JP4587348B2 - 新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性の新規な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素に関する。また本発明は、該酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたアルコール、特に（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、微生物によるグルコースを原料とした（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの発酵生産において、また、微生物における２，３−ブタンジオール代謝において重要な役割を有する酵素である。またこの酵素反応によって生成する（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールは、液晶、医薬品などの合成原料として有用な化合物である。
【０００３】
なお、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素とは、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化する活性を有する脱水素酵素であり、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールとともにメソ−２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基も酸化する活性を有する。
【０００４】
従来、２，３−ブタンジオール脱水素活性を有する酵素に関しては、２，３−ブタンジオールの生合成、代謝に関する研究によって、たとえば以下のような微生物において（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに対する脱水素酵素活性が報告されている(Arch. Microbiol. 116, 197-203 ,1978、J. Ferment. Technol. 61, 467-471 ,1983、J. Ferment. Technol. 62, 551-559 ,1984)。しかし、いずれも無細胞抽出液を用いた活性測定のみであり、様々な酵素が混在しているために、２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択性、比活性などの諸性質は明らかにされていない。
アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）
バチルス・セレウス（Bacillus cereus IAM 1072）、
バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans ATCC 8038）、
ミクロコッカス・リソデイクティカス（Micrococcus lysodeikticus IAM 1056）、
ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus IAM 1097）、
ミクロコッカス・ローゼウス（Micrococcus roseus IAM 1295）、
シュードモナス・サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila IAM 1504）、
サルシナ・ルテア（Sarcina lutea IAM 1099）、
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）
【０００５】
高度に精製され、諸性質が明らかにされた酵素としては、以下に示すような酵素で２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有することが示されている。しかし、ＤＬ体に対する活性のみでその立体選択性は報告されていない。また、ピキア・オフナエンシスを除き、２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性は、グリセロール脱水素酵素活性と同レベルかそれ以下の活性しか有せず、その比活性は一般に低い。
アクロモバクター・リキダム（Achromobacter liquidum KY 3047）由来のグリセロール脱水素酵素（特公昭 58-40467）、
バチルス・エスピー（Bacillus sp. G-1）由来のグリセロール脱水素酵素（特公平 03-72272）、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のグリセロール脱水素酵素（Biochim. Biophys. Acta 994, 270-279 (1989)）、
シトロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii DSM 30040）由来のグリセロール脱水素酵素（J. Bacteriol. 177, 4392-4401 (1995)）、
エルビニア・アロイデア（Erwinia aroideae IFO 3830）由来のグリセロール脱水素酵素（Chem. Pharm. Bull. 26, 716-721 (1978)）、
ジオトリカム・キャンディダム（Geotrichum candidum IFO 4597）由来のグリセロール脱水素酵素（特公平 01-27715）、
ピキア・オフナエンシス（Pichia ofunaensis AKU 4328）由来のジヒドロキシアセトン還元酵素（J. Biosci. Bioeng. 88, 148-152 (1999)）、
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のグリセロール脱水素酵素（J. Gen. Microbiol. 131, 1581-1588 (1985)）、
【０００６】
高度に精製され、かつ、２，３−ブタンジオールの（２Ｒ，３Ｒ）体に対する高い選択性が明らかにされている酵素としては、イシャリヒア・コリ（Escherichia coli W-1485）の生産するグリセロール脱水素酵素（J. Biol. Chem. 259, 2124-2129 (1984)）が公知である。この酵素は、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに対するVmaxが２８．０U/mg−蛋白質であり、ラセミ体に対するVmaxが２１．２U/mg−蛋白質であることから（２Ｒ，３Ｒ）体に対する立体選択性が示唆される。ここで、酵素１Ｕは、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを基質として１分間に１μmolの酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と省略する）を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと省略する）へ還元する酵素活性である。
また、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素（Arch. Microbiol. 154, 267-273 (1990)）は、２，３−ブタンジオンから（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生産することが報告されているが、ＤＬ−２，３−ブタンジオールに対する脱水素酵素活性は２０．３U/mg−蛋白質程度であり、いずれも比活性は低い。
【０００７】
更に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）より２，３−ブタンジオール代謝に関与する２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードする遺伝子がクローニングされ、大腸菌で発現されている（FEMS Microbiol. Lett. 124 (2), 141-150 (1994)）が、その立体選択性は報告されていない。また、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）のゲノム解析の結果、シュードモナス・プチダ由来の２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子に高いホモロジーを有する遺伝子が同定されているが、実際に、この遺伝子を発現させ、その酵素活性、立体選択性などは確認されていない。
【０００８】
（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールなどの光学活性アルコールの生産に有用な、立体選択性が高く、比活性の高い（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の探索、特に、該酵素を容易に大量生産を可能にするため、該酵素をコードする遺伝子の単離、該酵素を発現可能な形質転換体の調製は、産業上重要な課題となっている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＡＤ＋を補酵素として利用しうる（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の提供を課題とする。また本発明は、２，３−ブタンジオンを基質とする光学活性（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの酵素的な製造工程に利用した場合に、光学的純度の高い生成物を収率良く与えることができる（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を提供することも課題としている。
【００１０】
更に本発明は、目的とする性状を備えた（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換え体として得ることを課題とする。加えて、新規な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素による光学活性（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの酵素的な製造方法の提供をも課題とするものである。
【００１１】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは、ピキア・アンガスタ（旧名称：ハンゼヌラ・ポリモルファ）におけるグリセロール代謝に関与する酵素群に関する研究を進めてきた（Agri. Biol. Chem. 51, 2401-2407 (1987) ）。本菌株においては、グリセロール代謝経路としてリン酸化経路と酸化経路の２種類が存在し、ｐＨ６．０でＮＡＤＨとジヒドロキシアセトンを基質とした還元反応を触媒するグリセロール脱水素酵素Ｉ（ＧＤＨ−Ｉ）とｐＨ９．０でＮＡＤ＋とグリセロールを基質として酸化反応を触媒するグリセロール脱水素酵素ＩＩ（ＧＤＨ−ＩＩ）を併せ持つことが明らかになっている。
【００１２】
これら２種類の酵素のうち、ＧＤＨ−Ｉを電気泳動的に単一のバンドまで精製し、その諸性質を明らかにした結果、ＧＤＨ−Ｉが２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基に対して高い活性と高い選択性を併せ持つ、新規な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素であることが明らかとなった。
【００１３】
更に、本酵素をコードするＤＮＡを単離し、本酵素を高発現する組換え菌を造成し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、この酵素をコードするＤＮＡ、この酵素の製造方法、および用途に関する。
〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性質を有する（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（１）作用
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成する。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性
酸化反応の補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。還元反応の補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。また、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
（３）比活性
精製酵素の蛋白質１mg当たり１００Ｕ以上の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有する。
〔２〕更に付加的に、次の（４）、（５）に示す理化学的性質を有する〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（４）至適ｐＨ
グリセロール酸化反応の至適ｐＨが１０。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるサブユニットの分子量が３６，０００、ゲル濾過による分子量が７６，０００。
〔３〕ピキア属に属する微生物によって産生される〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
〔４〕ピキア属に属する微生物が、ピキア・アンガスタである〔３〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
〔５〕下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔６〕配列番号：１に記載の塩基配列と７０%以上の相同性を有する塩基配列を含む、〔５〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする、〔５〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８〕〔５〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔９〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する〔８〕に記載のタンパク質。
〔１０〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１１〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチド、または〔１０〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔１２〕〔１１〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔９〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔１３〕ピキア属に属し、〔１〕に記載の酵素、または〔８〕に記載のタンパク質を産生する微生物を培養する工程を含む、〔１〕に記載の酵素、または〔８〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔１４〕ピキア属に属する微生物が、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）である〔１３〕に記載の製造方法。
〔１５〕〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔８〕に記載のタンパク質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でケトンに作用させ、生成するアルコールを回収する工程を含むアルコールの製造方法。
〔１６〕微生物が、〔１１〕に記載の形質転換体である〔１５〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１７〕ケトンが、２，３−ブタンジオンであり、アルコールが（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールである〔１５〕に記載のアルコールの製造方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ＋を利用しうること、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を優先的に酸化すること、また、ＮＡＤＨを補酵素として２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生成することによって特徴付けられる。
【００１５】
本発明において、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性は、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオール及びグリセロールに対する酸化活性で表され、次のようにして確認することができる。
【００１６】
（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに対する酸化活性測定法:
１００mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５mM ＮＡＤＨ、５０mM（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオール及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０nmの吸光度の増加を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの増加を触媒する酵素量とする。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００１７】
グリセロールに対する酸化活性測定法:
１００mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５mM ＮＡＤＨ、１００mMグリセロール及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０ nmの吸光度の増加を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの増加を触媒する酵素量とする。
【００１８】
上記のような理化学的性状を持つ（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、たとえばピキア属酵母の培養物より精製することができる。ピキア属酵母としては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）が特に本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の産生能に優れる。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を得るために利用することができるピキア・アンガスタは、たとえば、ATCC 26012としてAmerian Type Culture Collection より入手することができる。
【００１９】
上記微生物は、ＹＰＤ（１％酵母エキス、１％ペプトン、２％グルコースを含むｐＨ６．０の培地）培地等の真菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を生産するには、ＹＰＤ培地のグルコースをメタノールもしくはグリセロールに変えた培地や、メタノール１ｇ、塩化アンモニウム０．５ｇ、リン酸２水素１カリ０．１ｇ、リン酸１水素２カリ０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０５ｇ、塩化鉄 (III) ６水和物３．０mg、塩化カルシウム２水和物１．０mg、塩化マンガン４水和物１．０mg、硫酸亜鉛７水和物１．０mg、チアミン塩酸塩２００mg、ビオチン２mg（培養液１００mLあたり）を含むｐＨ７．０の培地（以下、培地Ａと略す）でも培養可能であり、培地Ａにおけるメタノールの代わりにグリセロールを利用することもできる。
【００２０】
これらの培地を用いて培養した後、対数増殖期の菌体を回収することで、高い酵素活性を有する菌体とすることができる。また、培養においては、通気条件を少し抑制した条件において、酵素含量の高い菌体を調製することができる。
【００２１】
得られた菌体を、2-メルカプトエタノール(2-mercaptoethanol)等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド(phenylmethansulfonyl fluoride;PMFS)やエチレンジアミン４酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す）、ペプスタチン、ロイペプチン、ホスホラミドンのようなプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中でガラスビーズとの物理的な衝撃やミニラボ、フレンチプレスなどの高圧を利用するなどして破砕し、無細胞抽出液を得る。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画（アセトンやジメチルスルホキシドなどの有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより本発明の酵素を精製する事ができる。例えば、無細胞抽出液をブルー−セファロース、フェニル−セファロース、Resource Q（いずれもファルマシア製）などのカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
【００２２】
ピキア・アンガスタに由来する本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は以下の（１）−（３）の理化学的性質を有する蛋白質である。
（１）ＮＡＤ＋を補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成する。ＮＡＤＨを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を、また還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。また、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
（３）精製酵素の蛋白質１mg当たり１００Ｕ以上の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有する。
【００２３】
本発明の酵素は、更に付加的に、以下の（４）−（５）の理化学的性質を有するタンパク質である。
（４）至適ｐＨ
グリセロール酸化反応の至適ｐＨが１０。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（以下SDS-PAGEと省略する）によるサブユニットの分子量が３６，０００、ゲル濾過による分子量が７６，０００。
【００２４】
更に本発明の酵素は、以下の性状（６）−（９）によって特徴付けることができる。
（６）安定ｐＨ範囲
ｐＨ６−９．５の範囲で比較的安定である。
（７）作用適温の範囲
至適温度は３０℃である。
（８）温度安定性
３０℃まで比較的安定である。
（９）阻害
SH試薬であるパラクロロ水銀安息香酸（PCMB：p-chloromercuribenzoic acid）、o-フェナンスロリン (o-phenanthrolin) , ２，２’−ビピリジル（2,2'-bipyridyl）、塩化銅、塩化水銀、塩化鉄 (III) により阻害されるが、ＥＤＴＡでは阻害されない。
【００２５】
ピキア・アンガスタに由来する（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵素として酸化反応におけるＮＡＤＰ＋、あるいは還元反応におけるＮＡＤＰＨを実質的に利用することができない。しかし、ＮＡＤＰ＋やＮＡＤＰの利用性に関わらず、前記物理学化学的性状（１）−（３）、望ましくは（１）−（６）、あるいは更に望ましくは（１）−（９）を備えた酵素は、本発明に含まれる。
【００２６】
本発明は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、DNAやRNA等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であることもできる。また本発明のポリヌクレオチドは、DNA-RNAのキメラ分子であることもできる。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の好ましい態様を構成する。
【００２７】
本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）−（３）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：１記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
【００２８】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）−（３）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer)において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００２９】
さらに、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT, PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST, FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００３０】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてSWISS-PLOTを対象にBLASTプログラムを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、サッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）のYAG0であった。YAG0は、ゲノム解析の結果から推測された、仮想アルコール脱水素酵素様蛋白質（HYPOTHETICAL ZINC-TYPE ALCOHOL DEHYDROGENASE-LIKE PROTEIN）で、その蛋白質としての存在、機能、理化学的性質などは全く不明である。このYAG0に対するホモロジーはIdentityで４６％、Positiveで６２％であった。本発明の７０％以上のホモロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いたPositiveの相同性の値を表す。
【００３１】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。
本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）−（３）に示した物理化学的性状を有することを意味する。当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。その（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログを得ることが可能である。
【００３２】
さらに、本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT, PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００３３】
本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
【００３４】
配列番号：１に記載の塩基配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００３５】
さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３６】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００３７】
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
このようにして単離された、本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素発現ベクターが提供される。
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を組み換え体から得ることができる。
【００３８】
本発明においてＮＡＤ＋を電子受容体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、ＮＡＤ＋を電子受容体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、ＮＡＤ＋を電子受容体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
【００３９】
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００４０】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories)。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＨを電子供与体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００４１】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００４２】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００４３】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００４４】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００４５】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００４６】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００４７】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００４８】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００４９】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
【００５０】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５１】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５２】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５３】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００５４】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００５５】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００５６】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００５７】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００５８】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００５９】
本発明において使用する（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有する微生物は、ＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有するピキア属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
【００６０】
本発明は、前記（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のケトンの還元によるアルコール、特に（Ｒ）−２，３−ブタンジオールの製造用途に関する。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤＨを酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００６１】
本発明によるアルコールの製造方法におけるケトンとしては、隣接するジケトンを有する２，３−ブタンジオンや２，３−ペンタンジオンが好適に用いられる。
【００６２】
本発明は、前記（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素によるアルコールの酸化反応によるケトンの製造用途に関する。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤ＋を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００６３】
本発明によるケトンの製造方法におけるアルコールとしては、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオール、メソ−２，３−ブタンジオールが挙げられ、それぞれ、（Ｒ）−アセトイン、（Ｓ）−アセトインを合成することができる。
【００６４】
上記還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ＋の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるアルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００６５】
また、本発明のＤＮＡを含む組み換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記アルコールの製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のＮＡＤＨ依存性（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＨ再生酵素とＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、一方、もしくは、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００６６】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００６７】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００６８】
本発明の反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１５−３０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ６−９．５、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは０．１−３０%で行うことができる。反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨが０．００１mM−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加できる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００６９】
ＮＡＤＨの再生のために、たとえば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどが反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケトンに対してモル比で０．１−２０、好ましくは１−５倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などの、ＮＡＤＨ再生用の酵素は、本発明のＮＡＤＨ依存性カルボニル脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができる。
【００７０】
本発明のケトンの還元により生成するアルコールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせることにより行うことができる。
たとえば、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体をのぞいた後、限外濾過によりタンパク質を除去し、その濾液に酢酸エチルなどの溶媒を添加して（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを溶媒層に抽出する。これを相分離後、蒸留することにより純度の高い（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を精製することができる。
【００７１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の精製
ピキア・アンガスタ ATCC 26012株を７ＬのグリセロールをＣ源とした培地Ａ中で、２８℃、４０時間培養し、遠心分離により湿菌体を調製した。得られた湿菌体約１００gを５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１mM ２−メルカプトエタノール−１３０mLに澱懸し、ビードビーター（Biospec社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液を緩衝液Ａ（５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び１mM ２−メルカプトエタノール）で平衡化したブルーセファロース６Ｂ（２．２ｃｍ ｘ ２０ｃｍ）に添加し、緩衝液Ａで洗浄した後、０から１M 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出した。溶出したグリセロール脱水素酵素活性を示す画分を回収した。
【００７２】
濃縮した酵素液を緩衝液Ａに対して透析した後、４０％硫安飽和緩衝液Ａで平衡化したフェニル−セファロース（１．０ cm × １０ cm）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、４０％から０％硫安飽和の勾配溶出を行った。溶出したグリセロール脱水素酵素活性画分を回収し、限外濾過により濃縮した。
濃縮酵素液を２０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び１mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液で平衡化したリソースＱカラム（Resource Q HR 5/5）に添加し、同緩衝液で洗浄した後、０から１ M 塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。活性画分を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果、ほぼ単一バンドであった（図１）。
精製酵素の比活性は約２１８U/mg（グリセロール脱水素酵素活性；（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性で１３５０U/mg相当）であった。
精製の要約を表１に示す。
【００７３】
【表１】
【００７４】
［実施例２］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の分子量測定
実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた結果、３．６万であった。また、スーパーデックスＧ２００のゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、約７．６万であった。
【００７５】
［実施例３］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の至適pH
McIIvaine緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いてpHを変化させて、実施例１で得られた酵素のグリセロール脱水素酵素活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図２に示した。反応の至適ｐＨは１０であった。
【００７６】
［実施例４］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の作用至適温度
実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させてグリセロール脱水素酵素活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示した。至適温度は３０℃であった。
【００７７】
［実施例５］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のｐＨ安定性
実施例１で得られた酵素を、McIIvaine緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ２−１２中で、３０℃、１０分間インキュベートし、残存活性を測定した。結果は、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図４に示した。本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、ｐＨ６−９．５において比較的安定であった。
【００７８】
［実施例６］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の温度安定性
実施例１で得られた酵素をｐＨ７．５で１０分間放置した後、グリセロール脱水素酵素活性を測定した。結果は、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図５に示した。本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、３０℃まで比較的安定であった。
【００７９】
［実施例７］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の基質特異性
実施例１で得られた酵素を種々試薬５００mMと反応させ、その脱水素活性を測定した。結果は、ＮＡＤ＋を補酵素としたグリセロール脱水素活性を１００とした相対活性で表し、表２に示した。
【００８０】
【表２】
【００８１】
［実施例８］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択性
実施例１で得られた酵素を１，２−プロパンジオール、２，３−ブタンジオールの両異性体５００mMに対して反応させ、グリセロールに対する活性を１００とした相対活性で表し、表３に示した。
【００８２】
【表３】
【００８３】
［実施例９］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の試薬に対する挙動
種々の試薬中で30℃、10分間処理した後、グリセロール脱水素酵素活性を測定し、試薬を含まない条件で30℃、10分間処理した後の残存活性を１００とした残存活性で表し、表４に示した。本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、パラクロロ水銀安息香酸 (PCMB)、o-フェナンスロリン、２，２’−ジピリジル、塩化銅、塩化水銀、塩化鉄 (III) によって顕著に阻害され、エチレンジアミン４酢酸 (EDTA) では阻害されなかった。
【００８４】
【表４】
【００８５】
［実施例１０］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の部分アミノ酸配列
実施例１で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列を解析したが、Ｎ末アミノ酸はブロックされていることが示唆された。次に、Ｖ８プロテアーゼ（シグマ社製）を用いて精製酵素を部分消化し、SDS-PAGEにより分離後、PVDFメンブレンにブロッティングした。
ブロッティングされたペプチド断片をプロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステム製）によりアミノ酸配列を解析した結果、３種類のアミノ酸配列が得られた。ペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５に示した。
【００８６】
配列番号：３：ペプチドＡ
Lys-Pro-Gly-Asp-Arg-Val-Ala-Val-Glu-Ala
配列番号：４：ペプチドＢ
Ala-Thr-Ser-His-Cys-Ser-Asp-Arg-Ser-Arg-Tyr-Lys-Asp-Thr-Val-Ala-Gln-Asp-Leu-Gly-Leu
配列番号：５：ペプチドＣ
Phe-His-Ala-Ala-Phe-Asp
【００８７】
［実施例１１］ピキア・アンガスタからの染色体ＤＮＡの調製
ピキア・アンガスタ ATCC 26012株よりCryerらの方法（Meth. Cell Biol. 12, 39-44 (1975)）により、染色体ＤＮＡを精製した。
【００８８】
［実施例１２］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲによるクローニング
ペプチドＡに対応するセンスプライマーＡ及びペプチドＣに対応したアンチセンスプライマーＣを合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：６(プライマーＡ)、７(プライマーＣ)に示した。
【００８９】
プライマーＡ（配列番号：６）
AARCCNGGNGAYMGNGTNGC
プライマーＣ（配列番号：７）
TCRTCRAANGCNGCRTGRAA
【００９０】
［実施例１３］ＰＣＲ条件
ピキア・アンガスタ由来染色体ＤＮＡ２００ng、ExTaq １．２５Ｕ、ＥｘＴａｑ用緩衝液 (宝酒造製)を含む３０μLの下層反応液を80℃5分、4℃1分処理した後、プライマーＡ及びＢを各２０pmol、ｄＮＴＰ２０nmol、ＥｘＴａｑ用緩衝液を含む２０μLの上層反応液をAmpliWaxPCR Gem 50 （宝酒造製）に添加し、９４℃、１分間熱処理し、更に９４℃１分、５６℃１分、７２℃２分のサイクルを計３５回行った。
【００９１】
［実施例１４］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲ断片のサブクローニング
実施例１３で得られたＤＮＡ断片を１％低融点アガロースを用いて電気泳動して精製した。精製したＤＮＡ断片をベクターpT7Blue-2T（宝酒造製）と、Takara Ligation Kitを用いてライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地（１%バクト−トリプトン、０．５%バクト−酵母エキス、１%塩化ナトリウム、以下、LB培地と略す）プレート上で生育させた。
目的とするプラスミドを有する形質転換株よりプラスミドを精製し、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit (アプライドバイオシステムズ製)を用いてＰＣＲを行い、PRISM 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ製)により行った。決定されたコア領域の塩基配列をそれぞれ配列番号：８として示した。
【００９２】
［実施例１５］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域の周辺ＤＮＡのサブクローニング
ピキア・アンガスタの染色体ＤＮＡを制限酵素ApoI, PstI, XhoIでそれぞれ消化し、T4リガーゼを用いて16℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次にプライマーPODR-C5U（配列番号：９）、PODR-C3D（配列番号：１０）を各５０pmol、dNTP１０nmol、セルフ・ライゲーションさせたＤＮＡ５０ng、Ex-Taq用緩衝液(宝酒造製)、Ex-Taq１．５Ｕ（宝酒造製）を含む５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、６分４０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400（パーキンエルマー製）を用いて行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、ApoI, PstI, XhoIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約７６０bp、６０００bp、３５００bpのＤＮＡ断片が検出できた。
【００９３】
PODR-C5U（配列番号：９）
TTGGCATGCGATCTGTCGGAGCAATG
PODR-C3D（配列番号：１０）
TGAGCATGCAAATGCTGTTCTCAAGGC
【００９４】
ＰＣＲで増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片は、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収後、SphIによる制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド（PstI、XhoIで消化したＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片中に、SphI切断部位が存在したために、ＰＣＲ断片は２つに分かれた。それらのうちの、大きなＤＮＡ断片を精製した）を切り出し、Sephaglas（ファルマシア製）により精製、回収した。
【００９５】
得られたそれぞれのＤＮＡ断片をSphIで制限酵素消化したpUC18（宝酒造製）とTakara Ligation Kit Ver.2を用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（５０μg/mL）、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトピラノシド（以下、IPTGと呼ぶ）（２０μg/mL）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかの白色のコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Flexi-Prep (ファルマシア製) によりプラスミドを精製した。得られたプラスミドを、ＰＣＲの鋳型としたＤＮＡの調製に用いた制限酵素ApoI, PstI, XhoIに対応して、それぞれpPAD-Apo, pPAD-Pst, pPAD-Xhoとした。
【００９６】
精製したプラスミドから挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、Dye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit (パーキンエルマー製)を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンサー３７３Ａ(パーキンエルマー製)により行った。
【００９７】
pPAD-Apo, pPAD-Pst, pPAD-Xho内の挿入ＤＮＡ断片の解析した塩基配列を、コア領域の５’−上流側（５Ｕ）、３’−下流側（３Ｄ）に分け、それぞれApo-5U（配列番号：１１）、Apo-3D（配列番号：１２）、Pst-5U（配列番号：１３）として示した。また、これらのＤＮＡ断片の位置を制限酵素マップとして図６に示した。
【００９８】
ＰＣＲ増幅断片内にSphI切断部位が存在したために、コア配列上流のApoIからSphI部位の間の断片がクローン化できなかったために、新たにプライマー PODR-SPH（配列番号：１４）を合成し、プライマーPODR-C5Uと共に、ピキア・アンガスタより精製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を精製後、PstI消化し、PstI, SmaIで2重消化したpUC18とライゲーションを行い、プラスミドpPAD-Sphを得た。このpPAD-Sph内の挿入断片部分の塩基配列を解析し、得られた配列をSph-5Uとして配列番号：１５に示した。
【００９９】
Pst-5U, Sph-5U, Apo-5U, Apo-3Dの各塩基配列を図６のマップに基づき合成し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）検索により（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子の配列を決定した。決定したＤＮＡ配列は配列番号：１に、コードするタンパク質の配列は配列番号：２に示す。これらの合成、ＯＲＦ検索は、Genetyx-ATSQ/WIN、およびGenetyx-WIN（ともにソフトウェア開発株式会社製）ソフトの上で行った。
【０１００】
［実施例１６］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のクローニング
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の構造遺伝子の塩基配列を元に発現ベクター構築用のプライマーPAD-ATG1（配列番号：１６）、PAD-TAA1（配列番号：１７）を合成した。プライマーを各５０pmol、dNTP１０nmol、ピキア・アンガスタ由来染色体ＤＮＡ５０ng、Pfu-DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu-DNA polymerase２Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒)、アニール（５０℃、１分）、伸長（７５℃、５分）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
【０１０１】
PAD-ATG1（配列番号：１６）
TGCTCATGAAAGGTTTACTTTATTACGGTA
PAD-TAA1（配列番号：１７）
CAGTCTAGATTAGGAAACCTCGTTCGGC
【０１０２】
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的なバンドが検出できた。
得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素BspHI、XbaIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas (ファルマシア製) により精製した。
得られたＤＮＡ断片を、NcoI、XbaIで二重消化したpSE420D（Invitrogen製のプラスミドベクターpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開2000-189170）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌HB101株を形質転換した。
形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーよりプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を持つプラスミドをpSE-PAD1とした。
【０１０３】
［実施例１７］組換え（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の大腸菌による生産
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドpSE-PAD1で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、0.1mM IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌後、０．０２% ２−メルカプトエタノールを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて４分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収した。
【０１０４】
［実施例１８］組換え（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の基質特異性
実施例１７で調製した組換え（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を用いて種々の基質に対する活性を測定し、プラスミドを含有しない状態で実施例１７と同様に調製した無細胞抽出液の活性と比較した、酸化反応の結果を表５に、還元反応の結果を表６に示した。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【発明の効果】
光学活性アルコールなどの生産に有用なＮＡＤ＋依存性の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素ならびにそれをコードするＤＮＡが提供された。本酵素を利用することにより、光学純度の高い（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの効率的な生産方法が提供された。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、ＮＡＤＰ＋よりも安定なＮＡＤ＋依存性であることから、より容易に工業的な製造工程に応用することができる。
本発明による光学純度の高い（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの製造方法は、液晶や医薬品原料等の製造方法として有用である。
【０１０８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】グリセロール脱水素酵素活性を示す画分を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った結果を示す写真である。
【図２】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の至適pHの測定結果を示した図である。、最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図３】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の作用至適温度の測定結果を示す図である。最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図４】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のｐＨ安定性の測定結果を示す図である。未処理の活性を１００とした残存活性で表した。
【図５】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の温度安定性を測定した結果を示す図である。未処理の活性を１００とした残存活性で表した。
【図６】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子周辺の制限酵素地図を表わした図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性の新規な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素に関する。また本発明は、該酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたアルコール、特に（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、微生物によるグルコースを原料とした（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの発酵生産において、また、微生物における２，３−ブタンジオール代謝において重要な役割を有する酵素である。またこの酵素反応によって生成する（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールは、液晶、医薬品などの合成原料として有用な化合物である。
【０００３】
なお、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素とは、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を選択的に酸化する活性を有する脱水素酵素であり、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールとともにメソ−２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基も酸化する活性を有する。
【０００４】
従来、２，３−ブタンジオール脱水素活性を有する酵素に関しては、２，３−ブタンジオールの生合成、代謝に関する研究によって、たとえば以下のような微生物において（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに対する脱水素酵素活性が報告されている(Arch. Microbiol. 116, 197-203 ,1978、J. Ferment. Technol. 61, 467-471 ,1983、J. Ferment. Technol. 62, 551-559 ,1984)。しかし、いずれも無細胞抽出液を用いた活性測定のみであり、様々な酵素が混在しているために、２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択性、比活性などの諸性質は明らかにされていない。
アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）
バチルス・セレウス（Bacillus cereus IAM 1072）、
バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans ATCC 8038）、
ミクロコッカス・リソデイクティカス（Micrococcus lysodeikticus IAM 1056）、
ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus IAM 1097）、
ミクロコッカス・ローゼウス（Micrococcus roseus IAM 1295）、
シュードモナス・サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila IAM 1504）、
サルシナ・ルテア（Sarcina lutea IAM 1099）、
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）
【０００５】
高度に精製され、諸性質が明らかにされた酵素としては、以下に示すような酵素で２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有することが示されている。しかし、ＤＬ体に対する活性のみでその立体選択性は報告されていない。また、ピキア・オフナエンシスを除き、２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性は、グリセロール脱水素酵素活性と同レベルかそれ以下の活性しか有せず、その比活性は一般に低い。
アクロモバクター・リキダム（Achromobacter liquidum KY 3047）由来のグリセロール脱水素酵素（特公昭 58-40467）、
バチルス・エスピー（Bacillus sp. G-1）由来のグリセロール脱水素酵素（特公平 03-72272）、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のグリセロール脱水素酵素（Biochim. Biophys. Acta 994, 270-279 (1989)）、
シトロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii DSM 30040）由来のグリセロール脱水素酵素（J. Bacteriol. 177, 4392-4401 (1995)）、
エルビニア・アロイデア（Erwinia aroideae IFO 3830）由来のグリセロール脱水素酵素（Chem. Pharm. Bull. 26, 716-721 (1978)）、
ジオトリカム・キャンディダム（Geotrichum candidum IFO 4597）由来のグリセロール脱水素酵素（特公平 01-27715）、
ピキア・オフナエンシス（Pichia ofunaensis AKU 4328）由来のジヒドロキシアセトン還元酵素（J. Biosci. Bioeng. 88, 148-152 (1999)）、
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のグリセロール脱水素酵素（J. Gen. Microbiol. 131, 1581-1588 (1985)）、
【０００６】
高度に精製され、かつ、２，３−ブタンジオールの（２Ｒ，３Ｒ）体に対する高い選択性が明らかにされている酵素としては、イシャリヒア・コリ（Escherichia coli W-1485）の生産するグリセロール脱水素酵素（J. Biol. Chem. 259, 2124-2129 (1984)）が公知である。この酵素は、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに対するVmaxが２８．０U/mg−蛋白質であり、ラセミ体に対するVmaxが２１．２U/mg−蛋白質であることから（２Ｒ，３Ｒ）体に対する立体選択性が示唆される。ここで、酵素１Ｕは、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを基質として１分間に１μmolの酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と省略する）を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと省略する）へ還元する酵素活性である。
また、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素（Arch. Microbiol. 154, 267-273 (1990)）は、２，３−ブタンジオンから（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生産することが報告されているが、ＤＬ−２，３−ブタンジオールに対する脱水素酵素活性は２０．３U/mg−蛋白質程度であり、いずれも比活性は低い。
【０００７】
更に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）より２，３−ブタンジオール代謝に関与する２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードする遺伝子がクローニングされ、大腸菌で発現されている（FEMS Microbiol. Lett. 124 (2), 141-150 (1994)）が、その立体選択性は報告されていない。また、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）のゲノム解析の結果、シュードモナス・プチダ由来の２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子に高いホモロジーを有する遺伝子が同定されているが、実際に、この遺伝子を発現させ、その酵素活性、立体選択性などは確認されていない。
【０００８】
（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールなどの光学活性アルコールの生産に有用な、立体選択性が高く、比活性の高い（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の探索、特に、該酵素を容易に大量生産を可能にするため、該酵素をコードする遺伝子の単離、該酵素を発現可能な形質転換体の調製は、産業上重要な課題となっている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＡＤ＋を補酵素として利用しうる（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の提供を課題とする。また本発明は、２，３−ブタンジオンを基質とする光学活性（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの酵素的な製造工程に利用した場合に、光学的純度の高い生成物を収率良く与えることができる（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を提供することも課題としている。
【００１０】
更に本発明は、目的とする性状を備えた（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換え体として得ることを課題とする。加えて、新規な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素による光学活性（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの酵素的な製造方法の提供をも課題とするものである。
【００１１】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは、ピキア・アンガスタ（旧名称：ハンゼヌラ・ポリモルファ）におけるグリセロール代謝に関与する酵素群に関する研究を進めてきた（Agri. Biol. Chem. 51, 2401-2407 (1987) ）。本菌株においては、グリセロール代謝経路としてリン酸化経路と酸化経路の２種類が存在し、ｐＨ６．０でＮＡＤＨとジヒドロキシアセトンを基質とした還元反応を触媒するグリセロール脱水素酵素Ｉ（ＧＤＨ−Ｉ）とｐＨ９．０でＮＡＤ＋とグリセロールを基質として酸化反応を触媒するグリセロール脱水素酵素ＩＩ（ＧＤＨ−ＩＩ）を併せ持つことが明らかになっている。
【００１２】
これら２種類の酵素のうち、ＧＤＨ−Ｉを電気泳動的に単一のバンドまで精製し、その諸性質を明らかにした結果、ＧＤＨ−Ｉが２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基に対して高い活性と高い選択性を併せ持つ、新規な（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素であることが明らかとなった。
【００１３】
更に、本酵素をコードするＤＮＡを単離し、本酵素を高発現する組換え菌を造成し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、この酵素をコードするＤＮＡ、この酵素の製造方法、および用途に関する。
〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性質を有する（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（１）作用
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成する。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性
酸化反応の補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。還元反応の補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。また、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
（３）比活性
精製酵素の蛋白質１mg当たり１００Ｕ以上の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有する。
〔２〕更に付加的に、次の（４）、（５）に示す理化学的性質を有する〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（４）至適ｐＨ
グリセロール酸化反応の至適ｐＨが１０。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるサブユニットの分子量が３６，０００、ゲル濾過による分子量が７６，０００。
〔３〕ピキア属に属する微生物によって産生される〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
〔４〕ピキア属に属する微生物が、ピキア・アンガスタである〔３〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
〔５〕下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔６〕配列番号：１に記載の塩基配列と７０%以上の相同性を有する塩基配列を含む、〔５〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする、〔５〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８〕〔５〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔９〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する〔８〕に記載のタンパク質。
〔１０〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１１〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチド、または〔１０〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔１２〕〔１１〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔９〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔１３〕ピキア属に属し、〔１〕に記載の酵素、または〔８〕に記載のタンパク質を産生する微生物を培養する工程を含む、〔１〕に記載の酵素、または〔８〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔１４〕ピキア属に属する微生物が、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）である〔１３〕に記載の製造方法。
〔１５〕〔１〕に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔８〕に記載のタンパク質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でケトンに作用させ、生成するアルコールを回収する工程を含むアルコールの製造方法。
〔１６〕微生物が、〔１１〕に記載の形質転換体である〔１５〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１７〕ケトンが、２，３−ブタンジオンであり、アルコールが（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールである〔１５〕に記載のアルコールの製造方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ＋を利用しうること、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を優先的に酸化すること、また、ＮＡＤＨを補酵素として２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生成することによって特徴付けられる。
【００１５】
本発明において、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性は、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオール及びグリセロールに対する酸化活性で表され、次のようにして確認することができる。
【００１６】
（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに対する酸化活性測定法:
１００mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５mM ＮＡＤＨ、５０mM（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオール及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０nmの吸光度の増加を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの増加を触媒する酵素量とする。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００１７】
グリセロールに対する酸化活性測定法:
１００mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５mM ＮＡＤＨ、１００mMグリセロール及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０ nmの吸光度の増加を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの増加を触媒する酵素量とする。
【００１８】
上記のような理化学的性状を持つ（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、たとえばピキア属酵母の培養物より精製することができる。ピキア属酵母としては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）が特に本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の産生能に優れる。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を得るために利用することができるピキア・アンガスタは、たとえば、ATCC 26012としてAmerian Type Culture Collection より入手することができる。
【００１９】
上記微生物は、ＹＰＤ（１％酵母エキス、１％ペプトン、２％グルコースを含むｐＨ６．０の培地）培地等の真菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を生産するには、ＹＰＤ培地のグルコースをメタノールもしくはグリセロールに変えた培地や、メタノール１ｇ、塩化アンモニウム０．５ｇ、リン酸２水素１カリ０．１ｇ、リン酸１水素２カリ０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０５ｇ、塩化鉄 (III) ６水和物３．０mg、塩化カルシウム２水和物１．０mg、塩化マンガン４水和物１．０mg、硫酸亜鉛７水和物１．０mg、チアミン塩酸塩２００mg、ビオチン２mg（培養液１００mLあたり）を含むｐＨ７．０の培地（以下、培地Ａと略す）でも培養可能であり、培地Ａにおけるメタノールの代わりにグリセロールを利用することもできる。
【００２０】
これらの培地を用いて培養した後、対数増殖期の菌体を回収することで、高い酵素活性を有する菌体とすることができる。また、培養においては、通気条件を少し抑制した条件において、酵素含量の高い菌体を調製することができる。
【００２１】
得られた菌体を、2-メルカプトエタノール(2-mercaptoethanol)等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド(phenylmethansulfonyl fluoride;PMFS)やエチレンジアミン４酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す）、ペプスタチン、ロイペプチン、ホスホラミドンのようなプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中でガラスビーズとの物理的な衝撃やミニラボ、フレンチプレスなどの高圧を利用するなどして破砕し、無細胞抽出液を得る。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画（アセトンやジメチルスルホキシドなどの有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより本発明の酵素を精製する事ができる。例えば、無細胞抽出液をブルー−セファロース、フェニル−セファロース、Resource Q（いずれもファルマシア製）などのカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
【００２２】
ピキア・アンガスタに由来する本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は以下の（１）−（３）の理化学的性質を有する蛋白質である。
（１）ＮＡＤ＋を補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成する。ＮＡＤＨを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を、また還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。また、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
（３）精製酵素の蛋白質１mg当たり１００Ｕ以上の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有する。
【００２３】
本発明の酵素は、更に付加的に、以下の（４）−（５）の理化学的性質を有するタンパク質である。
（４）至適ｐＨ
グリセロール酸化反応の至適ｐＨが１０。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（以下SDS-PAGEと省略する）によるサブユニットの分子量が３６，０００、ゲル濾過による分子量が７６，０００。
【００２４】
更に本発明の酵素は、以下の性状（６）−（９）によって特徴付けることができる。
（６）安定ｐＨ範囲
ｐＨ６−９．５の範囲で比較的安定である。
（７）作用適温の範囲
至適温度は３０℃である。
（８）温度安定性
３０℃まで比較的安定である。
（９）阻害
SH試薬であるパラクロロ水銀安息香酸（PCMB：p-chloromercuribenzoic acid）、o-フェナンスロリン (o-phenanthrolin) , ２，２’−ビピリジル（2,2'-bipyridyl）、塩化銅、塩化水銀、塩化鉄 (III) により阻害されるが、ＥＤＴＡでは阻害されない。
【００２５】
ピキア・アンガスタに由来する（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵素として酸化反応におけるＮＡＤＰ＋、あるいは還元反応におけるＮＡＤＰＨを実質的に利用することができない。しかし、ＮＡＤＰ＋やＮＡＤＰの利用性に関わらず、前記物理学化学的性状（１）−（３）、望ましくは（１）−（６）、あるいは更に望ましくは（１）−（９）を備えた酵素は、本発明に含まれる。
【００２６】
本発明は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、DNAやRNA等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であることもできる。また本発明のポリヌクレオチドは、DNA-RNAのキメラ分子であることもできる。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の好ましい態様を構成する。
【００２７】
本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）−（３）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：１記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
【００２８】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）−（３）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer)において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００２９】
さらに、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT, PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST, FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００３０】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてSWISS-PLOTを対象にBLASTプログラムを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、サッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）のYAG0であった。YAG0は、ゲノム解析の結果から推測された、仮想アルコール脱水素酵素様蛋白質（HYPOTHETICAL ZINC-TYPE ALCOHOL DEHYDROGENASE-LIKE PROTEIN）で、その蛋白質としての存在、機能、理化学的性質などは全く不明である。このYAG0に対するホモロジーはIdentityで４６％、Positiveで６２％であった。本発明の７０％以上のホモロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いたPositiveの相同性の値を表す。
【００３１】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。
本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）−（３）に示した物理化学的性状を有することを意味する。当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。その（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログを得ることが可能である。
【００３２】
さらに、本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT, PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００３３】
本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
【００３４】
配列番号：１に記載の塩基配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００３５】
さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３６】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００３７】
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
このようにして単離された、本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素発現ベクターが提供される。
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を組み換え体から得ることができる。
【００３８】
本発明においてＮＡＤ＋を電子受容体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、ＮＡＤ＋を電子受容体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、ＮＡＤ＋を電子受容体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
【００３９】
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００４０】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories)。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＨを電子供与体とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００４１】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００４２】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００４３】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００４４】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００４５】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００４６】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００４７】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００４８】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００４９】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
【００５０】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５１】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５２】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５３】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００５４】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００５５】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００５６】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００５７】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００５８】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００５９】
本発明において使用する（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有する微生物は、ＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有するピキア属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
【００６０】
本発明は、前記（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のケトンの還元によるアルコール、特に（Ｒ）−２，３−ブタンジオールの製造用途に関する。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤＨを酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００６１】
本発明によるアルコールの製造方法におけるケトンとしては、隣接するジケトンを有する２，３−ブタンジオンや２，３−ペンタンジオンが好適に用いられる。
【００６２】
本発明は、前記（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素によるアルコールの酸化反応によるケトンの製造用途に関する。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤ＋を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００６３】
本発明によるケトンの製造方法におけるアルコールとしては、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオール、メソ−２，３−ブタンジオールが挙げられ、それぞれ、（Ｒ）−アセトイン、（Ｓ）−アセトインを合成することができる。
【００６４】
上記還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ＋の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるアルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００６５】
また、本発明のＤＮＡを含む組み換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記アルコールの製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のＮＡＤＨ依存性（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＨ再生酵素とＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、一方、もしくは、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００６６】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００６７】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００６８】
本発明の反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１５−３０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ６−９．５、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは０．１−３０%で行うことができる。反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨが０．００１mM−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加できる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００６９】
ＮＡＤＨの再生のために、たとえば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどが反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケトンに対してモル比で０．１−２０、好ましくは１−５倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などの、ＮＡＤＨ再生用の酵素は、本発明のＮＡＤＨ依存性カルボニル脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができる。
【００７０】
本発明のケトンの還元により生成するアルコールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせることにより行うことができる。
たとえば、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体をのぞいた後、限外濾過によりタンパク質を除去し、その濾液に酢酸エチルなどの溶媒を添加して（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを溶媒層に抽出する。これを相分離後、蒸留することにより純度の高い（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を精製することができる。
【００７１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の精製
ピキア・アンガスタ ATCC 26012株を７ＬのグリセロールをＣ源とした培地Ａ中で、２８℃、４０時間培養し、遠心分離により湿菌体を調製した。得られた湿菌体約１００gを５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１mM ２−メルカプトエタノール−１３０mLに澱懸し、ビードビーター（Biospec社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液を緩衝液Ａ（５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び１mM ２−メルカプトエタノール）で平衡化したブルーセファロース６Ｂ（２．２ｃｍ ｘ ２０ｃｍ）に添加し、緩衝液Ａで洗浄した後、０から１M 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出した。溶出したグリセロール脱水素酵素活性を示す画分を回収した。
【００７２】
濃縮した酵素液を緩衝液Ａに対して透析した後、４０％硫安飽和緩衝液Ａで平衡化したフェニル−セファロース（１．０ cm × １０ cm）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、４０％から０％硫安飽和の勾配溶出を行った。溶出したグリセロール脱水素酵素活性画分を回収し、限外濾過により濃縮した。
濃縮酵素液を２０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び１mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液で平衡化したリソースＱカラム（Resource Q HR 5/5）に添加し、同緩衝液で洗浄した後、０から１ M 塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。活性画分を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果、ほぼ単一バンドであった（図１）。
精製酵素の比活性は約２１８U/mg（グリセロール脱水素酵素活性；（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性で１３５０U/mg相当）であった。
精製の要約を表１に示す。
【００７３】
【表１】
［実施例２］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の分子量測定
実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた結果、３．６万であった。また、スーパーデックスＧ２００のゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、約７．６万であった。
【００７５】
［実施例３］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の至適pH
McIIvaine緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いてpHを変化させて、実施例１で得られた酵素のグリセロール脱水素酵素活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図２に示した。反応の至適ｐＨは１０であった。
【００７６】
［実施例４］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の作用至適温度
実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させてグリセロール脱水素酵素活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示した。至適温度は３０℃であった。
【００７７】
［実施例５］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のｐＨ安定性
実施例１で得られた酵素を、McIIvaine緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ２−１２中で、３０℃、１０分間インキュベートし、残存活性を測定した。結果は、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図４に示した。本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、ｐＨ６−９．５において比較的安定であった。
【００７８】
［実施例６］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の温度安定性
実施例１で得られた酵素をｐＨ７．５で１０分間放置した後、グリセロール脱水素酵素活性を測定した。結果は、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図５に示した。本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、３０℃まで比較的安定であった。
【００７９】
［実施例７］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の基質特異性
実施例１で得られた酵素を種々試薬５００mMと反応させ、その脱水素活性を測定した。結果は、ＮＡＤ＋を補酵素としたグリセロール脱水素活性を１００とした相対活性で表し、表２に示した。
【００８０】
【表２】
［実施例８］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択性
実施例１で得られた酵素を１，２−プロパンジオール、２，３−ブタンジオールの両異性体５００mMに対して反応させ、グリセロールに対する活性を１００とした相対活性で表し、表３に示した。
【００８２】
【表３】
［実施例９］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の試薬に対する挙動
種々の試薬中で30℃、10分間処理した後、グリセロール脱水素酵素活性を測定し、試薬を含まない条件で30℃、10分間処理した後の残存活性を１００とした残存活性で表し、表４に示した。本発明による（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、パラクロロ水銀安息香酸 (PCMB)、o-フェナンスロリン、２，２’−ジピリジル、塩化銅、塩化水銀、塩化鉄 (III) によって顕著に阻害され、エチレンジアミン４酢酸 (EDTA) では阻害されなかった。
【００８４】
【表４】
［実施例１０］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の部分アミノ酸配列
実施例１で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列を解析したが、Ｎ末アミノ酸はブロックされていることが示唆された。次に、Ｖ８プロテアーゼ（シグマ社製）を用いて精製酵素を部分消化し、SDS-PAGEにより分離後、PVDFメンブレンにブロッティングした。
ブロッティングされたペプチド断片をプロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステム製）によりアミノ酸配列を解析した結果、３種類のアミノ酸配列が得られた。ペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５に示した。
【００８６】
配列番号：３：ペプチドＡ
Lys-Pro-Gly-Asp-Arg-Val-Ala-Val-Glu-Ala
配列番号：４：ペプチドＢ
Ala-Thr-Ser-His-Cys-Ser-Asp-Arg-Ser-Arg-Tyr-Lys-Asp-Thr-Val-Ala-Gln-Asp-Leu-Gly-Leu
配列番号：５：ペプチドＣ
Phe-His-Ala-Ala-Phe-Asp
【００８７】
［実施例１１］ピキア・アンガスタからの染色体ＤＮＡの調製
ピキア・アンガスタ ATCC 26012株よりCryerらの方法（Meth. Cell Biol. 12, 39-44 (1975)）により、染色体ＤＮＡを精製した。
【００８８】
［実施例１２］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲによるクローニング
ペプチドＡに対応するセンスプライマーＡ及びペプチドＣに対応したアンチセンスプライマーＣを合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：６(プライマーＡ)、７(プライマーＣ)に示した。
【００８９】
プライマーＡ（配列番号：６）
AARCCNGGNGAYMGNGTNGC
プライマーＣ（配列番号：７）
TCRTCRAANGCNGCRTGRAA
【００９０】
［実施例１３］ＰＣＲ条件
ピキア・アンガスタ由来染色体ＤＮＡ２００ng、ExTaq １．２５Ｕ、ＥｘＴａｑ用緩衝液 (宝酒造製)を含む３０μLの下層反応液を80℃5分、4℃1分処理した後、プライマーＡ及びＢを各２０pmol、ｄＮＴＰ２０nmol、ＥｘＴａｑ用緩衝液を含む２０μLの上層反応液をAmpliWaxPCR Gem 50 （宝酒造製）に添加し、９４℃、１分間熱処理し、更に９４℃１分、５６℃１分、７２℃２分のサイクルを計３５回行った。
【００９１】
［実施例１４］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲ断片のサブクローニング
実施例１３で得られたＤＮＡ断片を１％低融点アガロースを用いて電気泳動して精製した。精製したＤＮＡ断片をベクターpT7Blue-2T（宝酒造製）と、Takara Ligation Kitを用いてライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地（１%バクト−トリプトン、０．５%バクト−酵母エキス、１%塩化ナトリウム、以下、LB培地と略す）プレート上で生育させた。
目的とするプラスミドを有する形質転換株よりプラスミドを精製し、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit (アプライドバイオシステムズ製)を用いてＰＣＲを行い、PRISM 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ製)により行った。決定されたコア領域の塩基配列をそれぞれ配列番号：８として示した。
【００９２】
［実施例１５］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域の周辺ＤＮＡのサブクローニング
ピキア・アンガスタの染色体ＤＮＡを制限酵素ApoI, PstI, XhoIでそれぞれ消化し、T4リガーゼを用いて16℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次にプライマーPODR-C5U（配列番号：９）、PODR-C3D（配列番号：１０）を各５０pmol、dNTP１０nmol、セルフ・ライゲーションさせたＤＮＡ５０ng、Ex-Taq用緩衝液(宝酒造製)、Ex-Taq１．５Ｕ（宝酒造製）を含む５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、６分４０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400（パーキンエルマー製）を用いて行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、ApoI, PstI, XhoIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約７６０bp、６０００bp、３５００bpのＤＮＡ断片が検出できた。
【００９３】
PODR-C5U（配列番号：９）
TTGGCATGCGATCTGTCGGAGCAATG
PODR-C3D（配列番号：１０）
TGAGCATGCAAATGCTGTTCTCAAGGC
【００９４】
ＰＣＲで増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片は、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収後、SphIによる制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド（PstI、XhoIで消化したＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片中に、SphI切断部位が存在したために、ＰＣＲ断片は２つに分かれた。それらのうちの、大きなＤＮＡ断片を精製した）を切り出し、Sephaglas（ファルマシア製）により精製、回収した。
【００９５】
得られたそれぞれのＤＮＡ断片をSphIで制限酵素消化したpUC18（宝酒造製）とTakara Ligation Kit Ver.2を用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（５０μg/mL）、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトピラノシド（以下、IPTGと呼ぶ）（２０μg/mL）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかの白色のコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Flexi-Prep (ファルマシア製) によりプラスミドを精製した。得られたプラスミドを、ＰＣＲの鋳型としたＤＮＡの調製に用いた制限酵素ApoI, PstI, XhoIに対応して、それぞれpPAD-Apo, pPAD-Pst, pPAD-Xhoとした。
【００９６】
精製したプラスミドから挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、Dye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit (パーキンエルマー製)を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンサー３７３Ａ(パーキンエルマー製)により行った。
【００９７】
pPAD-Apo, pPAD-Pst, pPAD-Xho内の挿入ＤＮＡ断片の解析した塩基配列を、コア領域の５’−上流側（５Ｕ）、３’−下流側（３Ｄ）に分け、それぞれApo-5U（配列番号：１１）、Apo-3D（配列番号：１２）、Pst-5U（配列番号：１３）として示した。また、これらのＤＮＡ断片の位置を制限酵素マップとして図６に示した。
【００９８】
ＰＣＲ増幅断片内にSphI切断部位が存在したために、コア配列上流のApoIからSphI部位の間の断片がクローン化できなかったために、新たにプライマー PODR-SPH（配列番号：１４）を合成し、プライマーPODR-C5Uと共に、ピキア・アンガスタより精製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を精製後、PstI消化し、PstI, SmaIで2重消化したpUC18とライゲーションを行い、プラスミドpPAD-Sphを得た。このpPAD-Sph内の挿入断片部分の塩基配列を解析し、得られた配列をSph-5Uとして配列番号：１５に示した。
【００９９】
Pst-5U, Sph-5U, Apo-5U, Apo-3Dの各塩基配列を図６のマップに基づき合成し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）検索により（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子の配列を決定した。決定したＤＮＡ配列は配列番号：１に、コードするタンパク質の配列は配列番号：２に示す。これらの合成、ＯＲＦ検索は、Genetyx-ATSQ/WIN、およびGenetyx-WIN（ともにソフトウェア開発株式会社製）ソフトの上で行った。
【０１００】
［実施例１６］（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のクローニング
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の構造遺伝子の塩基配列を元に発現ベクター構築用のプライマーPAD-ATG1（配列番号：１６）、PAD-TAA1（配列番号：１７）を合成した。プライマーを各５０pmol、dNTP１０nmol、ピキア・アンガスタ由来染色体ＤＮＡ５０ng、Pfu-DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu-DNA polymerase２Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒)、アニール（５０℃、１分）、伸長（７５℃、５分）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
【０１０１】
PAD-ATG1（配列番号：１６）
TGCTCATGAAAGGTTTACTTTATTACGGTA
PAD-TAA1（配列番号：１７）
CAGTCTAGATTAGGAAACCTCGTTCGGC
【０１０２】
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的なバンドが検出できた。
得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素BspHI、XbaIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas (ファルマシア製) により精製した。
得られたＤＮＡ断片を、NcoI、XbaIで二重消化したpSE420D（Invitrogen製のプラスミドベクターpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開2000-189170）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌HB101株を形質転換した。
形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーよりプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とする（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を持つプラスミドをpSE-PAD1とした。
【０１０３】
［実施例１７］組換え（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の大腸菌による生産
（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドpSE-PAD1で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、0.1mM IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌後、０．０２% ２−メルカプトエタノールを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて４分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収した。
【０１０４】
［実施例１８］組換え（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の基質特異性
実施例１７で調製した組換え（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を用いて種々の基質に対する活性を測定し、プラスミドを含有しない状態で実施例１７と同様に調製した無細胞抽出液の活性と比較した、酸化反応の結果を表５に、還元反応の結果を表６に示した。
【０１０５】
【表５】
【表６】
【発明の効果】
光学活性アルコールなどの生産に有用なＮＡＤ＋依存性の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素ならびにそれをコードするＤＮＡが提供された。本酵素を利用することにより、光学純度の高い（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの効率的な生産方法が提供された。本発明の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、ＮＡＤＰ＋よりも安定なＮＡＤ＋依存性であることから、より容易に工業的な製造工程に応用することができる。
本発明による光学純度の高い（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールの製造方法は、液晶や医薬品原料等の製造方法として有用である。
【０１０８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】グリセロール脱水素酵素活性を示す画分を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った結果を示す写真である。
【図２】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の至適pHの測定結果を示した図である。、最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図３】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の作用至適温度の測定結果を示す図である。最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図４】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のｐＨ安定性の測定結果を示す図である。未処理の活性を１００とした残存活性で表した。
【図５】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の温度安定性を測定した結果を示す図である。未処理の活性を１００とした残存活性で表した。
【図６】（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子周辺の制限酵素地図を表わした図である。
Claims (14)
- 次の（１）から（５）に示す理化学的性質を有する（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（１）作用
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｒ）−アセトインを生成する。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性
酸化反応の補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。還元反応の補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。また、２，３−ブタンジオールの（Ｒ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
（３）比活性
精製酵素の蛋白質１mg当たり１００Ｕ以上の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有する。
（４）至適ｐＨ
グリセロール酸化反応の至適ｐＨが１０。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるサブユニットの分子量が３６，０００、ゲル濾過による分子量が７６，０００。 - ピキア属に属する微生物によって産生される請求項１に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
- ピキア属に属する微生物が、ピキア・アンガスタである請求項２に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
- 下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号：１に記載の塩基配列と９０%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。 - 請求項４に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
- 配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する請求項５に記載のタンパク質。
- 請求項４に記載されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項４に記載されたポリヌクレオチド、または請求項７に記載のベクターを保持する形質転換体。
- 請求項８に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項６に記載の蛋白質の製造方法。
- ピキア属に属し、請求項１に記載の酵素、または請求項５に記載のタンパク質を産生する微生物を培養する工程を含む、請求項１に記載の酵素、または請求項５に記載のタンパク質の製造方法。
- ピキア属に属する微生物が、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）である請求項１０に記載の製造方法。
- 請求項１に記載の（Ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、請求項５に記載のタンパク質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でケトンに作用させ、生成するアルコールを回収する工程を含むアルコールの製造方法。
- 微生物が、請求項８に記載の形質転換体である請求項１２に記載のアルコールの製造方法。
- ケトンが、２，３−ブタンジオンであり、アルコールが（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ブタンジオールである請求項１２に記載のアルコールの製造方法。
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