JP2002345479A - 新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents
新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、ＮＡＤＨを補酵素とする(R)-2,3-ブ
タンジオール脱水素酵素と、この酵素による光学活性ア
ルコールやケトンの製造方法の提供を課題とする。 【解決手段】新規な(R)-2,3-ブタンジオール脱水素酵素
を見出し、本酵素をコードするDNAを単離し、本酵素を
高発現する組換え体を作成した。この酵素は、Kluyvero
myces lactisから得ることができる。この酵素により、
４−ヒドロキシ−２−ブタノンから光学純度の高い
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを効率的に製造するこ
とができる。また、ラセミ体１，３−ブタンジオールか
ら光学純度の高い（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを、
また（Ｒ）−１，３−ブタンジオールから４−ヒドロキ
シ−２−ブタノンを、効率的に生成する生産方法が提供
される。
タンジオール脱水素酵素と、この酵素による光学活性ア
ルコールやケトンの製造方法の提供を課題とする。 【解決手段】新規な(R)-2,3-ブタンジオール脱水素酵素
を見出し、本酵素をコードするDNAを単離し、本酵素を
高発現する組換え体を作成した。この酵素は、Kluyvero
myces lactisから得ることができる。この酵素により、
４−ヒドロキシ−２−ブタノンから光学純度の高い
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを効率的に製造するこ
とができる。また、ラセミ体１，３−ブタンジオールか
ら光学純度の高い（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを、
また（Ｒ）−１，３−ブタンジオールから４−ヒドロキ
シ−２−ブタノンを、効率的に生成する生産方法が提供
される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＮＡＤ＋依存性の
新規な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素に関
する。また本発明は、該酵素蛋白質をコードするポリヌ
クレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を発現する組換
え体を用いた光学活性なアルコール、特に（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールあるいは（Ｓ）−１，３−ブタンジ
オールを製造する方法、および、ケトン、特に４−ヒド
ロキシ−２−ブタノンを製造する方法に関する。
新規な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素に関
する。また本発明は、該酵素蛋白質をコードするポリヌ
クレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を発現する組換
え体を用いた光学活性なアルコール、特に（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールあるいは（Ｓ）−１，３−ブタンジ
オールを製造する方法、および、ケトン、特に４−ヒド
ロキシ−２−ブタノンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】光学活性１，３−ブタンジオールは、ア
ゼチジノンなど抗生物質の合成中間体の原料として有用
な化合物である（J. Chem. Soc., Chem. Commun., 9, 6
62-664(1991)）。光学活性１，３−ブタンジオールを製
造する方法としては、以下のような方法が知られてい
る。 （１）化学的に合成されたラセミ体の１，３−ブタンジ
オールを光学分割剤を用いて光学分割する方法（特開昭
６１−１９１６３１号公報）、（２）光学活性化合物で
処理したラネーニッケル触媒を用いて４−ヒドロキシ−
２−ブタノンから不斉合成する方法（特開昭５８−２０
４１８７号およびBull.Chem.Soc.Jpn.,53,1356-1360(19
80)）、（３）ラセミ体の１，３−ブタンジオールに微
生物を作用させて（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを残
存させる方法（特公平６−９５９５１および特開平７−
２３１７８５）、（４）４−ヒドロキシ−２−ブタノン
に微生物を作用させて不斉還元反応により（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールを生成する方法（特許公報２７３１
５８９号）、（５）ラセミ体の１，３−ブタンジオール
に微生物を作用させて（Ｓ）−１，３−ブタンジオール
を残存させる方法（特開平７−３９３９０）しかしなが
ら、（１）および（２）は高価な光学分割剤、触媒を用
いねばならない。また（２）（３）（４）（５）は反応
収率が悪い、光学純度が低い、等の欠点がある。
ゼチジノンなど抗生物質の合成中間体の原料として有用
な化合物である（J. Chem. Soc., Chem. Commun., 9, 6
62-664(1991)）。光学活性１，３−ブタンジオールを製
造する方法としては、以下のような方法が知られてい
る。 （１）化学的に合成されたラセミ体の１，３−ブタンジ
オールを光学分割剤を用いて光学分割する方法（特開昭
６１−１９１６３１号公報）、（２）光学活性化合物で
処理したラネーニッケル触媒を用いて４−ヒドロキシ−
２−ブタノンから不斉合成する方法（特開昭５８−２０
４１８７号およびBull.Chem.Soc.Jpn.,53,1356-1360(19
80)）、（３）ラセミ体の１，３−ブタンジオールに微
生物を作用させて（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを残
存させる方法（特公平６−９５９５１および特開平７−
２３１７８５）、（４）４−ヒドロキシ−２−ブタノン
に微生物を作用させて不斉還元反応により（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールを生成する方法（特許公報２７３１
５８９号）、（５）ラセミ体の１，３−ブタンジオール
に微生物を作用させて（Ｓ）−１，３−ブタンジオール
を残存させる方法（特開平７−３９３９０）しかしなが
ら、（１）および（２）は高価な光学分割剤、触媒を用
いねばならない。また（２）（３）（４）（５）は反応
収率が悪い、光学純度が低い、等の欠点がある。
【０００３】その他、２，３−ブタンジオール脱水素活
性を有する酵素に関しては、２，３−ブタンジオールの
生合成、代謝に関する研究によって、たとえば以下のよ
うな微生物において（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジ
オールに対する脱水素酵素活性が報告されている(Arch.
Microbiol. 116, 197-203 ,1978、J. Ferment. Techno
l. 61, 467-471 ,1983、J. Ferment. Technol. 62, 551
-559 ,1984)。しかし、いずれも無細胞抽出液を用いた
活性測定のみであり、様々な酵素が混在しているため
に、２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択性な
どの諸性質は明らかにされていない。
性を有する酵素に関しては、２，３−ブタンジオールの
生合成、代謝に関する研究によって、たとえば以下のよ
うな微生物において（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジ
オールに対する脱水素酵素活性が報告されている(Arch.
Microbiol. 116, 197-203 ,1978、J. Ferment. Techno
l. 61, 467-471 ,1983、J. Ferment. Technol. 62, 551
-559 ,1984)。しかし、いずれも無細胞抽出液を用いた
活性測定のみであり、様々な酵素が混在しているため
に、２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択性な
どの諸性質は明らかにされていない。
【０００４】アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromona
s hydrophila）バチルス・セレウス（Bacillus cereus
IAM 1072）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagu
lans ATCC 8038）、ミクロコッカス・リソデイクティカ
ス（Micrococcus lysodeikticus IAM 1056）、ミクロコ
ッカス・ルテウス（Micrococcus luteus IAM 1097）、
ミクロコッカス・ローゼウス（Micrococcus roseus IAM
1295）、シュードモナス・サッカロフィラ（Pseudomon
as saccharophila IAM 1504）、サルシナ・ルテア（Sar
cina lutea IAM 1099）、スタフィロコッカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus）
s hydrophila）バチルス・セレウス（Bacillus cereus
IAM 1072）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagu
lans ATCC 8038）、ミクロコッカス・リソデイクティカ
ス（Micrococcus lysodeikticus IAM 1056）、ミクロコ
ッカス・ルテウス（Micrococcus luteus IAM 1097）、
ミクロコッカス・ローゼウス（Micrococcus roseus IAM
1295）、シュードモナス・サッカロフィラ（Pseudomon
as saccharophila IAM 1504）、サルシナ・ルテア（Sar
cina lutea IAM 1099）、スタフィロコッカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus）
【０００５】高度に精製され、諸性質が明らかにされた
酵素としては、以下に示すような酵素で２，３−ブタン
ジオール脱水素酵素活性を有することが示されている。
しかし、ＤＬ体に対する活性のみでその立体選択性は報
告されていない。
酵素としては、以下に示すような酵素で２，３−ブタン
ジオール脱水素酵素活性を有することが示されている。
しかし、ＤＬ体に対する活性のみでその立体選択性は報
告されていない。
【０００６】アクロモバクター・リキダム（Achromobac
ter liquidum KY 3047）由来のグリセロール脱水素酵素
（特公昭 58-40467）、バチルス・エスピー（Bacillus
sp. G-1）由来のグリセロール脱水素酵素（特公平 03-7
2272）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothermophilus）由来のグリセロール脱水素酵素
（Biochim. Biophys. Acta 994, 270-279 (1989)）、シ
トロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii
DSM 30040）由来のグリセロール脱水素酵素（J. Bacte
riol. 177, 4392-4401 (1995)）、エルビニア・アロイ
デア（Erwinia aroideae IFO 3830）由来のグリセロー
ル脱水素酵素（Chem. Pharm. Bull. 26, 716-721 (197
8)）、ジオトリカム・キャンディダム（Geotrichum can
didum IFO 4597）由来のグリセロール脱水素酵素（特公
平 01-27715）、ピキア・オフナエンシス（Pichia ofun
aensis AKU 4328）由来のジヒドロキシアセトン還元酵
素（J. Biosci. Bioeng. 88, 148-152 (1999)）、シゾ
サッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）由来のグリセロール脱水素酵素（J. Gen. Microbio
l. 131, 1581-1588 (1985)）、
ter liquidum KY 3047）由来のグリセロール脱水素酵素
（特公昭 58-40467）、バチルス・エスピー（Bacillus
sp. G-1）由来のグリセロール脱水素酵素（特公平 03-7
2272）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothermophilus）由来のグリセロール脱水素酵素
（Biochim. Biophys. Acta 994, 270-279 (1989)）、シ
トロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii
DSM 30040）由来のグリセロール脱水素酵素（J. Bacte
riol. 177, 4392-4401 (1995)）、エルビニア・アロイ
デア（Erwinia aroideae IFO 3830）由来のグリセロー
ル脱水素酵素（Chem. Pharm. Bull. 26, 716-721 (197
8)）、ジオトリカム・キャンディダム（Geotrichum can
didum IFO 4597）由来のグリセロール脱水素酵素（特公
平 01-27715）、ピキア・オフナエンシス（Pichia ofun
aensis AKU 4328）由来のジヒドロキシアセトン還元酵
素（J. Biosci. Bioeng. 88, 148-152 (1999)）、シゾ
サッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）由来のグリセロール脱水素酵素（J. Gen. Microbio
l. 131, 1581-1588 (1985)）、
【０００７】高度に精製され、かつ、２，３−ブタンジ
オールの（２Ｒ，３Ｒ）体に対する高い選択性が明らか
にされている酵素としては、イシャリヒア・コリ（Esch
erichia coli W-1485）の生産するグリセロール脱水素
酵素（J. Biol. Chem. 259, 2124-2129 (1984)）が公知
である。この酵素は、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタン
ジオールに対するVmaxが２８．０U/mg−蛋白質であり、
ラセミ体に対するVmaxが２１．２U/mg−蛋白質であるこ
とから（２Ｒ，３Ｒ）体に対する立体選択性が示唆され
る。ここで、酵素１Ｕは、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブ
タンジオールを基質として１分間に１μmolのＮＡＤ＋
をＮＡＤＨへ還元する酵素活性である。
オールの（２Ｒ，３Ｒ）体に対する高い選択性が明らか
にされている酵素としては、イシャリヒア・コリ（Esch
erichia coli W-1485）の生産するグリセロール脱水素
酵素（J. Biol. Chem. 259, 2124-2129 (1984)）が公知
である。この酵素は、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタン
ジオールに対するVmaxが２８．０U/mg−蛋白質であり、
ラセミ体に対するVmaxが２１．２U/mg−蛋白質であるこ
とから（２Ｒ，３Ｒ）体に対する立体選択性が示唆され
る。ここで、酵素１Ｕは、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブ
タンジオールを基質として１分間に１μmolのＮＡＤ＋
をＮＡＤＨへ還元する酵素活性である。
【０００８】本酵素のSDS-PAGEにおける分子量は55,00
0、ゲル濾過における分子量は、417,000の8量体と考え
られる。また、本酵素はアンモニウムイオンにより活性
化され、酸化反応の至適pHが１０付近であり（J. Biol.
Chem. 259, 2124-2129 (1984)）、本発明の酵素とは異
なる。また、本酵素の１，３−ブタンジオールに対する
立体選択性は報告されていない。
0、ゲル濾過における分子量は、417,000の8量体と考え
られる。また、本酵素はアンモニウムイオンにより活性
化され、酸化反応の至適pHが１０付近であり（J. Biol.
Chem. 259, 2124-2129 (1984)）、本発明の酵素とは異
なる。また、本酵素の１，３−ブタンジオールに対する
立体選択性は報告されていない。
【０００９】また、サッカロマイセス・セレビジエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）由来の（Ｒ）−２，３−ブタ
ンジオール脱水素酵素（Arch. Microbiol. 154, 267-27
3 (1990)）は、２，３−ブタンジオンから（２Ｒ，３
Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生産することが報告さ
れているが、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを不斉還元
した反応については報告例がない。
ccharomyces cerevisiae）由来の（Ｒ）−２，３−ブタ
ンジオール脱水素酵素（Arch. Microbiol. 154, 267-27
3 (1990)）は、２，３−ブタンジオンから（２Ｒ，３
Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生産することが報告さ
れているが、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを不斉還元
した反応については報告例がない。
【００１０】また、ピキア・アンガスタ（Pichia angus
ta）により（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
をコードする遺伝子がクローニングされ大腸菌で発現さ
れている(特願2000-333363)が、４−ヒドロキシ−２−
ブタノンを不斉還元した反応については報告例がない。
ta）により（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
をコードする遺伝子がクローニングされ大腸菌で発現さ
れている(特願2000-333363)が、４−ヒドロキシ−２−
ブタノンを不斉還元した反応については報告例がない。
【００１１】更に、シュードモナス・プチダ（Pseudomo
nas putida）より２，３−ブタンジオール代謝に関与す
る２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードする遺伝
子がクローニングされた。この酵素は、大腸菌で発現さ
れている（FEMS Microbiol.Lett. 124 (2), 141-150 (1
994)）が、その立体選択性は報告されていない。また、
シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aerugino
sa）のゲノム解析の結果、シュードモナス・プチダ由来
の２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子に高いホモ
ロジーを有する遺伝子が同定されているが、この遺伝子
によってコードされる酵素の活性や、立体選択性などは
確認されていない。そのため、経済的に優れ、且つ、簡
便な方法で高い反応収率で光学純度の高い光学活性１，
３−ブタンジオールを得る方法の確立が望まれている。
nas putida）より２，３−ブタンジオール代謝に関与す
る２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードする遺伝
子がクローニングされた。この酵素は、大腸菌で発現さ
れている（FEMS Microbiol.Lett. 124 (2), 141-150 (1
994)）が、その立体選択性は報告されていない。また、
シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aerugino
sa）のゲノム解析の結果、シュードモナス・プチダ由来
の２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子に高いホモ
ロジーを有する遺伝子が同定されているが、この遺伝子
によってコードされる酵素の活性や、立体選択性などは
確認されていない。そのため、経済的に優れ、且つ、簡
便な方法で高い反応収率で光学純度の高い光学活性１，
３−ブタンジオールを得る方法の確立が望まれている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、光学活性な
１，３−ブタンジオールの製造において、光学純度の高
い生成物を収率良く与えることができる製造方法を提供
することを課題としている。また、本発明は、ＮＡＤＨ
を補酵素として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元
して、高い光学純度の（Ｒ）−１，３−ブタンジオール
を生成する新規な酵素の提供を課題とする。更に本発明
は、目的とする性状を備えた該酵素をコードするポリヌ
クレオチドを単離し、組換え体として得ることを課題と
する。加えて、組換え体による光学活性な１，３−ブタ
ンジオールの製造方法の提供をも課題とするものであ
る。
１，３−ブタンジオールの製造において、光学純度の高
い生成物を収率良く与えることができる製造方法を提供
することを課題としている。また、本発明は、ＮＡＤＨ
を補酵素として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元
して、高い光学純度の（Ｒ）−１，３−ブタンジオール
を生成する新規な酵素の提供を課題とする。更に本発明
は、目的とする性状を備えた該酵素をコードするポリヌ
クレオチドを単離し、組換え体として得ることを課題と
する。加えて、組換え体による光学活性な１，３−ブタ
ンジオールの製造方法の提供をも課題とするものであ
る。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、経済的に
優れ、且つ、簡便な方法で光学純度の高い光学活性１，
３−ブタンジオールを得る方法として、酵素の選択性に
着目した。たとえば、立体選択的に4−ヒドロキシ−2−
ブタノンを還元して（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを
生成する酵素を見出すことができれば、前記課題を解決
することができる。更に、このような酵素を異種微生物
により高発現させることができれば、遺伝子組換え菌を
用いて4−ヒドロキシ−2−ブタノンから（Ｒ）−１，３
−ブタンジオールを効率的に生産することが可能とな
る。
優れ、且つ、簡便な方法で光学純度の高い光学活性１，
３−ブタンジオールを得る方法として、酵素の選択性に
着目した。たとえば、立体選択的に4−ヒドロキシ−2−
ブタノンを還元して（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを
生成する酵素を見出すことができれば、前記課題を解決
することができる。更に、このような酵素を異種微生物
により高発現させることができれば、遺伝子組換え菌を
用いて4−ヒドロキシ−2−ブタノンから（Ｒ）−１，３
−ブタンジオールを効率的に生産することが可能とな
る。
【００１４】そしてこのような酵素を探索した結果、本
発明者らは、優れた反応収率と高い立体選択性を有する
酵素を見出し、それを精製することに成功した。この酵
素は、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を
脱水素する高い活性と高い立体選択性を併せ持つ、新規
な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素である。
本酵素は還元反応において４−ヒドロキシ−２−ブタノ
ンを還元して高い収率で高い光学純度の（Ｒ）−１，３
−ブタンジオールを生成する。また酸化反応において
は、この酵素は、ラセミ体の１，３−ブタンジオールの
うち、特異的に（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを酸化
して高い光学純度の（Ｓ）−１，３−ブタンジオールと
４−ヒドロキシ−２−ブタノンを生成する。本発明の
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択
性は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンの還元によって生
成する（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの光学純度が、
通常９０%ee以上、望ましくは９９%ee以上であることに
よって特徴付けることができる。
発明者らは、優れた反応収率と高い立体選択性を有する
酵素を見出し、それを精製することに成功した。この酵
素は、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を
脱水素する高い活性と高い立体選択性を併せ持つ、新規
な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素である。
本酵素は還元反応において４−ヒドロキシ−２−ブタノ
ンを還元して高い収率で高い光学純度の（Ｒ）−１，３
−ブタンジオールを生成する。また酸化反応において
は、この酵素は、ラセミ体の１，３−ブタンジオールの
うち、特異的に（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを酸化
して高い光学純度の（Ｓ）−１，３−ブタンジオールと
４−ヒドロキシ−２−ブタノンを生成する。本発明の
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択
性は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンの還元によって生
成する（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの光学純度が、
通常９０%ee以上、望ましくは９９%ee以上であることに
よって特徴付けることができる。
【００１５】本発明者らは、更に、本酵素をコードする
ＤＮＡを単離し、本酵素を高発現する組換え体の構築に
成功した。そして本酵素、あるいは組換え体の酵素活性
を利用して、光学活性アルコール、あるいはケトンの新
規な製造方法を確立し、本発明を完成した。すなわち本
発明は、以下の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素
酵素、この酵素をコードするポリヌクレオチド、この酵
素の製造方法、および用途に関する。 〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性質を有す
る（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。 （１）作用 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ
＋と略す）を補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−
ブタンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成す
る。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下、ＮＡＤＨと略す）を補酵素として、２，３−ブタン
ジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ールを生成する。 （２）基質特異性 （ａ）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を利用する。還
元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。 （ｂ）４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して、
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する。 （ｃ）ラセミ体１，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の
水酸基を優先的に酸化し、（Ｓ）−１，３−ブタンジオ
ールを残存させる。 （３）至適ｐＨ 酸化反応、還元反応ともにｐＨ ６．０。 〔２〕更に付加的に、次の（４）、（５）に示す理化学
的性質を有する〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタン
ジオール脱水素酵素。 （４）至適温度 酸化反応、還元反応ともに３７℃。 （５）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）により４５，
０００。ゲルろ過による分子量が９１，０００。 〔３〕クライベロマイセス属に属する微生物によって産
生される〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオー
ル脱水素酵素。 〔４〕クライベロマイセス属に属する微生物が、クライ
ベロマイセス・ラクティスである〔３〕に記載の（Ｒ）
−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。 〔５〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌ
クレオチド。 （ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌ
クレオチド。 （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
質をコードするポリヌクレオチド。 （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／
または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に
記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋
白質をコードするポリヌクレオチド。 （ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸
配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードす
るポリヌクレオチド。 （ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０%以上
の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチド。 〔６〕〔５〕に記載のポリヌクレオチドによってコード
される蛋白質。 〔７〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチドを含むベク
ター。 〔８〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチド、または
〔７〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
ＤＮＡを単離し、本酵素を高発現する組換え体の構築に
成功した。そして本酵素、あるいは組換え体の酵素活性
を利用して、光学活性アルコール、あるいはケトンの新
規な製造方法を確立し、本発明を完成した。すなわち本
発明は、以下の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素
酵素、この酵素をコードするポリヌクレオチド、この酵
素の製造方法、および用途に関する。 〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性質を有す
る（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。 （１）作用 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ
＋と略す）を補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−
ブタンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成す
る。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下、ＮＡＤＨと略す）を補酵素として、２，３−ブタン
ジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ールを生成する。 （２）基質特異性 （ａ）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を利用する。還
元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。 （ｂ）４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して、
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する。 （ｃ）ラセミ体１，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の
水酸基を優先的に酸化し、（Ｓ）−１，３−ブタンジオ
ールを残存させる。 （３）至適ｐＨ 酸化反応、還元反応ともにｐＨ ６．０。 〔２〕更に付加的に、次の（４）、（５）に示す理化学
的性質を有する〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタン
ジオール脱水素酵素。 （４）至適温度 酸化反応、還元反応ともに３７℃。 （５）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）により４５，
０００。ゲルろ過による分子量が９１，０００。 〔３〕クライベロマイセス属に属する微生物によって産
生される〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオー
ル脱水素酵素。 〔４〕クライベロマイセス属に属する微生物が、クライ
ベロマイセス・ラクティスである〔３〕に記載の（Ｒ）
−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。 〔５〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌ
クレオチド。 （ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌ
クレオチド。 （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
質をコードするポリヌクレオチド。 （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／
または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に
記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋
白質をコードするポリヌクレオチド。 （ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸
配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードす
るポリヌクレオチド。 （ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０%以上
の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチド。 〔６〕〔５〕に記載のポリヌクレオチドによってコード
される蛋白質。 〔７〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチドを含むベク
ター。 〔８〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチド、または
〔７〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔９〕〔８〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を
回収する工程を含む、〔６〕に記載の蛋白質の製造方
法。 〔１０〕クライベロマイセス属に属し、〔１〕に記載の
酵素、または〔６〕に記載の蛋白質を産生する微生物を
培養する工程を含む、〔１〕に記載の酵素、または
〔６〕に記載の蛋白質の製造方法。 〔１１〕クライベロマイセス属に属する微生物が、クラ
イベロマイセス・ラクティス（Kluyveromayces lacti
s）である〔１０〕に記載の製造方法。 〔１２〕ＮＡＤＨの存在下で、〔１〕に記載の（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔６〕に記載の蛋
白質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物
からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、
ケトンに作用させ、ケトンの還元によって生成する光学
活性アルコールを取得する工程を含む、光学活性アルコ
ールの製造方法。 〔１３〕微生物が、〔８〕に記載の形質転換体である
〔１２〕に記載の光学活性アルコールの製造方法。 〔１４〕ケトンが、４−ヒドロキシ−２−ブタノンであ
り、光学活性アルコールが（Ｒ）−１，３−ブタンジオ
ールである〔１２〕に記載の光学活性アルコールの製造
方法。 〔１５〕〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオー
ル脱水素酵素、〔６〕に記載の蛋白質、それらを産生す
る微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択さ
れるいずれかの酵素活性物質を、ＮＡＤ＋の存在下でラ
セミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を酸化
し、残存する光学活性アルコールを取得する工程を含
む、光学活性アルコールの製造方法。 〔１６〕微生物が、〔８〕に記載の形質転換体である
〔１５〕に記載の光学活性アルコールの製造方法。 〔１７〕ラセミ体アルコールが、ラセミ体１，３−ブタ
ンジオールであり、光学活性アルコールが（Ｓ）−１，
３−ブタンジオールである〔１５〕に記載の光学活性ア
ルコールの製造方法。 〔１８〕ＮＡＤ＋の存在下で、〔１〕に記載の（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔６〕に記載の蛋
白質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物
からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質をア
ルコールに作用させ、アルコールの酸化によって生成す
るケトンを取得する工程を含む、ケトンの製造方法。 〔１９〕微生物が、〔８〕に記載の形質転換体である
〔１８〕に記載のケトンの製造方法。 〔２０〕アルコールが（Ｒ）−１，３−ブタンジオール
であり、ケトンが４−ヒドロキシ−２−ブタノンである
〔１８〕に記載のケトンの製造方法。 〔２１〕次の工程を含む、（Ｒ）−１，３−ブタンジオ
ールの製造方法。 (1)（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを優先的に酸化
し、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを生成する酵素、そ
れを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群
から選択されるいずれかの酵素活性物質を、ラセミ体
１，３−ブタンジオールに作用させ、（Ｒ）−１，３−
ブタンジオールと４−ヒドロキシ−２−ブタノンを合成
する工程、(2)４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元し
て（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する酵素、そ
れを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群
から選択されるいずれかの酵素活性物質を、工程(1)に
より生成した４−ヒドロキシ−２−ブタノンに作用さ
せ、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して（Ｒ）−
１，３−ブタンジオールを生成する工程、および(3)工
程(2)で生成する（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを取
得する工程 〔２２〕前記工程(2)に記載の酵素活性物質が、〔１〕
に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、
〔６〕に記載の蛋白質、それらを産生する微生物、およ
びそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの
酵素活性物質である、〔２１〕に記載の（Ｒ）−１，３
−ブタンジオールの製造方法。 〔２３〕前記工程(1)における酵素活性物質が、キャン
ディダ・パラプシロシス由来の (S) 体特異的２級アル
コール脱水素酵素を生産する微生物、およびそれらの処
理物であることを特徴とする、〔２１〕に記載の（Ｒ）
−１，３−ブタンジオールの製造方法。
回収する工程を含む、〔６〕に記載の蛋白質の製造方
法。 〔１０〕クライベロマイセス属に属し、〔１〕に記載の
酵素、または〔６〕に記載の蛋白質を産生する微生物を
培養する工程を含む、〔１〕に記載の酵素、または
〔６〕に記載の蛋白質の製造方法。 〔１１〕クライベロマイセス属に属する微生物が、クラ
イベロマイセス・ラクティス（Kluyveromayces lacti
s）である〔１０〕に記載の製造方法。 〔１２〕ＮＡＤＨの存在下で、〔１〕に記載の（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔６〕に記載の蛋
白質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物
からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、
ケトンに作用させ、ケトンの還元によって生成する光学
活性アルコールを取得する工程を含む、光学活性アルコ
ールの製造方法。 〔１３〕微生物が、〔８〕に記載の形質転換体である
〔１２〕に記載の光学活性アルコールの製造方法。 〔１４〕ケトンが、４−ヒドロキシ−２−ブタノンであ
り、光学活性アルコールが（Ｒ）−１，３−ブタンジオ
ールである〔１２〕に記載の光学活性アルコールの製造
方法。 〔１５〕〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオー
ル脱水素酵素、〔６〕に記載の蛋白質、それらを産生す
る微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択さ
れるいずれかの酵素活性物質を、ＮＡＤ＋の存在下でラ
セミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を酸化
し、残存する光学活性アルコールを取得する工程を含
む、光学活性アルコールの製造方法。 〔１６〕微生物が、〔８〕に記載の形質転換体である
〔１５〕に記載の光学活性アルコールの製造方法。 〔１７〕ラセミ体アルコールが、ラセミ体１，３−ブタ
ンジオールであり、光学活性アルコールが（Ｓ）−１，
３−ブタンジオールである〔１５〕に記載の光学活性ア
ルコールの製造方法。 〔１８〕ＮＡＤ＋の存在下で、〔１〕に記載の（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔６〕に記載の蛋
白質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物
からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質をア
ルコールに作用させ、アルコールの酸化によって生成す
るケトンを取得する工程を含む、ケトンの製造方法。 〔１９〕微生物が、〔８〕に記載の形質転換体である
〔１８〕に記載のケトンの製造方法。 〔２０〕アルコールが（Ｒ）−１，３−ブタンジオール
であり、ケトンが４−ヒドロキシ−２−ブタノンである
〔１８〕に記載のケトンの製造方法。 〔２１〕次の工程を含む、（Ｒ）−１，３−ブタンジオ
ールの製造方法。 (1)（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを優先的に酸化
し、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを生成する酵素、そ
れを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群
から選択されるいずれかの酵素活性物質を、ラセミ体
１，３−ブタンジオールに作用させ、（Ｒ）−１，３−
ブタンジオールと４−ヒドロキシ−２−ブタノンを合成
する工程、(2)４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元し
て（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する酵素、そ
れを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群
から選択されるいずれかの酵素活性物質を、工程(1)に
より生成した４−ヒドロキシ−２−ブタノンに作用さ
せ、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して（Ｒ）−
１，３−ブタンジオールを生成する工程、および(3)工
程(2)で生成する（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを取
得する工程 〔２２〕前記工程(2)に記載の酵素活性物質が、〔１〕
に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、
〔６〕に記載の蛋白質、それらを産生する微生物、およ
びそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの
酵素活性物質である、〔２１〕に記載の（Ｒ）−１，３
−ブタンジオールの製造方法。 〔２３〕前記工程(1)における酵素活性物質が、キャン
ディダ・パラプシロシス由来の (S) 体特異的２級アル
コール脱水素酵素を生産する微生物、およびそれらの処
理物であることを特徴とする、〔２１〕に記載の（Ｒ）
−１，３−ブタンジオールの製造方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明による（Ｒ）−２，３−ブ
タンジオール脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ＋を利
用しうること、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の
水酸基を優先的に酸化すること、また、ＮＡＤＨを補酵
素として４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元し、光学
活性な（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成すること
によって特徴付けられる。本発明において、（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素とは、２，３−ブタ
ンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化する活
性を有する脱水素酵素であり、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３
−ブタンジオールとともにメソ−２，３−ブタンジオー
ルの（Ｒ）配置の水酸基も酸化する活性を有する。本酵
素は、実施例に示すように（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ールに対する酵素活性が強いことから、（Ｒ）−２，３
−ブタンジオール脱水素酵素と呼ぶ。加えてこの酵素
は、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに対する脱水素酵
素作用も有する。
タンジオール脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ＋を利
用しうること、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の
水酸基を優先的に酸化すること、また、ＮＡＤＨを補酵
素として４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元し、光学
活性な（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成すること
によって特徴付けられる。本発明において、（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素とは、２，３−ブタ
ンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化する活
性を有する脱水素酵素であり、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３
−ブタンジオールとともにメソ−２，３−ブタンジオー
ルの（Ｒ）配置の水酸基も酸化する活性を有する。本酵
素は、実施例に示すように（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ールに対する酵素活性が強いことから、（Ｒ）−２，３
−ブタンジオール脱水素酵素と呼ぶ。加えてこの酵素
は、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに対する脱水素酵
素作用も有する。
【００１７】本発明において、（Ｒ）−１，３−ブタン
ジオールに対する酸化活性、４−ヒドロキシ−２−ブタ
ノンに対する還元活性、および、２，３−ブタンジオン
に対する還元活性は、次のようにして確認することがで
きる。
ジオールに対する酸化活性、４−ヒドロキシ−２−ブタ
ノンに対する還元活性、および、２，３−ブタンジオン
に対する還元活性は、次のようにして確認することがで
きる。
【００１８】（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに対する
酸化活性測定法:５０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）、２．５mM ＮＡＤ＋、２０mM（Ｒ）−１，３
−ブタンジオール及び酵素を合む反応液中３０℃で反応
させ、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０nmの吸光度の増
加を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの増
加を触媒する酵素量とした。また、蛋白質の定量は、バ
イオラッド製蛋白質アッセイキットを用いた色素結合法
により行った。
酸化活性測定法:５０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）、２．５mM ＮＡＤ＋、２０mM（Ｒ）−１，３
−ブタンジオール及び酵素を合む反応液中３０℃で反応
させ、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０nmの吸光度の増
加を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの増
加を触媒する酵素量とした。また、蛋白質の定量は、バ
イオラッド製蛋白質アッセイキットを用いた色素結合法
により行った。
【００１９】４−ヒドロキシ−２−ブタノンに対する還
元活性測定法:５０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）、０．２mM ＮＡＤＨ、２０mM４−ヒドロキシ
−２−ブタノン及び酵素を合む反応液中３０℃で反応さ
せ、ＮＡＤＨの減少にともなう３４０ nmの吸光度の減
少を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの減
少を触媒する酵素量とした。
元活性測定法:５０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）、０．２mM ＮＡＤＨ、２０mM４−ヒドロキシ
−２−ブタノン及び酵素を合む反応液中３０℃で反応さ
せ、ＮＡＤＨの減少にともなう３４０ nmの吸光度の減
少を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの減
少を触媒する酵素量とした。
【００２０】２，３−ブタンジオンに対する還元活性測
定法:５０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）、
０．２mM ＮＡＤＨ、２０mM２，３−ブタンジオン及び
酵素を合む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＨの減少
にともなう３４０ nmの吸光度の減少を測定する。１U
は、１分間に１μmolのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素
量とした。
定法:５０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）、
０．２mM ＮＡＤＨ、２０mM２，３−ブタンジオン及び
酵素を合む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＨの減少
にともなう３４０ nmの吸光度の減少を測定する。１U
は、１分間に１μmolのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素
量とした。
【００２１】上記のような理化学的性状を持つ（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、たとえばクライ
ベロマイセス属酵母の培養物より精製することができ
る。クライベロマイセス属酵母としては、クライベロマ
イセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）が特に本
発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
の産生能に優れる。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素を得るために利用することができるク
ライベロマイセス・ラクティスは、たとえば、ＩＦＯ
１２６７、ＡＴＣＣ ８５８５、ＮＲＲＬ Ｙ−１１４
０、ＣＢＳ ２３５９、ＩＦＯ１９０２、ＩＦＯ １９０
３、ＩＦＯ ０４３３、として財団法人発酵研究所より
入手することができる。これらのうち、ＩＦＯ １２６
７が本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素を得るために好適に利用できる。
２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、たとえばクライ
ベロマイセス属酵母の培養物より精製することができ
る。クライベロマイセス属酵母としては、クライベロマ
イセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）が特に本
発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
の産生能に優れる。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素を得るために利用することができるク
ライベロマイセス・ラクティスは、たとえば、ＩＦＯ
１２６７、ＡＴＣＣ ８５８５、ＮＲＲＬ Ｙ−１１４
０、ＣＢＳ ２３５９、ＩＦＯ１９０２、ＩＦＯ １９０
３、ＩＦＯ ０４３３、として財団法人発酵研究所より
入手することができる。これらのうち、ＩＦＯ １２６
７が本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素を得るために好適に利用できる。
【００２２】上記微生物は、ＹＭ培地等の真菌の培養に
用いられる一般的な培地で培養される。十分に増殖させ
た後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェ
ニルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤やプロテア
ーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液と
する。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画
（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマ
トグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたア
フィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせ
ることにより精製する事ができる。たとえば、フェニル
−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、Ｍｏ
ｎｏＱを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチ
ル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、ハ
イアパタイトを用いた吸着クロマトグラフィー等を経て
電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。
用いられる一般的な培地で培養される。十分に増殖させ
た後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェ
ニルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤やプロテア
ーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液と
する。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画
（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマ
トグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたア
フィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせ
ることにより精製する事ができる。たとえば、フェニル
−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、Ｍｏ
ｎｏＱを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチ
ル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、ハ
イアパタイトを用いた吸着クロマトグラフィー等を経て
電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。
【００２３】クライベロマイセス・ラクティスに由来す
る本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
は、以下の理化学的性状（１）−（３）を備えた蛋白質
である。 （１）作用 ＮＡＤ＋を補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブ
タンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成す
る。ＮＡＤＨを補酵素として、２，３−ブタンジオンを
還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生
成する。 （２）基質特異性 （ａ）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を利用する。還
元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。 （ｂ）４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して、
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する。 （ｃ）ラセミ体１，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の
水酸基を優先的に酸化し、（Ｓ）−１，３−ブタンジオ
ールを残存させる。 （３）至適ｐＨ 酸化反応、還元反応ともにｐＨ ６．０。
る本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
は、以下の理化学的性状（１）−（３）を備えた蛋白質
である。 （１）作用 ＮＡＤ＋を補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブ
タンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成す
る。ＮＡＤＨを補酵素として、２，３−ブタンジオンを
還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生
成する。 （２）基質特異性 （ａ）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を利用する。還
元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。 （ｂ）４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して、
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する。 （ｃ）ラセミ体１，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の
水酸基を優先的に酸化し、（Ｓ）−１，３−ブタンジオ
ールを残存させる。 （３）至適ｐＨ 酸化反応、還元反応ともにｐＨ ６．０。
【００２４】更に付加的に、次の（４）、（５）に示す
理化学的性質を有する請求項１に記載の（Ｒ）−２，３
−ブタンジオール脱水素酵素。 （４）至適温度 酸化反応、還元反応ともに３７℃。 （５）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４５，０００。ゲルろ過による
分子量が９１，０００。
理化学的性質を有する請求項１に記載の（Ｒ）−２，３
−ブタンジオール脱水素酵素。 （４）至適温度 酸化反応、還元反応ともに３７℃。 （５）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４５，０００。ゲルろ過による
分子量が９１，０００。
【００２５】クライベロマイセス・ラクティスに由来す
る（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵
素として酸化反応におけるβ−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋と省略す
る）、あるいは還元反応における還元型β−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨ
と省略する）を実質的に利用することができない。しか
し、ＮＡＤＰ＋やＮＡＤＰＨの利用性に関わらず、前記
物理学化学的性状（１）−（３）、望ましくは（１）−
（５）を備えた酵素は、本発明に含まれる。
る（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵
素として酸化反応におけるβ−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋と省略す
る）、あるいは還元反応における還元型β−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨ
と省略する）を実質的に利用することができない。しか
し、ＮＡＤＰ＋やＮＡＤＰＨの利用性に関わらず、前記
物理学化学的性状（１）−（３）、望ましくは（１）−
（５）を備えた酵素は、本発明に含まれる。
【００２６】本発明は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオー
ル脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその
ホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチド
は、DNAやRNA等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工
的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であること
もできる。また本発明のポリヌクレオチドは、DNA-RNA
のキメラ分子であることもできる。本発明の（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌ
クレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を
含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に
示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしており、この
アミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明による（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素の好ましい態様を構
成する。
ル脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその
ホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチド
は、DNAやRNA等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工
的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であること
もできる。また本発明のポリヌクレオチドは、DNA-RNA
のキメラ分子であることもできる。本発明の（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌ
クレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を
含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に
示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしており、この
アミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明による（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素の好ましい態様を構
成する。
【００２７】本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール
脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログと
は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加さ
れたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質
（１）−（３）を有する蛋白質をコードするポリヌクレ
オチドを含む。当業者であれば、配列番号：１記載のポ
リヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid
Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,p
p.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practica
l Approach IRL Press pp.200 (1991) などを用いて、
適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入
することによりポリヌクレオチドのホモログを得ること
が可能である。
脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログと
は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加さ
れたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質
（１）−（３）を有する蛋白質をコードするポリヌクレ
オチドを含む。当業者であれば、配列番号：１記載のポ
リヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid
Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,p
p.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practica
l Approach IRL Press pp.200 (1991) などを用いて、
適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入
することによりポリヌクレオチドのホモログを得ること
が可能である。
【００２８】また、本発明におけるポリヌクレオチドの
ホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなる
ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリ
ダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理
化学的性質（１）−（３）を有する蛋白質をコードする
ポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハ
イブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：
１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少な
くとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連
続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブ
ＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeli
ng and detection system (Amersham Pharmaica Biotec
h社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：４２
℃、0.5xSSCを含むprimary wash buffer）において、ハ
イブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
ホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなる
ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリ
ダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理
化学的性質（１）−（３）を有する蛋白質をコードする
ポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハ
イブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：
１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少な
くとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連
続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブ
ＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeli
ng and detection system (Amersham Pharmaica Biotec
h社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：４２
℃、0.5xSSCを含むprimary wash buffer）において、ハ
イブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００２９】さらに、本発明におけるポリヌクレオチド
のホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と
少なくとも８０%、好ましくは少なくとも８５%または９
０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有する蛋
白質をコードするポリヌクレオチドを含む。蛋白質のホ
モロジー検索は、たとえばSWISS-PROT, PIRなどの蛋白
質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMB
L、あるいはGenBankなどのＤＮＡ配列に関するデータベ
ース、ＤＮＡ配列を元にした予想酸配列に関するデータ
ベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを
利用して、例えば、インターネットを通じて行うことが
できる。
のホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と
少なくとも８０%、好ましくは少なくとも８５%または９
０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有する蛋
白質をコードするポリヌクレオチドを含む。蛋白質のホ
モロジー検索は、たとえばSWISS-PROT, PIRなどの蛋白
質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMB
L、あるいはGenBankなどのＤＮＡ配列に関するデータベ
ース、ＤＮＡ配列を元にした予想酸配列に関するデータ
ベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを
利用して、例えば、インターネットを通じて行うことが
できる。
【００３０】配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用い
てSWISS-PROTを対象にBLASTプログラムを用いてホモロ
ジー検索を行った結果、既知の蛋白質の中でもっとも高
いホモロジーを示したのは、サッカロマイセス・セレビ
ジアエ（Saccharomyces cerevisiae）のYAG0であった。
YAG0は、ゲノム解析の結果から推測された、仮想アルコ
ール脱水素酵素様蛋白質（HYPOTHETICAL ZINC-TYPE ALC
OHOL DEHYDROGENASE-LIKE PROTEIN）で、その蛋白質と
しての存在、機能、理化学的性質などは全く不明であ
る。このYAG0に対するホモロジーはIdentityで６０％、
Positiveで７３％であった。本発明の８０％以上のホモ
ロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いたPositiv
eの相同性の値を表す。
てSWISS-PROTを対象にBLASTプログラムを用いてホモロ
ジー検索を行った結果、既知の蛋白質の中でもっとも高
いホモロジーを示したのは、サッカロマイセス・セレビ
ジアエ（Saccharomyces cerevisiae）のYAG0であった。
YAG0は、ゲノム解析の結果から推測された、仮想アルコ
ール脱水素酵素様蛋白質（HYPOTHETICAL ZINC-TYPE ALC
OHOL DEHYDROGENASE-LIKE PROTEIN）で、その蛋白質と
しての存在、機能、理化学的性質などは全く不明であ
る。このYAG0に対するホモロジーはIdentityで６０％、
Positiveで７３％であった。本発明の８０％以上のホモ
ロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いたPositiv
eの相同性の値を表す。
【００３１】本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸
配列からなる蛋白質に関する。本発明はまた、配列番
号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ
を含む。
配列からなる蛋白質に関する。本発明はまた、配列番
号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ
を含む。
【００３２】本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール
脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミ
ノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿
入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配
列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能
的に同等な蛋白質を意味する。本発明において、配列番
号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に
同等とは、当該蛋白質が前記（１）−（３）に示した物
理化学的性状を有することを意味する。当業者であれ
ば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法
（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in
Enzymol.100,pp.448 (1983), MolecularCloning 2ndEd
t., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , P
CR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）
などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または
付加変異を導入することにより（Ｒ）−２，３−ブタン
ジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレ
オチドを得ることができる。その（Ｒ）−２，３−ブタ
ンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌク
レオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列
番号：２に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水
素酵素のホモログを得ることが可能である。
脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミ
ノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿
入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配
列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能
的に同等な蛋白質を意味する。本発明において、配列番
号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に
同等とは、当該蛋白質が前記（１）−（３）に示した物
理化学的性状を有することを意味する。当業者であれ
ば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法
（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in
Enzymol.100,pp.448 (1983), MolecularCloning 2ndEd
t., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , P
CR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）
などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または
付加変異を導入することにより（Ｒ）−２，３−ブタン
ジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレ
オチドを得ることができる。その（Ｒ）−２，３−ブタ
ンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌク
レオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列
番号：２に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水
素酵素のホモログを得ることが可能である。
【００３３】さらに、本発明の（Ｒ）−２，３−ブタン
ジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に示
されるアミノ酸配列と少なくとも８０%、好ましくは少
なくとも８５%または９０%、より好ましくは９５%以上
のホモロジーを有する蛋白質をいう。蛋白質のホモロジ
ー検索は、たとえばSWISS-PROT、PIRなどの蛋白質のア
ミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるい
はGenBankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、Ｄ
ＮＡ配列を元にした予想酸配列に関するデータベースな
どを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用し
て、例えば、インターネットを通じて行うことができ
る。
ジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に示
されるアミノ酸配列と少なくとも８０%、好ましくは少
なくとも８５%または９０%、より好ましくは９５%以上
のホモロジーを有する蛋白質をいう。蛋白質のホモロジ
ー検索は、たとえばSWISS-PROT、PIRなどの蛋白質のア
ミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるい
はGenBankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、Ｄ
ＮＡ配列を元にした予想酸配列に関するデータベースな
どを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用し
て、例えば、インターネットを通じて行うことができ
る。
【００３４】本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール
脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえ
ば、以下のような方法によって単離することができる。
脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえ
ば、以下のような方法によって単離することができる。
【００３５】配列番号：１に記載の塩基配列を元にＰＣ
Ｒ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡ
もしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを
行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
Ｒ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡ
もしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを
行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００３６】さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブと
して、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をフ
ァージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換し
て得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用
して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイ
ブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオ
チドを得ることができる。
して、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をフ
ァージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換し
て得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用
して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイ
ブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオ
チドを得ることができる。
【００３７】また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の
塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの
外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵
素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自
己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うこ
とにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、Ｒ
ＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣ
Ｒ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより
本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの
外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵
素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自
己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うこ
とにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、Ｒ
ＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣ
Ｒ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより
本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００３８】なお本発明のポリヌクレオチドには、以上
のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮ
Ａ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮ
Ａが含まれる。
のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮ
Ａ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮ
Ａが含まれる。
【００３９】このようにして単離された、本発明による
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードす
るポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入するこ
とにより、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
発現ベクターが提供される。
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードす
るポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入するこ
とにより、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
発現ベクターが提供される。
【００４０】また、この発現ベクターで形質転換した形
質転換体を培養することにより、本発明の（Ｒ）−２，
３−ブタンジオール脱水素酵素を組換え体から得ること
ができる。
質転換体を培養することにより、本発明の（Ｒ）−２，
３−ブタンジオール脱水素酵素を組換え体から得ること
ができる。
【００４１】本発明において（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素を発現させるために、形質転換の対象
となる微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水
素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を発現
することができる生物であれば特に制限はない。利用可
能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示
すことができる。
オール脱水素酵素を発現させるために、形質転換の対象
となる微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水
素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を発現
することができる生物であれば特に制限はない。利用可
能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示
すことができる。
【００４２】エシェリヒア(Escherichia)属 バチルス(Bacillus)属 シュードモナス(Pseudomonas)属 セラチア(Serratia)属 ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属 コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属 ストレプトコッカス(Streptococcus)属 ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系
の開発されている細菌 ロドコッカス(Rhodococcus)属 ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター
系の開発されている放線菌 サッカロマイセス(Saccharomyces)属 クライベロマイセス(Kluyveromyces)属 シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属 チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属 ヤロウイア(Yarrowia)属 トリコスポロン(Trichosporon)属 ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属 ピキア(Pichia)属 キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発
されている酵母 ノイロスポラ(Neurospora)属 アスペルギルス(Aspergillus)属 セファロスポリウム(Cephalosporium)属 トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の
開発されているカビ
の開発されている細菌 ロドコッカス(Rhodococcus)属 ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター
系の開発されている放線菌 サッカロマイセス(Saccharomyces)属 クライベロマイセス(Kluyveromyces)属 シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属 チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属 ヤロウイア(Yarrowia)属 トリコスポロン(Trichosporon)属 ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属 ピキア(Pichia)属 キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発
されている酵母 ノイロスポラ(Neurospora)属 アスペルギルス(Aspergillus)属 セファロスポリウム(Cephalosporium)属 トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の
開発されているカビ
【００４３】形質転換体の作製のための手順および宿主
に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物
工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に
準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキ
ュラー・クローニング、ColdSpring Harbor Laboratori
es）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＨを電子
供与体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において
安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター
中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳さ
せる必要がある。
に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物
工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に
準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキ
ュラー・クローニング、ColdSpring Harbor Laboratori
es）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＨを電子
供与体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において
安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター
中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳さ
せる必要がある。
【００４４】そのためには、転写・翻訳を制御するユニ
ットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側
上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流
に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ター
ミネーターとしては、宿主として利用する微生物中にお
いて機能することが知られているプロモーター、ターミ
ネーターを用いる必要がある。これら各種微生物におい
て利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−
などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出
版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 7
5-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細
に記述されている。
ットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側
上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流
に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ター
ミネーターとしては、宿主として利用する微生物中にお
いて機能することが知られているプロモーター、ターミ
ネーターを用いる必要がある。これら各種微生物におい
て利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−
などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出
版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 7
5-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細
に記述されている。
【００４５】例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェ
リヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミ
ドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、
lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペ
ロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ P
Ｌ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用でき
る。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファー
ジ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーター
などを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳ
Ｅ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイト
を一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開2000-189
170に記載）が好適に利用できる。
リヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミ
ドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、
lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペ
ロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ P
Ｌ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用でき
る。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファー
ジ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーター
などを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳ
Ｅ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイト
を一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開2000-189
170に記載）が好適に利用できる。
【００４６】バチルス属においては、ベクターとしてpU
B110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能
であり、染色体にインテグレートすることもできる。ま
た、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリ
プロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミ
ラーゼ)などが利用できる。
B110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能
であり、染色体にインテグレートすることもできる。ま
た、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリ
プロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミ
ラーゼ)などが利用できる。
【００４７】シュードモナス属においては、シュードモ
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系
が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプ
ラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター
(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含
む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ター
ミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子
などが利用できる。
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系
が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプ
ラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター
(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含
む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ター
ミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子
などが利用できる。
【００４８】ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))な
どのプラスミドベクターが利用可能である。プロモータ
ー、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されている
プロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能であ
る。
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))な
どのプラスミドベクターが利用可能である。プロモータ
ー、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されている
プロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能であ
る。
【００４９】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen.
Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが
利用可能である。
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen.
Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが
利用可能である。
【００５０】ストレプトコッカス(Streptococcus)属に
おいては、pHV1301(FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (19
85)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (198
5)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
おいては、pHV1301(FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (19
85)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (198
5)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００５１】ラクトバチルス(Lactobacillus)属におい
ては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J.
Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であ
り、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが
利用可能である。
ては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J.
Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であ
り、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが
利用可能である。
【００５２】ロドコッカス(Rhodococcus)属において
は、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodoch
rous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能で
ある (J.Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
は、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodoch
rous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能で
ある (J.Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００５３】ストレプトマイセス(Streptomyces)属にお
いては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Strepto
myces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Labo
ratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを
構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486
(Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gen
e 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1
995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バー
ジニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプ
ラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11,
46-53 (1997) ）。
いては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Strepto
myces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Labo
ratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを
構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486
(Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gen
e 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1
995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バー
ジニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプ
ラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11,
46-53 (1997) ）。
【００５４】サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラ
スミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在する
リボソームＤＮＡとの相同組換えを利用したインテグレ
ーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺
伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極
めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、G
APDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PH
O(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダー
ゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラー
ゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能で
ある。
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラ
スミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在する
リボソームＤＮＡとの相同組換えを利用したインテグレ
ーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺
伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極
めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、G
APDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PH
O(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダー
ゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラー
ゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能で
ある。
【００５５】クライベロマイセス属、特にクライベロマ
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラス
ミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390
(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミ
ド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS
系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組換えに
より染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミ
ド（EP 537456など）などが利用可能である。また、AD
H、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが
利用可能である。
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラス
ミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390
(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミ
ド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS
系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組換えに
より染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミ
ド（EP 537456など）などが利用可能である。また、AD
H、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが
利用可能である。
【００５６】シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyc
es)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセ
ス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マー
カーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol.
Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマ
イセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用でき
る（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒
造から市販されており容易に利用できる。
es)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセ
ス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マー
カーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol.
Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマ
イセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用でき
る（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒
造から市販されており容易に利用できる。
【００５７】チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyc
es)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygo
saccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Re
s. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクタ
ーが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ
由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロ
ウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 252
1 (1990)）などが利用可能である。
es)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygo
saccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Re
s. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクタ
ーが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ
由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロ
ウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 252
1 (1990)）などが利用可能である。
【００５８】ピキア(Pichia)属においては、ピキア・ア
ンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula
polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されてい
る。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複
製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能である
が、比較的不安定であるため、染色体への多コピーイン
テグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (199
1)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコ
ールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモータ
ーなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(P
ichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する
遺伝子 (PARS1、PARS2)などを利用した宿主ベクター系
が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (198
5)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強
いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15,
3859 (1987)）。
ンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula
polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されてい
る。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複
製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能である
が、比較的不安定であるため、染色体への多コピーイン
テグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (199
1)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコ
ールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモータ
ーなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(P
ichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する
遺伝子 (PARS1、PARS2)などを利用した宿主ベクター系
が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (198
5)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強
いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15,
3859 (1987)）。
【００５９】キャンディダ(Candida)属においては、キ
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・
ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系
が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいて
はキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニング
され（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、こ
れを利用したベクターが開発されている。また、キャン
ディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタ
イプのベクターは強力なプロモーターが開発されている
（特開平 08-173170）。
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・
ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系
が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいて
はキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニング
され（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、こ
れを利用したベクターが開発されている。また、キャン
ディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタ
イプのベクターは強力なプロモーターが開発されている
（特開平 08-173170）。
【００６０】アスペルギルス(Aspergillus)属において
は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、
アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) など
がカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染
色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外
プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可
能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (198
9)）。
は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、
アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) など
がカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染
色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外
プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可
能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (198
9)）。
【００６１】トリコデルマ(Trichoderma)属において
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnol
ogy 7, 596-603 (1989)）。
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnol
ogy 7, 596-603 (1989)）。
【００６２】また、微生物以外でも、植物、動物におい
て様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を
用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、ト
ウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白
質を発現させる系が開発されており、好適に利用でき
る。
て様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を
用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、ト
ウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白
質を発現させる系が開発されており、好適に利用でき
る。
【００６３】本発明において使用する（Ｒ）−２，３−
ブタンジオール脱水素酵素生産能を有する微生物は、
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有
するクライベロマイセス属に属するすべての菌株、突然
変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された
本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
ブタンジオール脱水素酵素生産能を有する微生物は、
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有
するクライベロマイセス属に属するすべての菌株、突然
変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された
本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
【００６４】本発明は、前記（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素活性を有する酵素活性物質を利用し
た、ケトンの還元による光学活性なアルコールの製造方
法、あるいはアルコールの酸化によるケトンの製造方法
に関する。本発明において、（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素活性を有する酵素活性物質とは、前記
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、組換え蛋
白質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物
からなる群から選択されるいずれかの物質を言う。
オール脱水素酵素活性を有する酵素活性物質を利用し
た、ケトンの還元による光学活性なアルコールの製造方
法、あるいはアルコールの酸化によるケトンの製造方法
に関する。本発明において、（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素活性を有する酵素活性物質とは、前記
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、組換え蛋
白質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物
からなる群から選択されるいずれかの物質を言う。
【００６５】また本発明における微生物の処理物には、
具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理に
よって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガ
ラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽
出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。更に
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、あるいは
その組換え蛋白質の処理物には、酵素蛋白質を担体に結
合、吸着、あるいは包埋したものが含まれる。担体には
不溶性のもののみならず、水溶性の担体が用いられる場
合もある。担体を利用して酵素蛋白質の処理物を得る方
法は公知である。
具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理に
よって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガ
ラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽
出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。更に
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、あるいは
その組換え蛋白質の処理物には、酵素蛋白質を担体に結
合、吸着、あるいは包埋したものが含まれる。担体には
不溶性のもののみならず、水溶性の担体が用いられる場
合もある。担体を利用して酵素蛋白質の処理物を得る方
法は公知である。
【００６６】まず本発明は、ＮＡＤＨの存在下で、前記
酵素活性物質を、ケトンに作用させ、ケトンの還元によ
って生成する光学活性アルコールを取得する工程を含
む、光学活性アルコールの製造方法に関する。あるいは
本発明は、前記酵素活性物質を、ＮＡＤ＋の存在下でラ
セミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を酸化
し、残存する光学活性アルコールを取得する工程を含
む、光学活性アルコールの製造方法に関する。
酵素活性物質を、ケトンに作用させ、ケトンの還元によ
って生成する光学活性アルコールを取得する工程を含
む、光学活性アルコールの製造方法に関する。あるいは
本発明は、前記酵素活性物質を、ＮＡＤ＋の存在下でラ
セミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を酸化
し、残存する光学活性アルコールを取得する工程を含
む、光学活性アルコールの製造方法に関する。
【００６７】本発明による光学活性なアルコールの製造
方法におけるケトンとしては、２，３−ブタンジオンや
２，３−ペンタンジオン、あるいは４−ヒドロキシ−２
−ブタノンが好適に用いられる。たとえば４−ヒドロキ
シ−２−ブタノンを基質として用いた場合には、（Ｒ）
−１，３−ブタンジオールを合成することができる。ま
た、ラセミ体１，３−ブタンジオールを原料として、前
記酵素活性物質を作用させることにより、（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールを選択的に酸化して、残存する光学
活性アルコールである（Ｓ）−１，３−ブタンジオール
を得ることができる。
方法におけるケトンとしては、２，３−ブタンジオンや
２，３−ペンタンジオン、あるいは４−ヒドロキシ−２
−ブタノンが好適に用いられる。たとえば４−ヒドロキ
シ−２−ブタノンを基質として用いた場合には、（Ｒ）
−１，３−ブタンジオールを合成することができる。ま
た、ラセミ体１，３−ブタンジオールを原料として、前
記酵素活性物質を作用させることにより、（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールを選択的に酸化して、残存する光学
活性アルコールである（Ｓ）−１，３−ブタンジオール
を得ることができる。
【００６８】更に本発明は、本発明の酵素とは逆の立体
選択性を有するアルコール脱水素酵素を生産する微生物
と、本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素を生産する微生物をともに利用することにより、ラセ
ミ体アルコールから所望の光学活性アルコールを生産す
る方法に関する。すなわち本発明は、次の工程を含む、
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造方法を提供す
る。 (1)（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを優先的に酸化
し、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを生成する酵素、そ
れを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群
から選択されるいずれかの酵素活性物質を、ラセミ体
１，３−ブタンジオールに作用させ、（Ｒ）−１，３−
ブタンジオールと４−ヒドロキシ−２−ブタノンを合成
する工程、(2)４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元し
て（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する酵素、そ
れを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群
から選択されるいずれかの酵素活性物質を、工程(1)に
より生成した４−ヒドロキシ−２−ブタノンに作用さ
せ、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して（Ｒ）−
１，３−ブタンジオールを生成する工程、および(3)工
程(2)で生成する（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを取
得する工程前記工程のうち、工程(1)および(2)は、逐
次、もしくは、同時に行うことができる。
選択性を有するアルコール脱水素酵素を生産する微生物
と、本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素を生産する微生物をともに利用することにより、ラセ
ミ体アルコールから所望の光学活性アルコールを生産す
る方法に関する。すなわち本発明は、次の工程を含む、
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造方法を提供す
る。 (1)（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを優先的に酸化
し、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを生成する酵素、そ
れを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群
から選択されるいずれかの酵素活性物質を、ラセミ体
１，３−ブタンジオールに作用させ、（Ｒ）−１，３−
ブタンジオールと４−ヒドロキシ−２−ブタノンを合成
する工程、(2)４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元し
て（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する酵素、そ
れを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群
から選択されるいずれかの酵素活性物質を、工程(1)に
より生成した４−ヒドロキシ−２−ブタノンに作用さ
せ、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して（Ｒ）−
１，３−ブタンジオールを生成する工程、および(3)工
程(2)で生成する（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを取
得する工程前記工程のうち、工程(1)および(2)は、逐
次、もしくは、同時に行うことができる。
【００６９】ラセミ体１，３−ブタンジオールの内、
（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを選択的に酸化する活
性を有する微生物としては、例えば、特開平02-19589
7、特開平03-187399、特開平04-152895、特開平03-2286
93に記載の、ラセミ体１，３−ブタンジオールから
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生産することが知ら
れている微生物が挙げられる。
（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを選択的に酸化する活
性を有する微生物としては、例えば、特開平02-19589
7、特開平03-187399、特開平04-152895、特開平03-2286
93に記載の、ラセミ体１，３−ブタンジオールから
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生産することが知ら
れている微生物が挙げられる。
【００７０】また、ラセミ体１，３−ブタンジオールの
内、（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを選択的に酸化す
る活性を有する酵素としては、（Ｓ）体特異的２級アル
コール脱水素酵素が挙げられ、キャンディダ・パラプシ
ロシスの生産する （Ｓ）体特異的２級アルコール脱水
素酵素（特開平07-231785）やゲオトリカム・キャンデ
ィダムの生産する（Ｓ）体特異的２級アルコール脱水素
酵素(WO98/17788)) などが挙げられる。これらの中で、
キャンディダ・パラプシロシスの生産する （Ｓ）体特
異的２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を高
発現させた大腸菌（特開平07-231785）が好適に用いら
れる。
内、（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを選択的に酸化す
る活性を有する酵素としては、（Ｓ）体特異的２級アル
コール脱水素酵素が挙げられ、キャンディダ・パラプシ
ロシスの生産する （Ｓ）体特異的２級アルコール脱水
素酵素（特開平07-231785）やゲオトリカム・キャンデ
ィダムの生産する（Ｓ）体特異的２級アルコール脱水素
酵素(WO98/17788)) などが挙げられる。これらの中で、
キャンディダ・パラプシロシスの生産する （Ｓ）体特
異的２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を高
発現させた大腸菌（特開平07-231785）が好適に用いら
れる。
【００７１】更に本発明は、ＮＡＤ＋の存在下で、前記
酵素活性物質をアルコールに作用させ、アルコールの酸
化によって生成するケトンを取得する工程を含む、ケト
ンの製造方法に関する。
酵素活性物質をアルコールに作用させ、アルコールの酸
化によって生成するケトンを取得する工程を含む、ケト
ンの製造方法に関する。
【００７２】本発明によるケトンの製造方法におけるア
ルコールとしては、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール、およびメソ−２，３−ブタンジオールが挙げら
れる。これらの化合物を基質として用いることにより、
それぞれ、（Ｒ）−アセトイン、および（Ｓ）−アセト
インを合成することができる。また、（Ｒ）−１，３−
ブタンジオールからは４−ヒドロキシ−２−ブタノンを
合成することができる。
ルコールとしては、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール、およびメソ−２，３−ブタンジオールが挙げら
れる。これらの化合物を基質として用いることにより、
それぞれ、（Ｒ）−アセトイン、および（Ｓ）−アセト
インを合成することができる。また、（Ｒ）−１，３−
ブタンジオールからは４−ヒドロキシ−２−ブタノンを
合成することができる。
【００７３】酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培
養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体
を、基質と補酵素を含む反応溶液と接触させることによ
り、目的とする酵素反応を行わせることができる。な
お、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定
されない。
養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体
を、基質と補酵素を含む反応溶液と接触させることによ
り、目的とする酵素反応を行わせることができる。な
お、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定
されない。
【００７４】本発明の光学活性アルコールの製造方法に
おいて、還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡ
Ｄ＋を、ＮＡＤＨへ再生するための酵素反応を組み合わ
せることができる。再生するための酵素反応は、たとえ
ば微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系、メチロトロー
フのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができ
る。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースやエ
タノール、ギ酸などを添加することにより増強すること
が可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する
能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加
することによって、ＮＡＤＨを再生することもできる。
たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、ア
ルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水
素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、
その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用い
てＮＡＤＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤ
Ｈ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるア
ルコールの製造のための反応系に添加する、固定化した
ものを添加する、あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を
介して接触させることができる。
おいて、還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡ
Ｄ＋を、ＮＡＤＨへ再生するための酵素反応を組み合わ
せることができる。再生するための酵素反応は、たとえ
ば微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系、メチロトロー
フのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができ
る。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースやエ
タノール、ギ酸などを添加することにより増強すること
が可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する
能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加
することによって、ＮＡＤＨを再生することもできる。
たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、ア
ルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水
素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、
その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用い
てＮＡＤＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤ
Ｈ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるア
ルコールの製造のための反応系に添加する、固定化した
ものを添加する、あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を
介して接触させることができる。
【００７５】また、本発明のＤＮＡを含む組換えベクタ
ーで形質転換した微生物の生菌体を前記アルコールの製
造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加
的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡ
ＤＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転
換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素
を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、Ｎ
ＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱
水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵
素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）など
の遺伝子を、本発明のＮＡＤＨ依存性（Ｒ）−２，３−
ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡと同時に
宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＨ再
生酵素とＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２，３−ブタンジオー
ル脱水素酵素の発現、還元反応を行うことも可能であ
る。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への
導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる
複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクタ
ーにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに
両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝
子を染色体中に導入する方法などを利用することができ
る。
ーで形質転換した微生物の生菌体を前記アルコールの製
造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加
的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡ
ＤＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転
換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素
を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、Ｎ
ＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱
水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵
素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）など
の遺伝子を、本発明のＮＡＤＨ依存性（Ｒ）−２，３−
ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡと同時に
宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＨ再
生酵素とＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２，３−ブタンジオー
ル脱水素酵素の発現、還元反応を行うことも可能であ
る。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への
導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる
複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクタ
ーにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに
両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝
子を染色体中に導入する方法などを利用することができ
る。
【００７６】単一のベクター中に複数の遺伝子を導入す
る場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制
御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラ
クトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペ
ロンとして発現させることも可能である。
る場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制
御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラ
クトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペ
ロンとして発現させることも可能である。
【００７７】本発明の光学活性アルコールの製造方法、
あるいはケトンの製造方法において、酸化反応に付随し
てＮＡＤ＋から生成するＮＡＤＨを、ＮＡＤ＋へ再生す
るための酵素反応を組み合わせることができる。本発明
の光学活性アルコールの製造方法は、ラセミ体を構成す
る光学異性体の一方を酸化し、他方を残存させる工程を
含む。
あるいはケトンの製造方法において、酸化反応に付随し
てＮＡＤ＋から生成するＮＡＤＨを、ＮＡＤ＋へ再生す
るための酵素反応を組み合わせることができる。本発明
の光学活性アルコールの製造方法は、ラセミ体を構成す
る光学異性体の一方を酸化し、他方を残存させる工程を
含む。
【００７８】酸化反応に付随してＮＡＤ＋から生成する
ＮＡＤＨを、ＮＡＤ＋へ再生するための工程は、通常、
微生物の有するＮＡＤＨ酸化活性により行うことができ
る。具体的には、細胞の電子伝達系を構成するＮＡＤＨ
脱水素酵素、ＮＡＤＨ酸化酵素、ジアホラーゼ（J.Am.C
hem.Soc. 107, 6999-7008 (1985)）などの作用により行
うことができる。大腸菌などを宿主として利用する場合
には、本発明の (R)-2,3-ブタンジオール脱水素酵素を
コードする遺伝子を有する微生物を溶存酸素濃度を低く
保ちながら培養することにより、ＮＡＤ＋再生活性が高
い微生物を調製することができる（特開2000-19748
5）。また、前記ＮＡＤＨと同様にＮＡＤＨ脱水素酵
素、ＮＡＤＨ酸化酵素、ジアホラーゼなどをコードする
遺伝子を、本発明の (R)-2,3-ブタンジオール脱水素酵
素をコードする遺伝子とともに宿主に導入することによ
り、より効率的にＮＡＤ ＋再生を行うことができる。
ＮＡＤＨを、ＮＡＤ＋へ再生するための工程は、通常、
微生物の有するＮＡＤＨ酸化活性により行うことができ
る。具体的には、細胞の電子伝達系を構成するＮＡＤＨ
脱水素酵素、ＮＡＤＨ酸化酵素、ジアホラーゼ（J.Am.C
hem.Soc. 107, 6999-7008 (1985)）などの作用により行
うことができる。大腸菌などを宿主として利用する場合
には、本発明の (R)-2,3-ブタンジオール脱水素酵素を
コードする遺伝子を有する微生物を溶存酸素濃度を低く
保ちながら培養することにより、ＮＡＤ＋再生活性が高
い微生物を調製することができる（特開2000-19748
5）。また、前記ＮＡＤＨと同様にＮＡＤＨ脱水素酵
素、ＮＡＤＨ酸化酵素、ジアホラーゼなどをコードする
遺伝子を、本発明の (R)-2,3-ブタンジオール脱水素酵
素をコードする遺伝子とともに宿主に導入することによ
り、より効率的にＮＡＤ ＋再生を行うことができる。
【００７９】本発明の酵素を用いた反応は、水中もしく
は水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、
酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンな
どの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との２相系、もし
くは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタ
ノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、ア
セトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系において
行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リ
アクターなどを利用して行うことも可能である。
は水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、
酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンな
どの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との２相系、もし
くは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタ
ノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、ア
セトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系において
行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リ
アクターなどを利用して行うことも可能である。
【００８０】本発明の反応は、反応温度４−６０℃、好
ましくは１５−３０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ
６−９．５、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは
０．１−３０%で行うことができる。反応系には必要に
応じて補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨが０．００１mM
−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加でき
る。また、基質は反応開始時に一括して添加することも
可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎない
ように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ま
しい。
ましくは１５−３０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ
６−９．５、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは
０．１−３０%で行うことができる。反応系には必要に
応じて補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨが０．００１mM
−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加でき
る。また、基質は反応開始時に一括して添加することも
可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎない
ように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ま
しい。
【００８１】ＮＡＤＨの再生のために、たとえば、グル
コース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱
水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素
を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノール
などが反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケ
トンに対してモル比で０．１−２０、好ましくは１−５
倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水
素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素など
の、ＮＡＤＨ再生用の酵素は、本発明のＮＡＤＨ依存性
カルボニル脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１
００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することが
できる。
コース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱
水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素
を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノール
などが反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケ
トンに対してモル比で０．１−２０、好ましくは１−５
倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水
素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素など
の、ＮＡＤＨ再生用の酵素は、本発明のＮＡＤＨ依存性
カルボニル脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１
００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することが
できる。
【００８２】この基質濃度に対して、本発明の（Ｒ）−
２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、４−ヒドロキシ
−２−ブタノン還元反応の場合、たとえば１mU/mL〜１
００U/mL (４−ヒドロキシ−２−ブタノン還元活性とし
て)、好ましくは１００mU/mL以上の酵素量とすることに
より、酵素反応を効率的に進めることができる。また酵
素活性物質として微生物菌体を利用するときには、基質
に対する微生物の使用量は、乾燥菌体として0.01〜5.0
重量％相当量とするのが好ましい。酵素や、菌体などの
酵素活性物質は、反応液に溶解、あるいは分散させるこ
とにより、基質と接触させることができる。あるいは、
化学結合や包括などの手法によって固定化した酵素活性
物質を用いることもできる。更に、基質は透過できる
が、酵素分子や菌体の透過を制限する多孔質膜で基質溶
液と酵素活性物質を隔てた状態で反応させることもでき
る。
２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、４−ヒドロキシ
−２−ブタノン還元反応の場合、たとえば１mU/mL〜１
００U/mL (４−ヒドロキシ−２−ブタノン還元活性とし
て)、好ましくは１００mU/mL以上の酵素量とすることに
より、酵素反応を効率的に進めることができる。また酵
素活性物質として微生物菌体を利用するときには、基質
に対する微生物の使用量は、乾燥菌体として0.01〜5.0
重量％相当量とするのが好ましい。酵素や、菌体などの
酵素活性物質は、反応液に溶解、あるいは分散させるこ
とにより、基質と接触させることができる。あるいは、
化学結合や包括などの手法によって固定化した酵素活性
物質を用いることもできる。更に、基質は透過できる
が、酵素分子や菌体の透過を制限する多孔質膜で基質溶
液と酵素活性物質を隔てた状態で反応させることもでき
る。
【００８３】本発明のケトンの還元により生成するアル
コールの精製は、菌体、蛋白質の遠心分離、膜処理など
による分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせる
ことにより行うことができる。たとえば、（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールでは、微生物菌体を含む反応液を遠
心分離し、微生物菌体を除いた後、その濾液に酢酸エチ
ルなどの溶媒を添加して（Ｒ）−１，３−ブタンジオー
ルを溶媒層に抽出する。これを相分離後、蒸留すること
により純度の高い（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを精
製することができる。以下、実施例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるもので
はない。
コールの精製は、菌体、蛋白質の遠心分離、膜処理など
による分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせる
ことにより行うことができる。たとえば、（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールでは、微生物菌体を含む反応液を遠
心分離し、微生物菌体を除いた後、その濾液に酢酸エチ
ルなどの溶媒を添加して（Ｒ）−１，３−ブタンジオー
ルを溶媒層に抽出する。これを相分離後、蒸留すること
により純度の高い（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを精
製することができる。以下、実施例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるもので
はない。
【００８４】
【実施例】［実施例１］（Ｒ）−２，３−ブタンジオー
ル脱水素酵素の精製 クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ １２６７株を
１．２ＬのＹＭ培地（グルコース２０g/L、酵母エキス
３g/L、麦芽エキス３g/L、ペプトン５g/L、ｐＨ６．
０）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られ
た湿菌体を５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）、０．０２％２−メルカプトエタノール及び２mMフ
ェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で澱懸
し、ビードビーター（Biospec社製）により破砕後、遠
心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離
により除核酸した上清を得た。その上清に硫安を３０％
飽和になるまで添加し、３０％硫安を含む標準緩衝液
（１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．０１
％２−メルカプトエタノール、１０％ グリセロール）
で平衡化したフェニル−セファロースＨＰ（２．６cm×
１０cm）に添加し、硫安濃度を３０％−０％の勾配溶出
を行った。ＮＡＤＨ依存性４−ヒドロキシ−２−ブタノ
ン還元活性は、勾配溶出部分に３つのピークがみられ
た。これらのピークのうち最初に溶出したピーク部分を
回収し、限外濾過により濃縮した。
ル脱水素酵素の精製 クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ １２６７株を
１．２ＬのＹＭ培地（グルコース２０g/L、酵母エキス
３g/L、麦芽エキス３g/L、ペプトン５g/L、ｐＨ６．
０）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られ
た湿菌体を５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）、０．０２％２−メルカプトエタノール及び２mMフ
ェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で澱懸
し、ビードビーター（Biospec社製）により破砕後、遠
心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離
により除核酸した上清を得た。その上清に硫安を３０％
飽和になるまで添加し、３０％硫安を含む標準緩衝液
（１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．０１
％２−メルカプトエタノール、１０％ グリセロール）
で平衡化したフェニル−セファロースＨＰ（２．６cm×
１０cm）に添加し、硫安濃度を３０％−０％の勾配溶出
を行った。ＮＡＤＨ依存性４−ヒドロキシ−２−ブタノ
ン還元活性は、勾配溶出部分に３つのピークがみられ
た。これらのピークのうち最初に溶出したピーク部分を
回収し、限外濾過により濃縮した。
【００８５】濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析
した後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ（０．５cm×
５cm）に添加し、０−０．５ M塩化ナトリウムの勾配
溶出を行った。溶出した４−ヒドロキシ−２−ブタノン
還元活性画分を回収し、限外濾過により濃縮した。濃縮
酵素液に硫安を４０％飽和になるまで添加し、４０％飽
和硫安を含む標準緩衝液で平衡化したブチル−セファロ
ース（０．７５cm×２．５cm）に添加し、４０％−０％
飽和硫安で勾配溶出を行った。溶出した４−ヒドロキシ
−２−ブタノン還元活性画分を回収した。４−ヒドロキ
シ−２−ブタノン還元活性画分を０．０１％２−メルカ
プトエタノール、１０％グリセロールを含む５mMリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）に透析した後、同緩衝
液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（０．５cm
×１０cm）に添加し、５−３５０mMリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ ８．０）の濃度勾配溶出を行った。ヒドロキ
シアパタイト−カラムにより得られた４−ヒドロキシ−
２−ブタノン還元活性画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
解析した結果、単一バンドであった（図１）。精製酵素
の比活性は約１．５ U/mgであった。精製の要約を表１
に示す。
した後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ（０．５cm×
５cm）に添加し、０−０．５ M塩化ナトリウムの勾配
溶出を行った。溶出した４−ヒドロキシ−２−ブタノン
還元活性画分を回収し、限外濾過により濃縮した。濃縮
酵素液に硫安を４０％飽和になるまで添加し、４０％飽
和硫安を含む標準緩衝液で平衡化したブチル−セファロ
ース（０．７５cm×２．５cm）に添加し、４０％−０％
飽和硫安で勾配溶出を行った。溶出した４−ヒドロキシ
−２−ブタノン還元活性画分を回収した。４−ヒドロキ
シ−２−ブタノン還元活性画分を０．０１％２−メルカ
プトエタノール、１０％グリセロールを含む５mMリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）に透析した後、同緩衝
液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（０．５cm
×１０cm）に添加し、５−３５０mMリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ ８．０）の濃度勾配溶出を行った。ヒドロキ
シアパタイト−カラムにより得られた４−ヒドロキシ−
２−ブタノン還元活性画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
解析した結果、単一バンドであった（図１）。精製酵素
の比活性は約１．５ U/mgであった。精製の要約を表１
に示す。
【００８６】
【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ステップ 蛋白質 酵素活性 比活性 (mg) (U) (U/mg) ──────────────────────────── 無細胞抽出液 3390 16.2 0.00478 プロタミン硫酸沈殿 1480 12.5 0.00845 フェニル−セファロース 50.8 2.08 0.0410 MonoQ 2.23 1.27 0.570 ブチル−セファロース 0.559 0.394 0.705 ヒドロキシアパタイト 0.0325 0.0483 1.484 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００８７】［実施例２］（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ール脱水素酵素の分子量測定 実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより求めた結果、４５，０００であっ
た。また、スーパーデックスＧ２００のゲルろ過カラム
を用いて分子量を測定したところ、９１，０００であっ
た。
ール脱水素酵素の分子量測定 実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより求めた結果、４５，０００であっ
た。また、スーパーデックスＧ２００のゲルろ過カラム
を用いて分子量を測定したところ、９１，０００であっ
た。
【００８８】［実施例３］（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ール脱水素酵素の至適ｐＨ リン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ブリッ
トン・ロビンソンの広域緩衝液を用いてｐＨを変化させ
て、実施例１で得られた酵素の（Ｒ）−１，３−ブタン
ジオールの酸化活性、４−ヒドロキシー２−ブタノンの
還元活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表
し、図２に酸化活性、図３に還元活性を示した。反応の
至適ｐＨは酸化反応、還元反応ともに６．０であった。
ール脱水素酵素の至適ｐＨ リン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ブリッ
トン・ロビンソンの広域緩衝液を用いてｐＨを変化させ
て、実施例１で得られた酵素の（Ｒ）−１，３−ブタン
ジオールの酸化活性、４−ヒドロキシー２−ブタノンの
還元活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表
し、図２に酸化活性、図３に還元活性を示した。反応の
至適ｐＨは酸化反応、還元反応ともに６．０であった。
【００８９】［実施例４］（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ール脱水素酵素の至適温度 実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけ
を変化させて、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの酸化
活性、４−ヒドロキシー２−ブタノンの還元活性を測定
し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図４に酸
化活性、図５に還元活性を示した。反応の至適温度は酸
化反応，還元反応ともに３７℃であった。
ール脱水素酵素の至適温度 実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけ
を変化させて、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの酸化
活性、４−ヒドロキシー２−ブタノンの還元活性を測定
し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図４に酸
化活性、図５に還元活性を示した。反応の至適温度は酸
化反応，還元反応ともに３７℃であった。
【００９０】［実施例５］（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ール脱水素酵素の基質特異性 実施例１で得られた酵素を種々のアルコールやケトンと
反応させ、その酸化、還元反応の活性を（Ｒ）−１，３
−ブタンジオールの酸化、４−ヒドロキシ−２−ブタノ
ンの還元を１００とした相対活性で表し、表２に示し
た。
ール脱水素酵素の基質特異性 実施例１で得られた酵素を種々のアルコールやケトンと
反応させ、その酸化、還元反応の活性を（Ｒ）−１，３
−ブタンジオールの酸化、４−ヒドロキシ−２−ブタノ
ンの還元を１００とした相対活性で表し、表２に示し
た。
【００９１】
【表２】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 基質 補酵素 相対活性 ─────────────────────────── 酸化反応 （Ｒ）−１，３−ブタンジオール NAD+ 100 (R)-2-ブタノール NAD+ 28 イソプロピルアルコール NAD+ 48 n-ブタノール NAD+ 0 エタノール NAD+ 0 グリセリン NAD+ 66 (2R,3R)-ブタンジオール NAD+ 15600 (R)-1,2-プロパンジオール NAD+ 13800 (S)-3-クロロ-1,2-プロパンジオール NAD+ 128 ─────────────────────────── 還元反応 ４−ヒドロキシ−２−ブタノン NADH 100 2-ブタノン NADH 31 アセトン NADH 63 3-ペンタノン NADH 100 2,3-ブタンジオン NADH 46400 2,3-ペンタンジオン NADH 51400 2,4-ペンタンジオン NADH 0 4-クロロ-アセト酢酸エチル NADH 0 アセト酢酸エチル NADH 0 アセトール NADH 53600 アセトイン NADH 101000 1-ヒドロキシ-2-ブタノン NADH 12100 アセトフェノン NADH 36 2-ヒドロキシ-アセトフェノン NADH 360 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００９２】［実施例６］（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ール脱水素酵素の立体選択性 実施例１で得られた酵素を１，３−ブタンジオール、
１，２−プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、
２−ブタノール、３−クロロ−１，２−プロパンジオー
ルと反応させ、活性の高い光学活性に対する酸化を１０
０とした相対活性で表し、表３に示した。本発明による
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、２，３
−ブタンジオールおよび１，２−プロパンジオールの立
体選択性が非常に高かった。
ール脱水素酵素の立体選択性 実施例１で得られた酵素を１，３−ブタンジオール、
１，２−プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、
２−ブタノール、３−クロロ−１，２−プロパンジオー
ルと反応させ、活性の高い光学活性に対する酸化を１０
０とした相対活性で表し、表３に示した。本発明による
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、２，３
−ブタンジオールおよび１，２−プロパンジオールの立
体選択性が非常に高かった。
【００９３】
【表３】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 基質 補酵素 相対活性 ─────────────────────────── （Ｒ）−１，３−ブタンジオール NAD+ 100 （Ｓ）−１，３−ブタンジオール NAD+ 35 ─────────────────────────── (R)-2-ブタノール NAD+ 100 (S)-2-ブタノール NAD+ 75 ─────────────────────────── (2R,3R)-2,3-ブタンジオール NAD+ 100 (2S,3S)-2,3-ブタンジオール NAD+ 1 ─────────────────────────── (R)-1,2-プロパンジオール NAD+ 100 (S)-1,2-プロパンジオール NAD+ 1 ─────────────────────────── (R)-3-クロロ-1,2-プロパンジオール NAD+ 29 (S)-3-クロロ-1,2-プロパンジオール NAD+ 100 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００９４】［実施例７］（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ール脱水素酵素を用いた（Ｒ）−１，３−ブタンジオー
ルの合成 ２００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）、４４m
gＮＡＤＨ、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素０．６Ｕ、０．１％４−ヒドロキシ−２−ブタノンを
含む反応液２mL中で、２５℃で終夜反応させた。生成し
た１，３−ブタンジオールの光学純度は次のようにして
求めた。反応液２mLを塩化ナトリウムで飽和させた後、
酢酸エチル２mLにより１，３−ブタンジオールを抽出し
た。抽出溶媒を脱溶媒した後、残渣に塩化アセチル１０
０μLを加えて、アセチル化した。これに１mLのｎ−ヘ
キサンを加えて、アセチル化した１，３−ブタンジオー
ルを溶解し、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラ
フィーにより分析した。光学分割カラムは、ダイセル化
学工業株式会社製キラルセルＯＢ（CHIRALCEL OＢ.４.
６ mm × ２５ cm） を用い、ｎ−ヘキサン：イソプロ
パノール＝１９：１の溶離液、流速１．０mL/min、波長
２２０nm、温度４０℃により行った。その結果、本発明
によって生成した１，３−ブタンジオールは、９９％ｅ
ｅ以上のＲ体であった。また、生成された１，３−ブタ
ンジオールをガスクロマトグラフィーで定量し、出発原
料である４−ヒドロキシ−２−ブタノンに対する収率を
求めた。ガスクロマトグラフィーの条件は以下のとおり
である。すなわち、Porapak PS(Waters)、mesh 50-80、
３．２mmｘ２１０cmを用い、カラム温度を１６５℃と
し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を利用して分析し
た。その結果、反応の収率は約９５％であった。
ール脱水素酵素を用いた（Ｒ）−１，３−ブタンジオー
ルの合成 ２００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）、４４m
gＮＡＤＨ、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素０．６Ｕ、０．１％４−ヒドロキシ−２−ブタノンを
含む反応液２mL中で、２５℃で終夜反応させた。生成し
た１，３−ブタンジオールの光学純度は次のようにして
求めた。反応液２mLを塩化ナトリウムで飽和させた後、
酢酸エチル２mLにより１，３−ブタンジオールを抽出し
た。抽出溶媒を脱溶媒した後、残渣に塩化アセチル１０
０μLを加えて、アセチル化した。これに１mLのｎ−ヘ
キサンを加えて、アセチル化した１，３−ブタンジオー
ルを溶解し、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラ
フィーにより分析した。光学分割カラムは、ダイセル化
学工業株式会社製キラルセルＯＢ（CHIRALCEL OＢ.４.
６ mm × ２５ cm） を用い、ｎ−ヘキサン：イソプロ
パノール＝１９：１の溶離液、流速１．０mL/min、波長
２２０nm、温度４０℃により行った。その結果、本発明
によって生成した１，３−ブタンジオールは、９９％ｅ
ｅ以上のＲ体であった。また、生成された１，３−ブタ
ンジオールをガスクロマトグラフィーで定量し、出発原
料である４−ヒドロキシ−２−ブタノンに対する収率を
求めた。ガスクロマトグラフィーの条件は以下のとおり
である。すなわち、Porapak PS(Waters)、mesh 50-80、
３．２mmｘ２１０cmを用い、カラム温度を１６５℃と
し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を利用して分析し
た。その結果、反応の収率は約９５％であった。
【００９５】［実施例８］（Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ール脱水素酵素の部分アミノ酸配列 実施例１で得られた酵素を用いて、プロテインシーケン
サーによりＮ末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配
列を配列番号：３に示した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
ゲルより、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
を含むゲル断片を切り出し、２回洗浄後、リジルエンド
ペプチダーゼを用いて、３５℃で終夜イン・ゲル・ダイ
ジェションを行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ
(東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、２.０mm × ２５０mm)
を用い、０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中でア
セトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離
し、分取した。分取したペプチドピーク1種をlep_78と
し、プロテインシーケンサー（HewlettPackard G1005A
Protein Sequencer System）によりアミノ酸配列の解析
を行った。lep_78のアミノ酸配列を配列番号：４で示し
た。
ール脱水素酵素の部分アミノ酸配列 実施例１で得られた酵素を用いて、プロテインシーケン
サーによりＮ末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配
列を配列番号：３に示した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
ゲルより、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
を含むゲル断片を切り出し、２回洗浄後、リジルエンド
ペプチダーゼを用いて、３５℃で終夜イン・ゲル・ダイ
ジェションを行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ
(東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、２.０mm × ２５０mm)
を用い、０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中でア
セトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離
し、分取した。分取したペプチドピーク1種をlep_78と
し、プロテインシーケンサー（HewlettPackard G1005A
Protein Sequencer System）によりアミノ酸配列の解析
を行った。lep_78のアミノ酸配列を配列番号：４で示し
た。
【００９６】配列番号：３：N末端アミノ酸配列 Met-Arg-Ala-Leu-Ala-Tyr-Phe-Gly-Lys-Gln 配列番号：４：lep_78 Leu-Ala-Pro-Gly-Gly-Glu-Gly-Phe-Asp-Phe
【００９７】［実施例９］クライベロマイセス・ラクテ
ィスからの染色体ＤＮＡの精製 クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ １２６７株を
ＹＭ培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体
ＤＮＡの精製は、Meth. Cell Biol. 29, 39-44(1975)
に記載の方法により行った。
ィスからの染色体ＤＮＡの精製 クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ １２６７株を
ＹＭ培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体
ＤＮＡの精製は、Meth. Cell Biol. 29, 39-44(1975)
に記載の方法により行った。
【００９８】［実施例１０］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素遺伝子のコア領域のクローニング N末端、lep_78のアミノ酸配列を元にそれぞれセンスプ
ライマー、アンチセンスプライマーを合成した。それぞ
れの塩基配列を配列番号：５ (KLB1-N) 、６ (KLB1-78)
に示した。
オール脱水素酵素遺伝子のコア領域のクローニング N末端、lep_78のアミノ酸配列を元にそれぞれセンスプ
ライマー、アンチセンスプライマーを合成した。それぞ
れの塩基配列を配列番号：５ (KLB1-N) 、６ (KLB1-78)
に示した。
【００９９】配列番号：５：KLB1-N GTCGGATCCGCHYTNGCHTAYTTYGGNAA 配列番号：６：KLB1-78 CAGGGATCCRAARTCRAADCCYTCDCCDCC
【０１００】プライマーKLB1-N、KLB1-78各５０pmol、d
NTP１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由来染
色体ＤＮＡ５０ng、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液 (宝酒造
製)、Ｅｘ−Ｔａｑ ２Ｕ (宝酒造製)を含む５０μLの反
応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（５０
℃、３０秒）、伸長（７０℃、４０秒）を３０サイク
ル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を
用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電
気泳動により解析した結果、８００bpあたりに特異的と
思われるバンドが検出できた。得られたＤＮＡ断片を、
フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿とし
て回収した。得られたＤＮＡ断片を、BamHIで制限酵素
消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とす
るバンドの部分を切り出し、Sephaglas BandPrep Kit
(ファルマシア製)により精製した。
NTP１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由来染
色体ＤＮＡ５０ng、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液 (宝酒造
製)、Ｅｘ−Ｔａｑ ２Ｕ (宝酒造製)を含む５０μLの反
応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（５０
℃、３０秒）、伸長（７０℃、４０秒）を３０サイク
ル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を
用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電
気泳動により解析した結果、８００bpあたりに特異的と
思われるバンドが検出できた。得られたＤＮＡ断片を、
フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿とし
て回収した。得られたＤＮＡ断片を、BamHIで制限酵素
消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とす
るバンドの部分を切り出し、Sephaglas BandPrep Kit
(ファルマシア製)により精製した。
【０１０１】得られたＤＮＡ断片を、BamHIで消化したp
UC18（宝酒造製）とTakara Ligation Kitを用いて、ラ
イゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。形質
転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地
（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキ
ス、１％塩化ナトリウム、以下、ＬＢ培地と略す）プレ
ート上で生育させ、Blue/Whiteセレクション法により選
別されたいくつかの白色のコロニーをアンピシリンを含
む液体ＬＢ培地で培養し、Flexi-Prep(ファルマシア製)
によりプラスミドを精製し、pKLB1とした。精製したプ
ラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。
ＤＮＡ塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle
Sequencing FS ready Reaction Kit(パーキンエルマー
製)を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンサーABI PRI
SMTM３１０(パーキンエルマー製)により行った。決定さ
れたコア領域の塩基配列を配列番号：７に示した。
UC18（宝酒造製）とTakara Ligation Kitを用いて、ラ
イゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。形質
転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地
（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキ
ス、１％塩化ナトリウム、以下、ＬＢ培地と略す）プレ
ート上で生育させ、Blue/Whiteセレクション法により選
別されたいくつかの白色のコロニーをアンピシリンを含
む液体ＬＢ培地で培養し、Flexi-Prep(ファルマシア製)
によりプラスミドを精製し、pKLB1とした。精製したプ
ラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。
ＤＮＡ塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle
Sequencing FS ready Reaction Kit(パーキンエルマー
製)を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンサーABI PRI
SMTM３１０(パーキンエルマー製)により行った。決定さ
れたコア領域の塩基配列を配列番号：７に示した。
【０１０２】［実施例１２］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解
析 クライベロマイセス・ラクティス由来染色体ＤＮＡを制
限酵素PstI、HaeII、BamHI、NdeIで消化し、T4リガーゼ
を用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応によ
り、各断片を環化させた。次に、プライマーKLB1-IP1
(配列番号：８)およびKLB1-IP2(配列番号：９)を各１０
０ｐｍｏｌ、環化ＤＮＡを２５ng、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝
液 (宝酒造製)、Ｅｘ−Ｔａｑ ２Ｕ (宝酒造製)を含む
５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、ア
ニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、７分）を３
０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエル
マー製)を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロ
ースゲル電気泳動により解析した結果、PstI、HaeII、B
amHI、NdeIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約１６０
０bp、４０００bp、２４００bp、および２１００bpのＤ
ＮＡ断片が検出できた。このDNA断片をSephaglas BandP
rep Kit(ファルマシア製)により精製し、塩基配列をKLB
1-IP1、KLB1-IP2を用いて解析した。その結果、（Ｒ）
−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のＯＲＦ配列を決
定することができた。決定したDNA配列は配列番号：１
に、予想されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。Ｏ
ＲＦ検索は、Genetyx-win（ソフトウェア開発株式会社
製）ソフトを用いて行った。
オール脱水素酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解
析 クライベロマイセス・ラクティス由来染色体ＤＮＡを制
限酵素PstI、HaeII、BamHI、NdeIで消化し、T4リガーゼ
を用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応によ
り、各断片を環化させた。次に、プライマーKLB1-IP1
(配列番号：８)およびKLB1-IP2(配列番号：９)を各１０
０ｐｍｏｌ、環化ＤＮＡを２５ng、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝
液 (宝酒造製)、Ｅｘ−Ｔａｑ ２Ｕ (宝酒造製)を含む
５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、ア
ニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、７分）を３
０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエル
マー製)を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロ
ースゲル電気泳動により解析した結果、PstI、HaeII、B
amHI、NdeIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約１６０
０bp、４０００bp、２４００bp、および２１００bpのＤ
ＮＡ断片が検出できた。このDNA断片をSephaglas BandP
rep Kit(ファルマシア製)により精製し、塩基配列をKLB
1-IP1、KLB1-IP2を用いて解析した。その結果、（Ｒ）
−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のＯＲＦ配列を決
定することができた。決定したDNA配列は配列番号：１
に、予想されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。Ｏ
ＲＦ検索は、Genetyx-win（ソフトウェア開発株式会社
製）ソフトを用いて行った。
【０１０３】配列番号：８：KLB1-IP1 CAGGGATCCACCGCAGATACCACACCATG 配列番号：９：KLB1-IP2 GTCGGATCCGTGTCGAAACCTTCGATCCT
【０１０４】［実施例１３］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素遺伝子のクローニング （Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の構造遺伝
子配列を元にＯＲＦのみをクローニングするためのプラ
イマーKLBDH1-N（配列番号：１０）、KLBDH1-C（配列番
号：１１）を合成した。プライマーを各５０pmol、dNTP
１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由来染色体
ＤＮＡ５０ng、Pfu Turbo-DNA polymerase用緩衝液 (ST
RATAGENE製)、Pfu Turbo-DNA polymerase ２．５Ｕ (ST
RATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５
℃、２分３０秒）、アニール（５５℃、１分）、伸長
（７２℃、１分３０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR Sy
stem2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
オール脱水素酵素遺伝子のクローニング （Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の構造遺伝
子配列を元にＯＲＦのみをクローニングするためのプラ
イマーKLBDH1-N（配列番号：１０）、KLBDH1-C（配列番
号：１１）を合成した。プライマーを各５０pmol、dNTP
１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由来染色体
ＤＮＡ５０ng、Pfu Turbo-DNA polymerase用緩衝液 (ST
RATAGENE製)、Pfu Turbo-DNA polymerase ２．５Ｕ (ST
RATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５
℃、２分３０秒）、アニール（５５℃、１分）、伸長
（７２℃、１分３０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR Sy
stem2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
【０１０５】配列番号：１０：KLBDH1-N CTTGAATTCTACCATGCGTGCATTAGCTTATTTCGG 配列番号：１１：KLBDH1-C CAGCTTAAGATCTCTAGATTAGTTGGTGGCATCCAACTCACCATG
【０１０６】得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。ＤＮ
Ａ断片を制限酵素EcoR I、Afl IIで2重消化し、アガロ
ースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切
り出し、Sephaglas BandPrepKit(ファルマシア製)によ
り精製した。得られたＤＮＡ断片を、EcoR I、Afl IIで
2重消化したpSE420D（Invitrogen製のプラスミドベクタ
ーpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラス
ミド、特開2000-189170）とTakara Ligation Kitを用い
て、ライゲーションし、大腸菌HB101株を形質転換し
た。形質転換株をアンピシリンを含むＬＢ培地プレート
上で生育させ、挿入断片の塩基配列を解析した。目的と
する（Ｒ）−２，３−ブタンジオン脱水素酵素遺伝子を
持つプラスミドをpSE-KLB2とした。
ロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。ＤＮ
Ａ断片を制限酵素EcoR I、Afl IIで2重消化し、アガロ
ースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切
り出し、Sephaglas BandPrepKit(ファルマシア製)によ
り精製した。得られたＤＮＡ断片を、EcoR I、Afl IIで
2重消化したpSE420D（Invitrogen製のプラスミドベクタ
ーpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラス
ミド、特開2000-189170）とTakara Ligation Kitを用い
て、ライゲーションし、大腸菌HB101株を形質転換し
た。形質転換株をアンピシリンを含むＬＢ培地プレート
上で生育させ、挿入断片の塩基配列を解析した。目的と
する（Ｒ）−２，３−ブタンジオン脱水素酵素遺伝子を
持つプラスミドをpSE-KLB2とした。
【０１０７】［実施例１４］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素の大腸菌による生産 （Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を発現する
プラスミドpSE-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株を
アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、０．０２％ ２
−メルカプトエタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリ
セリンを含む５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）
に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバ
イオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕し
た。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中
として回収した。また該遺伝子を含まないプラスミドpS
E420Dを持つ大腸菌をＬＢ培地で終夜培養し、０．１mM
ＩＰＴＧ添加後さらに４時間培養した菌体を、同様に破
砕して２，３−ブタンジオンに対する還元活性を測定し
た。結果を表４に示す。
オール脱水素酵素の大腸菌による生産 （Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を発現する
プラスミドpSE-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株を
アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、０．０２％ ２
−メルカプトエタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリ
セリンを含む５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）
に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバ
イオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕し
た。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中
として回収した。また該遺伝子を含まないプラスミドpS
E420Dを持つ大腸菌をＬＢ培地で終夜培養し、０．１mM
ＩＰＴＧ添加後さらに４時間培養した菌体を、同様に破
砕して２，３−ブタンジオンに対する還元活性を測定し
た。結果を表４に示す。
【０１０８】
【表４】
【０１０９】［実施例１５］pSE-KLB2で形質転換した大
腸菌HB101による（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの製
造 pSE-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、１．０％ ラセ
ミ体１，３−ブタンジオールを含む１００mMリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０mLに懸濁し、終夜３０℃
で振とう反応を行った。反応後、反応液中の１，３−ブ
タンジオールの光学純度を分析した。その結果、残存し
た１，３−ブタンジオールは、９９％ｅｅ以上のS体で
あった。また、反応液中の１，３−ブタンジオールと４
−ヒドロキシ−２−ブタノンの定量をガスクロマトグラ
フィーで分析した。その結果、４．９g/Lの１，３−ブ
タンジオールと４．３g/Lの４−ヒドロキシ−２−ブタ
ノンが残存していた。
腸菌HB101による（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの製
造 pSE-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、１．０％ ラセ
ミ体１，３−ブタンジオールを含む１００mMリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０mLに懸濁し、終夜３０℃
で振とう反応を行った。反応後、反応液中の１，３−ブ
タンジオールの光学純度を分析した。その結果、残存し
た１，３−ブタンジオールは、９９％ｅｅ以上のS体で
あった。また、反応液中の１，３−ブタンジオールと４
−ヒドロキシ−２−ブタノンの定量をガスクロマトグラ
フィーで分析した。その結果、４．９g/Lの１，３−ブ
タンジオールと４．３g/Lの４−ヒドロキシ−２−ブタ
ノンが残存していた。
【０１１０】［実施例１６］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム由来のギ
酸脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSF-KLB2の
構築 マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を発現
するプラスミドpSFR426(特願2000-363894)をNco I、Eco
R Iの2つの制限酵素で二重消化し、マイコバクテリウム
由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製し
た。pSE-KLB2をNco I、EcoR Iの2つの制限酵素で二重消
化し、pSFR426から同酵素で切り出したマイコバクテリ
ウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片とT4 DN
Aリガーゼで連結し、ギ酸脱水素酵素と（Ｒ）−２，３
−ブタンジオール脱水素酵素を同時に発現可能なプラス
ミドpSF-KLB2を得た。
オール脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム由来のギ
酸脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSF-KLB2の
構築 マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を発現
するプラスミドpSFR426(特願2000-363894)をNco I、Eco
R Iの2つの制限酵素で二重消化し、マイコバクテリウム
由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製し
た。pSE-KLB2をNco I、EcoR Iの2つの制限酵素で二重消
化し、pSFR426から同酵素で切り出したマイコバクテリ
ウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片とT4 DN
Aリガーゼで連結し、ギ酸脱水素酵素と（Ｒ）−２，３
−ブタンジオール脱水素酵素を同時に発現可能なプラス
ミドpSF-KLB2を得た。
【０１１１】［実施例１７］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素とギ酸脱水素酵素の大腸菌による同時
発現 pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM
ＩＰＴＧを加え、さらに4時間培養を行った。菌体を遠
心分離により集菌した後、０．０２％ ２−メルカプト
エタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリセリンを含む
５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁し、密
閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用
いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕
液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収
し、２，３−ブタンジオンに対する還元活性とギ酸脱水
素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性の測定は、１０
０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２．５mM
ＮＡＤ＋、１００mM ギ酸および酵素を含む反応液中で
３０℃で行った。1Uは、上記反応条件において1分間に1
μmolのＮＡＤＨ生成を触媒する酵素量とした。その結
果、大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、２，３−ブ
タンジオン還元活性が０．６６５ U/mg-protein、ギ酸
脱水素酵素活性が０．３３９ U/mg-proteinであった。
オール脱水素酵素とギ酸脱水素酵素の大腸菌による同時
発現 pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM
ＩＰＴＧを加え、さらに4時間培養を行った。菌体を遠
心分離により集菌した後、０．０２％ ２−メルカプト
エタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリセリンを含む
５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁し、密
閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用
いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕
液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収
し、２，３−ブタンジオンに対する還元活性とギ酸脱水
素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性の測定は、１０
０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２．５mM
ＮＡＤ＋、１００mM ギ酸および酵素を含む反応液中で
３０℃で行った。1Uは、上記反応条件において1分間に1
μmolのＮＡＤＨ生成を触媒する酵素量とした。その結
果、大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、２，３−ブ
タンジオン還元活性が０．６６５ U/mg-protein、ギ酸
脱水素酵素活性が０．３３９ U/mg-proteinであった。
【０１１２】［実施例１８］pSF-KLB2大腸菌HB101によ
る（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造 pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、２５５ｍM ４−
ヒドロキシ−２−ブタノン、５１１ｍM ギ酸ナトリウム
を含む５００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）
１０mLに懸濁し、終夜３０℃で振とう反応を行った。反
応後、生成した１，３−ブタンジオールの光学純度と、
反応液中の１，３−ブタンジオールと4−ヒドロキシ−
２−ブタノンを実施例７と同様にして分析した。その結
果、生成した（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの光学純
度は９９％ｅｅ以上で、反応収率は６５％であった。
る（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造 pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、２５５ｍM ４−
ヒドロキシ−２−ブタノン、５１１ｍM ギ酸ナトリウム
を含む５００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）
１０mLに懸濁し、終夜３０℃で振とう反応を行った。反
応後、生成した１，３−ブタンジオールの光学純度と、
反応液中の１，３−ブタンジオールと4−ヒドロキシ−
２−ブタノンを実施例７と同様にして分析した。その結
果、生成した（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの光学純
度は９９％ｅｅ以上で、反応収率は６５％であった。
【０１１３】［実施例１９］２種類の菌体を用いたラセ
ミ体１，３−ブタンジオールの立体反転反応 キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱
水素酵素遺伝子を発現するプラスミドpKK-CPA1 (特開平
7-231785)で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mMのＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌し、菌体Aとした。次
に、pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピ
シリンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養
し、０．１mMのＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行
った。菌体を遠心分離により集菌し、菌体Bとした。
ミ体１，３−ブタンジオールの立体反転反応 キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱
水素酵素遺伝子を発現するプラスミドpKK-CPA1 (特開平
7-231785)で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mMのＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌し、菌体Aとした。次
に、pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピ
シリンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養
し、０．１mMのＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行
った。菌体を遠心分離により集菌し、菌体Bとした。
【０１１４】菌体Aに、４４３mM ラセミ体１，３−ブタ
ンジオール、２０g/L 酵母エキスを含む５００mMリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ ６．８）１０mLに懸濁し、終夜
３０℃で振とう反応を行った。反応後、反応液中の１，
３−ブタンジオールは２０３mMで９５％ｅｅのＲ体であ
り、４−ヒドロキシ−２−ブタノンは２５０mMであっ
た。この反応液から遠心分離により菌体を除去した後、
菌体Bと５００mMギ酸ナトリウムを加えて、さらに、終
夜３０℃で振とう反応を行った。反応後、反応液中の
１，３−ブタンジオールは３６３mMで９７．５％ｅｅの
Ｒ体、４−ヒドロキシ−２−ブタノンは２２．７mMとな
り、ラセミ体１，３−ブタンジオールから収率８２％で
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを回収する事ができ
た。
ンジオール、２０g/L 酵母エキスを含む５００mMリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ ６．８）１０mLに懸濁し、終夜
３０℃で振とう反応を行った。反応後、反応液中の１，
３−ブタンジオールは２０３mMで９５％ｅｅのＲ体であ
り、４−ヒドロキシ−２−ブタノンは２５０mMであっ
た。この反応液から遠心分離により菌体を除去した後、
菌体Bと５００mMギ酸ナトリウムを加えて、さらに、終
夜３０℃で振とう反応を行った。反応後、反応液中の
１，３−ブタンジオールは３６３mMで９７．５％ｅｅの
Ｒ体、４−ヒドロキシ−２−ブタノンは２２．７mMとな
り、ラセミ体１，３−ブタンジオールから収率８２％で
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを回収する事ができ
た。
【０１１５】
【発明の効果】光学活性アルコールなどの生産に有用
な、ＮＡＤ＋依存性の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール
脱水素酵素が提供された。本酵素を利用することによ
り、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから光学純度の高い
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの効率的な生産方法、
ラセミ体１，３−ブタンジオールから光学純度の高い
（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの生産方法、および
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールから４−ヒドロキシ−
２−ブタノンの効率的な生産方法が提供された。
な、ＮＡＤ＋依存性の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール
脱水素酵素が提供された。本酵素を利用することによ
り、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから光学純度の高い
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの効率的な生産方法、
ラセミ体１，３−ブタンジオールから光学純度の高い
（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの生産方法、および
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールから４−ヒドロキシ−
２−ブタノンの効率的な生産方法が提供された。
【０１１６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Daicel Chemical Industries, Co., Ltd. <120> Novel (R)-2,3-butanediol dehydrogenase, manufacturing the same, an d method for producing optically active alcohl using the same. <130> D1-A0105 <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1158 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <400> 1 atgcgtgcat tagcttattt cggaaaacaa gacatcagat acacaaagga tttggaggaa 60 cctgtcatcg aaacagatga tggaattgaa atcgaagtct catggtgtgg tatctgcggt 120 agtgatttac acgaatacct agatggtcct attttctttc cagaagatgg caaggtccac 180 gatgttagtg gtcttggatt gcctcaagct atgggtcatg agatgtccgg tatcgtatca 240 aaagttggac caaaagtaac caacatcaag gctggtgatc atgttgttgt agaagccacc 300 ggtacatgtc ttgatcatta cacttggcct aacgctgcac atgctaagga tgctgaatgt 360 gctgcttgtc aaagagggtt ctacaactgt tgtgcccatt tgggtttcat gggtctagga 420 gttcacagtg gtggttttgc tgaaaaagtc gttgttagtg aaaagcacgt tgttaagatt 480 ccaaacactt taccattgga cgttgcagcc ttagtcgaac caatctccgt ctcatggcat 540 gctgttagaa tctccaagtt acagaagggc caatccgcct tagttcttgg cgcaggtcca 600 attggattag ccaccatttt agctttgcaa ggtcatggtg cctccaagat tgtagtctct 660 gaaccagctg aaatcagaag aaatcaagct gccaagcttg gtgtcgaaac cttcgatcct 720 tctgaacata aagaagatgc cgttaatatt ttgaagaaat tggctccagg tggtgaaggt 780 ttcgattttg cctacgattg ttctggtgtt aaaccaactt ttgatacagg tgtccatgct 840 actaccttca gaggtatgta tgttaatatt gcaatctggg gccacaaacc catcgatttc 900 aaacctatgg acgtcactct gcaagagaaa ttcgtcaccg gttccatgtg ttacaccatt 960 aaagattttg aagatgtggt ccaagcctta ggcaatggca gcattgctat tgataaagct 1020 agacatttga ttacgggtag acaaaaaatc gaagatgggt tcactaaagg gttcgacgaa 1080 ttaatgaacc ataaagagaa aaacatcaag atattgttga ctcctaataa tcatggtgag 1140 ttggatgcca ccaactga 1158 <210> 2 <211> 385 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 2 Met Arg Ala Leu Ala Tyr Phe Gly Lys Gln Asp Ile Arg Tyr Thr Lys 1 5 10 15 Asp Leu Glu Glu Pro Val Ile Glu Thr Asp Asp Gly Ile Glu Ile Glu 20 25 30 Val Ser Trp Cys Gly Ile Cys Gly Ser Asp Leu His Glu Tyr Leu Asp 35 40 45 Gly Pro Ile Phe Phe Pro Glu Asp Gly Lys Val His Asp Val Ser Gly 50 55 60 Leu Gly Leu Pro Gln Ala Met Gly His Glu Met Ser Gly Ile Val Ser 65 70 75 80 Lys Val Gly Pro Lys Val Thr Asn Ile Lys Ala Gly Asp His Val Val 85 90 95 Val Glu Ala Thr Gly Thr Cys Leu Asp His Tyr Thr Trp Pro Asn Ala 100 105 110 Ala His Ala Lys Asp Ala Glu Cys Ala Ala Cys Gln Arg Gly Phe Tyr 115 120 125 Asn Cys Cys Ala His Leu Gly Phe Met Gly Leu Gly Val His Ser Gly 130 135 140 Gly Phe Ala Glu Lys Val Val Val Ser Glu Lys His Val Val Lys Ile 145 150 155 160 Pro Asn Thr Leu Pro Leu Asp Val Ala Ala Leu Val Glu Pro Ile Ser 165 170 175 Val Ser Trp His Ala Val Arg Ile Ser Lys Leu Gln Lys Gly Gln Ser 180 185 190 Ala Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro Ile Gly Leu Ala Thr Ile Leu Ala 195 200 205 Leu Gln Gly His Gly Ala Ser Lys Ile Val Val Ser Glu Pro Ala Glu 210 215 220 Ile Arg Arg Asn Gln Ala Ala Lys Leu Gly Val Glu Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Ser Glu His Lys Glu Asp Ala Val Asn Ile Leu Lys Lys Leu Ala Pro 245 250 255 Gly Gly Glu Gly Phe Asp Phe Ala Tyr Asp Cys Ser Gly Val Lys Pro 260 265 270 Thr Phe Asp Thr Gly Val His Ala Thr Thr Phe Arg Gly Met Tyr Val 275 280 285 Asn Ile Ala Ile Trp Gly His Lys Pro Ile Asp Phe Lys Pro Met Asp 290 295 300 Val Thr Leu Gln Glu Lys Phe Val Thr Gly Ser Met Cys Tyr Thr Ile 305 310 315 320 Lys Asp Phe Glu Asp Val Val Gln Ala Leu Gly Asn Gly Ser Ile Ala 325 330 335 Ile Asp Lys Ala Arg His Leu Ile Thr Gly Arg Gln Lys Ile Glu Asp 340 345 350 Gly Phe Thr Lys Gly Phe Asp Glu Leu Met Asn His Lys Glu Lys Asn 355 360 365 Ile Lys Ile Leu Leu Thr Pro Asn Asn His Gly Glu Leu Asp Ala Thr 370 375 380 Asn 385 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 3 Met Arg Ala Leu Ala Tyr Phe Gly Lys Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 4 Leu Ala Pro Gly Gly Glu Gly Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n indicates g, a, c or t. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n indicates g, a, c, or t. <400> 5 gtcggatccg chytngchta yttyggnaa 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 6 cagggatccr aartcraadc cytcdccdcc 30 <210> 7 <211> 745 <212> DNA <213> Kluyveromyces aestuarii <400> 7 aacaagacat cagatacaca aaggatttgg aggaacctgt catcgaaaca gatgatggaa 60 ttgaaatcga agtctcatgg tgtggtatct gcggtagtga tttacacgaa tacctagatg 120 gtcctatttt ctttccagaa gatggcaagg tccacgatgt tagtggtctt ggattgcctc 180 aagctatggg tcatgagatg tccggtatcg tatcaaaagt tggaccaaaa gtaaccaaca 240 tcaaggctgg tgatcatgtt gttgtagaag ccaccggtac atgtcttgat cattacactt 300 ggcctaacgc tgcacatgct aaggatgctg aatgtgctgc ttgtcaaaga gggttctaca 360 actgttgtgc ccatttgggt ttcatgggtc taggagttca cagtggtggt tttgctgaaa 420 aagtcgttgt tagtgaaaag cacgttgtta agattccaaa cactttacca ttggacgttg 480 cagccttagt cgaaccaatc tccgtctcat ggcatgctgt tagaatctcc aagttacaga 540 agggccaatc cgccttagtt cttggcgcag gtccaattgg attagccacc attttagctt 600 tgcaaggtca tggtgcctcc aagattgtag tctctgaacc agctgaaatc agaagaaatc 660 aagctgccaa gcttggtgtc gaaaccttcg atccttctga acataaagaa gatgccgtta 720 atattttgaa gaaattggct ccagg 745 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 8 cagggatcca ccgcagatac cacaccatg 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 9 gtcggatccg tgtcgaaacc ttcgatcct 29 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 10 cttgaattct accatgcgtg cattagctta tttcgg 36 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 11 cagcttaaga tctctagatt agttggtggc atccaactca ccatg 45
【図１】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるパターンを示す図
である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は実施例
１で得られた酵素を示す。
である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は実施例
１で得られた酵素を示す。
【図２】 実施例１で得られた酵素のＲ−１，３−ブタ
ンジオール酸化活性のｐＨ依存性を示す図である。
ンジオール酸化活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図３】 実施例１で得られた酵素の４−ヒドロキシ−
２−ブタノン還元活性のｐＨ依存性を示す図である。
２−ブタノン還元活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図４】 実施例１で得られた酵素のＲ−１，３−ブタ
ンジオール酸化活性の温度依存性を示す図である。
ンジオール酸化活性の温度依存性を示す図である。
【図５】 実施例１で得られた酵素の４−ヒドロキシ−
２−ブタノン還元活性の温度依存性を示す図である。
２−ブタノン還元活性の温度依存性を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月１日（２００２．７．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０２】［実施例１１］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解
析 クライベロマイセス・ラクティス由来染色体ＤＮＡを制
限酵素PstI、HaeII、BamHI、NdeIで消化し、T4リガーゼ
を用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応によ
り、各断片を環化させた。次に、プライマーKLB1-IP1
(配列番号：８)およびKLB1-IP2(配列番号：９)を各１０
０ｐｍｏｌ、環化ＤＮＡを２５ng、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝
液 (宝酒造製)、Ｅｘ−Ｔａｑ ２Ｕ (宝酒造製)を含む
５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、ア
ニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、７分）を３
０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエル
マー製)を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロ
ースゲル電気泳動により解析した結果、PstI、HaeII、B
amHI、NdeIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約１６０
０bp、４０００bp、２４００bp、および２１００bpのＤ
ＮＡ断片が検出できた。このDNA断片をSephaglas BandP
rep Kit(ファルマシア製)により精製し、塩基配列をKLB
1-IP1、KLB1-IP2を用いて解析した。その結果、（Ｒ）
−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のＯＲＦ配列を決
定することができた。決定したDNA配列は配列番号：１
に、予想されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。Ｏ
ＲＦ検索は、Genetyx-win（ソフトウェア開発株式会社
製）ソフトを用いて行った。
オール脱水素酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解
析 クライベロマイセス・ラクティス由来染色体ＤＮＡを制
限酵素PstI、HaeII、BamHI、NdeIで消化し、T4リガーゼ
を用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応によ
り、各断片を環化させた。次に、プライマーKLB1-IP1
(配列番号：８)およびKLB1-IP2(配列番号：９)を各１０
０ｐｍｏｌ、環化ＤＮＡを２５ng、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝
液 (宝酒造製)、Ｅｘ−Ｔａｑ ２Ｕ (宝酒造製)を含む
５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、ア
ニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、７分）を３
０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエル
マー製)を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロ
ースゲル電気泳動により解析した結果、PstI、HaeII、B
amHI、NdeIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約１６０
０bp、４０００bp、２４００bp、および２１００bpのＤ
ＮＡ断片が検出できた。このDNA断片をSephaglas BandP
rep Kit(ファルマシア製)により精製し、塩基配列をKLB
1-IP1、KLB1-IP2を用いて解析した。その結果、（Ｒ）
−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のＯＲＦ配列を決
定することができた。決定したDNA配列は配列番号：１
に、予想されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。Ｏ
ＲＦ検索は、Genetyx-win（ソフトウェア開発株式会社
製）ソフトを用いて行った。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０４】［実施例１２］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素遺伝子のクローニング （Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の構造遺伝
子配列を元にＯＲＦのみをクローニングするためのプラ
イマーKLBDH1-N（配列番号：１０）、KLBDH1-C（配列番
号：１１）を合成した。プライマーを各５０pmol、dNTP
１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由来染色体
ＤＮＡ５０ng、Pfu Turbo-DNA polymerase用緩衝液 (ST
RATAGENE製)、Pfu Turbo-DNA polymerase ２．５Ｕ (ST
RATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５
℃、２分３０秒）、アニール（５５℃、１分）、伸長
（７２℃、１分３０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR Sy
stem2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
オール脱水素酵素遺伝子のクローニング （Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の構造遺伝
子配列を元にＯＲＦのみをクローニングするためのプラ
イマーKLBDH1-N（配列番号：１０）、KLBDH1-C（配列番
号：１１）を合成した。プライマーを各５０pmol、dNTP
１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由来染色体
ＤＮＡ５０ng、Pfu Turbo-DNA polymerase用緩衝液 (ST
RATAGENE製)、Pfu Turbo-DNA polymerase ２．５Ｕ (ST
RATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５
℃、２分３０秒）、アニール（５５℃、１分）、伸長
（７２℃、１分３０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR Sy
stem2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０７】［実施例１３］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素の大腸菌による生産 （Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を発現する
プラスミドpSE-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株を
アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、０．０２％ ２
−メルカプトエタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリ
セリンを含む５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）
に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバ
イオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕し
た。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中
として回収した。また該遺伝子を含まないプラスミドpS
E420Dを持つ大腸菌をＬＢ培地で終夜培養し、０．１mM
ＩＰＴＧ添加後さらに４時間培養した菌体を、同様に破
砕して２，３−ブタンジオンに対する還元活性を測定し
た。結果を表４に示す。
オール脱水素酵素の大腸菌による生産 （Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を発現する
プラスミドpSE-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株を
アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、０．０２％ ２
−メルカプトエタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリ
セリンを含む５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）
に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバ
イオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕し
た。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中
として回収した。また該遺伝子を含まないプラスミドpS
E420Dを持つ大腸菌をＬＢ培地で終夜培養し、０．１mM
ＩＰＴＧ添加後さらに４時間培養した菌体を、同様に破
砕して２，３−ブタンジオンに対する還元活性を測定し
た。結果を表４に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０９】［実施例１４］pSE-KLB2で形質転換した大
腸菌HB101による（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの製
造 pSE-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、１．０％ ラセ
ミ体１，３−ブタンジオールを含む１００mMリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０mLに懸濁し、終夜３０℃
で振とう反応を行った。反応後、反応液中の１，３−ブ
タンジオールの光学純度を分析した。その結果、残存し
た１，３−ブタンジオールは、９９％ｅｅ以上のS体で
あった。また、反応液中の１，３−ブタンジオールと４
−ヒドロキシ−２−ブタノンの定量をガスクロマトグラ
フィーで分析した。その結果、４．９g/Lの１，３−ブ
タンジオールと４．３g/Lの４−ヒドロキシ−２−ブタ
ノンが残存していた。
腸菌HB101による（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの製
造 pSE-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、１．０％ ラセ
ミ体１，３−ブタンジオールを含む１００mMリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０mLに懸濁し、終夜３０℃
で振とう反応を行った。反応後、反応液中の１，３−ブ
タンジオールの光学純度を分析した。その結果、残存し
た１，３−ブタンジオールは、９９％ｅｅ以上のS体で
あった。また、反応液中の１，３−ブタンジオールと４
−ヒドロキシ−２−ブタノンの定量をガスクロマトグラ
フィーで分析した。その結果、４．９g/Lの１，３−ブ
タンジオールと４．３g/Lの４−ヒドロキシ−２−ブタ
ノンが残存していた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１０】［実施例１５］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム由来のギ
酸脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSF-KLB2の
構築 マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を発現
するプラスミドpSFR426(特願2000-363894)をNco I、Eco
R Iの2つの制限酵素で二重消化し、マイコバクテリウム
由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製し
た。pSE-KLB2をNco I、EcoR Iの2つの制限酵素で二重消
化し、pSFR426から同酵素で切り出したマイコバクテリ
ウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片とT4 DN
Aリガーゼで連結し、ギ酸脱水素酵素と（Ｒ）−２，３
−ブタンジオール脱水素酵素を同時に発現可能なプラス
ミドpSF-KLB2を得た。
オール脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム由来のギ
酸脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSF-KLB2の
構築 マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を発現
するプラスミドpSFR426(特願2000-363894)をNco I、Eco
R Iの2つの制限酵素で二重消化し、マイコバクテリウム
由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製し
た。pSE-KLB2をNco I、EcoR Iの2つの制限酵素で二重消
化し、pSFR426から同酵素で切り出したマイコバクテリ
ウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片とT4 DN
Aリガーゼで連結し、ギ酸脱水素酵素と（Ｒ）−２，３
−ブタンジオール脱水素酵素を同時に発現可能なプラス
ミドpSF-KLB2を得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１１】［実施例１６］（Ｒ）−２，３−ブタンジ
オール脱水素酵素とギ酸脱水素酵素の大腸菌による同時
発現 pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM
ＩＰＴＧを加え、さらに4時間培養を行った。菌体を遠
心分離により集菌した後、０．０２％ ２−メルカプト
エタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリセリンを含む
５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁し、密
閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用
いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕
液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収
し、２，３−ブタンジオンに対する還元活性とギ酸脱水
素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性の測定は、１０
０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２．５mM
ＮＡＤ＋、１００mM ギ酸および酵素を含む反応液中で
３０℃で行った。1Uは、上記反応条件において1分間に1
μmolのＮＡＤＨ生成を触媒する酵素量とした。その結
果、大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、２，３−ブ
タンジオン還元活性が０．６６５ U/mg-protein、ギ酸
脱水素酵素活性が０．３３９ U/mg-proteinであった。
オール脱水素酵素とギ酸脱水素酵素の大腸菌による同時
発現 pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM
ＩＰＴＧを加え、さらに4時間培養を行った。菌体を遠
心分離により集菌した後、０．０２％ ２−メルカプト
エタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリセリンを含む
５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁し、密
閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用
いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕
液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収
し、２，３−ブタンジオンに対する還元活性とギ酸脱水
素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性の測定は、１０
０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２．５mM
ＮＡＤ＋、１００mM ギ酸および酵素を含む反応液中で
３０℃で行った。1Uは、上記反応条件において1分間に1
μmolのＮＡＤＨ生成を触媒する酵素量とした。その結
果、大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、２，３−ブ
タンジオン還元活性が０．６６５ U/mg-protein、ギ酸
脱水素酵素活性が０．３３９ U/mg-proteinであった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１２】［実施例１７］pSF-KLB2大腸菌HB101によ
る（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造 pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、２５５ｍM ４−
ヒドロキシ−２−ブタノン、５１１ｍM ギ酸ナトリウム
を含む５００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）
１０mLに懸濁し、終夜３０℃で振とう反応を行った。反
応後、生成した１，３−ブタンジオールの光学純度と、
反応液中の１，３−ブタンジオールと4−ヒドロキシ−
２−ブタノンを実施例７と同様にして分析した。その結
果、生成した（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの光学純
度は９９％ｅｅ以上で、反応収率は６５％であった。
る（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造 pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌した後、２５５ｍM ４−
ヒドロキシ−２−ブタノン、５１１ｍM ギ酸ナトリウム
を含む５００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）
１０mLに懸濁し、終夜３０℃で振とう反応を行った。反
応後、生成した１，３−ブタンジオールの光学純度と、
反応液中の１，３−ブタンジオールと4−ヒドロキシ−
２−ブタノンを実施例７と同様にして分析した。その結
果、生成した（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの光学純
度は９９％ｅｅ以上で、反応収率は６５％であった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１３】［実施例１８］２種類の菌体を用いたラセ
ミ体１，３−ブタンジオールの立体反転反応 キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱
水素酵素遺伝子を発現するプラスミドpKK-CPA1 (特開平
7-231785)で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mMのＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌し、菌体Aとした。次
に、pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピ
シリンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養
し、０．１mMのＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行
った。菌体を遠心分離により集菌し、菌体Bとした。
ミ体１，３−ブタンジオールの立体反転反応 キャンディダ・パラプシロシス由来の２級アルコール脱
水素酵素遺伝子を発現するプラスミドpKK-CPA1 (特開平
7-231785)で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリ
ンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、
０．１mMのＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行っ
た。菌体を遠心分離により集菌し、菌体Aとした。次
に、pSF-KLB2で形質転換された大腸菌HB101株をアンピ
シリンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養
し、０．１mMのＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行
った。菌体を遠心分離により集菌し、菌体Bとした。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Daicel Chemical Industries, Co., Ltd. <120> Novel (R)-2,3-butanediol dehydrogenase, manufacturing the same, an d method for producing optically active alcohl using the same. <130> D1-A0105 <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1158 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <400> 1 atgcgtgcat tagcttattt cggaaaacaa gacatcagat acacaaagga tttggaggaa 60 cctgtcatcg aaacagatga tggaattgaa atcgaagtct catggtgtgg tatctgcggt 120 agtgatttac acgaatacct agatggtcct attttctttc cagaagatgg caaggtccac 180 gatgttagtg gtcttggatt gcctcaagct atgggtcatg agatgtccgg tatcgtatca 240 aaagttggac caaaagtaac caacatcaag gctggtgatc atgttgttgt agaagccacc 300 ggtacatgtc ttgatcatta cacttggcct aacgctgcac atgctaagga tgctgaatgt 360 gctgcttgtc aaagagggtt ctacaactgt tgtgcccatt tgggtttcat gggtctagga 420 gttcacagtg gtggttttgc tgaaaaagtc gttgttagtg aaaagcacgt tgttaagatt 480 ccaaacactt taccattgga cgttgcagcc ttagtcgaac caatctccgt ctcatggcat 540 gctgttagaa tctccaagtt acagaagggc caatccgcct tagttcttgg cgcaggtcca 600 attggattag ccaccatttt agctttgcaa ggtcatggtg cctccaagat tgtagtctct 660 gaaccagctg aaatcagaag aaatcaagct gccaagcttg gtgtcgaaac cttcgatcct 720 tctgaacata aagaagatgc cgttaatatt ttgaagaaat tggctccagg tggtgaaggt 780 ttcgattttg cctacgattg ttctggtgtt aaaccaactt ttgatacagg tgtccatgct 840 actaccttca gaggtatgta tgttaatatt gcaatctggg gccacaaacc catcgatttc 900 aaacctatgg acgtcactct gcaagagaaa ttcgtcaccg gttccatgtg ttacaccatt 960 aaagattttg aagatgtggt ccaagcctta ggcaatggca gcattgctat tgataaagct 1020 agacatttga ttacgggtag acaaaaaatc gaagatgggt tcactaaagg gttcgacgaa 1080 ttaatgaacc ataaagagaa aaacatcaag atattgttga ctcctaataa tcatggtgag 1140 ttggatgcca ccaactga 1158 <210> 2 <211> 385 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 2 Met Arg Ala Leu Ala Tyr Phe Gly Lys Gln Asp Ile Arg Tyr Thr Lys 1 5 10 15 Asp Leu Glu Glu Pro Val Ile Glu Thr Asp Asp Gly Ile Glu Ile Glu 20 25 30 Val Ser Trp Cys Gly Ile Cys Gly Ser Asp Leu His Glu Tyr Leu Asp 35 40 45 Gly Pro Ile Phe Phe Pro Glu Asp Gly Lys Val His Asp Val Ser Gly 50 55 60 Leu Gly Leu Pro Gln Ala Met Gly His Glu Met Ser Gly Ile Val Ser 65 70 75 80 Lys Val Gly Pro Lys Val Thr Asn Ile Lys Ala Gly Asp His Val Val 85 90 95 Val Glu Ala Thr Gly Thr Cys Leu Asp His Tyr Thr Trp Pro Asn Ala 100 105 110 Ala His Ala Lys Asp Ala Glu Cys Ala Ala Cys Gln Arg Gly Phe Tyr 115 120 125 Asn Cys Cys Ala His Leu Gly Phe Met Gly Leu Gly Val His Ser Gly 130 135 140 Gly Phe Ala Glu Lys Val Val Val Ser Glu Lys His Val Val Lys Ile 145 150 155 160 Pro Asn Thr Leu Pro Leu Asp Val Ala Ala Leu Val Glu Pro Ile Ser 165 170 175 Val Ser Trp His Ala Val Arg Ile Ser Lys Leu Gln Lys Gly Gln Ser 180 185 190 Ala Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro Ile Gly Leu Ala Thr Ile Leu Ala 195 200 205 Leu Gln Gly His Gly Ala Ser Lys Ile Val Val Ser Glu Pro Ala Glu 210 215 220 Ile Arg Arg Asn Gln Ala Ala Lys Leu Gly Val Glu Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Ser Glu His Lys Glu Asp Ala Val Asn Ile Leu Lys Lys Leu Ala Pro 245 250 255 Gly Gly Glu Gly Phe Asp Phe Ala Tyr Asp Cys Ser Gly Val Lys Pro 260 265 270 Thr Phe Asp Thr Gly Val His Ala Thr Thr Phe Arg Gly Met Tyr Val 275 280 285 Asn Ile Ala Ile Trp Gly His Lys Pro Ile Asp Phe Lys Pro Met Asp 290 295 300 Val Thr Leu Gln Glu Lys Phe Val Thr Gly Ser Met Cys Tyr Thr Ile 305 310 315 320 Lys Asp Phe Glu Asp Val Val Gln Ala Leu Gly Asn Gly Ser Ile Ala 325 330 335 Ile Asp Lys Ala Arg His Leu Ile Thr Gly Arg Gln Lys Ile Glu Asp 340 345 350 Gly Phe Thr Lys Gly Phe Asp Glu Leu Met Asn His Lys Glu Lys Asn 355 360 365 Ile Lys Ile Leu Leu Thr Pro Asn Asn His Gly Glu Leu Asp Ala Thr 370 375 380 Asn 385 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 3 Met Arg Ala Leu Ala Tyr Phe Gly Lys Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 4 Leu Ala Pro Gly Gly Glu Gly Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n indicates g, a, c or t. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n indicates g, a, c, or t. <400> 5 gtcggatccg chytngchta yttyggnaa 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 6 cagggatccr aartcraadc cytcdccdcc 30 <210> 7 <211> 745 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <400> 7 aacaagacat cagatacaca aaggatttgg aggaacctgt catcgaaaca gatgatggaa 60 ttgaaatcga agtctcatgg tgtggtatct gcggtagtga tttacacgaa tacctagatg 120 gtcctatttt ctttccagaa gatggcaagg tccacgatgt tagtggtctt ggattgcctc 180 aagctatggg tcatgagatg tccggtatcg tatcaaaagt tggaccaaaa gtaaccaaca 240 tcaaggctgg tgatcatgtt gttgtagaag ccaccggtac atgtcttgat cattacactt 300 ggcctaacgc tgcacatgct aaggatgctg aatgtgctgc ttgtcaaaga gggttctaca 360 actgttgtgc ccatttgggt ttcatgggtc taggagttca cagtggtggt tttgctgaaa 420 aagtcgttgt tagtgaaaag cacgttgtta agattccaaa cactttacca ttggacgttg 480 cagccttagt cgaaccaatc tccgtctcat ggcatgctgt tagaatctcc aagttacaga 540 agggccaatc cgccttagtt cttggcgcag gtccaattgg attagccacc attttagctt 600 tgcaaggtca tggtgcctcc aagattgtag tctctgaacc agctgaaatc agaagaaatc 660 aagctgccaa gcttggtgtc gaaaccttcg atccttctga acataaagaa gatgccgtta 720 atattttgaa gaaattggct ccagg 745 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 8 cagggatcca ccgcagatac cacaccatg 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 9 gtcggatccg tgtcgaaacc ttcgatcct 29 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 10 cttgaattct accatgcgtg cattagctta tttcgg 36 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 11 cagcttaaga tctctagatt agttggtggc atccaactca ccatg 45
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:645 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 1:72 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 木本 訓弘 茨城県つくば市千現１−14−14−401 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA08 BA80 CA04 DA06 DA12 EA04 GA11 4B050 CC03 DD04 FF05E FF09E LL05 4B064 AC05 AC32 CA21 CB13 CB18 CC03 CC24 CD15 CD27 DA01 DA16 4B065 AA26X AA72X AA72Y AA73X AB01 BA02 CA05 CA08 CA28 CA44
Claims (23)
- 【請求項１】 次の（１）から（３）に示す理化学的性
質を有する（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵
素。 （１）作用 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ
＋と略す）を補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−
ブタンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成す
る。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下、ＮＡＤＨと略す）を補酵素として、２，３−ブタン
ジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオ
ールを生成する。 （２）基質特異性 （ａ）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を利用する。還
元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。 （ｂ）４−ヒドロキシ−２−ブタノンを還元して、
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する。 （ｃ）ラセミ体１，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の
水酸基を優先的に酸化し、（Ｓ）−１，３−ブタンジオ
ールを残存させる。 （３）至適ｐＨ 酸化反応、還元反応ともにｐＨ ６．０。 - 【請求項２】 更に付加的に、次の（４）、（５）に示
す理化学的性質を有する請求項１に記載の（Ｒ）−２，
３−ブタンジオール脱水素酵素。 （４）至適温度 酸化反応、還元反応ともに３７℃。 （５）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により４５，０００。ゲルろ過による分子量が９
１，０００。 - 【請求項３】 クライベロマイセス属に属する微生物に
よって産生される請求項１に記載の（Ｒ）−２，３−ブ
タンジオール脱水素酵素。 - 【請求項４】 クライベロマイセス属に属する微生物
が、クライベロマイセス・ラクティスである請求項３に
記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。 - 【請求項５】 下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載
のポリヌクレオチド。 （ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌ
クレオチド。 （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
質をコードするポリヌクレオチド。 （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／
または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に
記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋
白質をコードするポリヌクレオチド。 （ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸
配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードす
るポリヌクレオチド。 （ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０%以上
の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチド。 - 【請求項６】 請求項５に記載のポリヌクレオチドによ
ってコードされる蛋白質。 - 【請求項７】 請求項５に記載されたポリヌクレオチド
を含むベクター。 - 【請求項８】 請求項５に記載されたポリヌクレオチ
ド、または請求項７に記載のベクターを保持する形質転
換体。 - 【請求項９】 請求項８に記載の形質転換体を培養し、
発現産物を回収する工程を含む、請求項６に記載の蛋白
質の製造方法。 - 【請求項１０】 クライベロマイセス属に属し、請求項
１に記載の酵素、または請求項６に記載の蛋白質を産生
する微生物を培養する工程を含む、請求項１に記載の酵
素、または請求項６に記載の蛋白質の製造方法。 - 【請求項１１】 クライベロマイセス属に属する微生物
が、クライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromayces
lactis）である請求項１０に記載の製造方法。 - 【請求項１２】 ＮＡＤＨの存在下で、請求項１に記載
の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、請求項
６に記載の蛋白質、それらを産生する微生物、およびそ
れらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素
活性物質を、ケトンに作用させ、ケトンの還元によって
生成する光学活性アルコールを取得する工程を含む、光
学活性アルコールの製造方法。 - 【請求項１３】 微生物が、請求項８に記載の形質転換
体である請求項１２に記載の光学活性アルコールの製造
方法。 - 【請求項１４】 ケトンが、４−ヒドロキシ−２−ブタ
ノンであり、光学活性アルコールが（Ｒ）−１，３−ブ
タンジオールである請求項１２に記載の光学活性アルコ
ールの製造方法。 - 【請求項１５】 請求項１に記載の（Ｒ）−２，３−ブ
タンジオール脱水素酵素、請求項６に記載の蛋白質、そ
れらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる
群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、ＮＡＤ＋
の存在下でラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体
の一方を酸化し、残存する光学活性アルコールを取得す
る工程を含む、光学活性アルコールの製造方法。 - 【請求項１６】 微生物が、請求項８に記載の形質転換
体である請求項１５に記載の光学活性アルコールの製造
方法。 - 【請求項１７】 ラセミ体アルコールが、ラセミ体１，
３−ブタンジオールであり、光学活性アルコールが
（Ｓ）−１，３−ブタンジオールである請求項１５に記
載の光学活性アルコールの製造方法。 - 【請求項１８】 ＮＡＤ＋の存在下で、請求項１に記載
の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、請求項
６に記載の蛋白質、それらを産生する微生物、およびそ
れらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素
活性物質をアルコールに作用させ、アルコールの酸化に
よって生成するケトンを取得する工程を含む、ケトンの
製造方法。 - 【請求項１９】 微生物が、請求項８に記載の形質転換
体である請求項１８に記載のケトンの製造方法。 - 【請求項２０】 アルコールが（Ｒ）−１，３−ブタン
ジオールであり、ケトンが４−ヒドロキシ−２−ブタノ
ンである請求項１８に記載のケトンの製造方法。 - 【請求項２１】 次の工程を含む、（Ｒ）−１，３−ブ
タンジオールの製造方法。(1)（Ｓ）−１，３−ブタン
ジオールを優先的に酸化し、４−ヒドロキシ−２−ブタ
ノンを生成する酵素、それを産生する微生物、およびそ
れらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素
活性物質を、ラセミ体１，３−ブタンジオールに作用さ
せ、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールと４−ヒドロキシ
−２−ブタノンを合成する工程、(2)４−ヒドロキシ−
２−ブタノンを還元して（Ｒ）−１，３−ブタンジオー
ルを生成する酵素、それを産生する微生物、およびそれ
らの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活
性物質を、工程(1)により生成した４−ヒドロキシ−２
−ブタノンに作用させ、４−ヒドロキシ−２−ブタノン
を還元して（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生成する
工程、および(3)工程(2)で生成する（Ｒ）−１，３−ブ
タンジオールを取得する工程 - 【請求項２２】 前記工程(2)に記載の酵素活性物質
が、請求項１に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール
脱水素酵素、請求項６に記載の蛋白質、それらを産生す
る微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択さ
れるいずれかの酵素活性物質である、請求項２１に記載
の（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造方法。 - 【請求項２３】 前記工程(1)における酵素活性物質
が、キャンディダ・パラプシロシス由来の (S) 体特異
的２級アルコール脱水素酵素を生産する微生物、および
それらの処理物であることを特徴とする、請求項２１に
記載の（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造方法。
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