WO2005033324A1 - Ｄ−乳酸菌生産用生体触媒 - Google Patents

Description

明 細 書

D—乳酸生産用生体触媒 技術分野 本発明は、 D—乳酸を高選択的に高生産する微生物と、 それを用いた D—乳酸 の生産方法に関するものである。 詳しくは純度が高い乳酸を効率良く生産する方 法、 特にピルビン酸の生成蓄積量が少ない D-乳酸の効率的な製造法に関わる。 また、本発明は、 FAD依存性 D-乳酸デヒドロゲナ一ゼが不活化あるいは低減 されている微生物を用いることを特徴とする D-乳酸の生産方法に関する。

また、本発明は、不純物であるコハク酸ゃフマル酸を生産せずに D-乳酸を生産 する微生物と、 それを用いた D-乳酸の生産方法に関するものである。 背景技術 生分解性ポリマーであるポリ乳酸は、 C〇₂問題 ·エネルギー問題の顕在化と ともにサスティナピリティー （持続可能性） 、 LCA (ライフサイクルアセスメ ン卜） 対応型製品として強い注目を浴びており、 その原料である乳酸には効率的 で安価な製造法が求められている。

ちなみに現在工業生産されているポリ乳酸は L一乳酸ポリマーであるが、 乳酸 には L—乳酸と D—乳酸があり、 D-乳酸についてもポリマー原料や農薬、医薬の 中間体として近年注目が集まりつつある。 但しいずれの用途においても、 原料た る乳酸には高い光学純度が要求されるのが事実である。

自然界には乳酸菌や糸状菌など乳酸を効率良く生産する微生物が存在し、 それ らを用いた乳酸製造法の中には既に実用化済みのものもある。例えば、 L-乳酸を 効率良く生産させる微生物として L a c t b ac i l l u s de l b rue c k i i等、また D-乳酸を効率良く生産させる微生物として S p o r o 1 a c t o b a c i 1 1 u s属の微生物等が知られている。 どの場合も乳酸の蓄積量は高い レベルに達しているが、 培養液中に含まれる乳酸以外の副生物、 例えば酢酸、 ェ 夕ノール、 ァセトイン、 ピルビン酸といった化合物が精製過程で除けきれないこ とが、 最終産物である乳酸の品質低下につながることがある。 また光学異性体の 混入が原因で、 光学純度の低下をきたす事も重大な問題となる。

そのような乳酸の純度低下を回避するには、 微生物によって生産される副生物 の量を低減化させることが効果的な手段である。 近年発展してきた遺伝子組換え 技術を利用して微生物の特定遺伝子を破壊すれば、 狙つた副生物の生産を特異的 に阻害することが可能となってきた。 ただ現状的には、 遺伝子破壊法がどのよう な微生物にでも容易に適用できる訳ではなく、 乳酸菌や糸状菌など元来乳酸を高 生産できる微生物での適用は容易ではない。 なぜならこれらの微生物はゲノム情 報が必ずしも十分とは言えず、 かつ遺伝子組換えめ宿主としても汎用されていな いからである。

それに対しゲノム情報が豊富で、 遺伝子組換え宿主としての実績が十分にある ェシエリヒア *コリ、 酵母、 ヒト培養細胞等では、 比較的容易に遺伝子破壊を行 うことが可能である。 特に増殖の速さや培養の容易さの点ではェシエリヒア ·コ リが最も好ましい。 さらにェシエリヒア ·コリが生産する乳酸は D体のみである ため、光学純度の高い D-乳酸を得る目的では好都合な宿主である。 しかし野生型 のェシエリヒア，コリは、 D-乳酸生産性が低く、 D-乳酸以外にも種々の副生有 機酸を生産する。 この問題を解決するために、 遺伝子組換えによってェシエリヒ ァ ·コリの代謝経路を改変し、 D-乳酸を選択的に高生産させる試みが過去になさ れている。

C h a n gら (Chang, D.—E.， et. al. , Appl. Environ. Microbiol. , Vol. 65 (4) , PP1384-1389 (1999)) は、 ェシエリヒア'コリのホスホトランスァセチラーゼ (以 下 p t aと略することがある）、及びホスホェノールピルピン酸カルポキシラーゼ (以下 P P cと略することがある）の 重変異株を 5 %のグルコース、 及びアミノ 酸を含む培地を用いて、 さらに予め通気培養で菌体を増加させた後、 嫌気培養を 行い、 培地中のグルコースが 5 %を超えないようにグルコースを追添加し培養す ることにより 6 2 . 2 gZLの D—乳酸を 6 0時間で生産させている。 この時の グルコースから D-乳酸への転換率は 7 6 %であった。

Z h o uら （Zhou，S.， et. al.， Appl. Environ. Microbiol. , Vol. 69 (1)， PP399-407 (2003)) は、 ピルペートホルメートリアーゼ （以下 p f 1と略すこと がある）、 フマル酸レダクターゼ （以下 f r dと略すことがある）、 アルコール/ アルデヒドデヒドロゲナーゼ (以下 a d e Eと略すことがある)、 およびァセテ一 トキナ一ゼ (以下 a c k Aと略すことがある）の 4重破壊ェシエリヒア ·コリを作 製し、 これを 5 %のグルコースを含む無機塩培地で嫌気条件下にて 1 6 8時間培 養することによって、ギ酸、コハク酸、エタノールおよび酢酸の副生なしに 4 8 . 5 g/Lの D—乳酸が生産されたと報告している。 しかしこの試みは、 D—乳酸 を高選択的に生産させることには成功しているが、 生産性は 0 . 2 9 gZLZh rとかなり低く、 選択率と生産性の両方を満足させたとは言えない。 また副生物 のピルビン酸についての言及がなく、 その低減ィヒ効果については不明である。 ピ ルビン酸は D—乳酸の代謝反応基質であるため、 他の副生有機酸とは異なり、 む やみに生成を抑えると D—乳酸そのものの生成も抑えられてしまう。 その点でピ ルビン酸の副生を最小限に抑えることは容易なことではない。 一般にピルビン酸 が乳酸モノマー原料に不純物として含まれた場合には、 ポリマー重合率が低下す る等の好ましからざる問題が生じることは当業者には良く知られた事実であり、 その意味からもピルビン酸はぜひとも低減化すべき副生物の一つである。 にも拘 わらず D乳酸生産性を高く維持しながら、 ピルビン酸副生を抑えることに成功し たという報告は過去になされていない。

以上まとめると、 現在までに知られているェシエリヒア ·コリでの D—乳酸最 大蓄積量 6 2. 2 g/1であり、 その生産時間は 6 0時間であった。一方、 L—乳 酸の工業化生産に用いられている乳酸菌または糸状菌の L一乳酸生産性が蓄積量 1 0 O gZL以上かつ生産時間 2 4時間以内であることを考慮すれば、 ェシエリ ヒア ·コリの D—乳酸蓄積 *と生産時間は依然として低いレベルにあると言わざ るを得ない。 ェシエリヒア ·コリが乳酸菌や糸状菌なみの乳酸生産性を達成した という報告は過去になく、 それどころかそもそもェシエリヒア ·コリを用いて' 1 0 0 gZLを越える D—乳酸を蓄積生産させることができるのか否かについても、 それを示唆するようなデータは過去に存在しなかった。

大腸菌を用いて D—乳酸発酵させる場合、 一般には酸素の存在は好ましくない 考えられている。 なぜなら酸素のような電子受容体が存在すると、 大腸菌は発 酵ではなく呼吸を行うからである。 酸素のような電子受容体が無い場合に限り、 大腸菌は基質レベルのリン酸化のみによりエネルギー （AT P) を得、 解糖系で 得られた還元力 （NADH) を用いて乳酸などの還元性有機酸を生産する。 その ような理由から、 従来の大腸菌による D—乳酸発酵は殆ど嫌気培養で行われてい る。 まれに培養の前半を通気し、 後半を嫌気培養するという二相培養が行われる 場合もあるが、 これは前半の通気培養によって十分な菌体量を確保するのが目的 であり、 最終的な乳酸発酵はやはり嫌気で行っている訳である。 しかし実際のェ 業生産を想定した場合、 培地に添加する安価なアミノ酸源であるコーンスティー プリカ一 （以下 C S Lと略すことがある） 等の中には不純物となる有機酸だけで なく、 D体、 L体両方の乳酸が含まれるが、嫌気培養だと L一乳酸が資化されず、 培地中に残存したままとなる。 L体からピルビン酸を生成する反応の触媒酵素で ある L-乳酸デヒドロゲナーゼ（以下 1 1 dと略すことがある）は通気条件下で発 現することが知られているので、 もし通気条件下でも効率良く乳酸発酵させる方 法があれば、 その方法を用いることで培地中に含まれる L体を菌体に資ィ匕させ、 光学的にも高い純度の D体を生産させることが可能となるものと期待されるが、 これまでそれを実現する技術は存在しなかった。

p f 1破壊株を用いた乳酸生産に関しては Z h o uらの報告に先立ち、 以下の ような報告がなされている。 すなわち C o n t a gら （Contag, P. R. , et. al.， Appl. Environ. Microbiol. , Vol.56 (12) , pp3760-3765 (1990) ) は、 p f 1非変 異ェシエリヒア ·コリ株が 3 5 mMの乳酸を生成するのに対して、 p f 1変異株 では乳酸の生産性は向上し、 45mMの乳酸を生成することを示している。 すな わちェシエリヒア ·コリにおいて p f 1活性の不活化により D—乳酸の生産性が 向上することは Con t a gらのデ一夕開示により既に公知となっている。

D—乳酸デヒドロゲナーゼは、 補酵素に対する依存性の違いによって、 NAD H依存性と F A D依存性に区別される。 NAD H依存性 D—乳酸デヒドロゲナー ゼは、 生体内でピルビン酸から D—乳酸への反応を触媒している。 特に大腸菌由 来の NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼは 1 dhAと呼ばれる。

Yangら (Yang, Υ.Τ·， et. al., Metab. Eng., Vol.1(2), ppl41-152 (1999)) は 1 dh A遺伝子を組み込んだ発現ベクターをェシエリヒア ·コリに導入するこ とで、 D—乳酸蓄積量が 8 g/L程度と低いながらも向上することを報告してい る。 すなわちェシエリヒア *コリにおいて 1 dhA活性の強化により、 D—乳酸 の生産性が向上することは Yangらのデータ開示により公知となっている。 , 一方で、 パンチら 〔： Bunch, PK, Microbiology, Vol, 143(Ptl)， 187-195(1997)〕 の報告によれば、 ェシエリヒア ·コリ由来 1 dh A遺伝子の発現ベクターを導入 したェシエリヒア ·コリは、 発現ベクターの導入によりその増殖が阻害されるこ とが報告されている。

また大腸菌以外の細菌由来 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （以下、 l dhと呼ぶこ とがある） を大腸菌に過剰発現させた例としては、 Lac t ob a c i l l u s he l ve t i c u s由来 1 d hの発現例としてコッカーら 〔Kochhar，S.， Eur. J. Biochem., (1992) 208， 799-805) や Lac t ob ac i l l u s bu l ga r i c u s由来 1 d hの発現例としてコッカーら 〔Kochhar，S.， Biochem.

Biophys. Res. Commun., (1992) 185， 705-712〕 の報告が挙げられるが、 いずれ の例も発現させた酵素の物理化学的性質を調べたものであって、 D体やピルビン 酸の蓄積量についての言及は皆無である。

しかしながら p f 1活性を不活ィ匕または低減化させ、 且つ 1 dh A活性を強ィ匕 させた微生物の D—乳酸生産性については、 依然として良く知られてはいなかつ た。 一般に発現べクタ一を用いた遺伝子強化方法では、 ベクタ一の脱落が生じ、 目 的遺伝子の発現量が低下し、 さらには目的物質の生産性が低下するという不具合 が生じ得る。 こうしたことから D—乳酸工業生産への応用に際し、 発現ベクター を用いた 1 dh遺伝子の強化方法には幾つかの解決すべき課題が存在し、 それに 代わる遺伝子強化方法が望まれる。 しかしながらそうした取り組みの報告はなさ れていない。

発現ベクターに代わる遺伝子強化方法として、 So l emら （Sol em， ， et. al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.68(5), pp2397-2403 (2002)) が報告した ようにゲノム上のある遺伝子のプロモータ一領域を任意のプロモーターに置換す ることで、 該遺伝子を強化する方法があげられる。 しかし、 本技術を上記の I d h A遺伝子を用いた D—乳酸製造に応用した場合を考えると、 この方法では強化 される 1 d h A遺伝子はゲノム上の遺伝子 1コピーのみであり、 多コピーの遺伝 子が発現する発現ベクターによる強化方法に比べ、 1 dh A活性の向上は小さな ものであると予測され、 D—乳酸生産性が発現ベクターを用いた場合に比べ向上 すると予想することは当業者といえども困難であった。

一方、 FAD依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （以下 d 1 dと略すことがある） については、 大腸菌から精製された酵素の解析により N ADH依存性 D—乳酸デ ヒドロゲナーゼとは逆の反応、 すなわち D—乳酸からピルビン酸への反応を主と して触媒することが開示されている。 過去において、 Shawらは d i dが破壊 された大腸菌株 J S 150と J S 151を取得しているが、 それらの株における D—乳酸生産性やピルビン酸生産性については言及していない（Shaw, L.， et. al., J. Bacteriol., Vol.121 (3), ppl047-1055 (1975))。 また Ba rne sらは、 d 1 dが種々のアミノ酸や糖類の取り¹こみに関わっていると報告しているが

(Barnes, E.M., et. al., J. Biol. Chem. , Vol.246(17), pp5518- 5522 (1971)〕、 D—乳酸やピルビン酸の生産への関わりについては言及していない。

尚、 大腸菌株の分讓機関の一つである Y a 1 e大学付属の E. c o 1 i Ge ne t i c S t ock Cen t e r (C G S C) のデータベースで d 1 d と p f 1の 2重変異株の検索を行うと、 M a t— J a nらの論文 (Mat-Jan, F.， et. al.， J. Bacteriol. , Vol. 171 (1) , pp342-348 (1989) ) が該当案件として出力さ れるが、 実際に精査した結果、 この論文には d 1 dと p f 1の 2重破壊株に関す る記述は見られなかった。

先にも述べたが D—乳酸に関しては、 微生物による発酵生産で工業化レベルに 見合う生産性と選択性を同時に達成したという報告は無く、 例えば主たる副生有 機酸であるコハク酸ゃフマル酸を、 高い D—乳酸生産性を維持しながら低減化さ せた前例もない。

そこで我々は D—乳酸の生産性を損なうことなくコハク酸生産を抑制すること を目標にして鋭意検討を重ね、 その結果、 嫌気条件下でォキサ口酢酸からリンゴ 酸への反応を触媒する酵素リンゴ酸デヒドロゲナーゼ （以下 m d hと呼ぶことが ある） の遺伝子を破壌することによって、 D—乳酸の生産性を損な'うこと無しに コハク酸の生成を完全に抑えることが可能であることを見出した。 しかし依然と してフマル酸が副生されていたため、 ァスパラギン酸アンモニアリアーゼ （以下 a s p Aと呼ぶことがある） の遺伝子を破壊することによって、 フマル酸の副生 量をも低減化することが可能であることを見出した。

md h活性不活化の効果に関しては、 1 9 7 0年の C o u r t r i g h tらの 論文に開示されている (Court right, J. B. et. al.， J. Bacteriol. , Vol. 102 (3) , PP722-728 (1970) )。 その開示内容は、 md h活性が不活化されたェシエリヒア · コリでは、 嫌気条件下でのォキサ口酢酸からリンゴ酸への反応活性がゼロになつ ているものの、 ァスパラギン酸からフマル酸への反応活性が逆に向上していると いうものであった。 つまり嫌気条件下でコ八ク酸を生成する経路には、 ォキサ口 酢酸からリンゴ酸を経由してフマル酸、 コハク酸に流れる経路と、 ォキサ口酢酸 からァスパラギン酸を経由してフマル酸、コ八ク酸に流れる経路の 2種類があり、 md h活性を不活化すると前者の経路は止まるが、 後者の経路はむしろ活性化さ れることを説明している。 よって C o u r t r i g tらの論文は、 md h活性 不活化によってコハク酸が生成しなくなることを開示したものではない。 md h活性不活化の効果に関するもう一つの先行技術は、 md h遺伝子が破壊 された酵母に関するものである（特開平 11— 056361号公報)。本特許は酵 母の mdh遺伝子を破壊することによって、 生産されるリンゴ酸量を変化させる というものであり、 その結果がコハク酸の生産量にどのような影響をもたらすか について言及したものではない。

つまるところ過去の知見からは、 微生物の m d hを不活化することによってコ ハク酸の生産が完全に抑制され得ることを想定することは、 当業者といえども困 難であった。

また a s p A活性不活化の効果については、過去において唯一、エルシニア ぺ ステイスでの知見が開示されている (Dreyfus, L. A., et. al., J. Bacteriol., Vol.136(2), pp757-764 (1978))。 しかしながら、 本論文の主旨は、 a s pA活性 の不活化によってァスパラギン酸やグルタミンが細胞内で分解されにくくなるこ とであって、 フマル酸生成量についての考察はなされてはいない。 特許文献 1 ：特開平 11—056361号公報

非特許文献 1 ： Chang, D. - E. , et. al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.65(4), ppl 384-1389 (1999)

非特許文献 2 ： Zhou，S.， et. al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.69(1), PP399-407 (2003)

非特許文献 3 ： Con tag, P.R., et. al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.56(12), PP3760-3765 (1990)

非特許文献 4 ： Yang, Y.T" et. al., Metab. Eng., Vol.1(2), ppHl-152 (1999) 非特許文献 5 ： Bunch, P.K., et. al., Microbiology, Vol.143 (Pt 1), pl87-195 (1997)

非特許文献 6 ： ochhar, S.， et. al., Eur. J. Biochem., Vol.208(3), PP799-805 (1992)

非特許文献 7 ： Kochhar, S.， et. al. , Biochem. Biophys. Res. Co匪 n.， Vol.185(2), pp705-712 (1992)

非特許文献 8 ： Sol em, C.， et. al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.68(5), PP2397-2403 (2002)

非特許文献 9 ： Shaw, L.， et. al., J. Bacteriol., Vol.121 (3), ppl047-1055 (1975)

非特許文献 1 0 ： Barnes, E.M., et. al., J. Biol. Chem. , Vol.246(17), PP5518-5522 (1971)

非特許文献 11 ： Mat-Jan, F.， et. al., J. Bacteriol., Vol.171(1)， pp342-348 (1989)

非特許文献 1 2 ： Courtright, J. B. et. al., J. Bacteriol., Vol.102(3), PP722-728 (1970)

非特許文献 13： Dreyfus, L. A.， et. al., J. Bacteriol., Vol.136(2), pp757-764 (1978) 発明の開示 本発明の課題の一つは、 D—乳酸の高生産方法を提供することであり、 本発明 の別な課題は光学純度が高く、 副生有機酸が少ない高選択的な D—乳酸の生産方 法を提供することにある。

本発明の他の課題は、 不純物有機酸として従来より微生物により乳酸を生成蓄 積させた培地中からの除去が簡単ではなかったピルビン酸の蓄積量を低減化させ た D-乳酸生産法を提供することにある。

本発明の他の課題は、 ヘテロ乳酸醱酵細菌を用いて乳酸を効率的に生産する乳 酸の生産方法を提供することである。 本発明の別な課題は、 ヘテロ乳酸醱酵細菌 を用いて光学純度の高い乳酸を効率的に生産する乳酸の生産方法を提供すること である。 本発明の他の課題は、 目的物質の生産性を低下させることなく、 副生物である コハク酸及び/又はフマル酸の生産を抑制する D-乳酸の生産方法を提供するも のである。

本発明の他の課題は、発現ベクターを用いた強化方法に代わる、安定な D-乳酸 デヒドロゲナーゼ遺伝子の強化方法を提供し、また、 D-乳酸をより高生産する方 法を提供することである。

本発明者らは、 これら上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、 iピルべ ートホルメートリアーゼ （P f 1 ) 活性が不活化あるいは低減化され、 かつェシ エリヒア ·コリ由来 NAD H依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （1 d h A) 活性 が増強された細菌が従来よりも短時間で D—乳酸を生産し、 これまでになく高い 蓄積量を達成することを見いだした。 特に 1 d h A活性の増強方法に関しては、 1 d h Aをコードする遺伝子をゲノム上において、 解糖系、 核酸生合成系又はァ ミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結するこ とで発現させた微生物を用いることにより、 発現べクタ一を用いた遺伝子発現強 化方法に比して短時間で著量の D—乳酸を生産させることが可能であることを見 いだした。 発現ベクターを用いた方法では本発明の方法よりも D—乳酸デヒドロ ゲナーゼの細胞内発現量は多いが何らかの理由によりこの高い酵素量力 乳酸 の高生産には直接結びついておらず、.むしろ、 本発明のように細胞内での酵素の 発現量はそれほど高くなくとも結果的に D—乳酸の生産性が飛躍的に'向上するこ とは極めて驚くべきことである。

次に発明者らは、 微生物培養液中に存在するピルビン酸の一部が、 実際に d 1 dによって D—乳酸から生成されていることを見出し、 さらに d 1 d遺伝子が実 質的に不活化された、あるいは低減された微生物を育種し培養することによって、 当該微生物の増殖が宿主と比較して抑制されないこと、 および培地中のピルビン 酸含有濃度が低下した高品質の D—乳酸を含む培養液が得られることを見出した。 さらに、 p f 1活性が不活化あるいは低減化され、 且つノまたは 1 d h A活性が 増強され、 且つ d 1 d遺伝子が実質的に不活化あるいは低減された微生物を育種 し培養することによって、 培地中のピルビン酸が低下した高品質の D—乳酸が得 られることを見出した。

さらに本発明者らは、 T C A回路を有し、 且つリンゴ酸デヒドロゲナーゼ （m d h )活性が不活化または低減され、且つァスパラギン酸アンモニアリァーゼ（a s p A)活性が不活化または低減ィ匕されている上記微生物を用いることによって、 D—乳酸の生産性を高く維持したままでコハク酸とフマル酸の副生を抑えうるこ とを見出すことによつて本発明に到達した。

即ち、 本発明は以下のとおりである。

〔1〕 ピルペートホルメートリアーゼ （p f 1 ) の活性が不活化あるいは低減ィ匕 されたへテ口乳酸発酵細菌を 2種以上のァミノ酸が添加された培地で培養し、 得 られた培養物から乳酸を回収することを特徴とする、 乳酸の生産方法。

〔2〕 ヘテロ乳酸発酵細菌がェシエリヒア ·コリであることを特徴とする 〔1〕 に記載の乳酸の生産方法。

〔3〕 ェシエリヒア ·コリが MT— 1 0 9 3 4 (F E RM B P— 1 0 0 5 7 ) 株であることを特徴とする 〔2〕 に記載の乳酸の生産方法。

〔4〕 ェシエリヒア ·コリ由来 NADH依存 ffiD—乳酸デヒドロゲナ一ゼ （I d h A) 活性が増強され、 かつピルペートホルメートリアーゼ （p f 1 ) 活性が不 活化あるいは低減化された細菌を培養し、 得られた培養物から D—乳酸を回収す ることを特徴とする、 D—乳酸の生産方法。

〔5〕 細菌がェシエリヒア，コリである 〔4〕 に記載の D—乳酸の生産方法。

[ 6 ) 2種類以上のアミノ酸が添加された培地で培養することを特徴とする、〔4〕 又は 〔5〕 に記載の D—乳酸の生産方法。 .

〔7〕 該微生物が本来有している F AD依存性 D—乳酸デヒドロゲナ一ゼ （d 1 d) 活性が不活化あるいは低減ィ匕された微生物であって、 ピルペートホルメート リアーゼ （p f 1 ) 活性が不活化あるいは低減ィ匕されている、 且つ/またはェシ エリヒア ·コリ由来 NAD H依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （l d h A) 活性 が増強されていることを特徴とする微生物。 〔8〕 微生物が細菌である 〔7〕 に記載の微生物。

〔9〕 細菌がェシエリ,ヒア 'コリである 〔8〕 に記載の微生物。

〔10〕 〔7〕 〜 〔9〕 の何れか一項に記載の微生物を液体培地で培養し、 培養液 中に D _乳酸を生成蓄積せしめ、 培養液から D—乳酸を分離することを特徴とす る D—乳酸の生産方法。

〔11〕 2種以上のアミノ酸が添加された培地で培養することを特徴とする、 請 求項 10に記載の D—乳酸の製造方法。

〔12〕 FAD依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （d 1 d) 活性が不活化あるい は低減化されている微生物を液体培地で培養し、 培養液中に D—乳酸を生成蓄積 せしめ、 培養液から D—乳酸を分離することを特徴とする D—乳酸の生産方法。 〔13〕 微生物が細菌である 〔12〕 に記載の方法。

〔14〕 細菌がェシエリヒア ·コリである 〔13〕 に記載の方法。

〔15〕 微生物のゲノム上において、 ェシエリヒア 'コリ由来の NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナ一ゼ （ l dhA) をコードする遺伝子が、 解糖系、 核酸生 合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモー夕一 を使用することで該 NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （l dhA) を発 現する微生物。

〔16〕 微生物がェシエリヒア ·コリである 〔15〕 に記載の微生物。

〔17〕 該微生物が本来有しているピルペートホルメートリアーゼ （p f 1) 活 性が不活化あるいは低減ィヒされている、 且つ Zまたは FAD依存性 D—乳酸デヒ ドロゲナ一ゼ （d 1 d) 活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とす る 〔15〕 又は 〔16〕 に記載の微生物。

〔18〕 ェシエリヒア ·コリのゲノム上において、 ェシエリヒア ·コリ由来の N ADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （l dhA) をコードする遺伝子のプロ モーターに代えて、 ェシエリヒア 'コリ由来の解糖系、 核酸生合成系又はアミノ 酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで 該 NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （l dhA) を発現するェシエリヒ 04014037 ァ ·コリ。

〔19〕 ェシエリヒア 'コリの解糖系、 核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関 わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターが、 ェシェリヒア 'コリ由来のグ リセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである 〔 1 8〕 記載のェシエリヒア ·コリ。

〔20〕 該ェシエリヒア ·コリが本来有しているピルペートホルメ一トリアーゼ (p f 1) 活性が不活化あるいは低減化されている、 且つノまたは FAD依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （d 1 d) 活性が不活化あるいは低減化されているこ とを特徴とする 〔18〕 又は 〔19〕 に記載のェシエリヒア 'コリ。

〔21〕 〔15〕 〜 〔20〕 のいずれか一項に記載の微生物を培地を用いて培養す ることにより D—乳酸を生産する方法。

〔22〕 TCA回路を有し、 且つリンゴ酸デヒドロゲナーゼ （mdh) 活性が不 活化あるいは低減ィヒされている微生物であって、 更にピルべートホルメートリア ーゼ （p f 1) 活性が不活化あるいは低減ィ匕されている、 且つ または FAD依 存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （d i d) 活性が不活化あるいは低減化されてい ることを特徴とする微生物。

〔23〕 該微生物が本来有しているァスパラギン酸アンモニアリア一ゼ （a s p A) 活性が不活化または低減化されている 〔22〕 に記載の微生物。

〔24〕 微生物が細菌である 〔22〕 又は 〔23〕 に記載の微生物。

〔25〕 細菌がェシエリヒア ·コリである 〔24〕 に記載の微生物。

〔 26〕ェシエリヒア ·コリ由来の NAD H依存性 D—乳酸デヒド口ゲナ一ゼ ( 1 dhA) 活性が増強されている 〔25〕 に記載の微生物。

〔27〕 〔22；！ 〜 〔26〕 の何れか一項に記載の微生物を培地を用いて培養する ことにより、 T C A回路上で生産される有機酸以外の化合物を生産させる方法。 〔28〕 有機酸以外の化合物が D—乳酸である 〔27〕 に記載の生産方法。

〔29〕 通気条件下で培養することを特徴とする 〔1〕 〜 〔6〕、 〔10〕 〜 〔1 4〕、 〔21〕、 〔28〕 の何れか一項に記載の乳酸の生産方法。 〔30〕 通気条件が温度 30°Cの水を対象とした場合、 常圧で酸素移動容量係数 KL&が 1 h-i以上 400 h-i以下となるような条件で達成し得る酸素供給を可能 とする条件であることを特徴とする 〔29〕 に記載の乳酸の生産方法。

〔31〕 培養 pHが 6〜8であることを特徴とする 〔1〕 〜 〔6〕、 〔10〕 〜 〔1 4〕、 〔21〕、 〔28〕 〜 〔30〕 の何れか一項に記載の乳酸の生産方法。

本発明により、 高い D—乳酸生産性と D—乳酸選択性を有する微生物が提供さ れる。 そして、 本発明により作製された微生物を培養し、 D—乳酸を生産するこ とにより既存の方法に比較してより経済的に高純度な D—乳酸を生産することが 可能となる。

また、本発明により、 ピルビン酸の生成量が少ない D-乳酸を生成する細菌が提 供される。そして、本発明により作成された菌株を培養し、 D-乳酸を生産するこ とにより既存の方法に比較してより経済的に化学的純度及び光学純度の高い D - 乳酸を生産することが可能となる。

また、本発明により作製された菌体を使用し D-乳酸を生産することにより、既 存の方法に比較して不純物 あるピルビン酸含量の低下した、 精製負荷の少ない 高品質の D-乳酸発酵液を製造できるようになる。

また、 本発明により、 TC A回路上で生産される有機酸以外の化合物の生産性 低下を招くことなく、 コハク酸及び Z又はフマル酸の副生を抑えることが可能と. なる。 特に TC A回路上で生産される有機酸以外の化合物を工業的に生産するこ とを目的とする場合、 副生物の種類と量を低減化することで目的物質の精製コス 卜の低減化が可能となる。 図面の簡単な説明 図 1は、 実施例 20における培養液中の D—乳酸蓄積量の経時変化を示したグ ラフである。 図中、 三角は MG1655Ap f l Ad l d株 （実施例 15) の結 果を、四角は MG 1655Ap f l Ad l d/pGAP 1 dhA株（実施例 18) の結果を、丸は MG 1655Ap f l Ad l d/GAP p 1 d hゲノム揷入株 (実 施例 19) の結果を示す。

図 2は、 実施例 24における培養液中乳酸蓄積濃度の経時変化を示したグラフ である。 図中、 十字は Δρ f 1 Δά 1 d株の結果を、 丸は Δρ f 1 Δά 1 dAm dh株の結果を、 三角は Δρ f 1 Δά 1 dApp c株の結果を、 四角は Δρ f 1 Δ d 1 d Δ f r d株の結果を示す。

図 3は、 実施例 24における培養液中コハク酸蓄積濃度の経時変化を示したグ ラフである。 図中、 十字は Δ p f 1 Δ d 1 d株の結果を、 丸は Δ p f 1 Δ d 1 d △ mdh株の結果を、 三角は Δρ f 1 Δά 1 άΔρ p c株の結果を、 四角は Δρ f 1 Δ d 1 d Δ f r d株の結果を示す。

図 4は、 実施例 25における培養液中乳酸蓄積濃度の経時変化を示したグラフ である。 図中、 丸は Δ p ί 1 Δ d 1 d Amd h Δ a s p株の結果を、 三角は Δ ρ f 1△ d 1 d Amdh Δ a s p/GAP 1 d h Aゲノム揷入株の結果を、 四角は Δ p f 1 Δ d 1 d Amd h株の結果を示す。

図 5は、 実施例 25における培養液中フマル酸蓄積濃度の経時変化を示したグ ラフである。 図中、 丸は Δ p f 1 Δ d 1 d Amd h Δ a s p株の結果を、 三角は Δρ f 1 Δά 1 dAmdhA s pZGAP 1 d h Aゲノム揷入株の結果を、 四 角は Δ p f 1 Δ d 1 d Amd h株の結果を示す。

発明を実施するための最良の形態 以下に本発明を詳しく説明する。

本発明におけるピルべ一卜ホルメートリアーゼ （p f 1) とは、 国際生化学連 合 （I. U. B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号 2. 3. 1. 54に分類さ れ、 ホルメートァセチルトランスフェラーゼとも呼ばれる酵素である。 本酵素は ピルビン酸からギ酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を意味する。 本発明における不活化とは、 既存の測定系によって測定された当該酵素の活性 が検出限界以下である状態を指す。

本発明における低減化とは、 当該酵素をコードする遺伝子の突然変異及び/ま たは遺伝子組み換えにより、 それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素 活性が低下している状態を指す。

本発明におけるヘテロ発酵細菌とは、 糖を発酵的に分解して乳酸以外にギ酸、 酢酸、 コハク酸、 エタノールより選ばれる物質のうち少なくとも 1種類以上を生 産する能力をもつ細菌を意味する。 具体的に本発明のへテロ醱酵性細菌としては ェシエリヒア ·コリが好適であり、 ピルペートホルメートリアーゼ （p f 1 ) の 活性が不活化あるいは低減化されたヘテロ発酵細菌としては、 本発明の実施例で 示した方法などで作製できる任意のェシエリヒア ·コリ野生株の p f 1遺伝子の 破壊株やェシェリヒア 'コリ MT— 1 0 9 3 4が例示できる。

上記 MT— 1 0 9 3 4はすでに p f 1は活性が低下していることが確認されて いる株であり、 容易に本発明を実施することが可能である。 本菌株は、 寄託番号 F E RM B P— 1 0 0 5 7として、 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号中央第 6 の、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 特許手続上の 微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基いて、 平成 1 4年 1 1 月 8日より寄託されている。 ：

また p f 1の単独変異株は、 MT— 1 0 9 3 4には H f r Cの性質があるため 任意の F—の性質をもつ野生株、 例えば MG 1 6 5 5、 W 3 1 1 0などと L B培 地中で 2時間混合後、 希釈してシングルコロニーを取得し、 所望の変異株を選択 すればよい。 p f 1変異株は嫌気培養において、 野生株と比較してギ酸の生成量 が低下しているのでそれらを指標に選択することでも取得できる。

本発明の培養とは、 培地を用いて本発明に係る微生物を培養することである。 その際、 使用される培地としては、 炭素源、 窒素源、 無機イオン、 及び乳酸を生 産するために微生物が要求する有機微量元素、 核酸、 ビタミン類等が含まれた培 地であれば特に制限はない。 本発明における 2種以上のアミノ酸が添加された培地とは、 天然に存在する各 種アミノ酸の中から少なくとも 2種以上を含有する培地を意味し、 酵母エキス、 カザミノ酸、 ペプトン、 ホエー、 廃糖蜜、 コーンスティープリカ一などの天然物 や天然物抽出物の加水分解物を含有する培地も含む。 より好ましい結果を得るた めには酵母エキス、 ペプトン、 ホエー、 廃糖蜜、 コーンスティ一プリカ一より選 ばれる少なくとも 1種類、 もしくはそれらの混合物が 0. 5%から 20%含む培 地が好ましく、 2%から 15%ではさらに好ましい。 特にコーンスティープリカ 一添加は大きな効果が得られ、 このとき硫酸アンモニゥムなどの塩は添加しない ほうがむしろよい結果となる。 培地は通常液体培地である。

' 培養条件としては作成された菌体、 培養装置により変動するが、 例えば p.f 1 活性が低減化された MT— 10934を使用する場合は、 培養温度は 20 ,から 40°C、 より好ましくは 25 から 35でで培養することが好ましく、 pHは N aOH、 NH₃等で 6. 0から 7. 2、 より好ましくは 6. 5から 6. 9で調整 し、 培養することが好ましい。 培養時間は得に限定されないが、 菌体が十分に増 殖し、 且つ乳酸が生成するに必要な時間である。

また、 p f 1活性が不活化されたェシエリヒア 'コリ野生株 MG1655の p f 1遺伝子破壊株を用いた場合には、 中性もしくは中性よりややアルカリ性側の pHで最大の生産性を得られ、培養 pHは 6. 9から 7. 4、より好ましくは 7. 1から 7. 3である。 培養温度は MT— 10934より高温で培養することが可 能となり 33 から 42°Cで培養することで最大の生産性を得ることができる。 培養に際しては通常は温度、 pH、 通気条件、 攪拌速度を制御し得る培養槽を 用いるのが一般的であるが、 本発明の培養に際しては培養槽を使用することに限 定されない。 培養槽を用いて培養する場合には、 必要により、 予め前培養として 種培養を行いこれを必要量予め調製しておいた培養槽内の培地に接種してもよい。

MT— 10934は、 pH7〜7. 5の p H領域でギ酸が生成することがある のに対して MG1655の p f 1遺伝子破壊株では、 本発明の培養方法ではギ酸 の生成は確認されない。 よって、 ヘテロ醱酵性細菌としてェシエリヒア ·コリを 用いる場合は、 採用した菌体で中性付近の P Hの培地を用いて乳酸を生産させた 場合に MT— 1 0 9 3 4のようにギ酸の生成が観察されたときは、 実際の乳酸の 製造に際しては培地の P Hを中性よりやや酸性側で制御し、 MG 1 6 5 5の p f 1遺伝子破壊株のようにギ酸の生成が観察されない場合は実際の乳酸の製造に際 しては培地の p Hを中性もしくはややアル力リ性側に制御することで最大生産性 が得られる。

本発明における培養物とは、 上述した方法により生産された菌体、 培養液、 及 びそれらの処理物を指す。

以上のようにして得られた培養液等の培養物から乳酸を回収する方法は、 例え ば培養液からならば通常知られた方法が利用でき、 例えば酸性化した後直接蒸留 する方法、 ラクチドを形成させて蒸留する方法、 アルコールと触媒を加えエステ ル化した後蒸留する方法、 有機溶媒中に抽出する方法、 イオン交換カラムで分離 する方法、 電気透析により濃縮分離する方法などやそれらを組み合わせた方法が 採用できる。 また、 本発明の方法により生産された菌体は、 乳酸の生産に適した 酵素群を生産していることから、 これを利用してさらに乳酸を生産し、 回収する ことも培養物から乳酸を回収する方法の一部とみなされる。

本発明におけるェシエリヒア ·コリ由来 NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナ ーゼ （l d h A) とは、 ピルビン酸と NAD Hから D—乳酸と NADを生成する ェシエリヒア ·コリ由来の酵素であり、 具体的には B u n c hら （Microbiology 143 (Pt 1)， 187-195 (1997) ) が取得した遺伝子、 またはェシエリヒア ·コリの ゲノム D N Aを铸型に配列番号 3および配列番号 4より P C Rにより増幅される D NAフラグメントに含まれる配列をもつ遺伝子より生産される酵素を例示でき る。

本発明において 1 d h A活性が増強されたとは、 1 d h Aをコードする遺伝子 の突然変異及び/または遺伝子組み換えにより、 それらの処理を行う前の状態よ りも有意に 1 d h Aをコードする遺伝子より生産される酵素の活性が増加した状 態を指す。 本発明における細菌とは一般の原核細胞の微生物である。

本発明において 1 d h A活性が増強され、 かつ P f 1活性が不活化あるいは低 減ィ匕された細菌の例として、 本発明実施例記載の MT— 1 0 9 3 4 / p G 1 y 1 d h Aを例示できる。 本菌株は上記 〔1〕 に記載した、 ピルべートホルメートリ ァーゼ （p f 1 ) の活性が不活化あるいは低減化されたヘテロ乳酸発酵細菌を 2 種以上のアミノ酸が添加された培地で培養し、 得られた ^養物から乳酸を回収す ることを特徴とする乳酸の生産方法に好適に利用することが出来る。

本発明における 1 d h A活性を増強する方策の一つとして、 1 d h Aをコード する遺伝子を、 解糖系、 核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発 現を司る遺伝子のプロモーターと連結した状態で発現プラスミドに組込み、 それ を所望の細菌へ導入する方法が有効である。 その場合の解糖系、 核酸生合成系又 はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、 恒 常的に細菌内、 好ましくはェシエリヒア ·コリ内で機能する強力なプロモーター 'で、 且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターを指し、 具 体的にはダリセルアルデヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターゃセリン ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ （g 1 y A) プロモーターが例示できる。 このよゔにして得られた細菌は、 通気条件下で D—乳酸を生産させる時に 1 d h Aの発現が増強されていないものと比較して D—乳酸の蓄積量が向上し、 不純物 のピルビン酸濃度が減少すると共に D—乳酸の光学純度が向上させることが可能 となる。

本発明における F AD依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （d 1 d ) とは、 D— 乳酸から、 補酵素である酸化型フラビンアデニンジヌクレオチドの存在下でピル ビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を意味する。

本発明における微生物とは、 D—乳酸生産能を有する微生物であれば特に制限 はなく、 D—乳酸生産能を有さない微生物であっても、 何らかの改変を加えるこ とによって D—乳酸生産能を有するようになった微生物をも含む。

本発明における d 1 d活性が不活化あるいは低減化されている、 且つ または p f 1活性が不活化あるいは低減化されている、 且つ/または 1 dhA活性が増 強されていることを特徴とする微生物として、 ェシエリヒア ·コリ MT— 109

94 (FERM BP— 10058) 株が例示できる。

本発明における解糖系、 核酸生合成系、 またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白 質の発現を司る遺伝子のプロモー夕一とは、 恒常的に微生物内で機能する強力な プロモーターで、 かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモー夕 一で、 具体的にはダリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ （以下 GAP DHと呼ぶことがある） のプロモーターゃセリンヒドロキシメチルトランスフエ ラーゼのプロモーターが例示できる。

本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有する R N Aポリメ;ラーゼが結 合し、 転写を開始する部位を意味する。 例えばェシエリヒア 'コリ由来の GAP DHフロモー夕一は G e n B a n k ac c e s s i on numbe r X 0 2662の塩基配列情報において、 塩基番号 397 -440に記されている。 本発明における 1 dhAをコードする遺伝子がゲノム上において、 解糖系、 核 酸生合成系、 またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロ モー夕一を使用することで該 1 dhAを発現し、 p f 1活性が不活化あるいは低 減化されている、 且つノまたは d 1 d活性が不活化あるいは低減化されているこ とを特徴とする微生物としては、 ェシエリヒア 'コリ MT— 10994 (FER M BP— 10058) 株を例示することができる。

ェシエリヒア ·コリ MT— 10994株は、 1 dhA遺伝子をゲノム上におい て GAP DHプロモーターと機能的に連結することで発現させており、 また遺伝 子破壊により p f 1 B、 d 1 dが不活化しているため、 これを用いて容易に本発 明を実施することが可能である。 本菌株は、 FERM BP— 10058の寄託 番号で、 茨城県つくば市東 1丁目 1番 1号中央第 6の独立行政法人産業技術総合 研究所 特許生物寄託センターに、 特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に 関するブタペスト条約に基いて、 平成 16年 3月 19日より寄託されている。 本発明において TC A回路とは、 糖 ·脂肪酸 ·多くのアミノ酸などの炭素骨格 を最終的に完全酸化するための代謝経路であり、 クェン酸回路、 トリカルボン酸 回路、 クレプス回路とも呼ばれる。

本発明におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ (md h)とは、国際生化学連合（ I . U. B . ) 酵素委員会報告に準拠した酵素番号 1 . 1 . 1 . 3 7に分類され、 リン ゴ酸から、 補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下 でォキサ口酢酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。

本発明における md h活性が不活化または低減されている微生物であって、 p f 1活性が不活化または低減されている、 且つ/または d 1 d活性が不活化または 低減されている微生物としては、 ェシエリヒア ·コリ MT— 1 0 9 9 4株を例示 できる。 本菌株は上記 〔1〕 に記載した、 ピルペートホルメートリア一ゼ （p f 1 ) の活性が不活化あるいは低減化されたヘテロ乳酸発酵細菌を 2種以上のアミ ノ酸が添加された培地で培養し、 得られた培養物から乳酸を回収することを特徴 とする乳酸の生産方法に好適に利用することが出来る。

本発明におけるァスパラギン酸アンモニアリア一ゼ （a s p A) とは、 国際生 化学連合 （I . U. B . ) 酵素委員会報告に準拠した酵素番号 4. 3. 1 . 1に分 類され、 ァスパルターゼとも呼ばれる酵素である。 本酵素は L—ァスパラギン酸 からフマル酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を意味する。

本発明で得られた微生物を培養して乳酸を生産させる際には、 通気を全く行わ なくとも良いが、 より好ましい結果を得るためには通気を行った方がよい。 ここ で言う通気条件下とは必ずしも培養液中を空気が通過する必要はなく、 培養槽の 形状によっては適度に培養液を撹拌しながら培養液上の空気層が換気されるよう な上面通気も含み、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。 液中に通気する場合は内圧、 撹拌羽根位置、 撹拌羽根形状、 撹拌速度の組み合わ せにより溶存酸素濃度が変化するために乳酸の生産性および乳酸以外の有機酸量 などを指標に次のように最適条件を求めることができる。 例えばェシエリヒア · コリ MT— 1 0 9 3 4株を AB L E社製培養装置 BM J— 0 1等の比較的小型の 培養槽で培養する場合は、 5 0 0 gの培養液を使用した際、 空気を常圧で 0 . 0 1 v vm〜l v vm、 撹拌 度 50 r pm〜500 r pm、 より好ましくは、 常 圧で 0. lvvm〜0. 5 v vm、 撹拌速度 100 r pm〜400 r pmで達成 し得る通気条件で好ましい結果を得ることができる。 この条件は通気撹拌条件が 温度 30 の水を対象とした場合常圧で酸素移動速度係数 k L aが 1 h— 1以上 400 h— 1となる条件で達成し得る酸素供給を可能とする条件である。

また、 最適な通気条件の別の指標としては MT— 10934株が嫌気培養で生 産するギ酸、 酢酸、 コハク酸、 エタノールが 5. OgZL以下、 さらに好ましく は 1. OgZL以下になり且つ、 乳酸が生産されるような通気量、 撹拌速度によ り達成される通気条件である。

また、 最適な通気条件の別の指標としては 0. 3%の光学異性体である L_乳 酸を含む培地で MT— 10934株を培養した際に 10〜100時間以内に L— 乳酸の濃度が 0. 02%以下に低下するような通気量、 攪拌速度である。

上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、 培養工程の 一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。

また、 上記のように通気を行うことで乳酸の生産性の向上、 光学異性体の削減 を達成することができる。

以下に実施例により本発明の一例を示すが、 これらは本発明をなんら制限する ものではない。

[実施例 1] MT— 10934株による乳酸生産

培養に使用する培地の組成を下記表 1に記載する。

膽

ブドウ糖 10%

コーンスティープリカ一 （日本食品化工製） 5%

硫酸アンモニゥム 0. 5%

リン酸水素ニナトリウム 12水和物 0 3%

リン酸ニ水素力リゥム 0 15%

塩化ナトリウム 0, 15%

硫酸マグネシウム 7水和物 0, 1 %

アデ力ノール LG 126 0, 1 % 本培地にはコーンスティープリカ一由来の酸加水分解後の還元糖 0. 34%、 D—乳酸 0. 31 %、 L—乳酸 0. 31%、 遊離アミノ酸 0. 33%及び微量の 各種有機酸が含まれている。

前培養として三角フラスコに入れた LB B r o t h, Mi l l e r培養液 (D i f c o 244620) 25mlにェシエリヒア ·コリ MT— 10934株 を植菌し、 一晩 120 r pmで撹拌培養を行った後、 1 L容培養槽 （ABLE社 製培養装置 BM J—01) に上記組成の培地 475 gを入れたものに全量植菌し た。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5 V vm、 撹拌速度 150 r pm、 培養温度 3 It、 pH6. 7 (NaOHで調整） でグルコースが完全に消費されるまで行つ た。

培養終了後、 得られた培養液中の有機酸の定量および光学純度の測定は HP L Cで定法に従って測定した。 結果を表 2に示す。 表 2

MG1655 (wild) MT-10934

D-乳酸蓄積量 54.9g/kg培溶液 90.5g/kg培養 培養液回収量 540g 570g

乾燥菌体重量 3.5g/L 2.2g/L

D -乳酸光学純度 99.9%ee以上 99.9 ee以上 . コハク酸 6.2g/L N. D〈0.2g/L ギ酸 1.8g/L N.D <0. lg/L 酢酸 2. g/L N.Dく 0. lg/L エタノール 0.8g/L N.Dく 0. lg/L 培養開始 50hr後の D-乳酸蓄積量 46.5g/kg 58.2g/kg

N.D:Not detected 上記結果において、 総乳酸量が培養開始時に加えたグルコース量を上まわって いる原因はコーンスティ一プリカ一中の炭素源を利用したためと考えられる。 し かしながら、 コーンスティ一プリカ一中の還元糖、 有機酸、 アミノ酸をすベて使 用したとしても 90%以上の変換率を達成した。 また、 培地中に不純物である有 機酸や乳酸の光学異性体の含まれる培養液を使用しても不純物である有機酸が減 少し、 光学純度が高い乳酸が製造された。

なお、 MG1655はアメリカン'タイプ'カルチャー，コレクション （AT CC) より ATCC47076として入手した。

[実施例 2] 1 d h A発現ベクターおよび乳酸生産菌の構築

セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ

(serine hydroxymethyl transferase) (g 1 y A) プロモーターを取得するため大 腸菌ゲノム DNAをテンプレートに用いて配列番号 1、 及び配列番号 2をプロ ーブとして用いることにより PCR法で増幅し、 得られたフラグメントを制限酵 素 Ec oR Iで消化することで約 850 bpの g 1 y Aプロモーターをコードす るフラグメントを得た。 さらに 1 dh Aの構造遺伝子を取得するためにェシエリ ヒア ·コリのゲノム DNAをテンプレートに用いて配列番号 3 、 及び配列番号 4をプローブとして用いることにより P C R法で増幅し、 得られたフラグメント を制限酵素 E c o R I及ぴ H i nd I I Iで消化することで約 1. Okbpの 1 dh A構造遺伝子フラグメントを得た。 上記の 2つのフラグメントとプラスミド pUC 18を制限酵素 E c oR I及び H i nd I I Iで消化することで得られる フラグメントとを混合し、 DNAリガーゼを用いて結合した後、 大腸菌に形質転 換することによりプラスミド pG 1 y 1 dhAを得た。

得られたプラスミド pG 1 y 1 dhAをェシエリヒア 'コリ MT— 10934 株に形質転換することにより乳酸生産菌 MT— 10934/pG 1 y 1 dhA株 を得た。

尚、 pUC 18はアメリカンタイプカルチヤ一コレクションより入手できる A TCC 37253から定法により抽出することにより得られる。 また、 MT— 1 0934株は、 上記寄託番号により、 茨城県つくば市東 1丁目 1番 1号中央第 6 の、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成 14年 11 月 8日より寄託されている。

[実施例 3] 乳酸生産菌 MT— 10934/pG 1 y 1 dhA株による乳酸 生産

前培養として三角フラスコにいれた LB B r o t h, M i 1 1 e r培養液 (D i f c o 244620) 25mlに実施例 2で得られた乳酸生産菌 MT— 1 0934/pG 1 y 1 dhA株を植菌し、 実施例 1に記載の方法で培養を行った。 培養終了後、 乳酸の定量および光学純度の測定は HP L Cで定法にしたがって測 定した。 結果を表 3に示す。 表 3

D—乳酸蓄積量 94gZkg培養液

570 g

2. 0 g

D—乳酸光学純度 99. 9 % e e以上

培養開始 50 h r後の D—乳酸蓄積量 65. 2 g/g一 上記結果において、 総乳酸量が培養開始時に加えたグルコース量を上まわって いる原因はコーンスティ一プリカー中の炭素源を利用したためと考えられる。 し かしながら、 コーンスティープリカ一中の還元糖、 有機酸、 アミノ酸をすベて使 用したとしても 90%以上の変換率を達成した。

[実施例 4] ェシエリヒア ·コリ p f 1遺伝子の近傍領域のクローニング ェシエリヒア ·コリのゲノム DN Aの全塩基配列は公知であり （Ge nB a n k ac c e s s i on numbe r U 00096 )，ェシエリヒア'コリ のピルペートホルメートリア一ゼ （以下 p f 1と呼ぶことがある） をコードする 遺伝子の塩基配列も報告されている （Ge n b an k ac c e s s i on n umbe r AE 000192)₀ p f 1をコードする遺伝子 （ 2， 283 b p) の塩基配列近傍領域をクローニングするため、 配列番号 5、 6、 7及び 8に示す オリゴヌクレオチドプライマーを 4種合成した。 配列番号 6、 7のプライマーは 5 '末端側に S p h I認識部位を有している。

ェシエリヒア · 3UMG 1655株のゲノム DNAを、 Cur r en t Pr o t oco l s i n Mo l ecu l ar B i o l ogy (J o nW i 1 ey & Sons) 記載の方法により調製し、 得られたゲノム DNA 1 μ, g と、 配列番号 5の塩基配列を有するプライマ一と配列番号 6の塩基配列を有する プライマー、 配列番号 7の塩基配列を有するプライマーと.配列番号 8の塩基配列 を有するプライマーの組み合わせで、 上記プライマー DN A各々 100 pmo 1 とを用いて、 通常の条件で PCRを行うことにより約 1. 8 kb (以下 p f I B 一 L断片と呼ぶことがある） 及び、 約 1. 3 kp (以下 p f 1 B— R断片と呼ぶ ことがある） の DNA断片を増幅した。 この DNA断片をァガロース電気泳動に て分離、 回収し、 p f 1 B— L断片を H i n d I I I及び S p h Iで、 p f 1 B — R断片を Sph I及び P s t Iでそれぞれ消化した。 この消化断片 2種と、 温 度感受性プラスミド pTH 18 c s 1 (Ge nB ank a c c e s s i on n umb e r AB 0 1 9 6 1 0) (Hashimoto— Gotoh, T.， et.al., Gene, Vol.241(1), ppl85-191 (2000)) ©H i nd i I I及び P s t I消化物とを T 4 DNAリガーゼで反応した後、ェシエリヒア ·コリ D H 5. a;コンビテントセル（宝 バイオ） に形質転換して、 p f 1 Bをコードする遺伝子の 5 '上流近傍断片と 3 '下流近傍断片の 2つの断片を含むプラスミドを得、 ρΤΗΔρ f 1と命名した。

[実施例 5] ェシエリヒア ·コリ MG1655株 p f 1遺伝子破壊株の作製 実施例 4で得たプラスミド ρΤΗΔρ f 1をェシエリヒア ·コリ MG 1655 株に形質転換し、 細胞が温度感受性プラスミドを保持できる 30 でクロラムフ ェニコール 1 O^gZmlを含む LB寒天プレート上で一晩培養し、 形質転換体 を得た。 得られた形質転換体を LB培地で 30でで 3時間から一晩培養後、 LB 液体培地または生理食塩水で適当に希釈して、 クロラムフエ二コール 10 g mlを含む LB寒天プレート上に塗布した。 この LB寒天プレートを、 温度感受 性プラスミドを保持できない 42 で培養し、 生育した形質転換体をゲノム外一 ゲノム間相同組換えによりプラスミド全長がェシエリヒア ·コリゲノムに組み込 まれた株として得た。

この株からゲノム DNAを取得し、 これを铸型とした PCRを実施して、 pT HI 8 c s 1が有するクロラムフエ二コール耐性遺伝子がゲノム上に存在するこ と、 および p f 1 Bをコードする遺伝子の 5 '側近傍領域、 及び 3 '側近傍領域 のそれぞれと相同な領域がゲノム上に存在することをもつてプラスミド全長がェ シエリヒア ·コリゲノムに組み込まれた株であることを確認した。 プラスミド全長がェシエリヒア ·コリゲノムに組み込まれた株を、 ク nラムフ ェニコールを含まない LB液体培地 20mlを入れた 100mlのパッフル付き フラスコに植え、 これを 3 で 4時間振とう培養した。 この培養液を適当にク 口ラムフエ二コールを含まない LB液体培地で希釈し、 クロラムフエ二コールを 含まない LB寒天培地上に塗布する。 これを 42でで培養して生育したコロニー を無作為に 96個選抜し、 それぞれをクロラムフエ二コールを含まない LB寒天 培地上と、 クロラムフエ二コールを含む LB寒天培地上に生育させ、 クロラムフ ェニコール感受性の株を選抜した。

さらに選抜された株からゲノム DNAを取得し、 これを铸型とした PC Rを実 施して p f 1をコードする遺伝子が欠損した株を選抜し、 これを MG 1655 Δ p f 1 B株と命名した。

[実施例 6] カザミノ酸を用いた MG1655Δρ f 1株による乳酸の生産 前培養として三角フラスコに LB Bro t , 1 1 161"培養液 （0丄 f c o244620) 25 gを入れたものを複数用意した。 これに乳酸生産菌 M G 1655、 MG 1655 Δ p f 1株、 および MG 1655 Δ p f 1株に実施例 2に記載のプラスミド pG 1 y 1 dhAを定法により組み換えた MG 1655 Δ p f 1 /pG 1 y 1 dhAの 3種類の菌株を別々に植菌し、 一晚、 30 、 1 20 r pmで撹拌培養を行った後、 1 L容の培養槽 （AB L E社製培養装置 BM J - 01) に表 4に示す培地 475 gを入れたものにそれぞれ全量植菌した。 培 養は大気圧下、 通気量 0. 5vvm、 撹拌速度 200 rpm、 培養温度 31 、 ρΗ6. 7 (NaOHで調整） で 50時間行った。 培養終了後、 得られた培養液 中の乳酸の定量および光学純度の測定は HP LCで定法に従って測定した。 結果 を表 5に示す。 表 4

培地組成

Gl ucos e 100 g/L

Na₂HP0₄ · 12H₂0 6. 0 g/L

KH₂P0₄ 0 g/L

NaC 1 0 g/L

Mg S〇₄ · 7 a q 1 g/L

酵母エキス 5 g/L

カザミノ酸 0 g/L 表 5

MG1655 MG1655 Apfl MG1655Apfl /pGlyldhA

D—乳酸蓄積量 28 g/L 58 g/L 63. 7 g/L

[実施例 7] コーンスティ一プリカ一を用いた MG 1655 Δ p f 1による乳 酸の生産

前培養として三角フラスコに入れた培養液 25 gに MG 1655、 MG 165 5 Δρ f 1、 および MG1655Ap f l/pGl y l dh Aを別々に植菌し、 一晩 30Ό、 120 r pmで撹拌培養を行った後、 1 L容培養槽 （AB L E社製 培養装置 BMJ— 01) に表 6に示す培地 475 gを入れたものに別々に全量植 菌した。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5vvm、 撹拌速度 300 rpm、 培養温 度 35で、 pH7. 2 (NaOHで調整） で 24時間行った。 培養終了後、 得ら れた培養液中の乳酸およびピルビン酸の測定は HP L Cで定法に従って測定した。 結果を表 7に示す。 表 6 ブドウ糖 10 %

コーンスティ一プリカ一 （日本食品化工製） 5%

アデ力ノール LG 126 0. 1 %

MG1655 MG1655Apfl MG1655Apfl/pGlyldhA

D -乳酸蓄積:量 52g/L 95g/kg培養液 95g/kg培養液

培養液回収量 520g 560g 560g

乾燥菌体重量 2.5g/L 2.5g/L 2.5g/L

ピルビン酸 l.lg/L l.lg/L 0.3g/L

培養時間 24時間 24時間 24時間 上記結果において、 総乳酸量が培養開始時に加えたグルコース量を上まわって いる原因はコーンスティープリカ一中の炭素源を利用したためと考えられる。 し かしながら、 コーンスティ一プリカ一中の還元糖、 有機酸、 アミノ酸を全て使用 したとしても 90 %以上の変換率を達成した。

[実施例 8] 高ダルコ一ス濃度下での MG 1 655 Δρ f 1株による乳酸の高 前培養として三角フラスコにいれた培養液 25 gに MG1655 Δρ f 1を植 菌し、 一晩 120 r pmで撹拌培養を行った後、 AB L E社製培養装置 BM J— 01の培養槽に表 8に示すグルコース濃度を 10%〜15%まで変化させた培地 475 gを入れたものに全量植菌した。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5 vvm、 撹拌速度 300 rDm、 培養温度 35 、 pH7. 2 (N a OHで調整） でグル コースが枯渴するまで行った。 培養終了後、 乳酸の測定は HP LCで定法にした がって測定した。 結果を表 9に示す。 表 8

mm

ブドウ糖 10%、 2 %, 15% コーンスティープリカ一 （日本食品化工製） 5 %

アデ力ノール LG126 0. 1 % 表 9

グルコース濃度 0% 2% 5%

95g/kg培養液 112g/kg培養液 130g/kg培養液 培養液回収量 560g 567g 580g

2.5 g/L 2.5g/L 2.5g/L 総乳酸量が培養開始時に加えたグルコース量を上まわる原因はコーンスティープ リカー中の炭素源を利用したためと考えられる。 しかしながら、 コーンスティー プリカ一中の還元糖、 有機酸、 アミノ酸をすベて使用したとしても 90%以上の 変換率を達成し、 かつ 130 g/Lというこれまでにない高い蓄積量を達成した。

[実施例 9] MG 1655Ap f 1株によるコーンスティープリカ一添加量の 検討

前培養として三角フラスコにいれた培養液 25 gに MG 1655 Δρ f 1を植 菌し、 一晩 120 r pmで撹拌培養を行った後、 AB L E社製培養装置 BM J— 01の培養槽に表 10に示すコーンスティ一プリカ一濃度を 1〜10%まで変化 させた培地 475 gを入れたものに全量植菌した。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5vvm、 撹拌速度 300 r pm、 培養温度 35で、 pH 7. 2 (N a OHで調 整） で 24時間行った。 培養終了後、 乳酸の測定は HPLCで定法にしたがって 測定した。 結果を表 11に示す。 表 10

I.成

ブドウ糖 10%

CSL (日本食品化工製） 1%、 2. 5%、 5%、 10% アデ力ノール LG 126 0. 1 %

表 1

CSL % 2. 5% 5% 10%

D—乳酸蓄積量 55 g/L 90 gXL 94 g/ 1 96 g/L

1%のコーンスティ一プリカ一添加区では生産速度の低下が観察されたものの 2 4時間で 55 gZLとこれまでにない生産速度である。 また、 使用したダルコ一 スに対する乳酸への変換率は 90 %以上を維持していた。

[実施例 10] MG1655 Δρ f 1株による通気条件による解糖速度への影 響

前培養として三角フラスコにいれた培養液 25 gに MG 1655 Δρ f 1株を植 菌し、 一晩 120 r pmで撹拌培養を行った後、 AB L E社製培養装置 BM J— 01の培養槽に表 12に示す培地 475 gを入れたものに全量植菌した。 培養は 大気圧下、 通気条件は表 13に示す条件、 培養温度 35 、 ρΗ7.' 2 (NaO Hで調整） で 24時間行った。 残存グルコース量はグルコース C I I—テストヮ コー （和光純薬工業） により測定した。 表 12

編 ，

ブドウ糖 12%

C S L (日本食品化工製） 5 「 % o/ アデ力ノール LG 126 0. 1 %

表 13

試験!^ 1 2 3 4

通気量 (vvm) 0 0. 5 0. 5 0. 5 攪拌速度 (rpm) 200 200 400 600

表 14

試験区 1 2 3 4

ク レコース残存量

(g/L) 59. 4 39. 4 21. 7 67. 9 この試験により通気条件が向上するに従い解糖速度が向上し、 通気条件を向 上させすぎると解糖速度が低下することがわかる。

[実施例 11] MG 1655Ap f lZpGl y l dhA株によるコーンステ ィープリカ一添加量の検討

前培養として三角フラスコにいれた培養液 25 gに MG 1655 Δρ f 1 B/ pG 1 y 1 dhAを植菌し、 一晩 120 r pmで撹拌培養を行った後、 ABLE 社製培養装置 BMJ— 01の培養槽に表 15に示すコーンスティープリカ一濃度 を 1〜10%まで変化させた培地 475 gを入れたものに全量植菌した。 培養は 大気圧下、 通気量 0. 5vvm、 撹拌速度300 1!1、 培養温度 35°C、 pH 7. 2 (NaOHで調整） で 24時間行った。 培養終了後、 D—乳酸の測定は H PLCで定法にしたがって測定した。 結果を表 16に示す。 表 15

培地組成

ブドウ糖 10%

CSL (日本食品化工製） 1 。、 厶 · 5 %、 5%、 10% アデ力ノール LG 126 0. 1 %

表 16

CSL 1 % 2. 5% 5% 10%

D—乳酸蓄積量 58g/L 92 g/L 96 g/1 97 g/L

1 %のコーンスティ一プリカ一添加区はこの中では最も低い生産性であるが、 24時間で 58 gZLと従来にない生産速度である。 また、 使用したグルコース に対する D—乳酸への変換率は 90 %以上を維持していた。

[実施例 12] MG1655Ap f 1/pGl y l dhA株による通気条件に よる解糖速度への影響

前培養として三角フラスコにいれた培養液 25 gに MG1655 Δρ f 1 B/ pG 1 y 1 dhAを植菌し、 一晩 120 r pmで撹拌培養を行った後、 ABLE 社製培養装置 BMJ— 01の培養槽に表 17に示す培地 475 gを入れたものに 全量植菌した。培養は大気圧下、通気条件は表 18に示す条件、培養温度 35 、 PH7. 2 (NaOHで調整） で 24時間行った。 残存グルコース量はダルコ一 ス CI I—テス卜ヮコー （和光純薬工業） により測定した。 表 17

鍾

ブドウ糖 12%

CSL (日本食品化工製） 5%

アデ力ノール LG126 0. 1 %

表 18

試験区 1 2 3 4 通気量 (vvm) 0 0. 5 0. 5 0. 5 攪拌速度（rpm) 200 200 400 600

表 19

試験区 1 2 3 4

グルコース残存量.

(g/L) 59. 4 36. 6 20. 1 54. 5 この試験により通気条件が向上するに従い解糖速度が向上し、 通気条件を向上 させすぎると解糖速度が低下することがわかる。

[実施例 13] ェシエリヒア ·コリ MG1655株 d 1 d遺伝子欠失株の作製 MG1655株由来ゲノム DNAの d 1 d遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づ いて作製された、 CAACACCAAGCTTTCGCG (配列番号 9) と T TCCACTCCTTGTGGTGGC (配列番号 10)、 AACTGCAGAA ATTACGGATGGCAGAG (配列番号 11 ) と TGTTCTAGAAA GTTCTTTGAC (配列番号 12) を用いて PCRを行った。 得られたフラ グメントをそれぞれ、 制限酵素 H i nd l l lと P s t I、 P s t Iと Xb a l で消化することにより、 それぞれ約 1 140 bpの フラグメントを得た。 この フラグメントを温度感受性プラスミド ρΤΗ 18 c s 1 (Hashimoto- Got oh， T.， et.al., Gene, Vol.241(1), ppl85-191 (2000)) を H i n d I I I，、 Xb a Iで 消化して得られるフラグメントと混合し、 リガーゼを用いて結合した後、 DH5 α株に 30"Cで形質転換し、 クロラムフエ二コール 1.0 M gZmlを含む LB寒 天プレートに生育する形質転換体を得た。 得られたコロニーをクロラムフエニコ ール 10 /m 1を含む LB液体培地で 30 で一晩培養し、 得られた菌体か らプラスミドを回収した。 このプラスミドを MG 1655株に 30°Cで形質転換 し、 クロラムフエ二コール 10 g/m 1を含む LB寒天プレートに生育する形 質転換体を得た。 得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、 30 で一晩培 養した。 次にこれらの培養菌体をが得られるようにクロラムフエ二コール 1 O g/m 1を含む LB寒天プレートに塗布し、 42でで生育するコロニーを得た。 さらにもう一度、 42でで生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、 相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。 本 クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。

次に上記クローンを LB寒天プレートに塗布し、 30°Cで一晩培養した後に、 LB液体培地 （3mlZ試験管） に接種し、 421で3〜4時間、 振とう培養し た。 これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈（10一²〜 10— ⁶程度） し、 LB寒天プレートに塗布し、 .42 で一晩培養し、 コロニーを得た。 出現し たコロニーの中から無作為に 100コロニ一をピックアップしてそれぞれを LB 寒天プレートとクロラムフエ二コール 10 g/m 1を含む LB寒天プレートに 生育させ、 L B寒天プレートにのみ生育するクロラムフエ二コール感受性のク口 ーンを選んだ。 さらにはこれらの目的クローンの染色体 DNAから PC Rにより d i dを含む約 2. O kb断片を増幅させ、 d 1 d遺伝子領域が欠失している株 を選抜し、 以上を満足するクローンを d I d欠失株とし、 得られた株を MG 16 55 Δά 1 d株と命名した。

[実施例 14] MG 1655 Δά 1 d株による D—乳酸生産

前培養として三角フラスコにいれた LB B r o t h, M i l l e r培養液

(D i f c o 244620) 25m lに MG 1655株、 または MG 1655 Δ d 1 d株を植菌し、 一晩、 1 20 r pmで攪拌培養を行った。 各々の前培養液全 量を、 表 20に示す組成の培地 475 gの入った ABLE社製培養装置 BM J— 01の培養槽に移し、 培養を行った。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5 vvm、 撹 拌速度 200 r pm、 培養温度 3 I 、 pH6. 7 (N a OHで調整） で 96時 間行った。 48時間後、 および培養終了後、 HPLCで乳酸、 ピルビン酸、 ギ酸 および酢酸の定量を定法にしたがって測定した。 MG 1655株、 MG 1655 △ d 1 d株それぞれを Wi 1 d、 Δά 1 dと表記して 48時間後の結果を表 21 に、 培養終了時の結果を表 22に示す。 表 20

培地組成

G l u c o s e 100 g/L

Na₂HP0₄ · 12H₂0 6. 0 g/L

(NH₄) ₂S0₄ 6. 0 g/L

KH₂P0₄ 3. 0 g/L

Na C 1 3. 0 g/L

Mg S0₄ · 7 a q 0. 1 g/L

酵母エキス 0. 5 g/L

カザミノ酸 5. 0 g/L 表 2

48時間後の結果

W.i 1 d △ d i d

D一乳酸蓄積量 26 g/L 22 g/L

ピルビン酸蓄積』 4. 5 g/L 1. 1 g/L

5. 0 g/L 1. 55 g/L

14 g/L 9. 5 g/L

表 22

96時間後の結果

Wi l d △ d i d

D—乳酸蓄積量 36 g/L 41 g/L

ピルビン酸蓄積量 5. 84 g/L 1. 26 g/L

3. 4 g/L 0 g/L

12 g/L 11 /L

[実施例 15] ェシエリヒア 'コリ MG 1655 p f 1、 d 1 d遺伝子欠失株 作製

実施例 4で得たプラスミド ρΤΗΔρ f 1を、 MG 1655 Ad 1 d株に形質 転換し、 クロラムフエ二コール 10 [I g/m 1を含む LB寒天プレートに生育す る形質転換体を得た。 得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、 30でで一 晚培養した。 次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフエ二コール 10 gZmlを含む LB寒天プレートに塗布し、 42 で生育するコロニーを得た。 得られたクローンから、 実施例 5と同様に行うことにより MG1655 d 1 d、 P f 1遺伝子欠失株を取得し、 MG 1655 Ap f l Ad l d株と命名した。 [実施例 16] MG 1655 Ad 1 d株、 MG 1655Ap f l Ad l d株へ の 1 d h A発現ベクターの導入

実施例 2で得たプラスミド pG 1 y 1 dhAを、 MG1655 Δ(1 1 d株、 M G1655Ap f l Ad l d株にそれぞれ形質転換することにより、 MG 165 5 Δά 1 d/pG 1 y 1 dhA株、 MG1655 Ap f l Ad l d/pG l y l dhA株を得た。

[実施例 17] MG 1655株、 MG 1655 Ad l d株、 MG 1655 Ap f l株、 MG 1655厶 p f l Ad l d株、 MG 1655 Δ d 1 d/p G 1 y 1 dhA株、 MG 1655Ap f l Ad l d/pG 1 y 10111八株にょる0—乳酸 前培養として三角フラスコにいれた LB B r o t h, M i l l e r培養液 25mlに MG1655株、 MG1655 Ad 1 d株、 MG 1655Ap f 1株、 MG 1655Ap f l Ad l d株、 MG1655Ad l dZpG l y l dhA株、 MG 1655 Ap f l Ad l d/pG l y l d h A株をそれぞれ植菌し、 ー晚、 120 r pmで攪拌培養を行った。 各々の前培養液全量を、 表 20に示す組成の 培地 475 gの入った ABLE社製培養装置 BMJ— 01の培養槽に移し、 培養 を行った。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5vvm、 撹拌速度 200 r pm、 培養 温度 31°C、 pH6. 7 (N a OHで調整） で 96時間行った。 培養終了後、 H PLCで乳酸、ピルビン酸、ギ酸および酢酸の定量を定法にしたがって測定した。 96時間後の結果を表 23に示す。 菌株名はそれぞれ A、 B、 D、 E、 F と表記した。 表 23

培養液中の各種有機酸濃度 (表中の数値の単位は全て gZL)

A B C D E F

D—乳酸蓄積量 40 41. 5 60 61 43 65 ピルビン酸蓄積】； 2. 7 1. 0 2 . 3 1 . 1 0 . 9 0 . 7

4. 0 3. 5 ND ND 3 . 5 ND

11 7. 3 4 . 4 4 . 3 7 . 0 4 . 2

[実施例 18] GAPDHプロモ一夕一制御下 1 dh A発現べクタ一および 1 d h A発現ベクター形質転換体の構築

ェシエリヒア ·コリの 1 dh A遺伝子の塩基配列はすでに報告されている （G enBank ac c e s s i on numbe r U36928) 。 クリセヅレ デヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ （GAPDH) プロモーターを取得するため ェシエリヒア ·コリ MG 1655株のゲノム DNAをテンプレートに用いて AA 、

(配 列番号 14) により PCR法で増幅し、 得られた DNAフラグメントを制限酵素 E c oR Iで消化することで約 100 b pの GAPDHプロモーターをコードす るフラグメントを得た。さらに D—乳酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子（ 1 d h A) を取得するためにェシエリヒア 'コリ MG1655株のゲノム DN Aをテンプレ

C (配列番号 16) により PCR法で増幅し、 得られた DNAフラグメントを制 限酵素 E c oR I及び H i nd I I Iで消化することで約 1. 0 kbpの D—乳 酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子 （1 dh) フラグメントを得た。 上記の 2つの D NAフラグメントとプラスミド pUC 18を制限酵素 E c oR I及び H i nd I I Iで消化することで得られるフラグメントを混合し、 リガーゼを用いて結合し た後、 ェシエリヒア 'コリ DH5 aコンビテントセル （夕カラバイオ社製） に形 質転換し、 アンピシリン 50 g/mLを含む L B寒天プレートに生育する形質 転換体を得た。 得られたコロニーをアンピシリン 5 O gZmLを含む LB液体 培地で LB培地で 30 で一晩培養し、 得られた菌体からプラスミド pGAP 1 dhAを回収した。 このプラスミド pGAP 1 dhAを MG1655 Δρ f 1;Δ d 1 d株に形質転換し、 アンピシリン l gZmLを含む LB寒天プレ トで 3 7で一晩することにより MG 1655Ap f l Ad l d/pGAP 1 dhA株を 得た。

[実施例 19] ェシエリヒア ·コリ MG1655Δρ ί 1 Δά 1 d株のゲノム 上 1 dhAプロモーターの GAPDHプロモーターへの置換

ェシエリヒア ·コリのゲノム DN Aの全塩基配列は公知であり （Ge nBan k ac c e s s i on numbe r U 00096)、 ェシエリヒア ·コリの

1 dhA遺伝子の塩基配列も報告されている （GenB ank a c c e s s i on numbe r U 36928)。 ェシエリヒア ·コ UMG 1655株由来 1 dhA遺伝子の 5' 近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、 AAGGTA CCACCAGAGCGTTCTCAAGC (配列番号 17 ) と GCTCTAG ATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC (配列番号 18 ) を用いて、 ェシエリヒア ·コリゲノム DN Aを铸型として PC Rを行うことにより約 100 0 b pの DNA断片を増幅した。

また、 ェシエリヒア ·コリ MG1655株のダリセルデヒド 3—リン酸デヒド ロゲナーゼ （GAPDH) プロモーターの配列情報に基づいて作製された GGT CTAGAGCAATGATTCACACGATTCG (配列番号 19) とェシ エリヒア ·コリ MG1655株の 1 d h A遺伝子の配列情報に基づいて作製され を用いて、 実施例 18で作製した発現ベクター p GAP 1 (111八を铸型として？ CRを行い、 GAPDHプロモーターと 1 dh A遺伝子の開始コドン近傍領域か らなる約 850 b pの DNAフラグメントを得た。

上記により得られたフラグメントをそれぞれ、 制限酵素 Kpn Iと Xb a I、 Xb a Iと P s t Iで消化し、 このフラグメントを温度感受性プラスミド pTH 18 c s 1を Kpn Iと P s t Iで消化して得られるフラグメントと混合し、 リ ガーゼを用いて結合した後、 DH5 αコンビテントセル （夕カラバイオ社製） に 30 で形質転換し、 クロラムフエ二コール 10 gXm 1を含む LB寒天プレ ートに生育する形質転換体を得た。 得られたコロニーをクロラムフエ二コール 1 O /mlを含む LB液体培地で 30で一晩培養し、 得られた菌体からプラス ミドを回収し、 pTH— GAP 1 d hAと命名した。 p TH— GAP 1 d h Aを MG 1655Ap f l Ad l d株に 30 で形質転換し、 クロラムフエ二コール 1 O g/mlを含む LB寒天プレートに 30 で一晩培養し、 形質転換体を得 た。 得ちれた形質転換体をクロラムフエ二コール 10 § 1111を含む1^8液体 培地に接種し、 30 で一晩培養した。 次にこれらの培養菌体が得られるように クロラムフエニコ一ル 10 UL g/m 1を含む LB寒天プレートに塗布し、 42V, で生育するコ口二一を得た。 得られたコロニーを薬剤を含まない L B液体培地で 301一晩培養し、 さらに薬剤を含まない L B寒天プレートに塗布して 42 で 生育するコロニーを得た。

出現したコロニーの中から無作為に 100コロニーをピックアップしてそれぞ れを薬剤を含まない LB寒天プレートとクロラムフエ二コール 10 n g/m 1.を 含む LB寒天プレートに生育させ、 クロラムフエ二コール感受性のクローンを選 んだ。 さらにはこれらの目的クローンの染色体 DNAから PC Rにより GAPD Hプロモーターと 1 dh A遺伝子を含む約 800 b p断片を増幅させ、 1 dhA プロモーター領域が GAPDHプロモーターに置換されている株を選抜し、 以上 を満足するクロ一ンを MG 1655Δρ ί 1 Δά 1 d/GAP 1 dhAゲノム揷 入株と命名した。 [実施例 20] MG 1655 Ap f l Ad l d株、 MG 1655Ap f 1 Δά

1 d/p GAP 1 dhA株、 MG 1655Ap f l Ad l d/GAP 1 dhAゲ ノム揷入株による D—乳酸生産

前培養として三角フラスコにいれた LB B r o t h, M i 1 1 e r培養液

(D i f c o 244620) 25mLに MG1655Δρ ί 1 Δά 1 d株、 MG 1655Ap f l Ad l d/pGAP 1 dhA株、 MG 1655Ap f l Ad l d&p f 1 B/GAP 1 dhAゲノム揷入株をそれぞれ植菌し、 ー晚、 120 r pmで攪拌培養を行った。 各々の前培養液全量を、 グルコース 120 g/L、 コ ーンスティープリカ一 （日本食品化工製） 5%よりなる培地 475 gの入った 1L容の培養槽 （ABLE社製培養装置 BMJ— 01) に移し、 培養を行った。 培養は大気圧下、通気量 0. 5 V vm、撹拌速度 200 r pm、培養温度 35Χλ ρΗ7. 2 (N a OHで調犛）でグルコースが枯渴するまで行った。培養終了後、 得られた培養液中の D—乳酸蓄積量を H P L Cで定法に従つて測定した。 結果を 図 1に示す。 それぞれの D—乳酸蓄生産性は、 MG 1655 Δ p f 1 Δ d 1 d株 が 48時間で 109. 0 g/L, MG 1655Ap f l Ad l d/p GAP 1 d h A株が 48時間で 115. 6 g/L、 MG 1655Ap f l Ad l d GAP

1 dhAゲノム揷入株が 30時間で 113. 5 gノ乙であった。

[実施例 21] ェシエリヒア 'コリ MG 1655Ap f l Ad l dAmdh株 の作製

ェシエリヒア ·コリのゲノム DN Aの全塩基配列は公知であり （Ge nB an k a c c e s s i on numb e r U 00096)、ェシエリヒア-コリの md h遺伝子の塩基配列も報告されている （Genb ank a c c e s s i o n numbe r AE 000403 )。md hをコードする遺伝子（ 939 b p) の塩基配列近傍領域をクローニングするため、 配列番号 21、 22、 23及び 2 4に示すオリゴヌクレオチドプライマーを 4種合成した。 配列番号 21の塩基配 列を有するプライマーは 5 '末端側に Kpn I認識部位を、 配列番号 22、 23 の塩基配列を有するプライマーは 5 '末端側に BamHI認識部位を、 配列番号 24の塩基配列を有するプライマーは 5 '末端側に Xb a I認識部位をそれぞれ 有している。

ェシエリヒア .コリ MG1655株のゲノム DNAを、 Cu r r en t P r o t o c o 1 s i n Mo l e c u l a r B i o l ogy (J oh nW i 1 ey & S on s )記載の方法により調製し、得られたゲノム DNA 1 z gと、 配列番号 21と配列番号 22、 配列番号 23と配列番号 24の組み合わせで、 上 記プライマー DNA各々 100 pmo 1とを用いて、 通常の条件で PCRを行う ことにより約 800 bp (以下 mdh— L断片と呼ぶことがある） 及び、 約 1， 000 bp (以下 mdh— R断片と呼ぶことがある） の DNA断片を増幅した。 この DNA断片をァガロース電気泳動にて分離、 回収し、 mdh— L断片を Kp η I及び BamH Iで、 md h— R断片を B amH I及び Xb a Iでそれぞれ消 化した。 この消化断片 2種と、 温度感受性プラスミド pTHl 8 c s 1 (Gen B a n k a c c e s s i o n n umb e r AB 0 1 9 6 1 0 )

(Hashimoto— Gotoh, T.， et.al., Gene, Vol.241(1), ppl85-191 (2000)) の Kp 111及び & I消化物とを T 4 DNAリガーゼで反応した後、 ェシエリヒア · コリ DH 5 αコンビテントセル （宝バイオ） に形質転換して、 mdhをコードす る遺伝子の 5 '上流近傍断片と 3 '下流近傍断片の 2つの断片を含むプラスミド を得、 本プラスミドを pTHAmdhと命名した。

プラスミド pTHAmdhをェシエリヒア ·コリ MG 1655Ap f l Ad l d株に形質転換し、 実施例 5と同様の方法に従って、 mdh遺伝子が破壌された MG1655Ap f l Ad l d株を取得した。 本株を MG 1655Δρ ί 1 Δά

1 dAmdh株と命名した。

[比較例 1 ] ェシェリヒア 'コリ MG1655Ap f I BAd l dApp c株の 作製

ェシエリヒア ·コリのゲノム DNAの全塩基配列は公知であり （Ge nB an k ac c e s s i on numbe r U 00096 )、ェシエリヒア.コリの p p c遺伝子の塩基配列も報告されている （Genbank ac c e s s i o n numb e r AE 000469)。 p p cをコードする遺伝子（2， 652 bp) の塩基配列近傍領域をクローニングするため、 配列番号 25、 26、 27 及び 28に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを 4種合成した。 配列番号 26、 27のプライマーは 5 '末端側に Xb a I認識部位を、 配列番号 28のプライマーは 5 '末端側に Sac I認識部位ををそれぞれ有している。 ェシエリヒア ·コリ MG1655株のゲノム DNA1 jtigと、 配列番号 25と 配列番号 26、 配列番号 27と配列番号 28の組み合わせで、 上記プライマー. D NA各々 100 pmo 1とを用いて、通常の条件で P C Rを行うことにより約 1，

450 bp (以下 p p c—L断片と呼ぶことがある） 及び、 約 750 bp (以下 pp c^R断片と呼ぶことがある） の DNA断片を増幅した。 この DNA断片を ァガロース電気泳動にて分離、 回収し、 pp c— L断片を Hi nd I I I及び X b a Iで、 p p c— R断片を Xb a I及び S a c Iでそれぞれ消化した。 この消 化断片 2種と、 温度感受性プラスミド pTHl 8 c s 1の H i nd I I I及び S a c I消化物とを T 4 DNAリガーゼで反応した後、 ェシエリヒア ·コリ DH 5 αコンビテン卜セル (宝バイオ） に形質転換して、 pp cをコードする遺伝子の

5 '上流近傍断片と 3 '下流近傍断片の 2つの断片を含むプラスミドを得て、 こ のプラスミドを ρΤΗΔρ p cと命名した。

プラスミド ρΤΗΔ p p cをェシエリヒア 'コリ MG 1655Ap f 1 Δ d 1 d株に形質転換し、 最終的に pp c遺伝子が破壊された MGl 655株 Δρ f 1 △ d 1 d株を取得した。 本株を MGl 655Ap f l BAd l dApp c株と命 名した。 なお本株を得る詳細な方法は、 本発明の実施例 5に記載された方法に準 じた。

[比較例 2 ]

ェシエリヒア 'コリ MG 1655Ap f 1 Δά 1 άΔ f r d株の作製 ェシェリヒア ·コリの^ —ム DN Aの全塩基配列は公知であり （G e n B a n k ac c e s s i on numb e r U 00096)、ェシエリヒア.コリの f r d遺伝子の塩基配列も報告されている （Genb ank a c c e s s i o n numbe r AE 000487 )。本実施例で欠失を試みる f r d遺伝子は、 f r dAをコードする遺伝子（1， 809 b p)、 f r d Bをコードする遺伝子（ 7 35 b p), f r dCをコードする遺伝子 （396 b p)、 及び f r dDをコード する遺伝子 （360 bp) の 4種類の遺伝子を含む遺伝子である。 f r d遺伝子 の塩基配列近傍領域をクローニングするため、 配列番号 29、 30、 31及び 3 2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ一を 4種合成した。 配列 番号 29のプライマーは 5 '末端側に E c oR I認識部位を、 配列番号 30、 3 1のプライマーは 5 '末端側に BamH I認識部位を、 配列番号 32のプライマ 一はその内部に H i nd I I I認識部位をそれぞれ有している。

ェシエリヒア ·コリ MG1655株のゲノム DNA1 fi gと、 配列番号 29と 配列番号 30、 配列番号 31と配列番号 32の組み合わせで、 上記プライマ一 D NA各々 100 pmo 1とを用いて、 通常の条件で P CRを行うことにより約 6

00 b p (以下 f r d— L断片と呼ぶことがある） 及び、 約 800 bp (以下 f r d— R断片と呼ぶことがある） の DNA断片を増幅した。 この DNA断片をァ ガロース電気泳動にて分離、 回収し、 f r d— L断片を E c oR I及び B amH Iで、 f r d— R断片を B amH I及び H i n d I I Iでそれぞれ消化した。 こ の消化断片 2種と、 温度感受性プラスミド pTHl 8 c s 1の Ec oR I及び H

1 nd I I I消化物とを T 4 DNAリガーゼで反応した後、 ェシエリヒア ·コリ DH5 αコンビテントセル （宝バイオ） に形質転換して、 f r dをコードする遺 伝子の 5一上流近傍断片と 3 '下流近傍断片の 2つの断片を含むプラスミドを得 て、 このプラスミドを ρΤΗΔ f r dと命名した。

プラスミド ρΤΗΔ f r dをェシエリヒア 'コリ MG 1655Ap f l Ad l d株に形質転換し、 最終的に f r d遺伝子が破壊された MG 1655 Δ p f 1厶 d 1 d株を得、 MG 1655Ap f 1 Δά 1 άΔ f r d株と命名した。 本株を得 る詳細な方法は、 本発明の実施例— 5に記載された方法に準じた。

[実施例 22] ェシエリヒア 'コリ MG 1655 Ap f l Ad l dAmdhA a s p株の作製

ェシエリヒア ·コリのゲノム DN Aの全塩基配列は公知であり （Ge nB an k a c c e s s i on numb e r U 00096 )、ェシエリヒア'コリの a s p A遺伝子の塩基配列も報告されている （Ge nb ank a c c e s s i on numb e r AE 000486 )。 a s p Aをコードする遺伝子（ 1， 4 82 b p) の塩基配列近傍領域をクローニングするため、 配列番号 33、 34、 35,及び 36に示すオリゴヌクレオチドプライマーを 4種合成した。

ェシエリヒア ·コリ MG1655株のゲノム DNA1 gと、 配列番号 33と 配列番号 34、 配列番号 35と配列番号 36の組み合わせで、 上記プライマー D NA各々 100 pmo 1とを用いて、 通常の条件で PCRを行うことにより約 9 10 b p (以下 a s p A— L断片と呼ぶことがある）及び、約 1， 100 bp (以 下 a s pA— R断片と呼ぶことがある） の DNA断片を増幅した。 この DNA断 片をァガロース電気泳動にて分離、 回収し、 As pA— L断片と As pA— R断 片の両者ともに DNA B l un t i ng K i t (宝バイオ） で末端を平滑化 した後、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて定法にて 5 '末端をリン酸化し た。 一方温度感受性プラスミド pTHl 8 c s 1は、 Sma I消化後、 アルカリ フォスファターゼにて脱リン酸化処理を行つた。 上記のリン酸化した 2種類の断 片と、 脱リン酸化したプラスミドを T4DNAリガーゼで反応した後、 ェシエリ ヒア ·コリ DH5 αコンビテントセル （宝バイオ） に形質転換して、 a s pAを コードする遺伝子の 5 '上流近傍断片と 3 '下流近傍断片の 2つの断片を含むプ ラスミドを得て、 このプラスミドを pTHA a s pと命名した。

プラスミド pTH厶 a s pをェシエリヒア コリ MG 1655Ap f 1 Ad 1 d厶 mdh株に形質転換し、 最終的に a s p A遺伝子が破壊された MG 1655 Δ p f 1 Δ d 1 d Amd h株を得、 MG 1655Ap f l Ad l d Amd h Δ a s p株と命名した。 本株を得る詳細な方法は、 本発明の実施例 5に記載された方 法に準じた。

[実施例 23] ェシエリヒア 'コリ MG1655Ap f l Ad l dAmdhA a s p株/ GAP 1 dh Aゲノム揷入株の作製

実施例 19で得たプラスミド pTH— GAP 1 dhAを、 ェシエリヒア 'コ リ MG 1655Ap f l Ad l dAmd ίιΔ a s p株に 30でで形質転換し、 ク 口ラムフエ二コール 10 [1 /m 1を含む LB寒天プレートに 3 O でー晚培養 し、 形質転換体を得た。 得られた形質転換体をクロラムフエ二コール 1 O gZ m 1を含む LB液体培地に接種し、 30°Cで一晩培養した。 次にこれらの培養菌 体が得られるようにクロラムフエ二コール 10 a g/m 1を含む LB寒天プレー トに塗布し、 42 で生育するコロニーを得た。 得られたコロニーを薬剤を含ま ない L B液体培地で 30で一晩培養し、 さらに薬剤を含まない L B寒天プレート に塗布して 42でで生育するコロニーを得た。

出現したコロニーの中から無作為に 100コロニーをピックアップしてそれぞ れを薬剤を含まない LB寒天プレートとクロラムフエニコ一ル 10 gZmlを 含む LB寒天プレードに生育させ、 クロラムフエニコ一ル感受性のクローンを選 んだ。 さらにはこれらの目的クローンの染色体 DNAから PC Rにより GAPD Hプロモーターと 1 dhA遺伝子を含む約 800 bp断片を增幅させ、 1 dhA プロモータ一領域が GAP DHプロモーターに置換されている株を選抜し、 以上 を満足するクローンを MG 1655 Δρ f 1 Δά 1 dAmd A a s p/GAP

1 dhAゲノム揷入株と命名した。

[実施例 24 ]

ェシエリヒア'コリ MG1655Ap f l Ad l d Amd h株による D—乳酸、 及びコ八ク酸の生産

前培養として 4本の三角フラスコに入れた LB B r o t h、 M i 1 1 e r培 養液 （D i f co244620) 25mlに、 実施例 15で得たェシエリヒア · コリ MG1655Ap f l Ad l d株、 実施例 21で得たェシェリヒア 'コリ M G1655Ap f Ι Δά Ι dAmd h株、 比較例 1で得たェシェリヒア 'コリ M G1655 Δρ f 1 Δά 1 dApp c株、 比較例 2で得たェシエリヒア ·コリ M G 1655 Δρ f l Ad l dAf r d株を別々に植菌し、 一晩 3 O 、 120 r pmで攪拌培養を行った。 その後、 4台の 1L容培養槽 （ABLE社製培養装置 BMJ—01) に、 表 24に示す培地 475 gを入れたものに、 別々に上記フラ スコ内容物全量を植菌した。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5vvm、 攪拌速度 2 00 r pm,培養温度 35 、 pH7. 2 (N a OHで調整）で 32時間行った。 培養終了後、 得られた培養液中の乳酸、 及びコ八ク酸濃度を HP LCで定法に従 つて測定した。 乳酸蓄積の結果を図 2に、 コハク酸蓄積の結果を図 3に示す。 乳酸については、 Δρ f Δ d 1 dAmdh株が 32時間で 89 g/L蓄積し、 △ p f 1△ d 1 d株と同等の蓄積を示したのに対して、 Δ p f 1 Δ d 1 p p c株、 Δρ f 1 Ad 1 dA f r d株ではそれぞれ 56 gZL、 71 gZLであつ た。 '

コハク酸については、 Δρ f 1 Ad 1 d株が 32時間で 3. 8 gZL蓄積した のに対して、 残る 3株はいずれも蓄積が見られなかった。 表 24

培地組成

ブドウ糖 12%

コーンスティープリカ一 （日本食品化工製） 5%

(残部：水）

[実施例 25] ェシエリヒア 'コリ MG 1655Ap f 1 Δ d 1 dAmdhA a s p株および MG 1655 Δρ f 1 Ad 1 dAmdhA a s /GAP 1 d A ゲノム挿入株による D—乳酸、 及びフマル酸の生産 ' 前培養として 3本の三角フラスコに入れた LB Bro th、 Mi 1 l e r培 養液 （D i f c o 244620) 25m 1に、 実施例 22で得たェシエリヒア . コリ MGl 655Ap f l Ad l dAmdhAa s p株と、 実施例 23で得たェ シエリヒア，コリ MG 1655 Δρ f 1 Ad 1 dAmdhA a s p/GAP 1 d h Aゲノム揷入株、 および実施例 21で得た Δρ f 1 Δά 1 dAmdh株を別々 に植菌し、 一晩 30で、 120 r pmで攪拌培養を行った。 その後、 3台の 1L 容培養槽 （ABLE社製培養装置 BMJ— 01) に、 表 24に示す培地 475 g を入れたものに、 別々に上記フラスコ内容物全量を植菌した。 培養は大気圧下、 通気量 0. 5vvm、 攪拌速度 200 rpm、 培養温度 35^、 pH7. 2 (N a OHで調整） で 48時間行った。 培養終了後、 得られた培養液中の乳酸、 及び フマル酸の濃度を HP L Cで定法に従って測定した。 乳酸蓄積の結果を図 4に、 フマル酸蓄積の結果を図 5に示す。

乳酸については、 Ap f l Ad l dAmdhAa s p株が 48時間で 91 gZ L、 Δρ f 1 Δά 1 dAmdh株が 48時間で 90 gZLと同等の蓄積を示した のに対して、 Δρ f 1 Ad 1 dAmdhA a s p/GAP 1 dh Aゲノム揷入株 では 24時間で 98 gZLの蓄積を示した。

フマル酸については、 Δρ f 1 Ad 1 dAmdh株が 48時間でひ. 037 g ZLの蓄積を示したのに対して、 Δρ f 1 Ad 1 dAmdhAa s p株と Δρ f 1 Δά 1 dAmdhAa s p/GAP 1 dh Aゲノム揷入株では 48時間で 0. 01 g/Lの蓄積を示した。

Claims

請 求 の 範 囲 .

1. ピルペートホルメートリアーゼ （p f 1) の活性が不活化あるいは低減化 されたヘテロ乳酸発酵細菌を 2種以上のアミノ酸が添加された培地で培養し、 得 られた培養物から乳酸を回収することを特徴とする、 乳酸の生産方法。

2. ヘテロ乳酸発酵細菌がェシエリヒア ·コリであることを特徴とする請求項 1に記載の乳酸の生産方法。

3. ェシエリヒア ·コリが MT— 10934 (FERM BP— 10057) 株であることを特徴とする請求項 2に記載の乳酸の生産方法。

4. ェシエリヒア ·コリ由来 NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （1 d hA) 活性が増強され、 かつピルペートホルメートリアーゼ （p ί 1) 活性が不 活化あるいは低減化された細菌を培養し、 得られた培養物から D—乳酸を回収す ることを特徵とする、 D_乳酸の生産方法。

5. 細菌がェシエリヒア ·コリである請求項 4に記載の D—乳酸の生産方法。

6. 2種類以上のアミノ酸が添加された培地で培養することを特徴とする、 請 求項 4又は 5に記載の D—乳酸の生産方法。

7. 該微生物が本来有している FAD依存性 D—乳酸デヒドロゲナ一ゼ （d 1. d) 活性が不活化あるいは低減化された微生物であって、 ピルペートホルメート リアーゼ （p f 1) 活性が不活化あるいは低減化されている、 且つ Zまたはェシ エリヒア ·コリ由来 NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナ一ゼ （1 dhA) 活性 が増強されていることを特徴とする微生物。

8. 微生物が細菌である請求項 7に記載の微生物。

9. 細菌がェシエリヒア ·コリである請求項 8に記載の微生物。

10. 請求項 7〜 9の何れか一項に記載の微生物を液体培地で培養し、 培養液 中に D—乳酸を生成蓄積せしめ、 培養液から D—乳酸を分離することを特徴とす る D—乳酸の生産方法。

11. 2種以上のアミノ酸が添加された培地で培養することを特徴とする、 請求 項 10に記載の D—乳酸の生産方法。

12. FAD依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （d 1 d) 活性が不活化あるい は低減化されている微生物を液体培地で培養し、 培養液中に D—乳酸を生成蓄積 せしめ、 培養液から D—乳酸を分離することを特徴とする D—乳酸の生産方法。

13. 微生物が細菌である請求項 12に記載の方法。

14. 細菌がェシェリヒア ·コリである請求項 13に記載の方法。

15. 微生物のゲノム上において、 ェシエリヒア ·コリ由来の NAD H依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （l dhA) をコードする遺伝子が、 解糖系、 核酸生 合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーター を使用することで該 NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （l dhA) を発 現する微生物。

16. 微生物がェシエリヒア ·コリである請求項 15に記載の微生物。

17. 該微生物が本来有しているピルべートホルメートリァーゼ （p f 1 ) 活 性が不活化あるいは低減化されている、 且つノまたは FAD依存性 D—乳酸デヒ ドロゲナ一ゼ （d 1 d) 活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とす る請求項 15又は請求項 16に記載の微生物。

18. ェシエリヒア ·コリのゲノム上において、 ェシエリヒア ·コリ由来の N ADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （l dhA) をコードする遺伝子のプロ モーターに代えて、 ェシェリヒア，コリ由来の解糖系、 核酸生合成系又はアミノ 酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで 該 NADH依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （l dhA) を発現するェシエリヒ ァ ·コリ。

19. ェシエリヒア ·コリの解糖系、 核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関 わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターが、 ェシエリヒア 'コリ由来のグ リセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子のプロモータ一である請求 項 18記載のェシエリヒア ·コリ。

20. 該ェシエリヒア ·コリが本来有しているピルペートホルメートリアーゼ (p f 1) 活性が不活化あるいは低減化されている、 且つ または FAD依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （d 1 d) 活性が不活化あるいは低減化されているこ とを特徴とする請求項 18又は請求項 19に記載のェシエリヒア 'コリ。

21. 請求項 15〜 20のいずれか一項に記載の微生物を培地を用いて培養す ることにより D—乳酸を生産する方法。

22. TCA回路を有し、 且つリンゴ酸デヒドロゲナーゼ （mdh) 活性が不 活化あるいは低減化されている微生物であって、 更にピルべ一トホルメートリア, ーゼ （p f 1) 活性が不活化あるいは低減化されている、 且つ/または FAD依 存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ （d 1 d) 活性が不活化あるいは低減化されてい ることを特徵とする微生物。

23. 該微生物が本来有しているァスパラギン酸アンモニアリアーゼ （a s p

A) 活性が不活化または低減化されている請求項 22に記載の微生物。

24. 微生物が細菌である請求項 22又は 23に記載の微生物。

25. 細菌がェシエリヒア ·コリである請求項 24に記載の微生物。

26. ェシエリヒア ·コリ由来の NAD H依存性 D—乳酸デヒドロゲナーゼ（ 1 dhA) 活性が増強されている請求項 25に記載の微生物。

27. 請求項 2.2〜 26の何れか一項に記載の微生物を培地を用いて培養する ことにより、 TC A回路上で生産される有機酸以外の化合物を生産させる方法。

28. 有機酸以外の化合物が D—乳酸である請求項 27に記載の生産方法。

29. 通気条件下で培養することを特徴とする請求項 1〜6、 10〜14、 2

1、 28の何れか一項に記載の乳酸の生産方法。

30. 通気条件が温度 30 の水を対象とした場合、 常圧で酸素移動容量係数 ^aが 1 h-i以上 40 Oh-i以下となるような条件で達成し得る酸素供給を可能 とする条件であることを特徴とする請求項 29に記載の乳酸の生産方法。

31. 培養 pHが 6〜8であることを特徴とする請求項 1〜 6、 10〜14、 21、 28〜 30の何れか一項に記載の乳酸の生産方法。