JP5541809B2 - ポリラクテートとその共重合体生成能が改善された変異微生物を利用したポリラクテートとその共重合体の製造方法 - Google Patents
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Description
下記実施例1では、大腸菌XL1−Blueにおいてアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるackAまたはエタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるadhEを不活性化させるか、アセテートをアセチルコエンザイムAに再転換する酵素をコーディングする遺伝子であるacsを増幅させると同時に、ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるppcを不活性化させるか、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるldhAを増幅させ、上記のように変異させた大腸菌をPHA合成酵素の遺伝子とプロピオニル−CoA−トランスフェラーゼの遺伝子を含む組み換えベクターに形質転換することによって、ポリラクテートまたはその共重合体を効率的に生産する変異大腸菌を製造した。図1は、ackA、adhE、acs、ppcまたはldhA遺伝子を不活性化または増幅させて、ポリラクテートとその共重合体生成能を高めた変異微生物の内部代謝経路を示すものである。
1−1−1:ackA、adhEまたはppc遺伝子の欠失
大腸菌XL1−Blue(Stratagene)において下記プライマーでone step inactivation方法(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640−6645、2000)を利用して、ackA、adhEまたはppcを欠失させた。
上記1−1−1に記述したように、one step inactivation方法(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640−6645, 2000)を利用して、acsとldhAの大腸菌染色体DNA上の各々の固有プロモータを強力プロモータの1つであるtrcプロモータに置換させて増幅した。
上記1−1−1または1−1−2の過程を通じて、ackA、adhE、acs、ppcまたはldhAが様々な組合で不活性化または増幅された変異微生物JLX1−9を製作した。
1−2−1.pPs619C1300−CPPCT組み換えベクターの製作
Pseudomonas sp.6−19(KCTC 11027BP)由来のPHA合成酵素(phaC1Ps6−19)遺伝子を分離するために、Pseudomonas sp.6−19の全体DNAを抽出し、phaC1Ps6−19遺伝子配列(Ae-Jin Song,Master’s Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004)に基づく配列番号35及び36の塩基配列を有するプライマーを製作し、PCRを行い、phaC1Ps6−19遺伝子を収得した。PCR反応物をアガロスゲル電気泳動し、phaC1 Ps6−19遺伝子に該当する1.7kbpサイズの遺伝子切片を確認した。
CP−PCTの場合、大腸菌で高発現される場合、深刻な代謝障害を起こし、毒性を示すと知られているが、一般的に組み換えタンパク質発現に広く使用されるtacプロモータやT7プロモータを使用したIPTGによる発現誘導システムでは、誘導体添加と同時に組み換え大腸菌がすべて死滅した。
ラクチル−CoAを効率的に利用しないPHA合成酵素を利用してPLA及びPLA共重合体を合成する時には、合成効率が非常に低いため、PLA及びPLA共重合体を合成するためには、ラクチル−CoAを効率的に利用することができるPHA合成酵素が非常に重要であると言える。これより、本発明者らは、シュードモナス属6−19(Pseudomonas sp.6−19)のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用して、ラクチル−CoAを基質として使用してラクテート重合体及びラクテート共重合体を高効率で製造することができるシステムを発明した。
ラクチル−CoAを効率的に利用しないPHA合成酵素を利用してPLA及びPLA共重合体を合成する時には、合成効率が非常に低いため、PLA及びPLA共重合体を合成するためには、ラクチル−CoAを効率的に利用することができるPHA合成酵素が非常に重要であると言える。これより、上記1−2−1で製作されたphaC1Ps6−19合成酵素変異体(phaC1Ps6−19300)を基礎にして配列番号57及び58、59、60のプライマーを使用したSDM方法を利用してE130D、S477F及びQ481Kが変異されたアミノ酸配列を有するPseudomonas属6−19由来PHA合成酵素変異体(phaC1Ps6−19310)を製作した。
実施例1−1で製作されたアセチル−CoA及びラクテートの量が増加した変異微生物に上記実施例1−2−3及び1−2−4で製作されたpPs619C1400−CPPCT532またはpPs619C1310−CPPCT532ベクターを導入することによって、ポリラクテートとポーリ(3−ヒドロキシブチレート−co−ラクテート)を効率的に生成する変異微生物を製作した。
フラスコ培養において、培養条件とこれによるラクテート生成程度が微生物の細胞成長(バイオマス)とP(3HB−co−LA)生成に及ぼす影響を調べるために、培養体積を異ならしめて培養することにした。このために、250mLフラスコに50mL、100mL、150mLの培地を入れ、XB/p400−532菌株を培養した。上記XB/p400−532菌株は、大腸菌XL1−Blueの代謝フローを操作しないまま、pPs619C1400−CPPCT532ベクターを導入した菌株である。
本発明の変異微生物に適用された遺伝的突然変異の組合が高分子生成能増加に及ぼす効果を確認した。
PLA単一重合体とラクテート(LA)含量が高いP(3HB−co−LA)共重合体の生合成のために、3−ヒドロキシブチレート(3HB)供給量を調節し、その生成能を調べた。
Claims (5)
- コエンザイムA供与体及びラクテートの生成の増加のためにコエンザイムA供与体の生成経路及びラクテートの生成経路に関与する1つ以上の遺伝子が遺伝工学的に操作されている変異大腸菌を製造し、
上記変異大腸菌をグルコースまたはグルコースとヒドロキシアルカノエートを含む培地中で培養し、
上記変異大腸菌からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含むことを特徴とするポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法であって、
上記変異大腸菌において、ackA遺伝子及びppc遺伝子が不活性化されており、かつldhA遺伝子が増幅されており、あるいは
上記変異大腸菌において、ackA遺伝子及びppc遺伝子が不活性化されており、かつldhA遺伝子及びacs遺伝子が増幅されており、あるいは
上記変異大腸菌において、ackA遺伝子、ppc遺伝子、及びadhE遺伝子が不活性化されており、かつldhA遺伝子及びacs遺伝子が増幅されており、かつ
上記変異大腸菌が、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、及びプロピオニル−CoA−トランスフェラーゼをコードする遺伝子を有する、方法。 - 上記コエンザイムA供与体が、アセチルコエンザイムA(acetyl−CoA)、β−ケトアジピル−CoA(β−ketoadipyl−CoA)、γ−ブチロベタイニル−CoA(γ−butyrobetainyl−CoA)、(R)−メチルマロニル−CoA((R)−methylmalonyl−CoA)、(S)−メチル−マロニル−CoA((S)−methyl−malonyl−CoA)、2’−(5’’−ホスホリボシル)−3’−デホスホ−CoA(2’−(5’’−phosphoribosyl)−3’−dephospho−CoA)、2’−(5’’−トリホスホリボシル)−3’−デホスホ−CoA(2’−(5’’−triphosphoribosyl)−3’−dephospho−CoA)、3、4−ジヒドロキシフェニルアセチル−CoA(3、4−dihydroxyphenylacetyl−CoA)、3−ヒドロキシアジピル−CoA(3−hydroxyadipyl−CoA)、3−ヒドロキシブチリル−CoA(3−hydroxybutyryl−CoA)、3−ヒドロキシフェニルアセチル−CoA(3−hydroxyphenylacetyl−CoA)、3−メチルクロトニル−CoA(3−methylcrotonyl−CoA)、4−ヒドロキシフェニルアセチル−CoA(4−hydroxyphenylacetyl−CoA)、フェニルアセチル−CoAのcis−ジヒドロジオール誘導体(cis−dihydrodiol derivative of phenylacetyl−CoA)、Δ2−エノイル−CoA(Δ2−enoyl−CoA)、2−trans−4−cis−ジエノイル−CoA(2−trans−4−cis−dienoyl−CoA)、3−ヒドロキシアシル−CoA(3−hydroxyacyl−CoA)、3−ケトアシル−CoA(3−ketoacyl−CoA)、cis−2−エノイル−CoA(cis−2−enoyl−CoA)、cis−3−エノイル−CoA(cis−3−enoyl−CoA)、trans−2−エノイル−CoA(trans−2−enoyl−CoA)、trans−3−エノイル−CoA(trans−3−enoyl−CoA)、cis−2、3−デヒドロアシル−CoA(cis−2、3−dehydroacyl−CoA)、D−3−ヒドロキシアシル−CoA(D−3−hydroxyacyl−CoA)、脂肪アシルCoA(fatty acyl CoA)、長鎖アシル−CoA(long−chain acyl−CoA)、trans、trans−Δ2−Δ4−ジエノイル−CoA(trans、trans−Δ2−Δ4−dienoyl−CoA)、極長鎖脂肪アシル−CoA(very long chain fatty acyl−CoA)、CoA誘導体(CoA derivative)、アセトアセチル−CoA(acetoacetyl−CoA)、アセチル−CoA(acetyl−CoA)、ω−カルボキシアシル−CoA(ω−carboxyacyl−CoA)、アシル−CoA(acyl−CoA)、L−3−ヒドロキシアシル−CoA(L−3−hydroxyacyl−CoA)、ブチリル−CoA(butyryl−CoA)、コエンザイムA(CoA)、コエンザイム−A−グループ(CoA)、クマロイル−CoA(coumaroyl−CoA)、クロトノベタイニル−CoA(crotonobetainyl−CoA)、クロトニル−CoA(crotonyl−CoA)、D−カルニチニル−CoA(D−carnitinyl−CoA)、デホスホ−CoA(dephospho−CoA)、ホルミル−CoA(formyl−CoA)、イソバレリル−CoA(isovaleryl−CoA)、L−カルニチニル−CoA(L−carnitinyl−CoA)、マロニル−CoA(malonyl−CoA)、O−スクシニルベンゾイル−CoA(O−succinylbenzoyl−CoA)、オキサリル−CoA(oxalyl−CoA)、パルミトイルCoA(palmitoyl CoA)、フェニルアセチル−CoA(phenylacetyl−CoA)、ピメロイル−CoA(pimeloyl−CoA)、プロピオニル−CoA(propionyl−CoA)、スクシニル−CoA(succinyl−CoA)、trans−Δ2、cis−Δ4−デカジエノイル−CoA(trans−Δ2、cis−Δ4−decadienoyl−CoA)、trans−Δ2−デセノイル−CoA(trans−Δ2−decenoyl−CoA)及びラクチルCoA(lactyl CoA)よりなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 上記遺伝子の発現の増幅は、固有プロモータ(native promoter)の強力プロモータ(strong promoter)への置換により行われることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 上記強力プロモータは、trcプロモータ、tacプロモータ、T7プロモータ及びlacプロモータよりなる群から選択されることを特徴とする請求項3に記載の製造方法。
- 上記ヒドロキシアルカノエートは、
3−ヒドロキシブチレート(3−hydroxybutyrate)、3−ヒドロキシ吉草酸(3−hydroxyvalerate)、4−ヒドロキシブチレート(4−hydroxybutyrate)、炭素数が6〜14個の中間鎖長さの(D)−3−ヒドロキシカルボン酸((D)−3−hydroxycarboxylic acid)、2−ヒドロキシプロピオン酸(2−hydroxypropionic acid)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3−hydroxypropionic acid)、3−ヒドロキシヘキサン酸(3−hydroxyhexanoic acid)、3−ヒドロキシヘプタン酸(3−hydroxyheptanoic acid)、3−ヒドロキシオクタン酸(3−hydroxyoctanoic acid)、3−ヒドロキシノナン酸(3−hydroxynonanoic acid)、3−ヒドロキシデカン酸(3−hydroxydecanoic acid)、3−ヒドロキシウンデカン酸(3−hydroxyundecanoic acid)、3−ヒドロキシドデカン酸(3−hydroxydodecanoic acid)、3−ヒドロキシテトラデカン酸(3−hydroxytetradecanoic acid)、3−ヒドロキシヘキサデカン酸(3−hydroxyhexadecanoic acid)、4−ヒドロキシ吉草酸(4−hydroxyvaleric acid)、4−ヒドロキシヘキサン酸(4−hydroxyhexanoic acid)、4−ヒドロキシヘプタン酸(4−hydroxyheptanoic acid)、4−ヒドロキシオクタン酸(4−hydroxyoctanoic acid)、4−ヒドロキシデカン酸(4−hydroxydecanoic acid)、5−ヒドロキシ吉草酸(5−hydroxyvaleric acid)、5−ヒドロキシヘキサン酸(5−hydroxyhexanoic acid)、6−ヒドロキシドデカン酸(6−hydroxydodecanoic acid)、3−ヒドロキシ−4−ペンテン酸(3−hydroxy−4−pentenoic acid)、3−ヒドロキシ−4−trans−ヘキセン酸(3−hydroxy−4−trans−hexenoic acid)、3−ヒドロキシ−4−cis−ヘキセン酸(3−hydroxy−4−cis−hexenoic acid)、3−ヒドロキシ−5−ヘキセン酸(3−hydroxy−5−hexenoic acid)、3−ヒドロキシ−6−trans−オクテン酸(3−hydroxy−6−trans−octenoic acid)、3−ヒドロキシ−6−cis−オクテン酸(3−hydroxy−6−cis−octenoic acid)、3−ヒドロキシ−7−オクテン酸(3−hydroxy−7−octenoic acid)、3−ヒドロキシ−8−ノネン酸(3−hydroxy−8−nonenoic acid)、3−ヒドロキシ−9−デセン酸(3−hydroxy−9−decenoic acid)、3−ヒドロキシ−5−cis−ドデセン酸(3−hydroxy−5−cis−dodecenoic acid)、3−ヒドロキシ−6−cis−ドデセン酸(3−hydroxy−6−cis−dodecenoic acid)、3−ヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸(3−hydroxy−5−cis−tetradecenoic acid)、3−ヒドロキシ−7−cis−テトラデセン酸(3−hydroxy−7−cis−tetradecenoic acid)、3−ヒドロキシ−5、8−cis−cis−テトラデセン酸(3−hydroxy−5、8−cis−cis−tetradecenoic acid)、3−ヒドロキシ−4−メチル吉草酸(3−hydroxy−4−methylvaleric acid)、3−ヒドロキシ−4−メチルヘキサン酸(3−hydroxy−4−methylhexanoic acid)、3−ヒドロキシ−5−メチルヘキサン酸(3−hydroxy−5−methylhexanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸(3−hydroxy−6−methylheptanoic acid)、3−ヒドロキシ−4−メチルオクタン酸(3−hydroxy−4−methyloctanoic acid)、3−ヒドロキシ−5−メチルオクタン酸(3−hydroxy−5−methyloctanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−メチルオクタン酸(3−hydroxy−6−methyloctanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−メチルオクタン酸(3−hydroxy−7−methyloctanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−メチルノナン酸(3−hydroxy−6−methylnonanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−メチルノナン酸(3−hydroxy−7−methylnonanoic acid)、3−ヒドロキシ−8−メチルノナン酸(3−hydroxy−8−methylnonanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−メチルデカン酸(3−hydroxy−7−methyldecanoic acid)、3−ヒドロキシ−9−メチルデカン酸(3−hydroxy−9−methyldecanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−メチル−6−オクテン酸(3−hydroxy−7−methyl−6−octenoic acid)、リンゴ酸(malic acid)、3−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル(3−hydroxysuccinic acid−methyl ester)、3−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル(3−hydroxyadipinic acid−methyl ester)、3−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル(3−hydroxysuberic acid−methyl ester)、3−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル(3−hydroxyazelaic acid−methyl ester)、3−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル(3−hydroxysebacic acid−methyl ester)、3−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル(3−hydroxysuberic acid−ethyl ester)、3−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル(3−hydroxysebacic acid−ethyl ester)、3−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル(3−hydroxypimelic acid−propylester)、3−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル(3−hydroxysebacic acid−benzilester)、3−ヒドロキシ−8−アセトキシオクタン酸(3−hydroxy−8−acetoxyoctanoic acid)、3−ヒドロキシ−9−アセトキシノナン酸(3−hydroxy−9−acetoxynonanoic acid)、フェノキシ−3−ヒドロキシブチレート(phenoxy−3−hydroxybutyric acid)、フェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸(phenoxy−3−hydroxyvaleric acid)、フェノキシ−3−ヒドロキシヘプタン酸(phenoxy−3−hydroxyheptanoic acid)、フェノキシ−3−ヒドロキシオクタン酸(phenoxy−3−hydroxyoctanoic acid)、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシブチレート(para−cyanophenoxy−3−hydroxybutyric acid)、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸(para−cyanophenoxy−3−hydroxyvaleric acid)、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸(para−cyanophenoxy−3−hydroxyhexanoic acid)、para−ニトロフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸(para−nitrophenoxy−3−hydroxyhexanoic acid)、3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸(3−hydroxy−5−phenylvaleric acid)、3−ヒドロキシ−5−シクロヘキシルブチレート(3−hydroxy−5−cyclohexylbutyric acid)、3、12−ジヒドロキシドデカン酸(3、12−dihydroxydodecanoic acid)、3、8−ジヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸(3、8−dihydroxy−5−cis−tetradecenoic acid)、3−ヒドロキシ−4、5−エポキシデカン酸(3−hydroxy−4、5−epoxydecanoic acid)、3−ヒドロキシ−6、7−エポキシドデカン酸(3−hydroxy−6、7−epoxydodecanoic acid)、3−ヒドロキシ−8、9−エポキシ−5、6−cis−テトラデカン酸(3−hydroxy−8、9−epoxy−5、6−cis−tetradecanoic acid)、7−シアノ−3−ヒドロキシヘプタン酸(7−cyano−3−hydroxyheptanoic acid)、9−シアノ−3−ヒドロキシノナン酸(9−cyano−3−hydroxynonanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−フルオロヘプタン酸(3−hydroxy−7−fluoroheptanoic acid)、3−ヒドロキシ−9−フルオロノナン酸(3−hydroxy−9−fluorononanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−クロロヘキサン酸(3−hydroxy−6−chlorohexanoic acid)、3−ヒドロキシ−8−クロロオクタン酸(3−hydroxy−8−chlorooctanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−ブロモヘキサン酸(3−hydroxy−6−bromohexanoic acid)、3−ヒドロキシ−8−ブロモオクタン酸(3−hydroxy−8−bromooctanoic acid)、3−ヒドロキシ−11−ブロモウンデカン酸(3−hydroxy−11−bromoundecanoic acid)、3−ヒドロキシ−2−ブテン酸(3−hydroxy−2−butenoic acid)、6−ヒドロキシ−3−ドデセン酸(6−hydroxy−3−dodecenoic acid)、3−ヒドロキシ−2−メチルブチレート(3−hydroxy−2−methylbutyric acid)、3−ヒドロキシ−2−メチル吉草酸(3−hydroxy−2−methylvaleric acid)、及び3−ヒドロキシ−2、6−ジメチル−5−ヘプテン酸(3−hydroxy−2、6−dimethyl−5−heptenoic acid)よりなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
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