。
可选地，所述PHA聚合酶基因选自phaC1437基因、phaC61-3基因、phaC4AK4基因、phaCAR基因或者其组合。
可选地，所述嗜盐菌为Halomonas TD1.0、Halomonas sp.LY01或者其衍生菌，
所述Halomonas sp.LY01的保藏编号为GDMCC No.62635，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
可选地，所述重组嗜盐菌表达外源的aldD基因、dhaT基因和orfz基因，所述嗜盐菌为Halomonas sp.LY01或其衍生菌。
可选地，所述重组嗜盐菌表达外源的orfz基因、lactonase基因和phaCAR基因，所述嗜盐菌为Halomonas sp.LY01或其衍生菌。
可选地，所述重组嗜盐菌表达外源的orfz基因、lactonase基因、phaCAR基因、p450基因、ADH1基因和BVMO基因，所述嗜盐菌为Halomonas sp.LY01或其衍生菌。
本申请的第二方面
本申请提供第一方面所述的重组嗜盐菌的制备方法，所述制备方法包括在嗜盐菌中构建所述代谢路径的步骤。
本申请的第三方面
本申请提供一种聚羟基脂肪酸酯的生产方法，所述生产方法包括如下步骤：对第一方面中所述的重组嗜盐菌进行发酵，收集菌体，制备聚羟基脂肪酸酯。
发酵所采用的培养体系可以为50M培养体系或者60LB培养体系，培养体系中的碳源有葡萄糖以及其他对应适用的碳源种类(6-羟基己酸、ε-己内酯、己二醇)。葡萄糖和其他对应适用的碳源种类在培养基体系中的质量比为(0-30)：(1-5)，例如葡萄糖在培养体系中的浓度(g/L)为0、5、10、15、20、25、30，其他对应适用的碳源种类在培养基体系中的浓度(g/L)为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5。
本申请的第四方面
本申请提供一种聚羟基脂肪酸酯，所述聚羟基脂肪酸酯的结构如下式所示：
m和n均为正整数。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1：6-羟基己酸为原料发酵生产P(3HB-co-6HHx)
通过Snapgene软件和网站NEB Tm Calculator(https://tmcalculator.neb.com/)进行引物设计及质粒的构造，并且通过一系列实验操作最终将质粒分别导入嗜盐菌Halomonas TD1.0中，实现6-羟基己酸为原料进行发酵得到产品P(3HB-co-6HHx)。
(1)6-羟基己酸为原料合成路径的确定
以6-羟基己酸为原料合成路径如图1所示，在嗜盐菌内有天然利用葡萄糖合成P3HB的路径，所以需要外加引入生成6HHx-coA的酶。
通过查阅文献及资料，确定图1中合成步骤①所需要的酶(6HHx-coA转移酶)主要包括来自菌株Clostridium kluyveri的orfz(NCBI登记号：WP_012103361.1)，来自Pseudomonas putida的alkK(NCBI登记号：CAB54055.1)，来自Metallosphaera sedula DSM5348的prpE(NCBI登记号：AIM27597.1)，来自Clostridium propionicum的pct540(NCBI登记号：ALJ75581.1)，来自Clostridium difficile的hadA(NCBI登记号：AAV40822.1)；合成步骤②中所需要的酶(PHA聚合酶)可以采用嗜盐菌本身的PHA聚合酶phaCTD。
(2)质粒的构建
将不同来源的6HHx-coA转移酶插入到pSEVA321质粒中，采用嗜盐菌自身的聚合酶phaCTD进行聚合。采用表达载体pSEVA321为骨架，以此分别加入基因orfz、alkK、prpE、pct540、hadA。基因片段及载体片段采用Q5高保真DNA聚合酶进行扩增及Gibson AssemblyMaster Mix(购自New England Biolabs)进行连接分别得到连接产物。
1)表达载体骨架及相关基因的序列片段PCR扩增
①表达载体pSEVA321骨架及orfz基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。
引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F1(SEQ ID No.1)：
AAAAAGAGATTTTAGACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R1(SEQ ID No.2)：
CTCTTCCCACTCCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAG
orfz基因对应的引物序列如下：
orfz-F(SEQ ID No.3)：
GAGGAGAAATACTAGATGGAGTGGGAAGAGATATATAAA
orfz-R(SEQ ID No.4)：
GCGGCCGCTACTAGTCTAAAATCTCTTTTTAAATTCATTCATT
分别以载体与基因序列为模板，反应总体积为50μL，在0.2mL PCR管中依次加入下列成分(如表1所示)：
表1、Q5高保真DNA聚合酶的PCR体系添加表
| 体系组分 | 反应体系 |
| Forward Primer(10μmol/L) | 2.5μL |
| Reverse Primer(10μmol/L) | 2.5μL |
| Q5 High-Fidelity 2×Master Mix | 25μL |
| Template DNA(<200ng) | 1μL |
| dd H2O | To 50μL |
混匀后瞬时离心，反应参数为：98℃预变性30s；98℃变性10s，50-72℃退火30s，72℃延伸30s/kb，35个循环后72℃终延伸2min。使用通用性DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收上述载体及基因，操作按产品说明书提供的步骤进行。
②表达载体pSEVA321骨架及alkK。基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F2(SEQ ID No.5)：
AGCGTTTGTGAATAAACTAGTAGCGGCCGCTG
pSEVA321-MmP1-R2(SEQ ID No.6)：
CATCTGGCCCAGCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAG
alkK基因对应的引物序列如下：
alkKF(SEQ ID No.7)：
GAGGAGAAATACTAGATGCTGGGCCAGATGATGCGC
alkK-R(SEQ ID No.8)：
GCGGCCGCTACTAGTTTATTCACAAACGCTGCTGCTGCTG
③表达载体pSEVA321骨架及prpE。基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F3(SEQ ID No.9)：
TTAAAGACTTCCTAAACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R3(SEQ ID No.10)：
GTAGCGCATAAACATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAG
prpE基因对应的引物序列如下：
PrpE-F(SEQ ID No.11)：
GAGGAGAAATACTAGATGTTTATGCGCTACATCATGGTG
prpE-R(SEQ ID No.12)：
TTAGGAAGTCTTTAATTCCTTCTTCAGTTC
④表达载体pSEVA321骨架及pct540。基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F4(SEQ ID No.13)：
GAAATGAAGTCCTGAACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R4(SEQ ID No.14)：
GGGAACCTTTCTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAG
pct540基因对应的引物序列如下：
Pct540-F(SEQ ID No.15)：
GAGGAGAAATACTAGATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGC
pct540-R(SEQ ID No.16)：
GCGGCCGCTACTAGTTCAGGACTTCATTTCCTTCAGACCCATTAAG
⑤表达载体pSEVA321骨架及hadA。基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F5(SEQ ID No.17)：
AAAGTTGTAAGATATACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R5(SEQ ID No.18)：
AACTCCTTCTAAAAGCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAG
hadA基因对应的引物序列如下：
hadA-F(SEQ ID No.19)：
GAGGAGAAATACTAGCTTTTAGAAGGAGTTAAAGTAGTAGAAC
hadA-R(SEQ ID No.20)：
GCGGCCGCTACTAGTATATCTTACAACTTTACTATCTTTAAAGT
2)重组质粒的连接
将上述1)中得到的载体及基因连接构建重组成为一个新质粒，通过GibsonAssembly Master Mix(购自New England Biolabs)进行连接，总反应体积为10μL，在0.2mLPCR管中依次加入下列成分：
表2、Gibson Assembly Master Mix酶连接时各组分添加量
| 体系组分 | 反应体系 |
| Gibson Assembly Master Mix(2X) | 5μL |
| Total Amount of Fragments | 0.2–1pmols*XμL |
| dd H2O | (5-X)μL |
| Total Volume | 10μL |
在冰上进行混匀，当这5个片段组装时，50℃热浴60分钟。获得连接产物。而后，将样品储存在冰上或-20℃，以备随后的转化。
3)大肠杆菌DH5α化学转化感受态细胞的制备
①使用LB平板培养基，挑取大肠杆菌(-20℃甘油保藏菌株)，在平板上分级划线，于37℃倒置培养14-16h。
②从LB平板上挑取活化的E.coli DH5α单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养12h。
③将上述培养物以1％接种于100mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养OD600达到0.5左右，放置冰上停止培养。
④取上述菌液1mL转入1.5mL离心管中，4000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清；之后按感受态细胞制备试剂盒(Takara公司)说明书进行。
⑤冰上将感受态细胞分装成每管100μL，-80℃保存，即获得感受态细胞DH5α。
4)连接产物转化到大肠感受态细胞DH5α
①-80℃冰箱内取出100μL制备的感受态细胞DH5α，迅速插入冰盒内，使其溶解。
②加入10μL连接产物轻轻混匀，冰中放置30分钟。
③42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中放置2分钟，注意不要晃动。添加700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混合均匀。
④37℃振荡培养1小时(160-225rpm)，吸取适量体积均匀涂布到含氯霉素抗生素的LB琼脂培养基平板中，然后倒置过夜培养。
⑤通过菌液PCR对阳性单菌落验证并送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
(3)重组质粒导入嗜盐菌Halomonas TD1.0
1)大肠感受态细胞DH5α中的质粒p321-MmP1-orfz/alkK/prpE/pct540/hadA转化到大肠杆菌S17-1将大肠感受态细胞DH5α中的质粒提取出来，提取质粒采用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，操作步骤按说明书进行；然后将提取后的质粒导入到大肠杆菌S17-1中(具体操作步骤与(2)中的iv相同)。
2)大肠杆菌S17-1(p321-MmP1-orfz/alkK/prpE/pct540/hadA)接合到嗜盐菌Halomonas TD1.0
①将E.coli S17-1(LB+Cm)与Halomonas TD1.0(60LB)分别培养(摇菌管4-5mL)，待OD600达到0.6-0.8，各取50μL按1:1混合涂布到无抗20LB平板，6-8h；
②在含有抗生素Cm的平板上划线培养48h；
③最后再挑取单克隆在60LB含抗生素Cm平板上验证,利用PCR再次验证，保菌。
60LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠60g/L，水，pH为8.5。
(4)接合不同质粒的嗜盐菌Halomonas TD1.0内加入6-羟基己酸进行发酵
1)种子液的制备
①将重组的盐单胞菌Halomonas TD1.0(p321-MmP1-orfz/alkK/prpE/pct540/hadA)在含Cm的60LB平板，37℃活化24h，待其长出单克隆。
②挑选上述①中单克隆接种于装有5mL种子培养基(60LB)及5μL Cm的摇菌管中，37℃，220rpm培养12h。
③取上述②中菌液，按1％接种于装有20mL种子培养基(60LB)及20μL Cm的150mL锥形瓶中，37℃，220rpm培养12h。
2)P(3HB-co-6HHx)发酵生产
发酵液准备，①50MM培养体系
底料(g/L)：水；NaCl 50；yeast 1；
组分I(g/L)：水；MgSO4 20；CO(NH2)2 30；
组分II(g/L)水；KH2PO4 175；
组分III(g/L)：将5g/L Fe(III)-NH4-Citrate和2g/L CaCl2·2H2O及浓盐酸(12mol/L)41.7ml充分混合后定容1L；
组分IV(g/L)：含ZnSO4·7H2O 0.1，MnCl2·4H2O 0.03，H3BO3 0.3，CoCl2·6H2O0.2，CuSO4·5H2O 0.01，NiCl2·6H2O 0.02和NaMoO4·2H2O 0.03；
组分III&IV取100ml组分III，10ml组分IV且加入90mL去离子水混合，最后用5M的NaOH调pH值到4.5-5.5；
碳源(g/L)：水；葡萄糖30，6-羟基己酸5。
②60LB发酵培养体系酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠60g/L，葡萄糖30g/L，其他碳源5g/L，水，pH为8.5。本批实验采用50MM培养体系，将种子液按5％接种于500ml锥形瓶(底料45ml；组分I1ml；组分II 1ml；组分III&IV 1ml；碳源；1‰的抗生素Cm；5M的NaOH调pH值到8.5-9.5)内，并加入20mg/L的IPTG诱导剂，置于摇床37℃、220rpm培养48h。
3)发酵结束后收集菌体进行检测细胞干重、OD600和P(3HB-co-6HHx)含量
①细胞干重(CDW)：将30-35ml发酵后菌液置于50ml离心管中，8000rpm室温下离心6min，去上清液(尽可能减少固体沉淀的损失)；加入去离子水恢复原体积，重悬，保证沉淀完全消失，8000rpm室温下离心6min，去上清液；封口膜封口离心管置于-80℃冰箱冻存0.5-2h；将离心管于真空冷冻干燥机内干燥12-16小时；称重，计算细胞干重。
②OD600：将发酵后的菌液稀释一定倍数，确保使用分光光度计在波长为600nm时的读数位于为0.3-0.8范围之中。
③P(3HB-co-6HHx)含量检测：在40mg冻干细胞中加入2ml酯化液(包含甲醇、3wt％(v/v)浓硫酸(98wt％,w/w)和1g/L苯甲酸)及2ml氯仿，100℃下酯化约4h。PHB标品和ε-己内酯标品20-30mg采用同样处理为参照。
甲醇分解后，样品在GC-2014气相色谱仪(日本岛津)上测定PHB含量。初始温度维持在80℃，1.5min；在第一阶段,温度以30℃/min的速度增加到140℃；在第二阶段，以40℃/min的速度增加到240℃，此过程耗时2min；总的分析时间是8min；注射温度为240℃和检测器温度为250℃。
4)发酵结果：
不同重组的盐单胞菌Halomonas TD1.0的发酵结果如下表所示：
表3、接合不同质粒的重组嗜盐菌以葡萄糖及6-羟基己酸为原料的发酵情况
实施例2：ε-己内酯为原料发酵生产P(3HB-co-6HHx)
(1)ε-己内酯为原料合成路径的确定
以ε-己内酯为原料合成路径如图2所示，在实施例1的基础上，需要外加引入ε-己内酯水解变成6-羟基己酸的酶。
确定图2中合成步骤③所需的酶(ε-己内酯水解酶)有来自菌株Rhodococcussp.HI-31的lactonase(NCBI登记号：BAH56676.1)基因。
(2)质粒的构建
将不同来源的可生成6HHx-coA的酶与ε-己内酯水解酶连接，并且以表达载体pSEVA321为骨架，以此加入基因orfz/alkK/prpE/pct540/hadA及基因lactonase，两基因之间采用相同的核糖体结合序列(RBS)。
1)表达载体骨架及相关基因的序列片段PCR扩增
表达载体pSEVA321骨架及orfz、lactonase基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F1’(SEQ ID No.1)：
AAAAAGAGATTTTAGACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R1’(SEQ ID No.21)：
CCTCTTTCTCTAGTACTAAAATCTCTTTTTAAATTCATTCATTAATGATTCTCTGAATTTTGGATGAGCG
lactonase基因对应的引物序列如下：
lactonase-F1(SEQ ID No.22)：
AAAAAGAGATTTTAGTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGACCAACA
lactonase-R1(SEQ ID No.23)：
GCGGCCGCTACTAGTTTATTCAAGGGCTTTCTGGTACCAGG
表达载体pSEVA321骨架及alkK、lactonase基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。
引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F2’(SEQ ID No.24)：
AGCGTTTGTGAATAAACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R2’(SEQ ID No.25)：
CCTCTTTCTCTAGTATTATTCACAAACGCTGCTGCTGCTG
lactonase基因对应的引物序列如下：
lactonase-F2(SEQ ID No.26)：
AGCGTTTGTGAATAATACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGACCAACA
lactonase-R2(SEQ ID No.23)：
GCGGCCGCTACTAGTTTATTCAAGGGCTTTCTGGTACCAGG
表达载体pSEVA321骨架及prpE、lactonase基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。
引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F3’(SEQ ID No.27)：
AAAGCCCTTGAATAAACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R3’(SEQ ID No.28)：
CCTCTTTCTCTAGTATTAGGAAGTCTTTAATTCCTTCTTCAGTTCTTCCAC
lactonase基因序列如下：
lactonase-F3(SEQ ID No.29)：
TTAAAGACTTCCTAATACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGACCAACA
lactonase-R3(SEQ ID No.23)：
GCGGCCGCTACTAGTTTATTCAAGGGCTTTCTGGTACCAGG
表达载体pSEVA321骨架及pct540、lactonase基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F4’(SEQ ID No.27)：
AAAGCCCTTGAATAAACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R4’(SEQ ID No.30)：
CCTCTTTCTCTAGTATCAGGACTTCATTTCCTTCAGACCCATTAAG
lactonase基因对应的引物序列如下：
lactonase-F4(SEQ ID No.31):
GAAATGAAGTCCTGATACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGACCAACA
lactonase-R4(SEQ ID No.23)：
GCGGCCGCTACTAGTTTATTCAAGGGCTTTCTGGTACCAGG
表达载体pSEVA321骨架及hadA、lactonase基因序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。
引物序列如下：
pSEVA321-MmP1-F5’(SEQ ID No.27)：
AAAGCCCTTGAATAAACTAGTAGCGGCCGCTGC
pSEVA321-MmP1-R5’(SEQ ID No.32)：
CCTCTTTCTCTAGTAATATCTTACAACTTTACTATCTTTAAAGT
lactonase基因序列如下：
Lactonase-F5(SEQ ID No.33)：
AAAGTTGTAAGATATTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGACCAACA
lactonase-R5(SEQ ID No.23)：
GCGGCCGCTACTAGTTTATTCAAGGGCTTTCTGGTACCAGG
分别以载体与基因序列为模板，采用Q5高保真DNA聚合酶进行片段PCR扩增。添加量同实施例1。
2)重组质粒的连接：将上述1中得到的载体及基因连接构建重组成为一个新质粒，通过Gibson Assembly Master Mix(购自New England Biolabs)进行连接，添加量及操作流程同实施例1。
3)大肠杆菌DH5α化学转化感受态细胞的制备及连接产物转化到大肠感受态细胞DH5α。具体操作流程同实施例1。
(3)重组质粒导入嗜盐菌Halomonas TD1.0：具体操作流程同实施例1。
(4)接合不同质粒的嗜盐菌Halomonas TD1.0内加入ε-己内酯进行发酵
①种子液的制备：具体操作流程同实施例1。
②P(3HB-co-6HHx)发酵生产采用50MM的培养体系(碳源为：葡萄糖30，ε-己内酯5，其余组分保持不变)，发酵液及接种量等具体操作流程同实施例1。
③发酵结束后收集菌体进行检测细胞干重、OD600和P(3HB-co-6HHx)含量。细胞干重、OD600和P(3HB-co-6HHx)含量检测方法同实施例1。
(5)发酵结果：
不同接合不同质粒的嗜盐菌的发酵结果如下表所示：
表4、以葡萄糖及ε-己内酯为原料的发酵情况
当以Halomonas TD1.0为底盘菌接合不同质粒时，发现当选择orfz基因与lactonase基因组合时，可得到近10wt％的6HHx单体，并且P(3HB-co-6HHx)的含量可接近60wt％；其他的基因如alkK、prpE、pct540、hadA对于6HHx-coA的产生也具有发挥一定的正向调节或者反向调节功能。
实施例3：不同底盘菌以ε-己内酯为原料发酵生产P(3HB-co-6HHx)
嗜盐菌Halomonas sp.LY01具有高产PHB且碳源广利用的优点，因此可在嗜盐菌Halomonas sp.LY01内接合质粒pSEVA321’(p321-MmP1-orfz-lactonase)。
接合、种子液制备、培养基制备发酵过程等操作同实施例2，发酵之后的结果如表5所示：
表5、不同菌株不同培养体系下的发酵结果
将嗜盐菌Halomonas sp.LY01与嗜盐菌Halomonas TD1.0对比，发现嗜盐菌Halomonas sp.LY01更具有优势，产生的6HHx单体比例更高；同时，嗜盐菌Halomonassp.LY01，可适用于多种培养体系。
PHA聚合酶除了嗜盐菌Halomonas sp.LY01本身的聚合酶phaC，还有来自Pseudomonas sp.MBEL 6-19菌的phaC1437(NCBI登记号：ACM68707.1，且发生四处突变：E130D，S325T，S477G，Q481K)，来自Pseudomonas sp.61-3菌的phaC61-3(NCBI登记号：BAA36200.1，且发生两处突变S325T，Q481K)，来自Aeromonas hydrophila 4AK4菌的phaC4AK4(NCBI登记号：AY093685.1)，及组成型的phaCAR{(Satoh K,Kawakami T,Isobe N,Pasquier L,Tomita H,Zinn M,Matsumoto K.Versatile aliphatic polyesterbiosynthesis system for producing random and block copolymers composed of 2-,3-,4-,5-,and 6-hydroxyalkanoates using the sequence-regulatingpolyhydroxyalkanoate synthase PhaCAR.Microb Cell Fact.2022May 14；21(1):84.doi:10.1186/s12934-022-01811-7.PMID:35568875；PMCID:PMC9107728.)，将这样不同的PHA聚合酶加入到p321-MmP1-orfz-lactonase形成不同的质粒，并将这些质粒导入到嗜盐菌Halomonas sp.LY01中，以葡萄糖和ε-己内酯为原料采用50MM培养体系进行发酵。具体操作步骤如下：
(1)质粒的构建
将不同来源的PHA聚合酶基因片段插入到p321-MmP1-orfz-lactonase质粒(pSEVA321’)中。
1)根据表达载体pSEVA321’以及phaC1437序列信息，利用Snapgene软件设计引物，引物序列如下：
phaC1437-F(SEQ ID No.34)：
GAGGAGAAATACTAGATGAGTAACAAGAGTAACGATGAGTTGAAGTATCAAGC
phaC1437-R(SEQ ID No.35)：
CTCTTCCCACTCCATAAAAGTTATCTCCTCCCTATCCTGTCTTGTTAAATTTACCGTTCGTGCACGTACGTGCC
pSEVA321’-F1(SEQ ID No.36)：
GTGCACGAACGGTAAATTTAACAAGACAGGATAGGGAGGAGATAACTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGAAACT
pSEVA321’-R1(SEQ ID No.37)：
ACTCTTGTTACTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAA
2)根据表达载体pSEVA321’以及phaC61-3序列信息，利用Snapgene软件设计引物，引物序列如下：
phaC61-3-F(SEQ ID No.38)：
GAGGAGAAATACTAGATGAGCAACAAAAACAGCGACGACCTG
phaC61-3-R(SEQ ID No.39)：
CTCTTCCCACTCCATAAAAGTTATCTCCTCCCTATCCTGTCTTGTTAAATTTAGCGTTCATGAACATAGGTGCCCGG
pSEVA321’-F2(SEQ ID No.40):
GTTCATGAACGCTAAATTTAACAAGACAGGATAGGGAGGAGATAACTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGAAACT
pSEVA321’-R2(SEQ ID No.41):
GTTTTTGTTGCTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAA
3)根据表达载体pSEVA321’以及phaC4AK4序列信息，利用Snapgene软件设计引物，引物序列如下：
phaC4AK4-F(SEQ ID No.42)：GAGGAGAAATACTAGATGAGCCAACCATCTTATGGC
phaC4AK4-R(SEQ ID No.43)：
CTCTTCCCACTCCATAAAAGTTATCTCCTCCCTATCCTGTCTTGTTAAATTCATGCGGCGTCCTC
pSEVA321’-F3(SEQ ID No.44):
GAGGACGCCGCATGAATTTAACAAGACAGGATAGGGAGGAGATAACTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGAAACT
pSEVA321’-R3(SEQ ID No.45):
AGATGGTTGGCTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAA
4)根据表达载体pSEVA321’以及phaCAR序列信息，利用Snapgene软件设计引物，引物序列如下：
phaCAR-F(SEQ ID No.42)：
GAGGAGAAATACTAGATGAGCCAACCATCTTATGGCC
phaCAR-R(SEQ ID No.46)：
CTCTTCCCACTCCATAAAAGTTATCTCCTCCCTATCCTGTCTTGTTAAATTCATGCCTTGGCTTTGACGTAT
pSEVA321’-F4(SEQ ID No.47):
AAAGCCAAGGCATGAATTTAACAAGACAGGATAGGGAGGAGATAACTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGAAACT
pSEVA321’-R4(SEQ ID No.45):
AGATGGTTGGCTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAA
分别以上述的载体与基因片段为模板，表达载体骨架及相关基因的序列片段PCR扩增具体加入量同实施例1中表1。
(2)重组质粒的连接：将上述(1)中的载体及得到的基因片段连接构建重组成为一个新质粒，通过Gibson Assembly Master Mix(购自New England Biolabs)进行连接，具体加入量同实施例1中的表2。
(3)将连接产物依次分别导入到大肠杆菌DH5α和大肠杆菌S17-1中，并最终将质粒接合进入嗜盐菌Halomonas sp.LY01中(具体操作流程同实施例2)。
(4)对导入不同质粒的嗜盐菌Halomonas sp.LY01进行发酵：培养体系为50MM，具体操作同实施例1。
(5)发酵结果如下：
表6、不同PHA聚合酶下的发酵结果
PHA聚合酶也会一定程度上增大P(3HB-co-6HHx)的含量及6HHx的比例；尤其是在嗜盐菌Halomonas sp.LY01内导入质粒pSEVA321’-phaCAR(p321-MmP1-orfz-lactonase-phaCAR)可使P(3HB-co-6HHx)的含量明显增加，含量可达到65wt％，且6HHx单体含量可达到10.9wt％。
实施例4：发酵生产不同单体比例的P(3HB-co-6HHx)
在实施例3中，嗜盐菌Halomonas sp.LY01含质粒pSEVA321’-phaCAR(p321-MmP1-orfz-lactonase-phaCAR)以葡萄糖和ε-己内酯为原料可以得到材料P(3HB-co-6HHx)，通过调节不同碳源比例，得到不同6HHx单体比例。
(1)种子液制备：具体操作步骤同实施例1。
(2)发酵液准备：培养体系50MM和60LB，其余组分加入量同实施例1。
碳源比例混合如表7所示：
表7、不同碳源比例添加量
| 实验序号 | 培养体系 | 葡萄糖(g/L) | ε-己内酯(g/L) |
| 3-1 | 50MM | 30 | 1 |
| 3-2 | 50MM | 30 | 2.5 |
| 3-3 | 50MM | 30 | 5 |
| 3-4 | 50MM | 15 | 1 |
| 3-5 | 50MM | 15 | 2.5 |
| 3-6 | 50MM | 15 | 5 |
| 3-7 | 60LB | 0 | 1 |
| 3-8 | 60LB | 0 | 2.5 |
| 3-9 | 60LB | 0 | 5 |
(3)细胞干重、OD600和P(3HB-co-6HHx)含量测定：细胞干重、OD600和P(3HB-co-6HHx)含量测定同实施例1。
(4)发酵结果：发酵结果如表8所示。
表8、不同碳源比例添加量的发酵结果
数据表明，当葡萄糖含量固定时，ε-己内酯含量增加，6HHx单体含量增加；当ε-己内酯含量固定时，葡萄糖含量减少，6HHx单体含量增加；当只添加ε-己内酯时，只产含6HHx单体的PHA，且6HHx单体比例最高为18.977wt％。
(5)含有6HHx1HNMR图。图3含有6HHx的1HNMR图。
实施例5：环己烷为原料发酵生产P(3HB-co-6HHx)
ε-己内酯可以通过环己烷经过图4的过程生成，因此可以将这些基因构建在同一个质粒上，并将此质粒与pSEVA321’-phaCAR同时接合到嗜盐菌Halomonas sp.LY01中，实现以葡萄糖和环己烷为原料的P(3HB-co-6HHx)的生产。
图4中的合成步骤①中所需要的酶为细胞色素P450单加氧酶(P450)，有不同的来源，其中应用广泛是来自菌株Acidovorax sp.CHX100(Karande R,Debor L,Salamanca D,Bogdahn F,Engesser KH,Buehler K,Schmid A.Continuous cyclohexane oxidation tocyclohexanol using a novel cytochrome P450 monooxygenase from Acidovoraxsp.CHX100 in recombinant P.taiwanensis VLB120 biofilms.BiotechnolBioeng.2016Jan；113(1):52-61.doi:10.1002/bit.25696.Epub 2015Sep 18.PMID:26153144.)和Bacillus megaterium(Yu HL,Li T,Chen FF,Luo XJ,Li A,Yang C,ZhengGW,Xu JH.Bioamination of alkane with ammonium by an artificially designedmultienzyme cascade.Metab Eng.2018May；47:184-189.doi:10.1016/j.ymben.2018.02.009.Epub 2018Feb 22.PMID:29477859.)；合成步骤②中所需要的酶为醇脱氢酶(ADH1)，广泛来源于Lactobacillus brevis ATCC 14869(C,/>W,Sattler JH,Kroutil W,Lavandera I,Gotor V.Steric vs.electronic effects in theLactobacillus brevis ADH-catalyzed bioreduction of ketones.Org BiomolChem.2014Jan 28；12(4):673-81.doi:10.1039/c3ob42057d.PMID:24302226.)和Acidovorax sp.CHX100(Salamanca D,Bühler K,Engesser KH,Schmid A,KarandeR.Whole-cell biocatalysis using the Acidovorax sp.CHX100Δ6HX for theproduction ofω-hydroxycarboxylic acids from cycloalkanes.NBiotechnol.2021Jan 25；60:200-206.doi:10.1016/j.nbt.2020.10.009.Epub 2020Oct27.PMID:33127412.)；合成步骤③中所需要的酶为Baeyer-Villig单加氧酶(BVMO)，广泛来源于Acinetobacter sp.NCIMB9871(Opperman DJ,Reetz MT.Towards practical Baeyer-Villiger-monooxygenases:design of cyclohexanone monooxygenase mutants withenhanced oxidative stability.Chembiochem.2010Dec 10；11(18):2589-96.doi:10.1002/cbic.201000464.PMID:21080396.)和Acidovorax sp.CHX100(Salamanca D,Bühler K,Engesser KH,Schmid A,Karande R.Whole-cell biocatalysis using theAcidovorax sp.CHX100Δ6HX for the production ofω-hydroxycarboxylic acidsfrom cycloalkanes.N Biotechnol.2021Jan 25；60:200-206.doi:10.1016/j.nbt.2020.10.009.Epub 2020Oct 27.PMID:33127412.)。下面主要是引用来自Acidovorax sp.CHX100菌株的P450酶，来自Lactobacillus brevis ATCC 14869菌株的ADH1酶，来自Acinetobacter sp.NCIMB9871的BVMO酶进行质粒构建。
(1)质粒构建
表达载体pSEVA341骨架(质粒上面抗生素的抗性表现为Kan和Spe)及P450、ADH1、BVMO基因的序列进行PCR扩增。
表达载体pSEVA341骨架及P450、ADH1、BVMO序列信息，利用Snapgene软件进行设计引物。引物序列如下：
pSEVA341-MmP1-F1(SEQ ID No.48):
CCTGCCAATGCCTAAAAGCTTGCGGCCGCG
pSEVA341-MmP1-R1(SEQ ID No.49):
AGCAGTCTGAGTCATAATTCGCGCGGCTTAGG
P450基因(细胞色素P450单加氧酶)其引物序列为：
P450-F(SEQ ID No.50):
TAAGCCGCGCGAATTATGACTCAGACTGCTGCGGC
P450-R(SEQ ID No.51):
CTCATACCTCCACTATCAGTGCTGCCCTTGCGG
ADH1(醇脱氢酶)的引物序列：
ADH1-F(SEQ ID No.52):
CAAGGGCAGCACTGATAGTGGAGGTATGAGCAATC
ADH1-R(SEQ ID No.53):
GTGAATTTATTCAAATTACTGTGCGGTATAACCA
BVMO(环己酮单加氧酶)的引物序列：
BVMO-F(SEQ ID No.54):
TATACCGCACAGTAATTTGAATAAATTCACATGTCGTAATGG
BVMO-R(SEQ ID No.55):
CGCGGCCGCAAGCTTTTAGGCATTGGCAGGTTG
分别以上述的载体与基因片段为模板，具体加入量同实施例1中表1。
(2)重组质粒的连接
将上述(1)中得到的载体及基因片段连接构建重组成为一个新质粒，通过GibsonAssembly Master Mix(购自New England Biolabs)进行连接，具体加入量同实施例1中的表2。
(3)将连接产物依次分别导入到大肠杆菌DH5α和大肠杆菌S17-1中，并最终将质粒接合进入重组嗜盐菌Halomonas sp.LY01(pSEVA321’-phaCAR)中(具体操作流程同实施例1，抗生素需要相应改变)。
(4)对导入不同质粒的嗜盐菌Halomonas sp.LY01进行发酵
培养体系为50MM，以葡萄糖和环己烷为碳源，且环己烷的添加量为5g/L，其余成分及浓度同实施例1，具体操作同实施例1。
(5)发酵结果如下：
表9、接合不同质粒的重组嗜盐菌在环己烷为碳源的条件下的发酵结果
当重组嗜盐菌Halomonas sp.LY01(pSEVA321-phaCAR)没有导入质粒pSEVA341-P450-ADH1-BVMO时，对于原料环己烷的利用率很低，并且细胞的生长状况较差；当导入pSEVA341-P450-ADH1-BVMO质粒后，能够产生约10wt％的6HHx单体。
实施例6：己二醇为原料发酵生产P(3HB-co-6HHx)
己二醇可以通过图5过程变成6-羟基己酸，这个通路便绕过ε-己内酯开环反应。可将这条路径中的关键基因构建一个新质粒，最终接合到嗜盐菌Halomonas sp.LY01中，实现以葡萄糖和己二醇为原料的P(3HB-co-6HHx)的生产。
图5中合成步骤①所需要的酶(dhaT)是醇脱氢酶主要来自Pseudomonas putidaKT2440，合成步骤②所需要的酶(aldD)是醛脱氢酶来自Pseudomonas putida KT2440，E.coli，Klebsiella pneumoniae。下面将引用来自Pseudomonas putida KT2440的dhaT酶(NCBI登记号：AAN68411.1)和aldD酶(NCBI登记号：AAN66172.1)。
(1)质粒构建
表达载体选择pSEVA321骨架，选择组成型Proin启动子，并直接引用来自文献(Zhang L,Ye JW,Zhang X,Huang W,Zhang Z,Lin Y,Zhang G,Wu F,Wang Z,Wu Q,ChenGQ.Effective production of Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)byengineered Halomonas bluephagenesis grown on glucose and 1,4-Butanediol.Bioresour Technol.2022Jul；355:127270.doi:10.1016/j.biortech.2022.127270.Epub 2022May 5.PMID:35526716.)的质粒pSEVA321-P58-aldD-dhaT，并插入orfz基因。根据表达载体pSEVA321以及orfz序列信息，利用Snapgene软件设计引物，引物序列如下：
pSEVA321-P58-F(SEQ ID No.56):
AAAAAGAGATTTTAGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGG
pSEVA321-P58-R(SEQ ID No.57):
CCTCTTTCTCTAGTATATAAACGCAGAAAGGCCCAC
orfz(6HHx-coA转移酶)的引物序列：
orfz-F’(SEQ ID No.58)：
CTTTCTGCGTTTATATACTAGAGAAAGAGGAGAAATAC
orfz-R’(SEQ ID No.59)：
GGGCTTTGTTAGCAGCTAAAATCTCTTTTTAAATTCATTCATTAAT
(2)重组质粒的连接
将上述(1)中得到的载体及基因连接构建重组成为一个新质粒，通过GibsonAssembly Master Mix(购自New England Biolabs)进行连接，具体加入量同实施例1中的表2。
(3)将连接产物依次分别导入到大肠杆菌DH5α和大肠杆菌S17-1中，并最终将质粒接合进入嗜盐菌Halomonas sp.LY01中(具体操作流程同实施例1)。
(4)对导入不同质粒的嗜盐菌Halomonas sp.LY01进行发酵
培养体系为50MM，原料采用己二醇和葡萄糖，且己二醇的添加量为5g/L，其余成分、用量及具体操作同实施例1。
(5)发酵结果如下：
表10、己二醇和葡萄糖为原料的发酵结果
通过接合质粒pSEVA321-P58-dhaT-aldD-orfz的发酵结果，可看出，己二醇为原料可以生产P(3HB-co-6HHx)，并且6HHx单体含量受培养体系的影响。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.重组嗜盐菌，其特征在于，其包含以6-羟基己酸和葡萄糖为原料生产聚羟基脂肪酸酯的代谢路径，所述聚羟基脂肪酸酯的结构如下式所示：
m和n均为正整数；
所述重组嗜盐菌表达外源的6HHx-coA转移酶基因，所述6HHx-coA转移酶基因选自orfz基因、alkK基因、prpE基因、pct540基因、hadA基因或者其组合；
还包含以ε-己内酯为原料生产6-羟基己酸的代谢路径；
所述重组嗜盐菌表达外源的lactonase基因。
2.根据权利要求1所述的重组嗜盐菌，其特征在于，其还包含以环己烷为原料生产ε-己内酯的代谢路径。
3.根据权利要求2所述的重组嗜盐菌，其特征在于，其表达外源的p450基因、ADH1基因和BVMO基因。
4.根据权利要求1所述的重组嗜盐菌，其特征在于，其还包含以己二醇为原料生产6-羟基己酸的代谢路径。
5.根据权利要求4所述的重组嗜盐菌，其特征在于，其表达外源的aldD基因和dhaT基因。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组嗜盐菌，其特征在于，其表达外源的PHA聚合酶基因。
7.根据权利要求6所述的重组嗜盐菌，其特征在于，所述PHA聚合酶基因选自phaC1437基因、phaC61-3基因、phaC4AK4基因、phaCAR基因或者其组合。
8.根据权利要求1至5和7中任一项所述的重组嗜盐菌，其特征在于，所述嗜盐菌为Halomonas TD1.0或者Halomonas sp.LY01，
所述Halomonas sp.LY01的保藏编号为GDMCC No.62635，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
9.权利要求1至8任一项所述的重组嗜盐菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在嗜盐菌中构建所述代谢路径的步骤。
10.聚羟基脂肪酸酯的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括如下步骤：对权利要求1至8任一项所述的重组嗜盐菌进行发酵，收集菌体，制备聚羟基脂肪酸酯。
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