JPWO2008090873A1 - ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）単位を含有するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産可能な微生物、該微生物を用いた３ＨＨ含有ＰＨＡの製造方法に関する。ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物において、染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子の選択的な不活性化、及びｂｋｔＢ遺伝子発現の増強をうことにより、３ＨＨ含有ＰＨＡの生産性が向上した微生物を構築することができる。そして、当該微生物を、酪酸或いは酪酸誘導体及び／又はブタノール或いはブタノール誘導体を含む炭素源を用いて培養することにより、３ＨＨ含有ＰＨＡ、特には３ＨＨを１０ｍｏｌ％以上の比率で含有するＰＨＡを高い生産性にて発酵生産することができる。

Description

本発明は、３−ヒドロキシ酪酸単位よりも炭素数の多い３−ヒロドキシアルカノエート単位を有するポリヒドロキシアルカノエート共重合体および微生物を用いて該共重合体を製造する方法に関する。

ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと記すこともある）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。これらのポリマーは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。

現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記すこともある）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記すこともある）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は１９２５年にBacillus megaterium内で最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要である。

その中で、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記すこともある）とからなる共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と記すこともある）の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。

しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）の３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系食品包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。

Ｐ（３ＨＢ）の柔軟性を高めるために、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記すこともある）からなる共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と記すこともある）及びその製造方法について研究がなされた（特許文献３、特許文献４）。これら報告におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたAeromonas caviaeの野生株を用い、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸を炭素源として発酵生産するものであった。３ＨＨ組成比はオレイン酸を炭素源としたとき１５ｍｏｌ％、パルミチン酸を炭素源としたとき５ｍｏｌ％であった。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性に関する研究もなされている（非特許文献１）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてA. caviaeを培養し、３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）については３ＨＨ組成の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の様な硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわち、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成比を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができるため、低３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を用いたテレビの筐体等のように硬さを要求されるものから、高３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を用いたフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。

しかしながら、前記製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、菌体あたりのポリマー含量３０％とポリマー生産性は低いものであったため、実用化に向けて更に高い生産性、特にポリマー含量を向上させる方法が探索されている。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業生産を目指した取組みの例として、以下の技術が挙げられる。非特許文献２では、Aeromonas hydrophilaを用い、オレイン酸を炭素源とした４３時間の流加培養を行うことにより、菌体量９５．７ｇ／Ｌ、ポリマー含量４５．２％、３ＨＨ組成比１７ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産された。また、A. hydrophilaを用いたグルコース及びラウリン酸を炭素源とした培養により、３ＨＨ組成比が１１ｍｏｌ％であり、菌体量５０ｇ／Ｌ、ポリマー含量５０％が達成された（非特許文献３）。

しかしながら、A. hydrophilaはヒトに対して病原性を有する（非特許文献４）ことから、工業生産に適した微生物とはいえない。また、これらの培養生産で用いられている炭素源は高価であるため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用も求められている。

このため、安全な宿主での生産及び生産性の向上を目指した取組みが行なわれた例として、以下の技術が挙げられる。A. caviaeよりクローニングされたポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子をCupriavidus necator（旧分類：Ralstonia eutropha或いはAlcaligenes eutrophus）に導入した形質転換体を用い、オクタン酸を炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った結果、３ＨＨ組成比は２２ｍｏｌ％であり、菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量は３３ｍｏｌ％であった（特許文献５、非特許文献５）。更に前記形質転換体を、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、３ＨＨ組成比は４〜５ｍｏｌ％であり、菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（非特許文献６）。前記製造方法は安価な植物油脂を炭素源とし、ポリマー含量も高いものの、菌体量が低いため、ポリマー生産量としてはレベルが低く、且つ３ＨＨ組成比４〜５ｍｏｌ％ではフィルム等の用途に適用できるほど柔らかいものではない。また、フラクトースを炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産できるC. necatorも構築されたが、３ＨＨ組成比は０．９〜１．６ｍｏｌ％であり、また本菌株のポリマー生産性は菌体量０．７３〜１．９１ｇ／Ｌ、ポリマー含量は３３〜６８％と低く、実生産に適しているとはいえなかった（非特許文献７）。

大腸菌を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産株も構築された。Aeromonas属細菌のＰＨＡ合成酵素遺伝子、C. necatorのＮＡＤＰＨ−アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子等を大腸菌に導入した株が構築された。ドデカンを炭素源として同大腸菌を４０．８時間培養した結果、菌体量７９ｇ／Ｌ、ポリマー含量２７．２％、３ＨＨ組成比１０．８ｍｏｌ％であった（非特許文献８）。A. caviaeのＰＨＡ合成酵素遺伝子、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子及びアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌も構築された。ラウリン酸を含む培地で該大腸菌を培養すると、菌体生産性は１ｇ／Ｌ、ポリマー含量約１６％、３ＨＨ組成比約１６ｍｏｌ％であった（非特許文献９）。これらの大腸菌では生産性は低く、工業的生産への適用は困難であった。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行なわれた（非特許文献１０）。A. caviae由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示され、また、５１８番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された変異体酵素や２１４番目のバリンがグリシンに置換された変異体酵素は大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性やポリマー含量が向上したことが報告されている。しかし、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており未だポリマー含量は約１３％と低いことから、これらの変異体酵素の特徴を活かした工業的生産に向けた更なる改良が必要であった。

また、C. necatorを宿主とし、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ ３７５３３）にポリエステル合成酵素遺伝子やＤ−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等（特許文献５参照）のＰＨＡ合成酵素発現プラスミドによる形質転換体が検討されており、本菌株の菌体量は４ｇ／Ｌと低かったが、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件改善により菌体量４５ｇ／Ｌ、ポリマー含量６２．５％、３ＨＨ組成比８．１ｍｏｌ％にまで向上した。このように、培養方法によってＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成比や生産性を改善する方法も研究された（特許文献６）。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性を制御する方法も開示されている（特許文献６）。少なくとも２種類の炭素数の異なる油脂および／または脂肪酸を炭素源として用いることによって、３ＨＨ組成比が１〜４０ｍｏｌ％のポリエステルを生産することが可能となり、種々の物性を有する（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産できるようになった。しかしながら、本製造方法では、３ＨＨ組成制御のために比較的高価なヘキサン酸、オクタン酸等を添加する必要があり、また高濃度のヘキサン酸は細胞毒性を示すことから菌体生産性が低下する結果となっている。また、多成分の炭素源を添加するため、生産設備が複雑・高価なものになる場合がある。

酪酸やブタノールの代謝に関与する遺伝子を組み込んだ大腸菌にて、グルコースと酪酸またはブタノールからＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産させた方法も開示されているが、３ＨＨ組成比は１〜３ｍｏｌ％程度と、高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産には一層の改良が必要であった（特許文献７）。

フィルムやシート、軟質系食品包装容器等への応用には３ＨＨ組成比が１０ｍｏｌ％以上であることが望まれるが、従来のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産において、３ＨＨ組成比を向上させようとすれば、ポリマー含量あるいは菌体量の低下を招くため、工業生産において望ましい７０％以上のポリマー含量且つ１００ｇ／Ｌ以上の菌体量において３ＨＨ組成比１０ｍｏｌ％以上を実現する方法はなく、一層の改良が必要であった。
特開昭５７−１５０３９３号公報 特開昭５９−２２０１９２号公報 特開平５−９３０４９号公報 特開平７−２６５０６５号公報 特開平１０−１０８６８２号公報 特開２００１−３４００７８号公報 米国特許６５９３１１６号明細書 Y. Doi, S. Kitamura, H. Abe; Macromolecules, 28, 4822-4823 (1995) Biotechnology and Bioengineering, vol.67, 240 (2000) Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.57, 50 (2001) 国立感染症研究所、病原体等安全管理規定、別表１付表１（１９９９） T. Fukui, Y. Doi; J. Bacteriol, 179, 15, 4821-4830 (1997) T.Fukui等、Appl. Microbiol. Biotecnol., 49, 333 (1998) T.Fukui等、Biomolecules, vol.3, 618 (2002) S.Park等、Biomacromolecules, vol.2, 248 (2001) X. Lu等、FEMS Microbiology Letters, vol.221, 97 (2003) T.Kichise等、Appl. Environ. Microbiol., 68, 2411-2419 (2002)

本発明は、安価で安全な炭素源を用いて、菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１００ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１０ｍｏｌ％以上のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、微生物において様々なｐｈｂＡ遺伝子の選択的な不活性化とｂｋｔＢ遺伝子発現の増強を行い、炭素源として酪酸又はブタノール、さらには酪酸又はブタノールに他の種々の炭素源を組み合わせて使用し、培養する事によって、前記微生物中に、３ＨＨ組成比率の向上したＰＨＡが生成され、蓄積できる事を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の第一は、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物において、染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子が不活性化されており、且つｂｋｔＢ構造遺伝子の上流に、該微生物内在のプロモーター及び／又は異種微生物のプロモーターが組み込まれた３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記載する）単位含有ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと記載する）を生産可能な微生物に関する。

好ましい実施態様は、組み込まれたプロモーターが、配列番号１で示されるC. necatorのｐｈｂＣＡＢオペロンのプロモーターの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする上記微生物である。より好ましくは、組み込まれたプロモーターが、配列番号１で示されるC. necatorのｐｈｂＣＡＢオペロンのプロモーターである上記微生物である。更に好ましくは、組み込まれたプロモーターが、配列番号２で示されるA. caviaeのｐｈａＰＣＪオペロンのプロモーターの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする上記微生物である。特に好ましくは、組み込まれたプロモーターが配列番号２で示されるA. caviaeのｐｈａＰＣＪオペロンのプロモーターである上記微生物である。

本発明の第二は、上記記載の微生物を用い、炭素源として酪酸及び／又はブタノールを用いることを特徴とする３ＨＨ単位含有ＰＨＡの製造方法に関する。

本発明により、安価で安全な炭素源を用いて、菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１００ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１０ｍｏｌ％以上のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産することができる。

以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明の３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨとも記す）単位含有ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡとも記す）とは、３ＨＨとともに３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢとも記す）、３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶとも記す）、３−ヒドロキシオクタン酸、或いはそれらよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸が共重合したポリエステルである。

本発明のｐｈｂＡ遺伝子とは、β−ケトチオラーゼのうち、２分子のアセチル−ＣｏＡを縮合する反応を触媒するがβ−ケトバレリル−ＣｏＡのチオリシスを殆ど触媒しないタンパク質をコードする遺伝子で、好ましくは配列番号３で示される遺伝子である。本発明のｂｋｔＢ遺伝子とは、β−ケトチオラーゼのうち、２分子のアセチル−ＣｏＡの縮合およびアセチル−ＣｏＡとそれよりも鎖長の長い例えばプロピオニル−ＣｏＡの縮合の両方をよく触媒し、且つβ−ケトバレリル−ＣｏＡのチオリシスを触媒するタンパク質をコードする遺伝子で、好ましくは配列番号４で示される遺伝子である（Slater. S.等, J. Bacteriol. vol.180, p1979 (1998)）。また、前記ＰＨＡを合成可能なポリメラーゼ遺伝子としては、A. caviaeのｐｈａＣなどが例示でき、宿主が結果としてＰＨＡを産生できればよい。

本発明において、ｂｋｔＢ遺伝子の本来のプロモーターとは、ｂｋｔＢ構造遺伝子の転写を誘発するＤＮＡ領域のことであり、宿主として用いるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物中に内在する前記領域のことである。

本発明におけるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物とは、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を有する野生株、突然変異株、或いは遺伝子操作した微生物であり、且つ、酪酸又はブタノールを資化できる微生物であれば特に制限はなく、それらを宿主として使用することができる。

具体的にはラルストニア（Ralstonia）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ワウテルシア（Wautersia）属、アエロモナス（Aeromonas）属、エシェリキア（Escherichia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、シュードモナス（Pseudomonas）属等の細菌類を使用することが好ましい。安全性及び生産性の観点からより好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属であり、さらに好ましくはカプリアビダス・ネケータ（Cupriavidus necator）である。勿論、人工的に突然変異処理して得られる変異株、遺伝子工学的手法により変異処理された菌株も使用できる。

そして、３ＨＨ組成比を高めるためには、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子が不活性化されていることが好ましい。ｐｈｂＡ遺伝子は、前記のようにアセチル−ＣｏＡ２分子の縮合によって、ＰＨＡモノマーである３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの前駆体であるアセトアセチル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する。一方、ｐｈｂＡ遺伝子はアセチル−ＣｏＡとブタノイル−ＣｏＡを縮合する反応を触媒しない（Slater. S.等, J. Bacteriol. vol.180, p1979 (1998)）。従って、ｐｈｂＡ遺伝子の不活性化はポリマー中の３ＨＢ比率を低くするため、結果として３ＨＨ比率が向上すると考えられる。

ｐｈｂＡ遺伝子を不活性化する方法は、結果としてｐｈｂＡタンパク質が不活性化されていればよく、リボソーム結合部位やｐｈｂＡ構造遺伝子内部に変異を導入する方法や、ＲＮＡ干渉を利用する方法、トランスポゾンの挿入やｐｈｂＡ構造遺伝子が完全に欠失されていてもよい。これらの方法は当業者に周知である。

また、３ＨＨ組成比を高めるためには、ｂｋｔＢ遺伝子産物の活性を増強することが好ましい。ｂｋｔＢ遺伝子産物は、アセチル−ＣｏＡ２分子の縮合だけではなく、アセチル−ＣｏＡとブタノイル−ＣｏＡを縮合する反応も触媒する。アセチル−ＣｏＡとブタノイル−ＣｏＡが縮合すると、ＰＨＡの構成モノマーである３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの前駆体である３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡが生じる。ｂｋｔＢ遺伝子産物の活性は、アセチル−ＣｏＡ２分子の縮合反応に対してよりもアセチル−ＣｏＡとブタノイル−ＣｏＡの縮合反応に対しての方が高いからである。ｂｋｔＢ遺伝子産物の活性を増強する方法は特に限定されないが、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の染色体上にある該遺伝子のプロモーターを改変して転写活性を上げることが好ましく、例えば、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物に内在しているｂｋｔＢ構造遺伝子の上流に、さらにｂｋｔＢ構造遺伝子の転写を誘発するプロモーターが組み込まれていると転写活性が上がる。

ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発するプロモーターは、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流に挿入されることが好ましい。また該プロモーターは、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物内在のプロモーター及び異種微生物のプロモーターであることが好ましく、配列番号１で示されるC. necatorのｐｈｂＣＡＢオペロンのプロモーターの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、配列番号２で示されるA. caviaeのｐｈａＰＣＪオペロンのプロモーターの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがより好ましい。前記方法は、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物としてC. necatorを用いる場合に好適である。

ここで、「配列番号１，２に示したプロモーターの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号１，２に示した塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発するプロモーター機能を有するＤＮＡを意味する。

前記ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。

ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。

以上のようにハイブリダイゼーション条件を例示したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。

上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１，２に示される塩基配列と、配列同一性が７０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡをあげることができ、ｂｋｔＢ構造遺伝子の転写を誘発する限り、上記ＤＮＡに包含される。

前記「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：GCG Wisconsin Package（Program Manual for The Wisconsin Package, Version8, 1994年9月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Medison, Wisconsin, USA 53711; Rice, P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England）、及び、the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー（Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland）。

本発明において、３ＨＨ含有ＰＨＡの生産に用い得る炭素源としては、酪酸或いはその誘導体及び／又はブタノール或いはその誘導体の添加を必須とし、好ましくは酪酸及び／又はブタノールである。酪酸又はブタノール以外に用いることができる炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース等の糖類やメタノール、エタノールなどブタノール以外のアルコール類、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸などの脂肪酸類、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体、乳酸、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油、パーム核油オレイン（以下、ＰＫＯＯとも記載する）等が挙げられる。

培養する際の酪酸及び／又はブタノールの添加量としては、菌株が増殖し、ポリエステルを合成できる範囲であれば全く問題無いが、酪酸、ブタノール以外の炭素源１００重量部に対して好ましくは５重量部〜４０重量部である。酪酸及び／又はブタノールの添加量が５重量部より少ないと、ＰＨＡ中の３ＨＨ組成比率が上がらない場合があり、４０重量部よりも多いと菌株が増殖しなくなる場合がある。本発明においては、微生物細胞内の脂肪酸代謝経路であるβ酸化反応によって酪酸又はブタノールから生産されたアセチル−ＣｏＡと、同じく酪酸又はブタノールがβ酸化反応により代謝されて生産されたブタノイル−ＣｏＡから、３−ヒロドキシヘキサノイル−ＣｏＡを生産し、それをＰＨＡへと変換する事によってＰＨＡが産生されると考えられる。

本発明において、宿主に用いるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の野生株が３−ヒロドキシヘキサノイル−ＣｏＡを殆どＰＨＡへと変換させる事ができない場合、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素を発現する遺伝子を染色体上へ挿入するか、或いはプラスミドベクターなどを導入する事で細胞内にて合成された３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡをＰＨＡへと変換する効率を向上させる必要がある。例えば、宿主としてC. necatorを使用する場合、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素を発現する遺伝子として、A. caviaeのｐｈａＣ遺伝子を導入することが好ましい。

本発明の３ＨＨ含有ＰＨＡを生産可能な微生物の作製方法は、特に限定されないが、C. necatorを宿主として以下に例示する。A. caviae由来で３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素を発現するポリエステル合成酵素変異体遺伝子を染色体上に相同組換え法などで導入する。そして、遺伝子破壊法を用いて、染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子を不活性化する。そして染色体上に存在するｂｋｔＢ遺伝子のプロモーターを改変するが、その態様は染色体上に本来存在するｂｋｔＢ遺伝子の転写活性が上がればどのような方法でも良い。例えば、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流に異種のプロモーター及びリボソーム結合部位を含むＤＮＡを挿入してもよいし、ｂｋｔＢ遺伝子の本来のプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を異種のプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を含むＤＮＡに置換する方法でもよい。本来のプロモーターは染色体上からすべて失われていてもよいし、一部が存在していてもよい。

前記ｂｋｔＢ遺伝子のプロモーターの改変において、染色体上に任意のＤＮＡを部位特異的に挿入／置換する方法は当業者に周知であり、代表的な方法としては以下の方法が挙げられる：
トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ohman等、J. Bacteriol., vol.162, p1068 (1985)）、
相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Noti等、Methods in Enzymol., vol.154, p197 (1987)）、
Bacillus subtilis由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Schweizer, Mol. Microbiol., vol.6, p1195 (1992)、Lenz等、J. Bacteriol., vol.176, p4385 (1994)）。
染色体上に任意のＤＮＡを挿入／置換出来ればその方法は特に制限されない。

以下に、C. necatorのｂｋｔＢ遺伝子開始コドンの上流にA. caviaeのｐｈａＣ遺伝子のプロモーター及びリボソーム結合部位を含むＤＮＡを挿入する場合の方法を、より具体的に例示する。

まず、置換フラグメントを作製する。置換フラグメントはｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流の配列にA. caviaeのｐｈａＣ遺伝子（以下、ｐｈａＣとも記す）のプロモーター及びリボソーム結合部位を含む配列がつながり、その後にｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン以降の下流配列がつながった塩基配列からなるＤＮＡとする。すなわち、該構造遺伝子の開始コドンの直前にｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された形式のＤＮＡフラグメントである。ｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含むＤＮＡを挟んで存在する上流のＤＮＡの塩基配列と下流のＤＮＡの塩基配列は染色体上のＤＮＡと相同組換えを起こすために必要な相同配列であって、一般的にはその長さが長いほど組換え頻度は高くなるが、相同組換えさえ起こればよく、その長さは任意に設定できる。

置換フラグメントには、遺伝子置換の際に選択マーカーとなる遺伝子を付加することができる。選択マーカーとなる遺伝子は、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相補する遺伝子等が使用できる。C. necatorを宿主とする場合にはカナマイシンの耐性遺伝子が好適である。

さらにそれらに加えて、第二段階の相同組換えによって選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した微生物株の選択を容易にするための遺伝子が付加できる。そのような遺伝子としてはBacillus subtilis由来のｓａｃＢ遺伝子が例示できる。この遺伝子が発現している微生物はシュークロースを含む培地で生育できないことが知られており、シュークロースを含む培地での生育によりこの遺伝子を脱落した株を選択することが容易となる。

これらで構成された置換フラグメントは、宿主微生物中で自律複製しないベクターに接続することによって遺伝子置換用のプラスミドとして作製される。カプリアビダス属細菌やシュードモナス属細菌等で利用できるこのようなプラスミドベクターには、例えばｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、或いはそれらと同じ複製起点を持つベクター等が挙げられる。さらには、導入効率の良い接合伝達での導入を可能にするｍｏｂ、ｏｒｉＴなどのＤＮＡを共存させることも可能である。

このような構成で作製されたＤＮＡ置換用のプラスミドＤＮＡは、エレクトロポレーション法や接合伝達法など公知の方法によりC. necatorに導入することができ、相同組換えを行うことができる。

次に相同組換えによって染色体上にＤＮＡ置換用のプラスミドＤＮＡが挿入された株の選択を行う。挿入株の選択は、ＤＮＡ置換用プラスミドＤＮＡに共存させた選択用の遺伝子に基づいた方法によって行うことができる。カナマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、カナマイシンを含む培地で生育してきた株から選ぶことができる。

次の段階で、第二の相同組換えによって染色体上から選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を選択する。挿入時に利用した選択用の遺伝子に基づいて、例えばカナマイシンを含む培地で生育できなくなった株を選択してもよいが、ｓａｃＢ遺伝子をＤＮＡ置換用プラスミドに共存させている場合は、シュークロースを含む培地で生育してくる株から容易に選択できる。このようにして得られた株が、所望するようにＤＮＡが置換された株かどうか確認するには、ＰＣＲ法やサザン・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡ塩基配列の決定など、公知の方法が使用できる。

以上のようにして、C. necatorの染色体上にあるｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流にA. caviaeのｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された株を取得することができる。

前記で作製した微生物を用いて３ＨＨ含有ＰＨＡを製造する方法について説明する。その方法は特に限定されないが、以下のようにして行う事ができる。本発明のＰＨＡの生産においては、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。

炭素源としては、酪酸及び／又はブタノールを使用することが好ましく、酪酸及び／又はブタノール以外の炭素源である油脂などを含む方がより好ましく、炭素源を与える際には、酪酸及び／又はブタノールと油脂とを混合した混合物を添加するか、又は、酪酸及び／又はブタノールと油脂を別々に添加することが好ましい。

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。

そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ1、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、培養液中に、発現プラスミドに存在する薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。

本発明において、菌体からの３ＨＨ含有ＰＨＡの回収は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。

培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いて３ＨＨ含有ＰＨＡを抽出する。この３ＨＨ含有ＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えて３ＨＨ含有ＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させて３ＨＨ含有ＰＨＡを回収する。

得られた３ＨＨ含有ＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ組成(ｍｏｌ％)の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。また本発明により、より柔軟なＰＨＡを作製する為には３ＨＨ組成比が高い方が好ましく、ＰＨＡを加工する観点から見ると、８ｍｏｌ％以上が好ましく、更に好ましくは９ｍｏｌ％以上、１０ｍｏｌ％以上の組成比であれば最も好ましい。また、ＰＨＡの生産性の観点から見ると、菌体量は１００ｇ／Ｌ以上、ポリマー含量は７０％以上であることが好ましい。

本発明で得られる柔軟性の高いＰＨＡは、フィルムやシート、軟質系食品包装容器などに好適に用いられる。

以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。

（実施例１） ＫＮＫ００５株の作製
先ず、ＤＮＡ置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。Cupriavidus necator Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、配列番号５と配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（ｐｈａＣＲｅ）の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で３分、を２５サイクル繰り返し、（３）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を同酵素で切断した部位にサブクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ）。

Aeromonas caviae由来のポリエステル合成酵素変異体遺伝子であるＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体は、次のように作成した。まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ社製）をＰｓｔＩ処理し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて平滑末端化しライゲーションすることによりＰｓｔＩサイトを欠失したプラスミドｐＢｌｕｅ−Ｎｅｗを作成した。このプラスミドのＥｃｏＲＩサイトにｐＪＲＤ２１５−ＥＥ３２ｄ１３（Fukui等、J. Bacteriol., vol.179, p4821 (1997)）より同酵素で切り出したｄ１３断片をクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｄ１３）。

次に、クローンＥ２−５０由来のプラスミド（非特許文献１０）をテンプレートとし、配列番号７と８に記載のプライマーのセット及び配列番号９と１０に記載のプライマーのセットを用いてそれぞれＰＣＲ法により増幅、２断片を得た。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分、を２５サイクル繰り返し、（３）７２℃で５分である。

増幅された２断片を等モル混合し再びＰＣＲ反応を行い、２断片を結合させた。その条件は（１）９６℃で５分、（２）９５℃で２分、７２℃で１分を１２サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ製）を用いた。目的サイズのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動ゲルより切り出しＰｓｔＩとＸｈｏＩで処理し、同酵素で処理したｐＢｌｕｅ−ｄ１３に断片を入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。

塩基配列決定を，ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ＰＨＡ合成酵素の１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンがセリンに、１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換された変異遺伝子であることを確認した。

ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇをテンプレートとして配列番号１１と配列番号１２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体の構造遺伝子ＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で２分、を２５サイクル繰り返し、（３）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。次に、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅを制限酵素ＳｂｆＩとＣｓｐ４５Ｉで処理し、同酵素で処理した上記増幅ＤＮＡ断片をｐｈａＣＲｅ構造遺伝子と入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。

次に、プラスミドｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）を制限酵素ＸｈｏＩとＤｒａＩで処理してカナマイシン耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離後、ＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ製）を用いて末端を平滑化し、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇを制限酵素ＳａｌＩで切断後同様に平滑末端化した部位に挿入した（ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｋｍ）。

続いて、プラスミドｐＭＴ５０７１（Ｔｓｕｄａ、ＧＥＮＥ，２０７：３３−４１（１９９８））制限酵素ＮｏｔＩで処理してｓａｃＢ遺伝子を含む約８ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離し、ｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｋｍを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣを作製した。

次に、遺伝子置換株の作製を行った。遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ｐｈａＣＲｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換し、C. nacator Ｈ１６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。

２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（くえん酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがC. nacator Ｈ１６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択してプラスミドが脱落した株を取得した。

さらにＰＣＲによる解析によりｐｈａＣＲｅ遺伝子がＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子に置換された菌株を単離した。この遺伝子置換株をＫＮＫ００５株と命名し、塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、染色体上のｐｈａＣＲｅ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでがＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子の開始コドンから終止コドンまでに置換された株であることを確認した。

（実施例２） ＡＳ株の作製
＜β−ケトチオラーゼ遺伝子の破壊用プラスミドの作製＞
プラスミドｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）をテンプレートとし、配列番号１３と配列番号１４で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約１．２ｋｂｐのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。次にｐＭＴ５０７１を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、同酵素で処理した上記ＤＮＡ断片をクロラムフェニコール耐性遺伝子と入れ替える形でクローニングした（ｐＳＡＣＫｍ）。

ＫＮＫ００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１５と配列番号１６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約１．１ｋｂｐのβ−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈｂＡ）を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を同酵素で切断した部位にサブクローニングした。配列番号１７で示される変異プライマーを用い、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ製）を利用して開始コドンから１６残基目のアミノ酸が終止コドンとなり、同時に制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生じるような塩基置換を行った。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ｐＳＡＣＫｍを同酵素で切断して調製した約５．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を（ｏｒｉＴ＋ＫｍＲ＋ｓａｃＢＲ）を挿入して染色体置換用ベクター（ｐＢｌｕｅＡＳＲＵ）とした。

＜染色体置換＞
実施例１のＤＮＡ置換株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ００５株を親株としてｐＢｌｕｅＡＳＲＵを用いて染色体置換株ＡＳ株を作製した。ＡＳ株のＤＮＡ塩基配列を解析して、β−ケトチオラーゼ遺伝子がｐＢｌｕｅＡＳＲＵの相同配列部分と置き換わって終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成していることを確認した。

（実施例３） Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製
＜ＤＮＡ挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡを次のように作製した。A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１８および配列番号１９で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＥｃｏＲＩ消化した（ＰＡｃ−５Ｐ＋Ｅｃｏ）。

次に、ＤＮＡ挿入部位をＡＳ株のｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン直前とし、以下の手順でまず該構造遺伝子の開始コドンより上流側のＤＮＡを作製した。

ＫＮＫ００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２０および配列番号２１で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンより上流側のＤＮＡを得た。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで同時消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏとした。

ＰＡｃ−５Ｐ＋ＥｃｏおよびＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２０および配列番号１９で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で５０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した（ｂＰａｃ−５Ｐ＋Ｂａｍ）。

次に、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンより下流側のＤＮＡを作製した。ＫＮＫ００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２２および配列番号２３で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンより下流側のＤＮＡを得た。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。

ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。ｂＰａｃ−５Ｐ＋ＢａｍとＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２０および配列番号２３で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。

ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−） （ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした（ｂＡＯ／ｐＢｌｕ）。塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、テンプレートとしたＤＮＡ部分の塩基配列と同一であることを確認した。

続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ｂＡＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。

＜ＤＮＡ挿入株Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
実施例１のＤＮＡ置換株の作製方法と同様にして、ＡＳ株を親株としてｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された株であることを確認した。

（実施例４） Ｐｒｅ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製
＜ＤＮＡ挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてC. necatorのｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡ（以下Ｐｒｅと略記する）を次のように作製した。ＫＮＫ００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号２４および配列番号２５で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）５４℃で３０秒、（４）６８℃で２５秒、（２）から（４）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化した。（Ｐｒｅ−５Ｐ）。

次に、ＤＮＡ挿入位置をC. necator ＡＳ株のｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン直前とし、以下の手順でまず該構造遺伝子の開始コドンより下流側のＤＮＡを作製した。

ＫＮＫ００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２２および配列番号２３で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンより下流側のＤＮＡを得た。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）６４℃で３０秒、（４）６８℃で３０秒、（２）から（４）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。

Ｐｒｅ−５ＰおよびＯＲＦ−５Ｐ−Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２４および配列番号２３で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）５４℃で３０秒、（４）６８℃で５０秒、（２）から（４）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した（ＰＲＯ−５Ｐ＋Ｃｌａ）。

次に、ｂｋｔＢ造遺伝子の開始コドンより上流側のＤＮＡを作製した。ＫＮＫ００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２０および配列番号２６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンより上流側のＤＮＡを得た。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）５８℃で３０秒、（４）６８℃で２０秒、（２）から（４）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−５Ｐ＋Ｂａｍとした。

ＰｂｋｔＢ−５Ｐ＋ＢａｍとＲＰＯ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２０および配列番号２３で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）６０℃で３０秒、（４）６８℃で１分３０秒、（２）から（４）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−） （ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした（ｂＲＯ／ｐＢｌｕ）。

塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、テンプレートとしたＤＮＡ部分の塩基配列と同一であることを確認した。

続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ｂＲＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＲＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。

＜ＤＮＡ挿入株Ｐｒｅ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
実施例１のＤＮＡ置換株の作製方法と同様にして、ＡＳ株を親株としてｂＲＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの直前にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＰｒｅ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの直前にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された株であることを確認した。

（実施例５） ＢＡＢ３／ＡＳ株の作製
＜ＤＮＡ挿入用プラスミドベクターの作製＞
ＤＮＡ挿入部位を実施例２で作製したＡＳ株のｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側−９１塩基目と−９２塩基目の間、即ちｂｋｔＢ構造遺伝子の直前に存在するＯＲＦの停止コドン直後とし、挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡを次のように作製した。

A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号２９および配列番号３０で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した（ＰＡｃ−Ｍｕｎ／３）。

また以下の手順で挿入部位より上流側のＤＮＡを作製した。

ＫＮＫ００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２７および配列番号２８で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の上流側ＯＲＦを得た。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をｍｉａＢ−Ｍｕｎ／３とした。

ＰＡｃ−Ｍｕｎ／３およびｍｉａＢ−Ｍｕｎ／３をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２７および配列番号３０で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した（ＢＡＢ３−Ｂａｍ＋Ｃｌａ）。

このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−） （ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした（ＢＡＢ３／ｐＢｌｕ）。塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、所望の塩基配列であることを確認した。

続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＢＡＢ３／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ３／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。

＜ＤＮＡ挿入株ＢＡＢ３／ＡＳ株の作製＞
実施例１のＤＮＡ置換株の作製方法と同様にして、ＡＳ株を親株としてＢＡＢ３／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ３／ＡＳ株と命名し、塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側−９１塩基目と−９２塩基目の間にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された株であることを確認した。

（実施例６） ＢＡＢ４／ＡＳ株の作製
＜ＤＮＡ挿入用プラスミドベクターの作製＞
ＤＮＡ挿入部位を実施例２で作製したＡＳ株のｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側−６５塩基目と−６６塩基目の間、即ちｂｋｔＢ構造遺伝子の直前に存在するＯＲＦの停止コドンから２６塩基下流とし、挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡを次のように作製した。

A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号３１および配列番号３２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した（ＰＡｃ−Ｍｕｎ／４）。

ＰＡｃ−Ｍｕｎ／４および実施例４で調製したｍｉａＢ−Ｍｕｎ／３をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２７および配列番号３２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した（ＢＡＢ４−Ｂａｍ＋Ｃｌａ）。

このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−） （ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした（ＢＡＢ４／ｐＢｌｕ）。塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、所望の塩基配列であることを確認した。

続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＢＡＢ４／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ４／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。

＜ＤＮＡ挿入株ＢＡＢ４／ＡＳ株の作製＞
実施例１のＤＮＡ置換株の作製方法と同様にして、ＡＳ株を親株としてＢＡＢ４／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ４／ＡＳ株と命名し、塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側−６５塩基目と−６６塩基目の間にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された株であることを確認した。

（実施例７） ＢＡＢ５／ＡＳ株の作製
＜ＤＮＡ挿入用プラスミドベクターの作製＞
遺伝子挿入部位を実施例２で作製したＡＳ株のｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側−５８塩基目と−５９塩基目の間、即ちｂｋｔＢ構造遺伝子の直前に存在するＯＲＦの停止コドンから３３塩基下流とし、挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡを次のように作製した。

A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号３３および配列番号３４で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した（ＰＡｃ−Ｍｕｎ／５）。

ＰＡｃ−Ｍｕｎ／５および実施例４で調製したｍｉａＢ−Ｍｕｎ／３をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２７および配列番号３４で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した（ＢＡＢ５−Ｂａｍ＋Ｃｌａ）。

このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−） （ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした（ＢＡＢ５／ｐＢｌｕ）。塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、所望の塩基配列であることを確認した。

続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＢＡＢ５／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。

＜ＤＮＡ挿入株ＢＡＢ５／ＡＳ株の作製＞
実施例１のＤＮＡ置換株の作製方法と同様にして、ＡＳ株を親株としてＢＡＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ５／ＡＳ株と命名し、塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側−５８塩基目と−５９塩基目の間にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された株であることを確認した。

（実施例８） ＢＲＢ５／ＡＳ株の作製
＜ＤＮＡ挿入用プラスミドベクターの作製＞
ＤＮＡ挿入部位を実施例２で作製したＡＳ株のｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側−５８塩基目と−５９塩基目の間、即ちｂｋｔＢ構造遺伝子の直前に存在するＯＲＦの停止コドンから３３塩基下流とし、挿入用ＤＮＡとしてC. necatorのｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡを次のように作製した。

C. necatorのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号３５および配列番号３６で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した（ＰＲｅ−Ｍｕｎ／５）。

ＰＲｅ−Ｍｕｎ／５および実施例４で調製したｍｉａＢ−Ｍｕｎ／３をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２７および配列番号３６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した（ＢＲＢ５−Ｂａｍ＋Ｃｌａ）。

このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−） （ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした（ＢＲＢ５／ｐＢｌｕ）。塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、所望の塩基配列であることを確認した。

続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＢＲＢ５／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＲＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。

＜ＤＮＡ挿入株ＢＲＢ５／ＡＳ株の作製＞
実施例１のＤＮＡ置換株の作製方法と同様にして、ＡＳ株を親株としてＢＡＲ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＲＢ５／ＡＳ株と命名し、塩基配列決定を、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側−５８塩基目と−５９塩基目の間にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含むＤＮＡが挿入された株であることを確認した。

（実施例９）β−ケトチオラーゼ活性の測定
まず、前培養培地（１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、（ｐＨ６．８））５ｍｌに試験菌株を植菌して３０℃で１晩培養したものを、５ｍｌの酵素活性測定用培地（１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５ｗ／ｖ％ フラクトース、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ ％ＣｕＳＯ₂・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの））に対して０．０５ｍｌ接種して、３０℃で２４時間培養した。

この培養液２ｍｌを４℃で１００００×ｇ、１分間の遠心分離を行い、菌体を集めた。この菌体を緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、１ｍｌの同緩衝液に懸濁した。これを超音波処理して菌体を破砕した後、１５０００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離した上清を粗酵素液として用いた。

β−ケトチオラーゼ活性は反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０６ｍＭ アセトアセチル−ＣｏＡ、０．１ｍＭ ＣｏＡ−ＳＨ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）に前記粗酵素液０．０１ｍｌを添加して、全量を０．５ｍｌとし、２５℃で反応させてアセトアセチル−ＣｏＡの分解を３０３ｎｍの吸光度で測定した。β−ケトチオラーゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのアセトアセチル−ＣｏＡを分解する酵素量を１ユニットとした。比活性はタンパク質１ｍｇあたりのユニットとした。なお、タンパク質の定量はウシ血清アルブミンをスタンダードとして、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ試薬（バイオラッド社製）を用いたブラッドフォード法で測定した。

実施例１から８で作製した菌株の内の代表的な菌株のβ−ケトチオラーゼの活性を表１に示す。

（実施例１０〜１２） 酪酸添加培養
実施例３で作製したＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株（実施例１０）、実施例４で作製したＰｒｅ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株（実施例１１）及び実施例２で作製したＡＳ株（実施例１２）の培養を行った。培養は次の様に行った。

前培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、（ｐＨ６．７）とした。ポリエステル生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．６ｗ／ｖ％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１ｗ／ｖ％ ＣｒＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの。）であり、炭素源はＰＫＯＯ（Palm kernel olein oil＝パーム核油オレイン）と、ＰＫＯＯ１００重量部に対して酪酸を３０重量部混合して使用し、培養は炭素源を流加する流加培養にて行った。

Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株、Ｐｒｅ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株及びＡＳ株のグリセロールストックを前培地に接種して２０時間培養し、２．５Ｌの生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤ−５００型）に１０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍとし、ｐＨは６．６から６．８の間でコントロールした。コントロールには１４％のアンモニア水を使用した。培養は６５時間まで行った。培養後遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、３ＨＨ組成比率を分析した。

生産されたポリエステルの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。

ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。

上記条件にて分析した結果、得られたポリエステルは化学式（１）に示すような共重合体ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であり、３ＨＨ比率は表２に示す通りであった。

（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）
（比較例１，２） 酪酸を添加しない培養
実施例１０と同じ培養条件にて、炭素源に酪酸を添加しない培養を実施例１で作製したＫＮＫ００５株（比較例１）及び実施例２で作製したＡＳ株（比較例２）について行った。３ＨＨ組成は表２に示す。

Claims (9)

1. ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物において、染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子が不活性化されており、且つｂｋｔＢ遺伝子の発現が増強された３−ヒドロキシヘキサン酸単位含有ポリヒドロキシアルカノエートを生産可能な微生物。
2. ｂｋｔＢ構造遺伝子の上流に、該微生物内在のプロモーター及び／又は異種微生物のプロモーターが組み込まれた請求項１に記載の微生物。
3. 組み込まれたプロモーターが、配列番号１で示されるCupriavidus necatorのｐｈｂＣＡＢオペロンのプロモーターの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター機能を有することを特徴とする、請求項２に記載の微生物。
4. 組み込まれたプロモーターが、配列番号１で示されるCupriavidus necatorのｐｈｂＣＡＢオペロンのプロモーターである請求項２に記載の微生物。
5. 組み込まれたプロモーターが、配列番号２で示されるAeromonas caviaeのｐｈａＰＣＪオペロンのプロモーターの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター機能を有することを特徴とする請求項２に記載の微生物。
6. 組み込まれたプロモーターが、配列番号２で示されるAeromonas caviaeのｐｈａＰＣＪオペロンのプロモーターである請求項２に記載の微生物。
7. 組み込まれたプロモーターがCupriavidus necatorのｐｈｂＰのプロモーター、或いは大腸菌のラクトースオペロン（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）プロモーター、又はそれらから派生したｔａｃ或いはｔｒｃプロモーターから選ばれる１つ以上である請求項２に記載の微生物。
8. 請求項１〜７何れかに記載の微生物を用い、炭素源として酪酸或いはその誘導体及び／又はブタノール或いはその誘導体を用いることを特徴とする３−ヒドロキシヘキサン酸単位含有ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
9. 炭素源として酪酸及び／又はブタノールを用いることを特徴とする、請求項８記載の製造方法。