JP4886775B2 - 補酵素再生によるグリコール酸の生産方法 - Google Patents
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Description
現行市販されている化学合成品のグリコール酸は少なからず夾雑物を含んでおり、ポリマー原料としては純度的に問題がある。なぜならこれらの夾雑物はグリコール酸の脱水縮合反応を阻害するのみならず、夾雑物の一つであるメトキシ酢酸が発癌性の疑いのある化合物であり、食品や飲料の包材中に含まれることが望ましくないからである。精製によって夾雑物を除くことは技術的には可能であるが、そのような精製品は価格が高くなり、安価な包材原料としては現実的でない。
上記した従来の方法によるグリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸の生産反応においては反応に供する菌体量が多いがために、それに伴う製造コストの上昇や菌体に由来する不純物の夾雑、さらにはヒドロキシカルボン酸類の製造後に菌体を廃棄するのに多大な労力とコストがかかるという問題点があげられる。
上記のNADを再生する技術においてはNAD再生のための反応基質を反応系に添加する必要があり、さらにはNAD再生反応により副生物が反応系内に蓄積するという欠点があげられる。
アルコールからのケトン製造において、上記の欠点を補うNAD再生方法として微生物が有する呼吸鎖を介して分子状酸素を還元し水を生成することでNADを再生するNADHデヒドロゲナーゼを利用する方法が例示されるが(特許文献4)、この酵素活性を強化した微生物による実例は報告されていない。
即ち、本発明は以下の〔1〕および〔2〕に記載のとおりである。
エシェリヒア・コリ由来のラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入することによりラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性を強化し、かつ、前記エシェリヒア・コリのグリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化またはエシェリヒア・コリ本来のグリコール酸オキシダーゼ活性よりも低減し、
さらに、エシェリヒア・コリ由来のNADHデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入することによりNADHデヒドロゲナーゼの活性を強化した組換え微生物を用いることを特徴とするグリコール酸の生産方法。
前記エシェリヒア・コリのグリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または前記エシェリヒア・コリ本来のグリコール酸オキシダーゼ活性よりも低減し、かつ、
エシェリヒア・コリ由来のNADHデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を前記エシェリヒア・コリに導入することによりNADHデヒドロゲナーゼの活性を強化した組換え微生物。
また、ヒドロキシカルボン酸とは、上記した末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類について水酸基を有する末端炭素の一つが酸化されカルボン酸になっているものである。そのような化合物としてグリコール酸、ヒドロキシエトキシ酢酸、グリセリン酸、3−ヒドロキシプロパン酸、2−ヒドロキシブタン酸、3−ヒドロキシブタン酸、4−ヒドロキシブタン酸、2,4−ジヒドロキシブタン酸などが例示できる。
本実施形態においてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとは、酸化型および還元型の明記がない限りそのどちらをも指す。
本実施形態では、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールとして、エチレングリコールを用いることができる。また、ヒドロキシカルボン酸としては、グリコール酸を好適に用いることができる。
本発明において、培養に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する培地であれば特に制限は無い。炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、蛋白質加水分解物等の無機及び有機の窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、硫酸イオン、その他が必要に応じて適宜使用される。有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。
また、培地組成は、ポリペプトン0.5g/L以上10g/L以下、Fe2SO40.02g/L以上0.3g/L以下、K2HPO40.5g/L以上5g/L以下、KH2PO40.5g/L以上5g/L以下、MgSO4・7H2O0.5g/L以上5g/L以下、(NH4)2SO40.3g/L以上15g/L以下、ニコチン酸0.02g/L以上1g/L以下(溶媒は水)とすると好ましい。
pHは5以上8以下とすることが好ましく、pH7.0以上7.4以下とするとより好ましく、pH7.2とすると最も好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
また、温度は、25℃以上40℃以下とすることが好ましく、33℃以上37℃以下とするとより好ましく、35℃とすると最も好ましい。こうすることにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
培養に必要な時間は12時間以上50時間以下とする。これにより、菌体重量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量が多い菌体を得ることできる。
例えば、pHは6以上9以下とすると好ましく、pH7.0以上8.0以下とするとより好ましく、pH7.2とすると最も好ましい。こうすることにより反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。
また、温度は、20℃以上45℃以下の範囲内が好ましく、30℃以上40℃以下とすると特に好ましく、35℃が最も好ましい。こうすることにより、反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。
また、反応は、好ましくは、好気条件とする。通気量は、反応液1Lあたり0.1L/min以上2.0L/min以下とすると好ましく、0.2L/min以上1.0L/min以下とするとより好ましい。また、攪拌速度は、200rpm以上1000rpm以下とすると好ましく、400rpm以上800rpm以下とするとより好ましい。こうすることにより、反応液に添加した菌体量あたりのヒドロキシカルボン酸生産量を高められるという効果が得られる。また、上記の通気、攪拌条件と相当する溶存酸素供給を実現できる気泡塔などを用いることでも反応が可能である。
また、反応時間は12時間以上96時間以下とすることにより、収率80%以上でヒドロキシカルボン酸を得ることができる。
エシェリヒア・コリのゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBanak accession number U00096)、エシェリヒア・コリのグリコール酸オキシダーゼの遺伝子(以下、glcDEFと略することがある)の塩基配列もすでに報告されている(GenBank accession number L43490)。
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼの遺伝子(以下、fucOと略することがある)の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number M31059)。またエシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子(以下、aldAと略することがある)の塩基配列もすでに報告されている(GenBank accession number M64541)。
さらに、グリセルアルデヒド3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いて配列番号9(AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC)及び配列番号10(ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG)に示すオリゴヌクレオチドを用いてPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするDNAフラグメントを得た。
製造例2で得られたプラスミドpGAPfucO−aldAを製造例1で得られた△glcDEF株に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートで、37℃で一晩培養することにより△glcDEF/pGAPfucO−aldA株を得た。
エシェリヒア・コリのNADHデヒドロゲナーゼの遺伝子(以下、ndhと略することがある)の塩基配列はすでに報告されている(GenBank accession number V00306)。ndhを取得するためにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いて配列番号11(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGACTACGGCATTGAAAAAGATTGTG)及び配列番号12(GGTCTAGACGATTAATGCAACTTCAAACG)に示すオリゴヌクレオチドを用いてPCR法で増幅することで約1.3kbpのndhフラグメントを得た。得られたndhフラグメントをT4DNAポリヌクレオチドキナーゼ処理した。
実施例1で得られた△glcDEF/pGAPfucO−aldA−ndh株を前培養として三角フラスコに入れたLB Broth,Miller培養液(Difco244620)25mLに植菌し、一晩、培養温度35℃、120rpmで攪拌培養を行った。前培養液全量を、以下に示す組成の培地475gの入った1L容の培養槽(ABLE社製培養装置BMJ−01)に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量0.5L/min、撹拌速度800rpm、培養温度35℃、pH7.2(NH3水溶液で調整)で行った。前記の条件で最初のグルコースが完全に枯渇した後、残りの時間を培地中のグルコース濃度0.1g/L未満となるような可変速度でグルコースを全量で40g供給した。
ポリペプトン:7g/L
グルコース:30g/L
ニコチン酸:0.1g/L
Fe2SO4:0.09g/L
K2HPO4:2g/L
KH2PO4:2g/L
MgSO4・7H2O:2g/L
(NH4)2SO4:5g/L
溶媒:水
溶離液:過塩素酸水溶液(pH2.1)
流速:1.0mL/min
検出器:UV検出器測定波長:280nm
製造例3で得られた△glcDEF/pGAPfucO−aldA株について実施例2と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。△glcDEF/pGAPfucO−aldA株の乾燥菌体1gあたりのグリコール酸生産量は20.2gであった。
△glcDEF/pGAPfucO−aldA−ndh株、および△glcDEF/pGAPfucO−aldA株について実施例2と同様に培養およびグリコール酸生産を行った。
△glcDEF/pGAPfucO−aldA−ndh株において常にNADH/NAD比の値が小さく、NADHからNADを再生していることが示された。
サンプル上清:25μL
1mol/L Tris−HCl:25μL
25%エタノール:10μL
純水:20μLテトラカラーワン(生化学工業社製):10μL
アルコールデヒドロゲナーゼ:10μL
Claims (2)
- エシェリヒア・コリを用いてエチレングリコールからグリコール酸を生産する方法において、
エシェリヒア・コリ由来のラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入することによりラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性を強化し、かつ、前記エシェリヒア・コリのグリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化またはエシェリヒア・コリ本来のグリコール酸オキシダーゼ活性よりも低減し、
さらに、エシェリヒア・コリ由来のNADHデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入することによりNADHデヒドロゲナーゼの活性を強化した組換え微生物を用いることを特徴とするグリコール酸の生産方法。 - エシェリヒア・コリ由来のラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入することによりラクトアルデヒドレダクターゼおよびラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性を強化し、
前記エシェリヒア・コリのグリコール酸オキシダーゼ活性を不活性化または前記エシェリヒア・コリ本来のグリコール酸オキシダーゼ活性よりも低減し、かつ、
エシェリヒア・コリ由来のNADHデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を前記エシェリヒア・コリに導入することによりNADHデヒドロゲナーゼの活性を強化した組換え微生物。
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