JPWO2005106005A1 - ヒドロキシカルボン酸類の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
coli B)株を培養し、培養液中からグリコール酸を分離・採取することを特徴とする微生物によるグリコール酸の生産方法が開示されている。なおエシェリヒア・コリK12(Escherichia
coli K12)株についてはグリコール酸の収率が低いことが開示されている。特開平10−174593号公報及び特開平10−174594号公報の実施例に記載されているグリコール酸生産方法の中でグリコール酸蓄積濃度が最も高いものは、ピシア・ナガニシイ(Pichia
naganishii)を用いた方法であり、30時間の反応で35.3g/Lのグリコール酸が得られている。ピシア・ナガニシイを用いたグリコール酸生産については更に、反応条件の改善がなされ、120時間の反応で105g/Lのグリコール酸が得られることが文献(Kataoka,M.,et.al.,Biosci.Biotechnol.
Biochem.,Vol.65(10),pp.2265-2270(2001))で報告されている。要するにピシア・ナガニシイを用いた生産方法では、エチレングリコールからグリコール酸への反応時間が120時間と長く、このことはグリコール酸の製造コストの上昇を招来するため工業規模的実生産を想定した場合には更なる反応時間の短縮が必要であった。そしてさらにこの生産方法においては使用する微生物が生産する副生有機酸が混入し、その後の精製工程や脱水縮合反応に支障をきたすという問題点も存在した。
J. Bacteriol., Vol. 153 (1), pp.134-139, (1983))。すなわちエチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応と、グリコールアルデヒドからグリコール酸への反応の二段階の代謝経路である。ボロナットらは、1,2−プロパンジオール(以下PDOと呼ぶことがある)からラクトアルデヒドへの反応触媒酵素プロパンジオールオキシドレダクターゼ(以下、PDO酸化還元酵素と呼ぶことがある)が、エチレングリコールをも基質とすることに着目した(Boronat,A.,et.
al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 672, pp.98-107, (1981))。PDO酸化還元酵素活性が突然変異により向上した菌株の中から、グリコールアルデヒドからグリコール酸への反応触媒酵素グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ(以下GAL脱水素酵素と呼ぶことがある)活性が向上した菌株を単離したのである。なお以下の表(表1)は、ボロナットらの論文から引用したものである。
以上の点に鑑み、本発明の解決するべき課題は、グリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸類を短時間で安価に且つ大量に供給し、かつ副生物を低減させ純度を向上させることにある。
〔1〕 エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素の活性を付与又は強化した微生物を利用することを特徴とする、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類を基質としたヒドロキシカルボン酸類の生産方法。
〔2〕 〔1〕記載の酵素をコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで微生物の該酵素活性を付与又は強化することを特徴とする〔1〕に記載の生産方法。
〔3〕 エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素とグリコールアルデヒドからグリコール酸への反応を触媒する酵素の両活性を、2種の該酵素をコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで付与又は強化した微生物を利用することを特徴とする、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類を基質としたヒドロキシカルボン酸類の生産方法。
〔4〕 エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子及び/又はグリコールアルデヒドからグリコール酸への反応を触媒する酵素をコードする遺伝子が、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わるタンパク質の発現を司る遺伝子のプロモーターと機能的に連結することで該酵素を発現する微生物を利用することを特徴とする〔2〕又は〔3〕記載の生産方法。
〔5〕 エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素がラクトアルデヒドレダクターゼであり、グリコールアルデヒドからグリコール酸への反応を触媒する酵素がラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼである〔1〕〜〔4〕の何れか一項に記載の生産方法。
〔6〕 該微生物が本来有しているグリコール酸オキシダーゼ活性が不活化或いは低減されている、且つ/またはピルベートホルメートリアーゼ活性が不活化または低減されていることを特徴とする微生物を利用することを特徴とする〔1〕〜〔5〕の何れか一項に記載の生産方法。
〔7〕 ヒドロキシカルボン酸が光学活性を有するヒドロキシカルボン酸であることを特徴とする〔1〕〜〔6〕の何れか一項に記載の生産方法。
〔8〕 〔1〕〜〔7〕の何れか一項に記載の生産方法に利用される微生物。
〔9〕 〔6〕においてエチレングリコールを基質として収率95%以上、生産速度2g/L/時間以上で得られたグリコール酸水溶液。
Cloning A Laboratory Manual, Second Edition",ColdSpring Harbor Laboratory
Press, (1989)等に記載されている。
なお、本発明に係る培養に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼのアミノ酸配列と遺伝子(以下、fucOと略することがある)の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number M31059)。fucOを取得するために、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてCGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG(配列番号1)、及びGTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(配列番号2)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで約1.2kbpのfucOフラグメントを得た。さらに、グリセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素(glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)(GAPDH)プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてAACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(配列番号3)、及びACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(配列番号4)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするDNAフラグメントを得た。上記の2つのDNAフラグメントとプラスミドpUC18を制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5株に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAPfucOを回収した。このプラスミドpGAPfucOをエシェリヒア・コリMG1655株に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃で一晩培養することによりMG1655/pGAPfucO株を得た。
なおエシェリヒア・コリMG1655株、エシェリヒア・コリDH5株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼのアミノ酸配列と遺伝子(以下、fucOと略することがある)の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number M31059)。またエシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子(以下、aldAと略することがある)の塩基配列もすでに報告されている(GenBank accession number M64541)。fucOを取得するためにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてGCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG(配列番号5)、及びGTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(配列番号2)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素XbaI及びHindIIIで消化することで約1.2kbpのfucOフラグメントを得た。さらに、aldAを取得するためにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてCGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAGTACCCGTTCAACATCC(配列番号6)、及びGCTCTAGACTCTTTCACTCATTAAGACTG(配列番号7)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びXbaIで消化することで約1.5kbpのaldAフラグメントを得た。さらに実施例1と同様にしてグリセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素(glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)(GAPDH)プロモーターをコードするフラグメントを得た。上記の3つのDNAフラグメントとプラスミドpUC18を制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5株に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAPfucO−aldAを回収した。このプラスミドpGAPfucO−aldAをエシェリヒア・コリMG1655株に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃で一晩培養することによりMG1655/pGAPfucO−aldA株を得た。
前培養として三角フラスコに入れたLB Broth, Miller培養液(Difco244620)25mLに実施例1において得られたエシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO株、エシェリヒア・コリMG1655野生株を植菌し、一晩、培養温度35℃、120rpmで攪拌培養を行った。各々の前培養液全量を、表2(表2)に示す組成の培地475gの入った1L容の培養槽(ABLE社製培養装置BMJ−01)に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量1vvm、撹拌速度800rpm、培養温度35℃、pH7.2(NH3水溶液で調整)で行った。培養開始後24時間の菌体を遠心分離(8000rpm、20分間)により集菌し、1mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2で洗浄後、同緩衝液で懸濁し最終液量を500mlとした。懸濁液をABLE社製培養装置BMJ−01の培養槽に移し、エチレングリコールを5g/時間の速度で添加し、22時間反応を行った。反応は大気圧下、通気量1vvm、撹拌速度800rpm、反応温度35℃、pH7.2(NH3水溶液で調整)で行った。得られた反応液中のグリコール酸蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。結果を図1(図1)に示す。
エシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO株において22時間で106g/Lのグリコール酸の蓄積が確認され、エチレングリコールからグリコール酸に至るまでの中間体であるグリコールアルデヒドは検出されなかった。一方野生株では反応22時間後においてもグリコール酸は検出されなかった。
実施例2で得られたエシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO−aldA株、エシェリヒア・コリMG1655野生株を実施例3と同様に培養した。培養開始後24時間以降、培養中の培養槽に直接エチレングリコールを5g/時間の速度で22時間添加することで反応を行った。得られた培養液中のグリコール酸蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。結果を図2(図2)に示す。
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBanak accession number U00096)、エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子(以下、aldAと略することがある)の塩基配列もすでに報告されている(GenBank accession number M64541)。エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAのaldA近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、TACTGCAGTGATCCTTGCAGGCAATGC(配列番号8)とGGTCTAGAATCATCAGAGAGACGGAATCG(配列番号9)、GGTCTAGAATGAGTGAAAGAGGCGGAG(配列番号10)とAAGGTACCGATGCTGGTGCGAAGAAGG(配列番号11)を用いてPCRを行った。得られたDNAフラグメントをそれぞれ、制限酵素PstIとXbaI、XbaIとKpnIで消化することにより、それぞれ約800bp、700bpのフラグメントを得た。このDNAフラグメントを温度感受性クローニングベクターpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,
241, 185-191 (2000)〕をPstI、KpnIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
実施例1において得られたプラスミドpGAPfucOを実施例--において得られた△aldA株、に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃で一晩培養することで△aldA/pGAPfucO株を得た。
実施例3と同様に△aldA/pGAPfucO株、MG1655/pGAPfucO株をそれぞれ培養し、集菌、洗浄の後、得られた菌体に対し、実施例3と同様にエチレングリコールを添加し、10時間反応を行った。反応により△aldA/pGAPfucO株において64.8g、MG1655/pGAPfucO株において64.2gのグリコール酸蓄積が確認された。グリコール酸の生産にラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが必ずしも必要ないことが示された。
実施例2で得られたエシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO−aldA株、実施例1で得られたエシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO株を実施例3と同様に培養した。ただし表1(表1)に示す培地組成のうちグルコース量を70g/Lとして実施した。24時間培養した後、全培養液を遠心分離することで集菌し得られた湿菌体重量を測定した。また、培地中の残存グルコース量を定法に従って測定し、菌体の増殖に要したグルコース量を算出した。結果を表3(表3)に示す。
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのfucOの塩基配列も報告されている(GenBank accession number M31059)。エシェリヒア・コリMG1655株のfucOの5’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、GCTCTAGACCTTCTCCTTGTTGCTTTACG(配列番号12)とAACTGCAGAGAGAGGTAGCTAATGGAACG(配列番号13)を用いて、エシェリヒア・コリゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより約650bpのDNA断片を増幅した。
241, 185-191 (2000)〕をPstIとKpnIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをMG1655株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを薬剤を含まないLB液体培地で30℃で一晩培養し、さらに薬剤を含まないLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
実施例3と同様にエシェリヒア・MG1655fucO欠失GAPpfucOゲノム挿入株を培養し、集菌、洗浄の後、得られた菌体に対し、実施例3と同様にエチレングリコールを添加し、24時間反応を行った。グリコール酸の蓄積は確認されなかった。
エシェリヒア・コリMG1655株のグリセルデヒド 3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターの配列情報に基づいて作製されたAACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(配列番号3)とエシェリヒア・コリMG1655株のfucOの配列情報に基づいて作製されたGTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG(配列番号2)を用いて、実施例1で作製した発現ベクターpGAPfucOを鋳型としてPCRを行い、GAPDHプロモーターとfucOからなる約1300bpのDNAフラグメントを得た。
実施例3と同様にエシェリヒア・MG1655/pACYCfucO株を培養し、集菌、洗浄の後、得られた菌体に対し、実施例3と同様にエチレングリコールを添加し、9時間反応を行った。反応により28gのグリコール酸が蓄積した。
それぞれの菌株を実施例3と同様に培養した。培養後の菌体を集菌、洗浄の後、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.4に懸濁し、超音波破砕した。破砕後の菌体抽出液を遠心分離し、その上清をラクトアルデヒドレダクターゼ活性測定に用いた。活性測定は基質にエチレングリコールを用い、反応により生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの増加を分光光度計で測定することで実施した。反応に用いた可溶性タンパク質重量当たりの1分間の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生成量を算出し、MG1655野生株の値を1とした際の結果を表4(表4)に示す。
実施例3と同様にエシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO株、およびエシェリヒア・コリMG1655野生株を培養し、集菌、洗浄の後、得られた菌体に対し、実施例3においてエチレングリコールを添加する替わりにグリセロールを150g/Lの濃度となるよう一括添加し、最終液量を500mlとして24時間反応を行った。得られた培養液中のL−グリセリン酸蓄積量を光学異性体分割用カラムを用いHPLCで定法にしたがって測定した。エシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO株において24時間で67g/LのL−グリセリン酸の蓄積が確認された。エシェリヒア・コリMG1655野生株においてはL−グリセリン酸の蓄積は確認されなかった。
実施例3と同様にエシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO株、エシェリヒア・コリMG1655野生株を培養した。培養開始後24時間の菌体を遠心分離(8000rpm、20分間)により集菌し、1mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2で洗浄した。洗浄後の菌体約300mgを同緩衝液で懸濁し終濃度100mMのジエチレングリコール存在下、最終液量4mlで18時間反応を行った。反応は大気圧下、反応温度37℃でマグネティックスターラーにより攪拌しつつ行った。得られた反応液中のヒドロキシエトキシ酢酸をHPLCで定法に従って測定した。エシェリヒア・コリMG1655/pGAPfucO株において1g/Lのヒドロキシエトキシ酢酸の蓄積が確認された。ジグリコール酸をはじめとするジエチレングリコール由来の副生物は検出されなかった。またエシェリヒア・コリMG1655野生株においてはヒドロキシエトキシ酢酸の蓄積は確認されなかった。
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBanak accession number U00096)、エシェリヒア・コリのglcDEF遺伝子の塩基配列もすでに報告されている(GenBank accession number L43490)。エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAのglcDEF遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、TTGGTACCGTTCTGCCAGCAACTGACG(配列番号16)とTGTCTAGAGTACCTCTGTGCGTCACTGG(配列番号17)、GCTCTAGACGCTTTGTTGTGTTGTGTGG(配列番号18)とAACTGCAGGATCGGTCAATGATTGCAGC(配列番号19)を用いてPCRを行った。得られたDNAフラグメントをそれぞれ、制限酵素KpnIとXbaI、XbaIとPstIで消化することにより、それぞれ約670bp、790bpのフラグメントを得た。このDNAフラグメントを温度感受性クローニングベクターpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,
241, 185-191 (2000)〕をKpnI、PstIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをpTH△glcDEFと命名した。
エシェリヒア・コリのpflB遺伝子の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number X08035)。MG1655株の染色体DNAのpflB遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、GCACGAAAGCTTTGATTACG(配列番号20)とTTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(配列番号21)、TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(配列番号22)とAAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(配列番号23)を用いてPCRを行った。得られたDNAフラグメントをそれぞれ、制限酵素HindIIIとSphI、SphIとPstIで消化することにより、それぞれ約1770bp、約1340bpのフラグメントを得た。このDNAフラグメントを温度感受性クローニングベクターpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,
241, 185-191 (2000)〕をHindIII、PstIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリMG1655株に30℃で形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを薬剤を含まないLB液体培地で30℃で一晩培養し、さらに薬剤を含まないLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
実施例16において得られたプラスミドpTH△glcDEFを△pflB株に形質転換し、最終的にMG1655pflB&glcDEF遺伝子欠失株(以下△pflB△glcDEF株と略することがある)を得た。詳細な方法は実施例16に記載された方法に準じた。
実施例1において得られたプラスミドpGAPfucOを実施例16において得られた△glcDEF株、実施例17で得られた△plfB株、および実施例18で得られた△pflB△glcDEF株にそれぞれ形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃で一晩培養することで△glcDEF/pGAPfucO株、△plfB/pGAPfucO株、△pflB△glcDEF/pGAPfucO株を得た。
実施例3で得られたMG1655/pGAPfucO株、実施例19において得られた△glcDEF/pGAPfucO株、△plfB/pGAPfucO株、△pflB△glcDEF/pGAPfucO株について実施例3と同様に培養を行った。培養開始後24時間の菌体を遠心分離(8000rpm、20分間)により集菌し、蒸留水で洗浄した。洗浄後の集菌体を75g秤量し、エチレングリコール150gと共に蒸留水に懸濁し最終液量を1500mlとした。懸濁液をABLE社製培養装置DPC−2の培養槽に移し、22時間反応を行った。反応は大気圧下、通気量0.7vvm、攪拌速度800rpm、反応温度35℃、pH7.2(NH3水溶液で調整)で行った。得られた反応液中のグリコール酸およびシュウ酸、酢酸の蓄積量、さらにエチレングリコールの残存量をHPLCで定法に従って測定した。結果を表5(表5)に示す。glcDEF遺伝子、且つ/またはpflB遺伝子の欠失によりシュウ酸、酢酸といった副生有機酸の低減が可能となり、さらにエチレングリコールの転化率が向上し、グリコール酸の生産性が飛躍的に向上した。
実施例1において得られたプラスミドpGAPfucOを実施例5において得られた△aldA株、に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃で一晩培養することで△aldA/pGAPfucO株を得た。
出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれを薬剤を含まないLB寒天プレートとクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、薬剤を含まないLB寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりpflB遺伝子を含む約2.0kb断片を増幅させ、pflB遺伝子領域が欠失している株を選抜し、得られた株をMG1655pflB遺伝子欠失株(以下△pflB株と略することがある)と命名した。
【実施例18】
△glcDEF/pGAPfucO株、△pflB/pGAPfucO株、△pflB△glcDEF/pGAPfucO株の構築
実施例1において得られたプラスミドpGAPfucOを実施例16において得られた△glcDEF株、実施例17で得られた△pflB株、および実施例18で得られた△pflB△glcDEF株にそれぞれ形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで37℃で一晩培養することで△glcDEF/pGAPfucO株、△pflB/pGAPfucO株、△pflB△glcDEF/pGAPfucO株を得た。
【実施例20】
実施例3で得られたMG1655/pGAPfucO株、実施例19において得られた△glcDEF/pGAPfucO株、△pflB/pGAPfucO株、△pflB△glcDEF/pGAPfucO株について実施例3と同様に培養を行った。培養開始後24時間の菌体を遠心分離(8000rpm、20分間)により集菌し、蒸留水で洗浄した。洗浄後の集菌体を75g秤量し、エチレングリコール150gと共に蒸留水に懸濁し最終液量を1500mlとした。懸濁液をABLE社製培養装置DPC−2の培養槽に移し、22時間反応を行った。反応は大気圧下、通気量0.7vvm、攪拌速度800rpm、反応温度35℃、pH7.2(NH3水溶液で調整)で行った。得られた反応液中のグリコール酸およびシュウ酸、酢酸の蓄積量、さらにエチレングリコールの残存量をHPLCで定法に従って測定した。結果を表5(表5)に示す。glcDEF遺伝子、且つ/またはpflB遺伝子の欠失によりシュウ酸、酢酸といった副生有機酸の低減が可能となり、さらにエチレングリコールの転化率が向上し、グリコール酸の生産性が飛躍的に向上した。
Claims (9)
- エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素の活性を付与又は強化した微生物を利用することを特徴とする、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類を基質としたヒドロキシカルボン酸類の生産方法。
- 請求項1記載の酵素をコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで微生物の該酵素活性を付与又は強化することを特徴とする請求項1に記載の生産方法。
- エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素とグリコールアルデヒドからグリコール酸への反応を触媒する酵素の両活性を、2種の該酵素をコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで付与又は強化した微生物を利用することを特徴とする、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類を基質としたヒドロキシカルボン酸類の生産方法。
- エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子及び/又はグリコールアルデヒドからグリコール酸への反応を触媒する酵素をコードする遺伝子が、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わるタンパク質の発現を司る遺伝子のプロモーターと機能的に連結することで該酵素を発現する微生物を利用することを特徴とする請求項2又は請求項3記載の生産方法。
- エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素がラクトアルデヒドレダクターゼであり、グリコールアルデヒドからグリコール酸への反応を触媒する酵素がラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼである請求項1〜4の何れか一項に記載の生産方法。
- 該微生物が本来有しているグリコール酸オキシダーゼ活性が不活化或いは低減されている、且つ/またはピルベートホルメートリアーゼ活性が不活化または低減されていることを特徴とする微生物を利用することを特徴とする請求項1〜5の何れか一項に記載の生産方法。
- ヒドロキシカルボン酸が光学活性を有するヒドロキシカルボン酸であることを特徴とする請求項1〜6の何れか一項に記載の生産方法。
- 請求項1〜7の何れか一項に記載の生産方法に利用される微生物。
- 請求項6においてエチレングリコールを基質として収率95%以上、生産速度2g/L/時間以上で得られるグリコール酸水溶液。
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