WO2010024445A1 - 光学活性なアミン誘導体を製造するための方法 - Google Patents

光学活性なアミン誘導体を製造するための方法 Download PDF

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optically active
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imine
amino acid
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透 長澤
豊和 吉田
浩一 石田
浩明 山本
訓弘 木本
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ダイセル化学工業株式会社
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an optically active amine derivative used as a raw material or synthetic intermediate for various pharmaceuticals by stereoselectively reducing an imine derivative.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an optically active amine derivative from an imine derivative. Another object of the present invention is to provide a microorganism or enzyme capable of producing an optically active amine derivative using an imine derivative as a substrate. Another object of the present invention is to isolate a DNA encoding the enzyme having the desired properties and obtain it as a recombinant. In addition, another object is to provide a method for producing an optically active amine derivative using a recombinant.
  • the present inventors diligently studied a method for satisfying such high demands. And it discovered that an optically active amine derivative could be produced
  • this invention provides the manufacturing method of the following optically active amines.
  • the present invention relates to a microorganism useful for the method, or an imine reductase, a polynucleotide containing a DNA encoding the enzyme, and a method for producing the enzyme.
  • A a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
  • B a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
  • C a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
  • D a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
  • E a polynucleotide encoding an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the imine derivative represented by the formula (I) is selected from the group consisting of the imine reductase according to [1] or [2], a microorganism that produces the imine reductase, and a processed product thereof,
  • a method for producing an optically active S-form amine derivative which comprises a step of contacting one enzyme active substance and a step of recovering an optically active S-form amine derivative represented by the formula (II).
  • Formula (I) Formula (II) (Wherein R1 and R2 groups represent an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, R3 group represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or hydrogen, and R1 and R3 may be wound around a ring) [4]
  • at least one enzyme active substance selected from the group consisting of a culture of microorganisms having the ability to reduce the compound in a stereoselective manner, microbial cells, and processed products thereof
  • a method for producing an optically active S-form amine derivative comprising a step of contacting and a step of recovering an optically active S-form amine derivative represented by the formula (II).
  • Formula (I) Formula (II) (Wherein R1 and R2 groups represent an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, R3 group represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or hydrogen, and R1 and R3 may be wound in a ring) [5]
  • A a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
  • B a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
  • C a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
  • D a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
  • E a polynucleotide encoding an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • [11] A recombinant vector into which the polynucleotide described in [10] is inserted.
  • the recombinant vector according to [11] into which a polynucleotide encoding a dehydrogenase capable of catalyzing a redox reaction using NADP + as a coenzyme is inserted.
  • the vector according to [12], wherein the dehydrogenase is glucose dehydrogenase.
  • the recombinant vector according to [12], wherein the glucose dehydrogenase is derived from Bacillus subtilis.
  • [15] A transformant retaining the polynucleotide according to [10] or the vector according to [12] in an expressible manner.
  • [16] A method for producing a protein encoded by the polynucleotide according to [10], comprising culturing the transformant according to [15] and recovering the expression product.
  • a method for efficiently producing an (S) isomer optically active amine by stereoselective reduction of imine using the reducing ability of microorganisms is also provided.
  • an imine reductase responsible for the reaction was also provided.
  • a DNA encoding an imine reductase was isolated, and a recombinant bacterium that highly expresses the enzyme was provided.
  • the method of the present invention is industrially advantageous because an optically active amine can be synthesized using an imine derivative that can be synthesized at low cost as a substrate and utilizing the high stereoselectivity of microorganisms.
  • the present invention is particularly useful for the production of (S) -2-methylpyrrolidine.
  • (S) -2-methylpyrrolidine is a compound useful as an intermediate for synthesizing pharmaceuticals. According to the present invention, the compound can be easily and efficiently produced by the action of microorganisms and enzymes.
  • the vertical axis represents the relative activity (%) with the activity value at which the highest activity was found as 100, and the horizontal axis represents the pH of the enzyme reaction solution. It is a graph which shows the result of having investigated the optimum pH (oxidation reaction) of the imine reductase derived from Streptomyces sp. GF3546. The vertical axis represents the relative activity (%) with the activity value at which the highest activity was found as 100, and the horizontal axis represents the pH of the enzyme reaction solution. It is a graph which shows the result of having investigated the optimal temperature (reduction reaction) of the imine reductase derived from Streptomyces sp. GF3546.
  • FIG. 3 is a diagram showing the process of constructing a plasmid (pSG-S2MP) in which an imine reductase gene derived from Streptomyces sp. GF3546 and a glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis are inserted.
  • the present invention provides at least one selected from the group consisting of a culture, a microbial cell, and a processed product of a microorganism having the ability to reduce the compound in a stereoselective manner to the imine derivative represented by the formula (I).
  • the present invention relates to a method for producing an optically active S-form amine derivative, which comprises a step of contacting two enzyme active substances and a step of recovering an optically active S-form amine derivative represented by the formula (II).
  • Formula (I) Formula (II) (Wherein R1 and R2 groups represent an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, R3 group represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or hydrogen, and R1 and R3 may be wound around a ring) .
  • cyclic imine compounds are preferred as the compounds of formula (I).
  • the cyclic imine compound includes, for example, an imine derivative represented by the following formula (III).
  • Formula (III) (Wherein R represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 4).
  • a compound represented by the formula (IV) can be obtained as an optically active amine derivative.
  • the compound is a preferred optically active amine derivative that can be prepared according to the present invention.
  • Formula (IV) (Wherein R represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 4).
  • a preferable compound in the present invention is a compound in which, in the formula (III), R is a methyl group, an ethyl group, or a propyl group, and n is 2 to 3. More specifically, the following compounds can be shown as preferred imine derivatives in the present invention. 2-methyl-1-pyrroline 2-methyl-1-piperidein 2-ethyl-1-pyrroline 2-ethyl-1-piperidein
  • optically active amine derivatives can be produced using these compounds as substrates.
  • 2-methyl-1-pyrroline ⁇ (S) -2-methylpyrrolidine 2-methyl-1-piperidein ⁇ (S) -2-methylpiperidine
  • 2-ethyl-1-pyrroline ⁇ (S) -2-ethylpyrrolidine 2- Ethyl-1-piperidein ⁇ (S) -2-ethylpiperidine
  • the ability to stereoselectively reduce an imine derivative refers to the ability to produce an S derivative amine derivative using the imine derivative represented by the formula (I), preferably the formula (III) as a substrate.
  • Any microorganism can be used as the microorganism of the present invention as long as it is a microorganism capable of producing an S derivative amine derivative.
  • the microorganism used in the present invention can be obtained, for example, by comparing the ability to produce S-form amine derivatives for microorganisms belonging to the genus as shown below.
  • the test microorganism is cultured in a medium containing an imine derivative represented by compound (I), preferably compound (III), and the optical purity of the optically active amine derivative produced in the culture is measured.
  • an optically active (S) -amine derivative can be confirmed, the microorganism can be used in the present invention.
  • the test microorganisms previously grown in the medium and suspend them in an appropriate buffer collect the test microorganisms previously grown in the medium and suspend them in an appropriate buffer. Further, the optical purity of the optically active amine derivative produced in this buffer solution is measured by contacting and reacting with the compound (I), preferably the imine derivative represented by the compound (III). If the production of an optically active amine derivative can be confirmed, the microorganism can be used in the present invention. At this time, if compound (I), preferably compound (III) is added to the medium during the cultivation of the test microorganism, induction of an enzyme for reducing this compound can be expected. If a reducing energy source is added during the reaction, more effective product accumulation can be expected. As the reducing energy source, glucose or the like can usually be used.
  • the microorganism is cultured in an appropriate medium containing 2-methyl-1-pyrroline, and the resulting microbial cell is treated with 10 mM 2-methyl-1-pyrroline, 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7. 0), and if necessary, suspended in a reaction solution containing glucose, shaken at 25 ° C. for 24 hours, and analyzed the product by TLC or HPLC to confirm the ability of microorganisms to reduce 2-methyl-1-pyrroline. can do.
  • the optical purity of the produced amine derivative can be measured, for example, by the following method.
  • the following components are added to 50 ⁇ L of a test sample, and the amine produced by reacting at 40 ° C. for 1 hour is converted to GITC, separated and quantified by HPLC. 2 mg / mL triethylamine 50 ⁇ L, and 8 mg / mL 2,3,4,6-tetra-O-acetyl- ⁇ -D-glucopyranosyl isothiocyanate (GITC) 100 ⁇ L
  • HPLC HPLC
  • -HPLC column Wakosil II 5C18 (4.6mmx150mm) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Detection UV absorption at 254 nm
  • (R) -2-methylpyrrolidine is eluted at 26.3 minutes
  • S) -2-methylpyrrolidine derivative is eluted at 24.9 minutes.
  • a microorganism capable of producing an optically active S-form amine derivative having a stereoselectivity of, for example, 60%, usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more is used. Can do.
  • the “optically active amine derivative” refers to an amine derivative in which one optical isomer is more contained than another optical isomer.
  • a preferred optically active amine derivative has an optical purity (ee) of, for example, 60%, usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
  • the optical purity of the optically active amine derivative can be confirmed using, for example, an optical resolution column.
  • the “optical isomer” of the present invention may be generally referred to as “optically active form” and “enantiomeric”.
  • a microorganism belonging to the genus Streptomyces reduces the imine derivative represented by the formula (I) to produce an S-form amine derivative. More specifically, the following microorganisms can be shown as microorganisms belonging to the genus Streptomyces. This microorganism is a preferred microorganism that produces a high optical purity (S) amine derivative in the present invention. Streptomyces sp. GF3546 (Streptomyces sp. GF3546)
  • microorganisms having the ability to stereoselectively reduce the imine derivative represented by the formula (I) or (III) are found not only from these deposited strains but also from various microbiological resources. be able to.
  • Microbial resources include microbial populations isolated from the natural environment, microbial strains stored in microbial depositories, and the like.
  • a microorganism belonging to the genus Streptomyces is preferable as a microorganism having the ability to reduce the imine derivative represented by the formula (I) or (III) in a stereoselective manner in the present invention.
  • a microorganism having the target action can be selected by the selection method as described above for Streptomyces microorganisms stored in a microorganism depository.
  • Deposited microorganisms can be sold, for example, from the following depository institutions.
  • microorganisms that can be used in the present invention can be selected based on the base sequence information of ribosomal DNA (rDNA).
  • rDNA base sequence information is useful as an index representing genetic proximity between organisms.
  • DNA encoding 16S rRNA (hereinafter referred to as “16S rDNA”) is utilized as a tool for determining the genetic identity or similarity of microorganisms. 16S rRNA exists in all living organisms, and structural differences are observed between organisms, but the sequence is conserved to such an extent that alignment is possible. Since the frequency of horizontal propagation of 16S rRNA between organisms is low, a method used for classification is widely used.
  • small subunit ribosomal RNA is one of the nucleic acid molecules constituting the ribosome, which is the field of protein synthesis.
  • SSU rRNA small subunit ribosomal RNA
  • the length of the base sequence is slightly different, the origin is considered to be the same from bacteria to human. Therefore, the base sequence of rRNA has high evolutionary conservation and is most frequently used in phylogenetic analysis of organisms (Microbiol. Rev., 58, 1-9 (1994)).
  • SSU rRNA in prokaryotes is about 1500 base 16S rRNA.
  • Phylogenetic classification using the base sequence of 16S rRNA is generally used for classification and identification of prokaryotes (ASM News, 65, 752-757 (1999), Biotechnology Experiments p113, Japanese Society for Biotechnology, Bafukan).
  • the current actinomycete classification system is constructed based on the similarity of 16S rDNA base sequences (Stackebrandt, et al. (1997) Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 479-491).
  • identification based on the homology of the 16S rDNA nucleotide sequence is not only at the genus level but also at the species level, which has become the mainstream of bacterial phylogeny (“Classification and identification of actinomycetes” (Japan actinomycetes). Society) p19).
  • the above-mentioned strain found by the present inventors contained the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in 16S rDNA.
  • searching these base sequence information for the base sequence information database it is possible to find a strain containing a highly identical base sequence in 16S rDNA from among microorganisms for which 16S rDNA has already been determined.
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • search services for 16S ⁇ ⁇ rRNA (Prokaryotes) base sequence information are provided.
  • microorganisms belonging to the genus Streptomyces from microorganisms thus found, microorganisms that can be used in the present invention can be obtained. If necessary, the action of the thus selected microorganism on the imine derivative can be confirmed in advance.
  • microorganisms can be cultured according to methods known in the field of fermentation.
  • any of a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains an appropriate amount of carbon source, nitrogen source, inorganic substance and other nutrients.
  • a liquid medium or a solid medium can be used.
  • a carbon source one or two or more types are appropriately selected from the following general carbon sources in consideration of the assimilation of microorganisms to be used.
  • Sugars Natural carbohydrates: Glucose, starch, Fructose, starch hydrolysate, Maltose, molasses, Galactose, molasses, wheat, Corn, etc.
  • Alcohols Organic acids: Glycerol, acetic acid, Methanol, gluconic acid, Such as ethanol, pyruvic acid, Ketoglutaric acid, Hydrocarbons such as citric acid: Fats such as normal paraffin: Palm kernel oil, Soybean oil, Olive oil, etc.
  • nitrogen source one or more kinds of nitrogen sources are appropriately selected from the following general nitrogen sources in consideration of the assimilation of microorganisms to be used.
  • Organic nitrogen compounds Meat extract, peptone, yeast extract, Soy hydrolyzate, milk casein, casamino acid, Various amino acids, corn steep liquor,
  • Inorganic nitrogen compounds such as other animal, plant and microbial hydrolysates: Ammonia, ammonium nitrate, ammonium sulfate, Ammonium salts such as sodium chloride, Nitrate such as sodium nitrate, urea, etc.
  • an inducer can be used to enhance the stereoselective reduction ability of the microbial imine derivative.
  • an imine derivative can be used depending on the microorganism to be used.
  • an inorganic salt one or two or more kinds can be appropriately selected and used from a trace amount of magnesium, manganese, potassium, calcium, sodium, copper, zinc and other phosphates, hydrochlorides, nitrates, acetates and the like. .
  • Culturing can be performed in a liquid medium containing the above-mentioned medium components using a normal culture method.
  • a normal culture method For example, the following culture method can be used. Shaking culture Aeration-agitation culture Continuous culture Feeding culture, fed batch culture
  • the culture conditions can be appropriately selected depending on the type of microorganism, the type of culture, and the culture method. There is no particular limitation as long as the strain to be used grows and can have the stereoselective reduction ability of the imine derivative.
  • the following conditions can be shown as general culture conditions.
  • the pH at the start of the culture is adjusted to 4 to 10, preferably 6 to 8.
  • Cultivation is carried out at a temperature of 15 to 70 ° C, preferably 20 to 40 ° C. It is not particularly limited if possible.
  • the cells are cultured for 1 to 14 days, preferably 1 to 7 days.
  • a treated product of microbial cells means a product obtained by treating the cells under conditions that maintain the target enzyme activity.
  • the maintenance of the enzyme activity means that the enzyme activity obtained from viable cells is generally maintained at 20% or more, usually 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more.
  • the enzymatic activity of the living microbial cell and its treated product can be quantitatively compared by comparing the enzymatic activity of the living microbial cell with the enzymatic activity of the treated product obtained from the same amount of living microbial cell.
  • the treated product in the present invention may have an enzyme activity higher than that of viable cells.
  • freeze-drying dehydration drying with an organic solvent, self-digestion of bacterial cells, extraction of enzyme active fraction, sonication and the like can be used.
  • a treatment method for example, freeze-dried microbial cells, acetone-dried microbial cells, microbial cell autolysates, microbial cell extracts, microbial cell pulverized materials, sonicated microbial cells, and the like can be obtained.
  • processes can be applied singly or by overlapping a plurality of processes.
  • the cells can be disrupted and a cell-free extract can be prepared by centrifugation or the like.
  • the cells can be crushed by mechanical crushing, ultrasonic waves, high-pressure treatment, enzyme digestion, autolysis, and the like.
  • the cell-free extract is included in the treated product of the microbial cells in the present invention.
  • a partially purified or completely purified enzyme that catalyzes the reaction can be obtained from the cells. That is, this invention relates to the imine reductase which can be refine
  • the imine reductase of the present invention has the physicochemical properties shown in the following (1) to (2). (1) Action: Depending on NADPH, 2-methyl-1-pyrroline is reduced to produce (S) -2-methylpyrrolidine.
  • (S) -2-methylpyrrolidine is oxidized to produce 2-methyl-1-pyrroline; and (2) Coenzyme dependency: NADPH is used as a coenzyme in the reduction reaction.
  • NADP + is used as a coenzyme for the oxidation reaction.
  • the imine reductase found by the present inventors has the following physicochemical properties in addition to the properties (1) to (2).
  • Such an imine reductase can be obtained from Streptomyces sp. GF3546, for example.
  • SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the imine reductase of the present invention can be purified from the above microorganism or a cell-free extract thereof. Specifically, substantially pure imine reductase can be obtained from a cell-free extract by appropriately combining the following purification steps. Splitting by solubility using ammonium sulfate, acetone, etc., Ion exchange chromatography, Hydrophobic chromatography, Affinity chromatography using 2 ′, 5′-ADP sepharose, blue or red sepharose, Gel filtration
  • the imine reductase of the present invention can be isolated as a substantially pure enzyme through the following purification steps. Disruption of cells with ultrasound or glass beads and preparation of cell-free extract, Isolation of imine reductase activity fractions by hydrophobic chromatography using Phenyl Sepharose and ion exchange chromatography using MonoQ
  • substantially pure means that the enzyme does not substantially contain biological polymer compounds or chemical substances other than the enzyme.
  • Biological polymer compounds other than the enzyme include, for example, proteins, saccharides, lipids, and nucleic acids derived from bacterial cells and culture solutions.
  • the substantially pure enzyme in the present invention has a purity of at least 75% or more, usually 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, or 99% or more. Methods for determining enzyme purity are known. For example, methods for determining protein purity by various types of chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis are well known.
  • the present invention provides an isolated imine reductase having the above physicochemical properties (1) and (2).
  • an isolated imine reductase means that it is separated from the natural environment in which it exists. Therefore, the imine reductase separated from the cells is included in the isolated imine reductase in the present invention.
  • the substantially pure imine reductase or the isolated imine reductase in the present invention can be purified or isolated, and then can be used as an enzyme composition.
  • an enzyme composition containing the imine reductase of the present invention can be prepared by combining purified or isolated imine reductase with a suitable carrier.
  • a suitable carrier an inert protein such as albumin, a saccharide such as sucrose, a sugar alcohol, or the like can be used.
  • the enzyme composition can be liquid or in a dry state.
  • An enzyme composition obtained by freeze-drying an aqueous solution containing an enzyme and a carrier is one of the preferred compositions in the present invention.
  • the activity of the imine reductase of the present invention can be quantified by the following method. That is, the reaction is carried out at 30 ° C. in a reaction solution having the following composition (1 mL), and the decrease in absorbance at 340 nm resulting from the decrease in NADPH is measured. 10 mM 2-methyl-1-pyrroline, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 0.1 mM NADPH and 1 U of enzyme were used as the amount of enzyme that catalyzes the decrease of 1 ⁇ mol of NADPH per minute under the above conditions.
  • the present invention relates to a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the present invention also includes a protein homolog consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the homolog of the imine reductase of the present invention consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding an imine reductase and a homologue thereof.
  • the polynucleotide can be an artificial molecule including an artificial nucleotide derivative in addition to a natural polynucleotide such as DNA or RNA.
  • the polynucleotide of the present invention can also be a DNA-RNA chimeric molecule.
  • the polynucleotide encoding the imine reductase of the present invention includes, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 encodes a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the protein containing this amino acid sequence constitutes a preferred embodiment of the imine reductase according to the present invention.
  • the homologue of the polynucleotide encoding the imine reductase of the present invention includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • Those skilled in the art will be able to introduce site-directed mutagenesis into the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 (NucleicleAcid Res.
  • the polynucleotide homologue in the present invention is a polynucleotide that can hybridize under stringent conditions with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and has the physicochemical properties (1) to ( Also included is a polynucleotide encoding a protein having 2).
  • the polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions is one or more selected from any of at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60, or 100 consecutive sequences in SEQ ID NO: 2.
  • the probe DNA is used as a probe DNA, for example, using ECLwashdirect nucleic acid labeling and detection system (manufactured by GE Healthcare) under the conditions described in the manual (wash: 42 ° C, primary wash buffer containing 0.5xSSC) Refers to a polynucleotide.
  • the polynucleotide homologue in the present invention includes a polynucleotide encoding a protein having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Protein identity searches include databases related to amino acid sequences of proteins such as SWISS-PROT, PIR, and DAD, databases related to DNA sequences such as DDBJ, EMBL, and Gene-Bank, and databases related to predicted amino acid sequences based on DNA sequences. For example, it can be performed through the Internet using programs such as BLAST and FASTA.
  • the present invention relates to a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the present invention also includes a protein homolog consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the homolog of the imine reductase of the present invention consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • a protein functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence of In the present invention, functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 means that the protein has the physicochemical properties shown in the above (1) and (2).
  • the homologue of the imine reductase of the present invention refers to a protein having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Protein identity searches include databases related to amino acid sequences of proteins such as SWISS-PROT, PIR, and DAD, databases related to DNA sequences such as DDBJ, EMBL, and Gene-Bank, and databases related to predicted amino acid sequences based on DNA sequences. For example, it can be performed through the Internet using programs such as BLAST and FASTA.
  • polynucleotide encoding the imine reductase of the present invention can be isolated by, for example, the following method.
  • the DNA of the present invention can be obtained by designing a primer for PCR based on the base sequence described in SEQ ID NO: 2 and performing PCR using a chromosomal DNA of an enzyme production strain or a cDNA library as a template.
  • a restriction enzyme digest of a chromosomal DNA of an enzyme producing strain is introduced into a phage, plasmid, etc., and a library or cDNA library obtained by transforming E. coli is used.
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained by colony hybridization, plaque hybridization and the like.
  • the base sequence of the DNA fragment obtained by PCR is analyzed, and from the obtained sequence, a PCR primer for extending outside the known DNA is designed, and the chromosomal DNA of the enzyme production strain is transformed with an appropriate restriction enzyme.
  • a PCR primer for extending outside the known DNA is designed, and the chromosomal DNA of the enzyme production strain is transformed with an appropriate restriction enzyme.
  • the polynucleotide of the present invention includes genomic DNA cloned by the method as described above, or cDNA obtained by synthesis in addition to cDNA.
  • An imine reductase expression vector is provided by inserting the thus isolated polynucleotide encoding the imine reductase according to the present invention into a known expression vector.
  • the imine reductase of the present invention can be obtained from a recombinant by culturing a transformant transformed with this expression vector.
  • a microorganism to be transformed is transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide having imine reductase and expresses imine reductase activity.
  • a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide having imine reductase and expresses imine reductase activity There is no particular limitation as long as it is an organism that can. Examples of the microorganisms that can be used include the following microorganisms.
  • Host vector system such as Escherichia genus Bacillus genus Pseudomonas genus Serratia genus Brevibacterium genus Corynebacterium genus Streptococcus genus Lactobacillus genus Bacteria Rhodococcus spp. Streptomyces spp.
  • Developed host vector systems such as Streptomyces spp. Saccharomyces spp. Kluyveromyces spp. Schizosaccharomyces spp.
  • Yeast neurospo that have been developed for host vector systems such as Zygosaccharomyces genus Yarrowia genus Trichosporon genus Rhodosporidium genus Pichia genus Candida genus (Neurospora) genus Aspergillus (Aspergillus) genus Cephalosporium (Cephalosporium) genus Trichoderma (Trichoderma) mold that has been developed host vector system such as the genus
  • a procedure for producing a transformant and construction of a recombinant vector suitable for the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al., Molecular cloning, ColdCSpring Harbor Laboratories).
  • the DNA is first introduced into a plasmid vector or a phage vector that is stably present in the microorganism, and the genetic information thereof is introduced. Must be transcribed and translated.
  • a promoter corresponding to a unit that controls transcription / translation may be incorporated upstream of the 5′-side of the DNA strand of the present invention, and more preferably a terminator may be incorporated downstream of the 3′-side.
  • a promoter and terminator it is necessary to use a promoter and terminator known to function in a microorganism used as a host.
  • promoters and terminators that can be used in these various microorganisms, “Basic Course of Microbiology 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Shuppan”, especially regarding yeast, Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990), Yeast 8, 423-488 (1992), and the like.
  • plasmid vectors in the genus Escherichia, particularly Escherichia coli, pBR and pUC series plasmids can be used as plasmid vectors, and lac ( ⁇ -galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, trc (lac, trp). Promoters derived from ⁇ phage PL, PR, and the like.
  • a terminator a terminator derived from trpA, phage, or rrnB ribosomal RNA can be used.
  • a vector pSE420D (described in JP-A No. 2000-189170) obtained by partially modifying a multicloning site of commercially available pSE420 (manufactured by Invitrogen) can be suitably used.
  • pUB110 series plasmids, pC194 series plasmids and the like can be used as vectors, and can be integrated into chromosomes. Further, apr (alkaline protease), npr (neutral protease), amy ( ⁇ -amylase) and the like can be used as a promoter and terminator.
  • Pseudomonas putida and Pseudomonas cepacia have been developed such as Pseudomonas putida and Pseudomonas cepacia.
  • a broad host range vector including genes necessary for autonomous replication derived from RSF1010
  • pKT240 based on the plasmid TOL plasmid involved in the degradation of toluene compounds can be used, and a lipase (special) can be used as a promoter and terminator. (Kaihei 5-284773) and the like can be used.
  • plasmid vectors such as pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)) can be used.
  • promoter and terminator promoters and terminators used in Escherichia coli can be used as they are.
  • plasmid vectors such as pCS11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799) and pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984) are available. is there.
  • pAM ⁇ 1 J. Bacteriol. 137, 614 (1979) developed for Streptococcus can be used, and those used in Escherichia coli as promoters can be used. .
  • Rhodococcus In the genus Rhodococcus, a plasmid vector isolated from Rhodococcus rhodochrous can be used (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992)).
  • plasmids can be constructed according to the method described in Hopwood et al., Genetic-Manipulation-of Streptomyces: A-Laboratory-Manual-Cold-Spring-Harbor-Laboratories (1985).
  • pIJ486 Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986
  • pKC 1064 Gene 103, 97-99 (1991)
  • pUWL-KS Gene 165, 149) -150 (1995)
  • the same plasmid can also be used in Streptomyces virginiae (Actinomycetol. 11, 46-53 (1997)).
  • Saccharomyces In the genus Saccharomyces (especially Saccharomyces cerevisiae), YRp, YEp, YCp, and YIp plasmids can be used, and homologous recombination with ribosomal DNA existing in multiple copies in the chromosome is used.
  • the integration vector (EP537456 and the like) is very useful because it can introduce a gene in multiple copies and can stably hold the gene.
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • GAPDH glycosyl dehydrogenase
  • PHO acid phosphatase
  • GAL ⁇ -galactosidase
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • ENO enolase
  • Kluyveromyces genus especially Kluyveromyces lactis, 2 ⁇ m plasmid derived from Saccharomyces cerevisiae, pKD1 plasmid (J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)), involved in killer activity PGK11-derived plasmids, autonomously proliferating gene KARS-type plasmids in the genus Kleberomyces, vector plasmids (EP 537456 etc.) that can be integrated into the chromosome by homologous recombination with ribosomal DNA and the like can be used.
  • promoters and terminators derived from ADH, PGK and the like can be used.
  • plasmid vectors containing ARS (genes involved in autonomous replication) derived from Schizosaccharomyces pombe and selection markers that complement auxotrophy derived from Saccharomyces cerevisiae are available ( Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)).
  • ADH promoter derived from Schizosaccharomyces pombe can be used (EMBO J. 6, 729 (1987)).
  • pAUR224 is commercially available from Takara Bio and can be used easily.
  • plasmid vectors derived from pSB3 derived from Zygosaccharomyces rouxii (Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)) can be used, and the promoter Saccharomyces PH
  • GAP-Zr glycosylaldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Pichia Angasta formerly Hansenula polymorpha
  • genes involved in autonomous replication derived from Pichia Angusta can be used, but since they are relatively unstable, multicopy integration into the chromosome is effective (Yeast 7, 431- 443 (1991)).
  • AOX alcohol oxidase
  • FDH formic acid dehydrogenase
  • host vector systems using genes (PARS1, PARS2) involved in Pichia autonomous replication have been developed in Pichia pastoris (Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)) Strong promoters such as high concentration culture and methanol-inducible AOX can be used (Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)).
  • Candida In the genus Candida, host vector systems in Candida maltosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida utilis, etc. Has been developed. In Candida maltosa, ARS derived from Candida maltosa has been cloned (Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)), and vectors using this have been developed. In Candida utilis, a strong promoter has been developed for the chromosome integration type vector (Japanese Patent Laid-Open No. 08-173170).
  • Aspergillus Aspergillus niger and Aspergillus oryzae are the most well-studied among molds, and integration into plasmids and chromosomes is available. Promoters derived from external proteases or amylases can be used (Trends in Biotechnology 7, 283-2871989 (1989)).
  • Trichoderma In the genus Trichoderma, a host vector system using Trichoderma reesei has been developed, and an extracellular cellulase gene-derived promoter or the like can be used (Biotechnology 7, 596-603 (1989)).
  • the microorganism having imine reductase-producing ability used in the present invention includes all strains belonging to the genus Streptomyces having the ability to produce imine reductase, mutant strains, variants, and genetic engineering techniques. Includes transformed strains that have acquired the ability to produce enzymes.
  • the method for producing an optically active amine derivative of the present invention comprises an enzyme active substance having imine reductase activity having the ability to stereoselectively reduce a substrate compound represented by formula (I) or formula (III).
  • enzyme active materials are substances derived from microorganisms having the ability to reduce the substrate compound represented by formula (I) or formula (III) in a stereoselective manner. Means a maintained substance. Specifically, for example, the following elements are included in the enzyme active substance in the present invention as long as the imine reductase activity is maintained.
  • a microorganism having the ability to stereoselectively reduce a substrate compound represented by formula (I) or formula (III) ii) The microbial cell culture of i) iii) Treated microbial cells of i)
  • the microorganism can be a culture or a microbial cell.
  • a culture refers to a state in which the microorganism is present together with a medium that supports the survival and growth of the microorganism.
  • a liquid medium containing microorganisms is a culture.
  • microbial cell is used as a term indicating the microorganism itself.
  • a microbial cell refers to the microbial cell collect
  • microbial cells can be recovered from the liquid medium by centrifugation. By washing the cells recovered from the culture, the medium components on the surface of the cells can be removed.
  • the enzyme active substance can be brought into contact with the substrate compound as it is or immobilized.
  • Various methods are known for immobilizing microbial cells or processed products thereof.
  • the following methods are known as immobilization methods for microorganisms and processed products thereof.
  • Polyacrylamide method Sulfur-containing polysaccharide gel method ( ⁇ -carrageenan gel method, etc.) Alginate gel method Agar gel method Ion exchange resin method
  • a microorganism and its treated product can be brought into contact with a substrate compound to be reacted.
  • the stereoselective imine reduction reaction by the microorganism in the present invention is performed by culturing the microorganism under an appropriate culture condition in which the enzyme is induced, and the obtained culture solution, or the cells collected from the culture solution or the cells. It can be carried out by adding an imine derivative as a reaction substrate to the treated product and incubating. Further, an imine stereoselective reduction reaction can be carried out while culturing by adding an imine derivative as a substrate at the start of culture of the microorganism or during the culture.
  • the microorganism is cultured under an appropriate culture condition in which an enzyme is induced, and the obtained culture solution, or the cells collected from the culture solution or the treated cells thereof are used.
  • a stereoselective reduction reaction can be performed by adding a reaction substrate. Further, it can be carried out in parallel with the culture for 1 to 7 days at the same pH and temperature range as the culture conditions.
  • reaction conditions the following conditions can be shown, for example. pH 4.0 to 9.0, preferably pH 6.0 to 8.0, A temperature of 15 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., The reaction time is contacted for 4 hours to 7 days.
  • the culture and reaction of microorganisms are performed separately, it is possible to minimize the introduction of impurities in the medium into the reaction system. As a result, advantageous results can be expected in the purification of the product after the reaction.
  • a more efficient reaction can be expected by performing the reaction in the presence of saccharides or the like as a source of reduction energy.
  • the compound added as a reducing energy source can be added according to the amount of the imine derivative as a reaction substrate. More specifically, the following reducing energy sources can be used.
  • Sugars Glucose, glucose-6-phosphate, sucrose, etc.
  • Organic acids Malic acid, citric acid, formic acid, etc.
  • Amino acids Alanine, glutamic acid, lysine, etc.
  • Alcohol Ethanol, isopropanol, etc.
  • Other inorganic compounds such as phosphorous acid May be available as
  • the reduction reaction in the present invention proceeds in the presence of a hydrogen donor. Therefore, the conditions under which the substrate compound can be reduced in the present invention can be provided by incubating the substrate compound and the enzyme active substance in the presence of a hydrogen donor. Any hydrogen donor can be used as long as it assists the reduction reaction in the present invention.
  • a preferred hydrogen donor in the present invention is NADPH or NADH. When using the imine reductase derived from Streptomyces sp. GF3546 and the homologues thereof or the enzyme active substances that have been successfully isolated by the present inventors, NADPH is preferably used.
  • NADP + produced from NADPH in association with the above reduction reaction to NADPH can be performed using NADP + reducing ability (such as glycolysis, methylotrophic C1 compound utilization pathway) of microorganisms.
  • NADP + reducing ability can be enhanced by adding glucose, ethanol, or the like to the reaction system.
  • it can also carry out by adding the microorganisms which have the capability to produce
  • microorganisms containing glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, organic acid dehydrogenase (malate dehydrogenase, etc.), processed products thereof, and partially purified or purified enzymes can be used for NADPH. Playback can be performed.
  • the components constituting the reaction necessary for NADPH regeneration are added to the reaction system for the production of the optically active amine according to the present invention, the immobilized one is added, or the membrane can be exchanged for NADPH. Can be contacted.
  • glucose dehydrogenase derived from Bacillus subtilis or Thermoplasma acidophilum can be used as an NADPH regeneration enzyme, specifically, imine reductase and Bacillus subtilis
  • pSG-S2MP which is a recombinant vector into which the gene for glucose dehydrogenase is introduced, is preferably used.
  • the reaction time may be shortened if a surfactant is added to the reaction solution.
  • the surfactant used for this purpose is not particularly limited as long as it enhances the permeability of the cell walls of living cells, and is cetylpyrimidinium bromide, cetyltrimethylammonium bromide, Triton X-100, paraisooctyl. Phenyl ether, Tween 80, Span 60 and the like can be mentioned, and it is preferable to use about 0.0001 to 1% with respect to the reaction solution. Moreover, the same effect may be expected by adding an organic solvent to the reaction solution.
  • the surfactant used for this purpose is not particularly limited as long as it increases the permeability of the cell wall of viable cells, and examples thereof include organic solvents such as toluene and xylene. It is preferable to use about 1%.
  • cells that have been improved in cell wall permeability by collecting cells and pretreating them with water or a buffer containing a surfactant and an organic solvent may be used without adding them to the reaction solution.
  • the imine derivative which is a reaction substrate in the present invention, can be used at an appropriate concentration so that a target product can be efficiently generated.
  • the imine derivative may be toxic to the bacterial cells and the enzyme that catalyzes the reaction, and high concentration reaction may not always lead to efficient production, and therefore requires attention.
  • the concentration of the imine derivative in the reaction solution can be, for example, 0.05 to 50% w / v, preferably 0.1 to 10% w / v.
  • the imine derivative can be added by any method such as batch (batch method), divided addition (fed batch method) or continuous addition (feed method). Furthermore, without adding imine as a substrate, ketone and amine as imine raw materials can be added to the reaction solution to produce imine in the reaction solution and supplied as a substrate.
  • the imine derivative added When the imine derivative added is handled in an inert gas atmosphere, coloring can be suppressed and an improvement in product quality can be expected. In anticipation of such an effect, the raw material can be added to the reaction solution in an inert gas atmosphere. Further, coloring can be prevented by carrying out the enzyme reaction in an inert gas atmosphere.
  • the inert gas used here for example, nitrogen, argon, helium, or the like can be used.
  • nitrogen is an inert gas that can be easily obtained.
  • argon has a higher specific gravity than air and therefore does not diffuse easily. Therefore, even in an open operation, the environment under an inert gas atmosphere can be maintained, which is advantageous in terms of operation.
  • the present invention includes a step of recovering an optically active amine derivative obtained by contacting a substrate compound with an enzyme active substance.
  • the optically active amine derivative can be isolated from the reaction solution by combining various chromatographies and crystallization by stereoselective reduction of the imine derivative.
  • the optically active amine derivative accumulated in the reaction solution can be extracted with, for example, the following solvent. Ethyl acetate, Butyl acetate, toluene, Xylene, Hexane, Heptane, Methyl isobutyl ketone, Methyl-t-butyl ether, Organic solvents such as halogens
  • the extracted amine derivative can be further purified by the following chromatography. Prior to purification, treatment with acid or alkali, dehydration with a dehydrating agent, or the like can be combined as necessary. Ion exchange chromatography, Adsorption chromatography
  • the optically active amine derivative can be collected by removing insoluble substances such as bacterial cells from the reaction solution by centrifugation, followed by solvent extraction under alkaline conditions and concentration under reduced pressure.
  • the liquid from which insoluble substances such as bacterial cells have been removed is adsorbed on an ion exchange resin capable of adsorbing amine derivatives and eluted with an alkali such as ammonia water, sodium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide methanol solution or sodium hydroxide ethanol solution. Then, a highly concentrated solution can be obtained simply.
  • the liquid from which insoluble substances such as bacterial cells have been removed is adsorbed on an ion exchange resin or the like that can adsorb amine derivatives.
  • the optically active amine derivative can be collected as crystals by subjecting it to hydrochloric acid chloride with hydrochloric acid after solvent extraction.
  • the solvent may be concentrated under reduced pressure, or the solvent may be replaced with a solvent having good crystallinity.
  • the solvent can be concentrated under reduced pressure, or the solvent can be replaced with a solvent having good crystallinity.
  • the optical purity may be increased by collecting the optically active amine derivative as a salt crystal with an acid. After solvent extraction, the optically active amine derivative can be collected as crystals by chlorinating with hydrochloric acid.
  • a mineral acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, or an organic acid such as mandelic acid, citric acid or tartaric acid can be used.
  • the salt of the amine derivative thus obtained is dissolved in a strong acid or strong alkali, then neutralized with a suitable alkali or acid, and neutralized, and easily separated from other impurities. Can do.
  • a mineral acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid
  • NaOH aqueous solution and ammonia water can be utilized for strong alkaline aqueous solution.
  • silica gel column chromatography which melt
  • a suitable developing phase for example, butanol, acetic acid, or a mixed solvent thereof with water can be used.
  • Example 1 (Screening) Liquid medium prepared to pH 7.3 comprising yeast extract 4 g / L, malt extract 10 g / L, glucose 4 g / L, ferric sulfate heptahydrate 5 mg / L, 2-methyl-1-pyrroline 1 g / L was dispensed in an amount of 4 mL into an 18 mm ⁇ test tube and sterilized by heating in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes.
  • one platinum loop of the strains shown in Table 1 below was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. for 2 to 6 days.
  • GITC 2,3,4,6-tetra-o-acetylglucopyranosyl isothiocyanate
  • GF3546 The microbiological characteristics of GF3546 are summarized in Table 2.
  • Table 2 GF3546 was identified by analysis of 16S-rDNA.
  • the base sequence of 16S-rDNA was analyzed with MicroSeq Full Gene 16S rDNA PCR / Sequencing kit (ABI). The analysis operation followed the kit instructions.
  • the obtained base sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Example 3 Synthesis of (S) -2-methylpyrrolidine by GF3546 Yeast extract 20 g / L, meat extract 30 g / L, NZ amine 10 g / L, glucose 20 g / L, ferric sulfate heptahydrate 1 mg / L, Manganese chloride tetrahydrate 1 mg / L, Zinc sulfate heptahydrate 1 mg / L liquid medium prepared to pH 7.3 was dispensed into shake flasks 40 mL at a time in an autoclave at 121 ° C. And sterilized by heating for 15 minutes.
  • GF 3546 was inoculated, and cultured with shaking at 28 ° C. for 72 hours. Bacteria were collected from the obtained culture broth by filtration, added with 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 30 mM 2-methyl-1-pyrroline and 2% glucose, and reacted at 25 ° C. with shaking. After the reaction, the reaction was converted to GITC according to Example 1 and then analyzed by HPLC. The results are shown in FIG. After 72 hours of reaction, it was confirmed that 27.5 mM (S) -2-methylpyrrolidine was generated with a selectivity of 97% ee.
  • the optical purity measurement method is as follows.
  • Example 4 Purification of imine reductase from GF3546
  • the GF3546 strain was cultured by the method of Example 3 and cells were prepared by filtration. The obtained wet cells were suspended with 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), and crushed with a bead beater (Biospec). The cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. Protamine sulfate was added to the cell-free extract, and a nucleic acid-depleted supernatant was obtained by centrifugation.
  • DTT dithiothreitol
  • PMSF mM phenylmethanesulfonyl fluoride
  • the reaction is carried out at 30 ° C. in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 0.2 mM NADPH, 10 mM 2-methyl-1-pyrroline and the enzyme, and the decrease in absorbance at 340 nm accompanying the decrease in NADPH is measured.
  • 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the decrease of 1 ⁇ mol NADPH per minute.
  • the concentrated enzyme solution was dialyzed against a standard buffer solution and then added to MonoQ 16/10 equilibrated with the same buffer solution, followed by gradient elution from 0M to 0.5M sodium chloride.
  • the fraction with the highest specific activity among the eluted active fractions was analyzed by SDS-PAGE, and as a result, it was a single band.
  • the specific activity of the purified enzyme was 120 mU / mg.
  • a summary of the purification is shown in Table 3.
  • Example 5 Synthesis of (S) -2-methylpyrrolidine by imine reductase 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 40 mM NADPH, 20 mM 2-methyl-1-pyrroline and the enzyme obtained in Example 4 The reaction was carried out overnight at 25 ° C. The produced 2-methylpyrrolidine was quantitatively and measured for optical purity according to Example 3. As a result, 2-methylpyrrolidine produced by this enzyme was 92.7% ee in S form. The reaction yield was 77.5%.
  • Example 6 Molecular weight measurement of imine reductase The molecular weight of the subunit of the enzyme obtained in Example 4 was determined by SDS-PAGE to be about 30,500. The molecular weight was measured using a Superdex 200 gel filtration column and found to be about 81,500.
  • Example 7 Optimum pH of imine reductase Reducing activity of 2-methyl-1-pyrroline of the enzyme obtained in Example 3 by changing pH using potassium phosphate buffer, Tris-HCl buffer, glycine-potassium chloride-potassium hydroxide buffer
  • the oxidation activity of (S) -2-methylpyrrolidine was examined and expressed as a relative activity with the maximum activity as 100, which is shown in FIG. 3 and FIG.
  • the optimum pH for the reduction reaction was 7.4 to 8.0, and the optimum pH for the oxidation reaction was 10.5.
  • the oxidation activity of (S) -2-methylpyrrolidine was measured by changing only the pH of the following standard measurement method.
  • Example 8 Optimum temperature of imine reductase The enzyme obtained in Example 4 was measured for the reductive activity of 2-methyl-1-pyrroline by changing only the temperature of the imine reduction standard reaction conditions. The activity is expressed as relative activity with 100 as shown in FIG. It was 35 ° C. to 45 ° C. that showed 80% or more of the maximum activity.
  • Example 9 Substrate specificity of imine reductase The enzyme obtained in Example 4 was reacted with various imine compounds, and the activity of the reduction reaction was defined as relative activity with the reduction of 2-methyl-1-pyrroline as 100. And shown in Table 4. Table 4: Substrate specificity of imine reductase
  • Example 10 Partial amino acid sequence of imine reductase Using the enzyme obtained in Example 9, the N-terminal amino acid sequence was analyzed by a protein sequencer. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4. Further, a gel fragment containing imine reductase was excised from the SDS-PAGE gel, washed twice, and then in-gel digested at 35 ° C. overnight using trypsin. The digested peptides were separated and fractionated by reverse-phase HPLC (TSO gel ODS-80-Ts, manufactured by Tosoh Corporation, 2.0 mm ⁇ 250 mm) by gradient elution of acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid.
  • reverse-phase HPLC TSO gel ODS-80-Ts, manufactured by Tosoh Corporation, 2.0 mm ⁇ 250 mm
  • T61 The collected peptide peak was designated as T61, and the amino acid sequence was analyzed with a protein sequencer (Hewlett Packard G1005A Protein Sequencer System).
  • the amino acid sequence of T61 is represented by SEQ ID NO: 5.
  • Example 11 Purification of chromosomal DNA from Streptomyces sp. GF 3546 GF3546 was cultured by the method of Example 3 to prepare bacterial cells. Purification of chromosomal DNA from the bacterial cells was performed by the method described in J. Dairy Sci., 75, 1186-1191 (1992).
  • Example 12 Cloning of core region of imine reductase gene A sense primer and an antisense primer were synthesized based on the amino acid sequences of N-terminal and T61, respectively. The respective base sequences are shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7. Using 50 ⁇ L of each primer containing 50 pmol, dNTP 10 nmol, Streptomyces sp.
  • GF 3546-derived chromosomal DNA 50 ng, Ex-Taq buffer (Takara Bio), 5% DMSO, Ex-Taq 1U (Takara Bio) Denaturation (94 ° C., 30 seconds), annealing (45 ° C., 30 seconds), and extension (70 ° C., 1 minute 5 seconds) were performed for 30 cycles using GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).
  • GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems.
  • a band considered to be specific around 900 bp could be detected.
  • the base sequence of this DNA fragment was analyzed, and the determined base sequence of the core region was shown as SEQ ID NO: 8.
  • Example 13 Analysis of nucleotide sequence around the core region of imine reductase gene Chromosomal DNA derived from Streptomyces sp. GF 3546 was digested with restriction enzyme SacI, and each ligation was performed overnight at 16 ° C using T4 ligase. The fragment was cyclized.
  • GF 3546-derived chromosomal DNA 50 ng, Pfu Turbo-DNA Polymerase buffer (STRATAGENE), 5% DMSO, Pfu Turbo-DNA Polymerase 1.9 U (STRATAGENE) 50 ⁇ L 30 cycles of denaturation (98 ° C, 30 seconds), annealing (60 ° C, 1 minute), extension (72 ° C, 1 minute 10 seconds), GeneAmp PCR System 9700 (manufactured by Applied Biosystems) Used. The obtained DNA fragment was purified and recovered by GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by GE Healthcare).
  • the DNA fragment was double-digested with restriction enzymes BspHI and XbaI, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the target band was excised and purified by GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by GE Healthcare).
  • the obtained DNA fragment was ligated using pSE420D (plasmid modified from multi-cloning site of plasmid vector pSE420 manufactured by Invitrogen, JP 2000-189170) double-digested with NcoI and XbaI and Takara Ligation Kit.
  • the JM109 strain was transformed.
  • the transformed strain was grown in an LB medium containing ampicillin, a plasmid was extracted from the grown transformant, and a plasmid in which the imine reductase gene was confirmed to be inserted was designated as pSUS2MP1.
  • the process of plasmid construction is shown in FIG.
  • Example 15 Evaluation of activity of recombinant imine reductase E. coli JM109 strain transformed with plasmid pSUS2MP1 expressing imine reductase was cultured overnight at 30 ° C in liquid LB medium containing ampicillin, and 0.1 mM IPTG was added. The culture was further performed for 4 hours. The cells are collected by centrifugation, suspended in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM DTT, and the cells are removed using a sealed ultrasonic crusher UCD-200TM (manufactured by Cosmo Bio). It was crushed. The cell disruption solution was centrifuged, and the supernatant was recovered as a cell extract. Further, E.
  • Example 16 Construction of plasmid pSG-S2MP that co-expresses imine reductase and Bacillus subtilis-derived glucose dehydrogenase PCR was performed in the same manner as in Example 14, and the amplified DNA fragment containing imine reductase was converted into BspHI, Double digested with XbaI. Next, a plasmid pSE-BSG1 (Japanese Patent Laid-Open No.
  • Example 17 Simultaneous expression of imine reductase and glucose dehydrogenase by Escherichia coli E. coli strain JM109 transformed with pSG-S2MP was cultured overnight at 30 ° C in a liquid LB medium containing ampicillin, and 0.1 mM IPTG was added. The culture was further performed for 4 hours. The cells are collected by centrifugation, suspended in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM DTT, and the cells are removed using a sealed ultrasonic crusher UCD-200TM (manufactured by Cosmo Bio). It was crushed.
  • 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.0
  • UCD-200TM manufactured by Cosmo Bio
  • the cell disruption solution was centrifuged, the supernatant was collected as a cell extract, and the imine reduction activity and glucose dehydrogenation activity against 2-methyl-1-pyrroline were measured. The results are shown in Table 5.
  • the glucose dehydrogenation activity was measured at 30 ° C. in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 2.5 mM NADP +, 100 mM glucose, and a cell extract. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 ⁇ mol NADPH per minute under the above reaction conditions.
  • Example 18 Production of (S) -2-methylpyrrolidine by recombinant E. coli E. coli strain JM109 transformed with pSG-S2MP was cultured overnight at 30 ° C in 5 mL of liquid LB medium containing ampicillin to give 0.1 mM IPTG. Was added and further cultured for 4 hours. The cells were collected by centrifugation, then suspended in 1 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 50 mM 2-methyl-1-pyrroline and 100 mM glucose, and shaken at 25 ° C. overnight.
  • 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.0
  • the present invention provides a method for efficiently producing an optically active amine derivative by stereoselective reduction using the reducing ability of microorganisms. Since the method of the present invention can be expected to have high stereoselectivity, it is industrially advantageous.
  • the optically active amine derivative produced by the present invention is useful as a raw material for synthesizing optically active pharmaceuticals.
  • (S) -2-methylpyrrolidine is a useful compound as a pharmaceutical raw material.

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Abstract

　イミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の培養物、菌体またはその処理物を作用させ、生成する光学活性なアミン誘導体を回収することにより、光学活性なアミン誘導体が製造される。 　本発明によって得られる光学活性なアミン誘導体は、医薬の合成原料として有用である。本発明によって、たとえば下記式(IV)で示される光学活性な化合物を製造することができる。 （式中、Ｒ基は炭素数１～３個のアルキル基を、ｎは１～４の整数を表す）

Description

光学活性なアミン誘導体を製造するための方法
　本発明は、イミン誘導体を立体選択的に還元することによって各種医薬品の原料あるいは合成中間体として利用されている光学活性なアミン誘導体を製造する方法に関する。
　イミン誘導体の立体選択還元による光学活性なアミン誘導体の製造方法としては、次のような報告を除いてほとんど知られていない。
－非特許文献1；Tetrahedron Asymmetry, 19, 93,96（2008）－
　キャンディダ・パラプシロシスによるＮ－フェニル－１－フェニルエチルアミン誘導体の還元
　ただし、これらの公知技術においては、Ｎ－ベンジリデンベンジルアミンの還元生成物がキラルな構造ではないため、反応の立体選択性は不明である。また、Ｎ－（（Ｅ）－Ｎ－（１－フェニルエチリデン）アニリン誘導体のキャンディダ・パラプシロシスによる還元反応は極めて弱いため、工業的な利用には適さない。また、該イミン還元反応を行う酵素の実態は全く不明である。
　また、２－メチルピロリジンの製法としては、次のような方法が知られている。
　－非特許文献２；Acta. Pharm. Suec., 1978, 15, 255-263－
　２－メチル－１－ピロリンを水素化ホウ素ナトリウムによって還元し、ラセミ２－メチルピロリジンとした後、酒石酸を用いた光学分割により、キラル－２－メチルピロリジンを得る方法
　－非特許文献３；J. Org. Chem., 1989, 54, 209-216－
　Ｌ－プロリンから誘導されるＬ－プロリノールの水酸基を塩化チオニルでクロロ基に変換し、窒素原子をベンジルオキシカルボニル基により保護した後、水素化トリブチル錫を用いてラジカル的に還元することにより、（Ｒ）－１－ベンジルオキシカルボニル－２－メチルピロリジンを製造し、さらに脱保護する方法
　－特許文献１；ＷＯ２００５／０７３３８８号公報－
　光学活性１，４－ペンダンジオールをジスルホナートとした後、アミンと反応させて環化し、２－メチルピロリジンを得る方法
　しかし、いずれの方法にも、次のような問題点が伴う。
－工程が長い
－危険な水素化試薬を使用する
－分割方法によって得るため収率が５０％を超えない
Tetrahedron Asymmetry, 19, 93,96（2008） Acta. Pharm. Suec., 1978, 15, 255-263 J. Org. Chem., 1989, 54, 209-216
ＷＯ２００５／０７３３８８号公報
　本発明の課題は、イミン誘導体から光学活性なアミン誘導体を製造するための方法を提供することである。更に本発明は、イミン誘導体を基質として光学活性なアミン誘導体を生成することができる微生物、あるいは酵素の提供を課題とする。更に本発明は、目的とする性状を備えた該酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換え体として得ることを課題とする。加えて、組換え体による光学活性アミン誘導体の製造方法の提供をも課題とするものである。
　本発明者らは、このような高度な要求を満足する方法を鋭意検討した。そして微生物の有する立体選択的な還元能力を利用して、イミン誘導体を立体選択的に還元することにより、光学活性なアミン誘導体を生成させうることを見出した。
　既に述べたように、イミン誘導体を立体選択的に還元する生合成に関与する酵素は知られている。しかし公知の酵素はいずれも代謝に関与する酵素である。そのため医薬品の中間体などの製造に応用した場合には、工業的な生産に求められる基質特異性や活性は期待できない。特に２－メチル－１－ピロリンなどの環状アルキルイミン誘導体を還元して、光学活性環状アルキルアミン誘導体を得る方法は、まったく知られていなかった。
　したがって、医薬品の中間体などの製造に好適な基質特異性や触媒活性を備えた微生物が見出されたことは、非常に意外な成果であった。更に驚くべきことに、微生物が有する立体選択的なイミンの還元能力は、十分に高く、工業的な利用に際し問題の無いレベルであった。たとえば、ストレプトマイセス・エスピー ＧＦ３５４６（Streptomyces sp. GF3546）は前記の課題を解決するための有用な性質を備えた微生物であることが見出された。更に本発明者らは、ＧＦ３５４６を大量培養し、無細胞抽出液を調製した後、次の工程を経てイミン還元酵素を高度に精製することに成功した。
－Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた疎水クロマトグラフィー、および
－ＭｏｎｏＱを用いたイオン交換クロマトグラフィー
　更に、イミン還元酵素をコードするＤＮＡを単離し、当該酵素を高発現する組換え菌を造成し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の光学活性アミンの製造方法を提供する。あるいは本発明は、当該方法に有用な微生物、あるいはイミン還元酵素、当該酵素をコードするＤＮＡを含むポリヌクレオチド、当該酵素の製造方法に関する。
〔１〕次の（１）～（５）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素；
（１）作用：還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略す）依存的に、２－メチル－１－ピロリンを還元し、（Ｓ）－２－メチルピロリジンを生成する。ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋と略す）依存的に、（Ｓ）－２－メチルピロリジンを酸化し、２－メチル－１－ピロリンを生成する；、および
（２）補酵素依存性：還元反応の補酵素としてＮＡＤＰＨを利用する。酸化反応の補酵素としてＮＡＤＰ＋を利用する。
（３）至適ｐＨ：還元反応は７．４～８．０、酸化反応は１０．５
（４）至適温度：還元反応は３５～４５℃
（５）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと略す）が約３０，５００、ゲルろ過による分子量が約８１，５００。
〔２〕〔１〕の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、イミン還元酵素。
（ａ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔３〕式（I）で示されるイミン誘導体に、〔１〕又は〔２〕に記載のイミン還元酵素、当該イミン還元酵素を生産する微生物、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１～３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１～３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
〔４〕
　式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１～３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１～３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
〔５〕
　式（Ｉ）の化合物が下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体であり、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＶ）で表されるアミン誘導体である〔１〕に記載の方法。
式（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 式（ＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式中Ｒ基は炭素数１～３個のアルキル基を、ｎは、１～４の整数を表す）
〔６〕
　式（ＩＩＩ）の化合物が２－メチル－１－ピロリンであり、式（ＩＶ）で表される化合物が、２－メチルピロリジンである〔５〕に記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法
〔７〕
　微生物が、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物であることを特徴とする〔４〕から〔６〕のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
〔８〕
　微生物が、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）であることを特徴とする〔４〕から〔６〕のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
〔９〕
　微生物が、ストレプトマイセス・エスピー NITE P-593（Streptomyces sp. NITE P-593）であることを特徴とする〔４〕から〔６〕のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
〔１０〕
　〔１〕の（１）および（２）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔１１〕
　〔１０〕に記載されたポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
〔１２〕
　更に、ＮＡＤＰ＋を補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、〔１１〕に記載された組換えベクター。
〔１３〕
　脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である、〔１２〕に記載のベクター。
〔１４〕
　グルコース脱水素酵素がバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来する、〔１２〕に記載の組換えベクター。
〔１５〕
　〔１０〕に記載されたポリヌクレオチド、または〔１２〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔１６〕
　〔１５〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔１０〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の製造方法。
　本発明により、微生物の還元能を使用したイミンの立体選択的還元により、（Ｓ）体光学活性アミンを効率的に製造する方法が提供された。また、該反応を担うイミン還元酵素が提供された。さらに、イミン還元酵素をコードするＤＮＡを単離し、当該酵素を高発現する組換え菌が提供された。本発明の方法は、安価に合成可能なイミン誘導体を基質とし、微生物の高い立体選択性を利用して、光学活性アミンが合成できるため、工業的に有利である。本発明は、特に、（Ｓ）－２－メチルピロリジンの製造に有用である。（Ｓ）－２－メチルピロリジンは、医薬品を合成するための中間体として有用な化合物である。本発明によって、当該化合物を微生物や酵素の作用によって簡便にかつ効率的に製造することが可能となった。
ストレプトマイセス sp. GF3546の１６Ｓ－ｒＤＮＡの塩基配列（配列番号：１）に基づいて作成した分子系統樹を示す図である。 ストレプトマイセス sp. GF 3546による２－メチル－１－ピロリン（２－ＭＰＮ）の還元反応の結果を示すグラフである。縦軸は（Ｓ）－２－メチルピロリジンの製造量（ｍＭ）を示し、横軸は反応時間（時間）を示す。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素の至適ｐＨ（還元反応）を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い活性が見られた活性値を１００とする相対活性（％）を、横軸は酵素反応液のｐＨを示す。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素の至適ｐＨ（酸化反応）を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い活性が見られた活性値を１００とする相対活性（％）を、横軸は酵素反応液のｐＨを示す。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素の至適温度（還元反応）を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い活性が見られた活性値を１００とする相対活性（％）を、横軸は酵素反応液の温度（℃）を示す。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素遺伝子が挿入されたプラスミド（ｐＳＵＳ２ＭＰ１）の構築の過程を示した図である。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素遺伝子と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子が挿入されたプラスミド（ｐＳＧ－Ｓ２ＭＰ）の構築の過程を示した図である。
　本発明は、前記式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の培養物、菌体およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法に関する。
式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１～３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１～３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）。
本発明において、環状イミン化合物は式（Ｉ）の化合物として好ましい。本発明において、環状イミン化合物は、たとえば下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体を含む。
式（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、Ｒ基は炭素数１～３個のアルキル基を、ｎは、１～４の整数を表す）。
　上記式（ＩＩＩ）の化合物を基質として用いた場合、光学活性アミン誘導体として式（ＩＶ）に示される化合物を得ることができる。当該化合物は、本発明によって製造することができる好ましい光学活性アミン誘導体である。
式（ＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　（式中、Ｒ基は炭素数１～３個のアルキル基を、ｎは、１～４の整数を表す）。
　本発明における好ましい化合物は、前記式（ＩＩＩ）において、たとえばＲがメチル基、エチル基、あるいはプロピル基であり、ｎが２～３の化合物である。より具体的には、本発明における好ましいイミン誘導体として次の化合物を示すことができる。
２－メチル－１－ピロリン
２－メチル－１－ピペリデイン
２－エチル－１－ピロリン
２－エチル－１－ピペリデイン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　これらの化合物を基質として、それぞれ以下の光学活性アミン誘導体を製造することができる。
２－メチル－１－ピロリン　　　→　（Ｓ）－２－メチルピロリジン
２－メチル－１－ピペリデイン　→　（Ｓ）－２－メチルピペリジン
２－エチル－１－ピロリン　　　→　（Ｓ）－２－エチルピロリジン
２－エチル－１－ピペリデイン　→　（Ｓ）－２－エチルピペリジン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　本発明において、イミン誘導体を立体選択的に還元しうる能力とは、前記式（Ｉ）望ましくは式（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を基質として、Ｓ体のアミン誘導体を生成する能力を言う。本発明の微生物は、Ｓ体のアミン誘導体を生成しうる微生物であれば、任意の微生物を用いることができる。本発明に用いる微生物は、たとえば以下に示すような属に属する微生物について、Ｓ体のアミン誘導体を生成する能力を比較することにより得ることができる。
　たとえば、化合物（Ｉ）望ましくは化合物（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を含む培地中で被験微生物を培養し、その培養物中に生成した光学活性アミン誘導体の光学純度を測定する。その結果、光学活性な（Ｓ）－アミン誘導体の生成が確認できれば、当該微生物を本発明に用いることができる。
　あるいは予め培地中で増殖させた被験微生物を集菌し、適当な緩衝液中に懸濁させる。更に化合物（Ｉ）望ましくは化合物（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体と接触、反応させて、この緩衝液中に生成される光学活性アミン誘導体の光学純度を測定する。光学活性なアミン誘導体の生成が確認できれば、当該微生物を本発明に用いることができる。このとき、被験微生物の培養時に、培地中に化合物（Ｉ）望ましくは化合物（ＩＩＩ）を加えておけば、この化合物を還元するための酵素の誘導が期待できる。更に反応時に還元エネルギー源を加えておけば、より効果的な生成物の蓄積が期待できる。還元エネルギー源としては、通常、グルコースなどを用いることができる。
　例えば、微生物を必要に応じて２－メチル－１－ピロリンを含む適当な培地で培養し、得られた微生物菌体を、１０ｍＭ ２－メチル－１－ピロリン、２５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、及び必要に応じてグルコースを含む反応液に懸濁し、２５℃で２４時間振盪し、生成物をＴＬＣもしくはＨＰＬＣにより分析することにより、微生物の２－メチル－１－ピロリン還元能を確認することができる。
　ＴＬＣの条件としては、例えば、Silica gel 60 F254 プレートを用い、１－ブタノール／酢酸／水＝２／１／１の展開液で展開し、ニンヒドリンにより呈色する方法が挙げられる。
　生成したアミン誘導体の光学純度は、例えば以下の方法により測定することができる。
　被検サンプル５０μＬに以下の成分を添加して、４０℃、１時間反応することにより生成したアミンをＧＩＴＣ化し、ＨＰＬＣにより分離し定量する。
　２ｍｇ／ｍＬ トリエチルアミン　５０μＬ、および
　８ｍｇ／ｍＬ ２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）　１００μＬ
　ＨＰＬＣの条件としては、例えば、以下のような条件を用いることができる。
－ＨＰＬＣカラム：和光純薬株式会社製 Wakosil II 5C18（4.6mmx150mm）
－溶離液：１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）：メタノール＝５５：４５
－流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
－検出：２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収
　上記条件下で、（Ｒ）－２－メチルピロリジンは２６．３分に、（Ｓ）－２－メチルピロリジン誘導体は２４．９分に溶出される。
　光学純度の高い生成物を得るには、より選択性の高い微生物を用いることが有利であることは言うまでも無い。具体的には、その立体選択性は、たとえば６０％、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の、光学活性なＳ体のアミン誘導体を生成しうる微生物を用いることができる。
　本発明における「光学活性なアミン誘導体」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるアミン誘導体を言う。本発明において、好ましい光学活性なアミン誘導体は、たとえば６０％、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の光学純度（enantiomeric excess；ｅｅ）を有する。光学活性なアミン誘導体の光学純度は、たとえば光学分割カラムなどを用いて確認することができる。本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」（enantiomeric）と呼ばれる場合もある。
　たとえばストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物は、前記式（Ｉ）で示されるイミン誘導体を還元し、Ｓ体のアミン誘導体を生成する。
　さらに具体的には、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物として、次の微生物を示すことができる。この微生物は、本発明において高い光学純度の（Ｓ）アミン誘導体を生成する好ましい微生物である。
ストレプトマイセス・エスピーＧＦ３５４６（Streptomyces sp. GF3546）
　上記の微生物は、次のとおり寄託されている（受託日；２００８年６月２４日）。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８
（３）識別のための表示および受託番号：
ストレプトマイセス・エスピーＧＦ３５４６（Streptomyces sp. GF3546）；受託番号　NITE　P-593
　さらにこれらの微生物は、ブダペスト条約に基づく国際寄託に、次のとおり移管されている。
（１）国際寄託当局：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（２）住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８
（３）識別の表示および受託番号
ストレプトマイセス・エスピー GF3546（Streptomyces sp. GF3546）
　　　；受託番号　NITE　BP-593 （移管日２００９年８月４日）
　本発明において、前記式（Ｉ）あるいは（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を立体選択的に還元する能力を有する微生物は、これらの寄託菌株のみならず、種々の微生物資源(microbiological resource)からも見出すことができる。微生物資源には、自然環境から単離される微生物群、微生物寄託機関に保存された微生物菌株などが含まれる。中でも、ストレプトマイセス属に属する微生物は、本発明において、前記式（Ｉ）あるいは（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を立体選択的に還元する能力を有する微生物として好ましい。したがって、たとえば、微生物寄託機関に保存されたストレプトマイセス属微生物を対象として、先に述べたような選択方法によって、目的の作用を有する微生物を選択することができる。寄託された微生物は、たとえば次のような寄託機関から分譲を受けることができる。
生物遺伝資源センター (NBRC)
理化学研究所 (JCM)
東京農業大学菌株保存室 (IAM)
American Type Culture Collection (ATCC)
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)
　あるいはリボソーマルＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列情報に基づいて、本発明に利用しうる微生物を選択することもできる。一般にｒＤＮＡの塩基配列情報は、生物間の遺伝学的な近さを表す指標として有用であることが広く知られている。特に１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（以下、「１６Ｓ ｒＤＮＡ」と記載する）は、微生物の遺伝的な同一性あるいは類似性を決定するためのツールとして活用されている。
　１６Ｓ ｒＲＮＡは、全生物に存在しており、生物間で構造の違いは見られるが、アライメント可能な程度に配列が保存されている。１６Ｓ ｒＲＮＡの生物間水平伝播の頻度は低いので、分類に使用する方法が汎用されている。
　具体的には、小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ ｒＲＮＡ）は、タンパク質合成の場であるリボソームを構成する核酸分子の１つである。その塩基配列の長さは、多少の違いはあるものの、細菌からヒトまで起源は同じものと見なされている。したがって、ｒＲＮＡの塩基配列は進化的保存性が高く、生物の系統解析において最も頻繁に利用されている（Microbiol. Rev., 58, 1-9 (1994)）。原核生物におけるＳＳＵ ｒＲＮＡ　は約１５００塩基の１６Ｓ ｒＲＮＡである。原核生物の分類と同定に１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を利用する系統分類が一般に用いられている（ASM News, 65, 752-757 (1999)、生物工学実験書ｐ１１３日本生物工学会編、培風館）。
　現在の放線菌の分類体系は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の類似性に基づいて構成されている（Stackebrandt, et al. (1997) Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 479-491）。菌株の同定においても、属レベルだけではなく種レベルにおいても１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の相同性に基づく同定が、細菌系統分類学の主流となっている（「放線菌の分類と同定」（日本放線菌学会）ｐ１９）。
　本発明者らが見出した上記の菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ中に配列番号：１に示す塩基配列を含んでいた。塩基配列情報データベースを対象として、これらの塩基配列情報を検索すれば、既に１６Ｓ ｒＤＮＡが決定された微生物の中から、その１６Ｓ ｒＤＮＡ中に同一性の高い塩基配列を含む菌株を見つけ出すことができる。たとえばDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）などの公共データベースサービス機関では、１６Ｓ ｒＲＮＡ（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）の塩基配列情報を対象とする検索サービスが提供されている。こうして見出された微生物のうち、特にストレプトマイセス属に属する微生物を選択することによって、本発明に利用しうる微生物とすることができる。必要に応じ、こうして選択された微生物のイミン誘導体に対する作用を予め確認することもできる。
　これら微生物は、醗酵学の分野で公知の方法に従って培養することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用することができる。培地は、液体培地または固体培地を使用することができる。
　具体的には、炭素源として、次に示すような一般的な炭素源より、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
　糖類：　　　　　　　　　天然炭水化物：
　グルコース、　　　　　　澱粉、
　フルクトース、　　　　　澱粉加水分解物、
　マルトース、　　　　　　糖蜜、
　ガラクトース、　　　　　廃糖蜜、
　　　　　　　　　　　　　麦、
　　　　　　　　　　　　　とうもろこしなど
　アルコール類：　　　　　有機酸類：
　グリセロール、　　　　　酢酸、
　メタノール、　　　　　　グルコン酸、
　エタノールなど　　　　　ピルビン酸、
　　　　　　　　　　　　　ケトグルタル酸、
　　　　　　　　　　　　　クエン酸など
炭化水素類：
　ノルマルパラフィンなど
脂肪類：
　パーム核油、
　大豆油、
　オリーブ油など
　窒素源としては、次に示すような一般的な窒素源の中から、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
有機窒素化合物：
　肉エキス、　　　　ペプトン、　　　　酵母エキス、
　大豆加水分解物、　ミルクカゼイン、　カザミノ酸、
　各種アミノ酸、　　コーンスティープリカー、
　その他の動物、植物、微生物の加水分解物など
無機窒素化合物：
　アンモニア、　　　硝酸アンモニウム、　　硫酸アンモニウム、
　塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、
　硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素など
　また、微生物のイミン誘導体の立体選択的還元能力を高めるために、誘導物質を用いることができる。誘導物質としては、イミン誘導体を、使用する微生物に応じて使用することができる。
　さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を培養液中に添加してもよい。
　培養は前記培地成分を含有する液体培地中で通常の培養方法を用いて行うことができる。たとえば次のような培養方法を利用することができる。
振とう培養 (shaking culture)
通気攪拌培養 (aeration-agitation culture)
連続培養 (continuous culture)
流加培養(feeding culture, fed batch culture)
　培養条件は、微生物の種類、培養の種類、培養方法により適宜選択することができる。利用する菌株が増殖し、イミン誘導体の立体選択的還元能力を有しうる条件であれば特に制限はない。一般的な培養条件として次のような条件を示すことができる。
　培養開始時のｐＨを４から１０、好ましくは６から８に調節
　１５から７０℃、好ましくは２０から４０℃の温度条件下で培養
　培養時間はイミン誘導体の還元能力を有する菌体が得ることができれば特に制限されない。通常は１日から１４日、好ましくは１日から７日培養する。
　本発明において、微生物菌体の処理物とは、菌体を目的とする酵素活性が維持される条件で処理したものを意味する。酵素活性の維持とは、生菌体で得られる酵素活性の一般的には２０％以上、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の活性を維持することを言う。生菌体とその処理物の酵素活性は、生菌体の酵素活性と、同量の生菌体から得られた処理物の酵素活性を比較することによって定量的に比較することができる。本発明における処理物は、生菌体よりも高い酵素活性を有する場合もある。
このような処理物を得る方法としては、凍結乾燥、有機溶媒による脱水乾燥、菌体の自己消化、酵素活性画分の抽出、超音波処理などを利用することができる。このような処理方法によって、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体自己消化物、菌体抽出物、菌体磨砕物、菌体の超音波処理物等を得ることができる。
これらの処理は、単独で、あるいは複数の処理を重複して適用することもできる。たとえば適当な培養液で微生物を培養後、菌体を破砕して、遠心分離等により無細胞抽出液を調製することができる。菌体は、機械的な破砕、超音波、高圧処理、酵素消化、自己消化などにより破砕することができる。無細胞抽出液は本発明における菌体の処理物に含まれる。
　更に本発明においては、当該菌体から当該反応を触媒する酵素を部分精製したものや完全に精製したものなどを得ることができる。すなわち本発明は、本発明によって提供されたイミン還元酵素活性を有する微生物の菌体から精製することができるイミン還元酵素に関する。本発明のイミン還元酵素は、次の（１）～（２）に示す理化学的性状を有する。
（１）作用：ＮＡＤＰＨ依存的に、２－メチル－１－ピロリンを還元し、（Ｓ）－２－メチルピロリジンを生成する。ＮＡＤＰ＋依存的に、（Ｓ）－２－メチルピロリジンを酸化し、２－メチル－１－ピロリンを生成する；、および
（２）補酵素依存性：還元反応の補酵素としてＮＡＤＰＨを利用する。酸化反応の補酵素としてＮＡＤＰ＋を利用する。
　本発明者らが見出したイミン還元酵素は、好ましい態様において、前記性状（１）～（２）に加えて、更に次の理化学的性状を有する。このようなイミン還元酵素は、たとえばストレプトマイセス・エスピーＧＦ３５４６から得ることができる。
（３）至適ｐＨ：還元反応は７．４～８．０、酸化反応は１０．５
（４）至適温度：還元反応は３５～４５℃
（５）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと略す）が約３０，５００、ゲルろ過による分子量が約８１，５００。
　本発明のイミン還元酵素は、上記微生物、あるいはその無細胞抽出液などから精製することができる。具体的には、次のような精製工程を適宜組み合わせることによって、無細胞抽出液から実質的に純粋なイミン還元酵素を得ることができる。
　硫安、アセトンなどを用いた溶解度による分割、
　イオン交換クロマトグラフィー、
　疎水クロマトグラフィー、
　２’，５’－ＡＤＰセファロースやブルーもしくはレッドセファロースなどを用いたアフィニティクロマトグラフィー、
　ゲル濾過
　例えば、微生物を集菌後、次のような精製工程を経て、本発明のイミン還元酵素を実質的な純粋な酵素として単離することができる。
　超音波あるいはガラスビーズによる菌体の破砕と無細胞抽出液の調製、
　Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた疎水クロマトグラフィー、および
　ＭｏｎｏＱを用いたイオン交換クロマトクロマトグラフィーによるイミン還元酵素活性分画の単離
　本発明において、「実質的に純粋」とは、当該酵素が、当該酵素以外の生物学的な高分子化合物や化学物質を実質的に含まないことを言う。当該酵素以外の生物学的な高分子化合物とは、たとえば菌体や培養液に由来するタンパク、糖類、脂質、核酸類が含まれる。本発明における実質的に純粋な酵素は、少なくとも７５％以上、通常８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、あるいは９９％以上の純度を有する。酵素の純度を決定する方法は公知である。たとえば、各種のクロマトグラフィーや、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによって蛋白質の純度を決定する方法が周知である。
　あるいは本発明によって、上記理化学的性状（１）（２）を有する単離されたイミン還元酵素が提供される。本発明において、単離されたイミン還元酵素とは、それが存在する天然の環境から分離されて存在していることを意味する。したがって、菌体から分離されたイミン還元酵素は、本発明における単離されたイミン還元酵素に含まれる。
　本発明における実質的に純粋なイミン還元酵素、あるいは単離されたイミン還元酵素は、精製、あるいは単離された後に、酵素組成物とすることもできる。たとえば、精製、あるいは単離されたイミン還元酵素を適当な担体と配合することによって、本発明のイミン還元酵素を含む酵素組成物を調製することができる。担体としては、アルブミンなどの不活性蛋白質、ショ糖などの糖類あるいは糖アルコールなどを利用することができる。酵素組成物は、液状であることもできるし、乾燥状態であることもできる。酵素と担体を含む水溶液を凍結乾燥することによって得られる酵素組成物は、本発明における好ましい組成物の一つである。
　本発明のイミン還元酵素は、以下の方法によりその活性を定量することができる。すなわち、次の組成の反応液中（１ｍＬ）で、３０℃で反応を行い、ＮＡＤＰＨの減少に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。
　　１０ｍＭ　２－メチル－１－ピロリン、
　１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、
　０．１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ及び
　酵素
１Ｕは、上記条件下、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。
　本発明は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、たとえば１００以下、通常５０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは１５以下、更に好ましくは１０以下、あるいは５以下のアミノ酸残基の変異は許容される。
　本発明は、イミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡやＲＮＡ等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であることもできる。また本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ－ＲＮＡのキメラ分子であることもできる。本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：２に示す塩基配列を含む。配列番号：２に示す塩基配列は、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明によるイミン還元酵素の好ましい態様を構成する。
　本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）～（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：２に記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
　また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）～（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：２に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system （ＧＥヘルスケア社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（wash:42℃、0.5xSSCを含むprimary wash buffer)においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
　さらに、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の同一性検索は、たとえばＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ－ＢａｎｋなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を基にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
　本発明は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）～（２）に示した物理化学的性状を有することを意味する。当業者であれば、配列番号：２記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりイミン還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのイミン還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：３に記載のイミン還元酵素のホモログを得ることが可能である。
　さらに、本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上の同一性を有するタンパク質をいう。タンパク質の同一性検索は、たとえばＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ－ＢａｎｋなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を基にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
　本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
　配列番号：２に記載の塩基配列を基にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
　さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
　また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」ｐ２５－３３、ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
　なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
　このようにして単離された、本発明によるイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、イミン還元酵素発現ベクターが提供される。
　また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のイミン還元酵素を組換え体から得ることができる。
　本発明においてイミン還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、イミン還元酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、イミン還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
　形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＰＨを電子供与体とするイミン還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
　そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’－側上流に、より好ましくはターミネーターを３’－側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
　例えば、エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドを利用でき、ｌａｃ（β－ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開２０００－１８９１７０に記載）が好適に利用できる。
　バチルス属においては、ベクターとしてｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α－アミラーゼ）などが利用できる。
　シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平５－２８４９７３）遺伝子などが利用できる。
　ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、ｐＡＪ４３（Gene 39, 281 (1985)）などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
　コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、ｐＣＳ１１（特開昭５７－１８３７９９）、ｐＣＢ１０１（Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
　ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、ｐＨＶ１３０１（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、ｐＧＫ１（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
　ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたｐＡＭβ１（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
　ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクターが使用可能である（J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992)）。
　ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、ＨｏｐｗｏｏｄらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、ｐＩＪ４８６（Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、ｐＫＣ１０６４（Gene 103,97-99 (1991)）、ｐＵＷＬ－ＫＳ（Gene 165,149-150 (1995)）が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997)）。
　サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（ＥＰ５３７４５６など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）、ＰＨＯ（酸性フォスファターゼ）、ＧＡＬ（β－ガラクトシダーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＥＮＯ（エノラーゼ）などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
　クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来２μｍ系プラスミド、ｐＫＤ１系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するｐＧＫｌ１由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子ＫＡＲＳ系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（ＥＰ　５３７４５６など）などが利用可能である。また、ＡＤＨ、ＰＧＫなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
　シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＲＳ（自律複製に関与する遺伝子）及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＤＨプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、ｐＡＵＲ２２４は、タカラバイオから市販されており容易に利用できる。
　チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）由来のｐＳＢ３（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来ＰＨＯ５プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来ＧＡＰ－Ｚｒ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
　ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（ＨＡＲＳ１、ＨＡＲＳ２）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるＡＯＸ（アルコールオキシダーゼ）、ＦＤＨ（ギ酸脱水素酵素）のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子（ＰＡＲＳ１、ＰＡＲＳ２）などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なＡＯＸなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
　キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス（Candida utilis）などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平０８－１７３１７０）。
　アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリジー（Aspergillus oryzae）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
　トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
　また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
　本発明において使用するイミン還元酵素生産能を有する微生物は、イミン還元酵素生産能を有するストレプトマイセス属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
　本発明の光学活性アミン誘導体の製造方法は、式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有するイミン還元酵素活性を有する酵素活性物質を、この酵素活性物質によって当該基質化合物の還元が可能な条件下で当該基質化合物に接触させる工程を含む。本発明において、酵素活性物質（enzymatic active materials）とは、式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物に由来する物質であって、その能力が維持された物質を意味する。具体的には、たとえば次のような要素は、イミン還元酵素活性を維持する限り、本発明における酵素活性物質に含まれる。
i)　式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物
ii)　i)の微生物菌体の培養物
iii)　i)の微生物菌体の処理物
　本発明において、微生物は、培養物であることもできるし、菌体であることもできる。培養物は、微生物の生存と増殖を支持する培地とともに当該微生物が存在する状態を言う。たとえば微生物を含む液体培地は、培養物である。一方、本発明においては、微生物そのものを指す用語として「菌体」（microbial cell）を用いる。菌体は、培養物から回収された微生物細胞を指す。たとえば遠心分離によって液体培地から微生物の菌体を回収することができる。培養物から回収された菌体を洗浄することによって、菌体表面の培地成分を除くこともできる。
　本発明において酵素活性物質は、そのまま、あるいは固定化して基質化合物と接触させることができる。微生物菌体あるいはその処理物を固定化するための種々の方法が公知である。たとえば、以下のような方法が微生物やその処理物の固定化方法として公知である。
　ポリアクリルアミド法
　含硫多糖ゲル法（κ－カラギーナンゲル法など）
　アルギン酸ゲル法
　寒天ゲル法
　イオン交換樹脂法
　あるいは、限外濾過膜等を用いたメンブレンバイオリアクター中で、微生物、その処理物、を基質化合物と接触させて反応させることもできる。
　本発明における微生物による立体選択的なイミンの還元反応は、微生物を酵素が誘導される適切な前記培養条件において培養を行い、得られた培養液、あるいは培養液から採取した菌体や該菌体処理物に反応基質であるイミン誘導体を加えて、インキュベートすることにより行うことができる。また、前記微生物の培養開始時、もしくは、培養途中に基質となるイミン誘導体を添加して、培養しながらイミンの立体選択的還元反応を行うこともできる。
　本発明における微生物による立体選択的還元方法は、微生物を酵素が誘導される適切な前記培養条件において培養を行い、得られた培養液、あるいは培養液から採取した菌体や該菌体処理物に反応基質を加えて、立体選択的還元反応を行うことができる。また、前記培養条件と同じｐＨ、温度範囲で、１日から７日間、培養と並行しても行うことができる。
　反応条件としては、たとえば以下の条件を示すことができる。
　ｐＨ４．０から９．０、好ましくはｐＨ６．０から８．０、
　温度１５から５０℃、好ましくは２０から４０℃、
　反応時間は、４時間から７日間接触させる。
　一般に、微生物の培養と反応とを、別に行った方が、培地中の不純物の反応系への持ち込みを最小限に抑えることができる。その結果、反応後の生成物の精製において、有利な結果を生むことが期待できる。
　また酵素的還元反応においては、還元エネルギー源として、糖類などの存在下で反応を行うことにより、さらに効率的な反応が期待できる。還元エネルギー源として添加する化合物は、反応基質であるイミン誘導体量に応じて添加することができる。より具体的には、次のような還元エネルギー源を利用することができる。
糖類：グルコース、グルコース－６－リン酸、スクロースなど
有機酸：リンゴ酸、クエン酸、ギ酸など
アミノ酸：アラニン、グルタミン酸、リジンなど
アルコール：エタノール、イソプロパノールなど
その他、亜リン酸など無機化合物を還元エネルギー源として利用できる場合もある。
　本発明における還元反応は、水素供与体の存在下で進行する。したがって、本発明における基質化合物の還元が可能な条件は、水素供与体の存在下で、基質化合物と酵素活性物質とをインキュベートすることによって提供することができる。本発明における還元反応を助けるものであれば、任意の水素供与体を利用することができる。本発明における好ましい水素供与体は、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨである。本発明者らが単離に成功したストレプトマイセス・エスピーＧＦ３５４６に由来するイミン還元酵素、およびそのホモログ、あるいは酵素活性物質を利用する場合には、ＮＡＤＰＨを利用するのが好ましい。
　上記還元反応に付随してＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤＰ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤＰ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＰＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＰＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明による光学活性アミンの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＰＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
　また、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記光学活性アミンの製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＰＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＰＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＰＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＰＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のイミン還元酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＰＨ再生酵素とイミン還元酵素の同時発現、イミン還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
　単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
　例えば、ＮＡＤＰＨ再生用酵素として、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）やサーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）に由来するグルコース脱水素酵素が利用可能であり、具体的には、イミン還元酵素とバシラス・サブチリス由来のグルコース脱水素酵素の遺伝子を導入した組換えベクターであるｐＳＧ－Ｓ２ＭＰなどが好適に利用される。
　アミン誘導体の分解に伴って、反応液のｐＨに変化が見られる場合には、適当な酸、アルカリを用いてｐＨを一定範囲に調節することで、さらに良好な反応性を維持して、反応を継続することもできる。
　本発明において生菌体を使用した場合、反応液中に界面活性剤を添加しておけば反応時間の短縮を期待できる場合がある。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、臭化セチルピリミジウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、トリトンＸ－１００、パライソオクチルフェニルエーテル、トゥイーン８０、スパン６０等があげられ、反応液に対して、０．０００１～１％程度使用することが好ましい。
　また、反応液中に有機溶媒を添加することによっても、同様の効果を期待でき場合がある。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、トルエン、キシレンなどの有機溶媒があげられ、反応液に対して、０．０００１～１％程度使用することが好ましい。
　また、反応液に添加せずとも、菌体を集菌後、界面活性剤および有機溶媒を含む水もしくはバッファーで前処理することにより、細胞壁の透過性を上げた菌体を用いてもよい。
　本発明における反応基質であるイミン誘導体は、目的とする生成物を効率的に生成できるように、適切な濃度で用いることができる。イミン誘導体は、菌体および当該反応を触媒する酵素に対して毒性を有することがあり、必ずしも高濃度反応が効率的な生産に結びつかないことがあり、注意を要する。イミン誘導体の反応液中における濃度として、たとえば０．０５から５０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１から１０％ｗ／ｖを示すことができる。イミン誘導体は、一括（バッチ法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加（フィード法）等の任意の方法で添加することができる。更に、基質となるイミンを添加せず、イミンの原料となるケトンとアミンを反応液に添加し、反応液中でイミンを生成させ、基質として供給することもできる。
　添加されるイミン誘導体は、不活性ガス雰囲気下で扱うことによって、着色が抑制され、製品品質の向上が期待できる。このような効果を期待して、反応液を不活性ガス雰囲気下で原料を反応液に添加することもできる。更に酵素反応をも不活性化ガス雰囲気下で行うことによって、着色を防ぐことができる。ここで使用する不活性ガスとしては、たとえば窒素、アルゴン、ヘリウムなどが使用できる。特に窒素は、容易に入手することができる不活性ガスである。あるいは、アルゴンは空気よりも比重が大きいため、容易に拡散しない。したがって、開放作業においても、不活性化ガス雰囲気下環境を維持できることから、操作上有利である。
　本発明は、基質化合物と酵素活性物質との接触によって得られた光学活性アミン誘導体を回収する工程を含む。具体的には、イミン誘導体の立体選択的還元により、光学活性なアミン誘導体は、各種クロマトグラフィーや結晶化などを組み合わせることにより、反応液から単離することができる。
　反応液中に蓄積された光学活性アミン誘導体は、たとえば次のような溶媒で抽出することができる。
　酢酸エチル、
　酢酸ブチル、
　トルエン、
　キシレン、
　ヘキサン、
　ヘプタン、
　メチルイソブチルケトン、
　メチル－ｔ－ブチルエーテル、
　ハロゲン系などの有機溶媒
　そして抽出されたアミン誘導体は、以下のようなクロマトグラフィーによって更に精製することができる。精製に先立って、必要に応じて、酸やアルカリによる洗浄、脱水剤による脱水などの処理を組み合わせることもできる。
　イオン交換クロマトグラフィー、
　吸着クロマトグラフィー
　たとえば、反応液から遠心分離によって、菌体などの不溶性物質を除去した後、アルカリ条件下で溶媒抽出後、減圧濃縮することにより、光学活性アミン誘導体を採取することができる。
　菌体などの不溶性物質を除去した液を、アミン誘導体を吸着できるイオン交換樹脂などに吸着させ、アンモニア水や水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウムメタノール溶液、水酸化ナトリウムエタノール溶液などのアルカリで溶出させれば、簡便に高濃度溶液を得ることができる。
　また、菌体などの不溶性物質を除去した液を、アミン誘導体を吸着できるイオン交換樹脂などに吸着させ、アンモニア水や水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウムメタノール溶液、水酸化ナトリウムエタノール溶液などのアルカリで溶出させれば、簡便に高濃度溶液を得ることができる。
　また、溶媒抽出後、塩酸で塩酸塩化することにより、光学活性アミン誘導体を結晶として採取することができる。回収率を高めるために、溶媒を減圧濃縮しておいてもよく、あるいは溶媒を結晶性のよい溶媒に置換しておくこともできる。
　また、回収率を高めるために、溶媒を減圧濃縮することもできるあるいは溶媒を結晶性のよい溶媒に置換しておくこともできる。
　あるいは、光学活性アミン誘導体を、酸との塩の結晶として採取することにより、その光学純度を高めることができる場合がある。溶媒抽出後、塩酸で塩酸塩化することにより、光学活性アミン誘導体を結晶として採取することができる。塩を精製する酸としては、塩酸、硫酸などの鉱酸、あるいはマンデル酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸を利用することができる。こうして得られたアミン誘導体の塩を、強酸あるいは強アルカリに溶解した後、適当なアルカリもしくは酸で、ｐＨを中性付近とし、中和晶析することで、容易に他の不純物と分離することができる。アミン誘導体の塩を溶解する強酸性水溶液には、たとえば塩酸、硫酸などの鉱酸を利用することができる。また、強アルカリ性水溶液には、ＮａＯＨ水溶液やアンモニア水を利用することができる。
　また、加熱下水溶液とし、冷却し、再結晶することで容易に他の不純物と分離することができる。
　更に得られた結晶を少量の水に溶解し、適当な展開相で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行うことで更に高度に精製することができる。シリカゲルゲルクロマトグラフィーの展開相には、たとえばブタノール、酢酸、あるいはそれらと水の混合溶剤などを利用することができる。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
また、表中菌株の株名の示すＧＦとは、国立大学法人岐阜大学保存菌株であることを示す。
　［実施例１］（スクリーニング）
　酵母エキス ４ｇ／Ｌ、麦芽エキス １０ｇ／Ｌ、グルコース ４ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・７水和物 ５ｍｇ／Ｌ、２－メチル－１－ピロリン １ｇ／ＬからなるｐＨ７．３に調製した液体培地を、１８ｍｍφ試験管に４ｍＬずつ分注し、オートクレーブ中１２１℃、１５分間加熱滅菌した。ここに、下表１に示す菌株を一白金耳接種し、２８℃、２～６日間、振とう培養した。
　得られた培養液から遠心分離によって集菌し、２－メチル－１－ピロリン １０ｍＭを含む２５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加え、２５℃、２４ｈｒ振とう反応させ、遠心分離によって菌を除いた後、シリカゲルを使用したＴＬＣ（展開液　１－ブタノール：酢酸：水＝２：１：１）で分析を行った。検出は、ニンヒドリンスプレーを噴霧することで行った。
　さらに反応が進行しているものについては、上清５０μＬに、２ｍｇ／ｍＬトリエチルアミン水溶液 ５０μＬを加え、さらに８ｍｇ／ｍＬ２，３，４，６－テトラ－ｏ－アセチルグルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）水溶液 １００μＬを加え、４０℃で１時間保持することで、ＧＩＴＣ化したものを液体クロマトグラフィーにより分析することで、光学純度の測定を行った。和光純薬株式会社製Ｃ１８カラム（Wakosil II 5C18, 4.6mm x 150mm）を用い、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）：メタノール＝５５：４５の溶離液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで通じ、２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収を検出することで測定した。
　分析結果を表１に示す。その結果、光学活性な２－メチルピロリジンが生成していることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
［実施例２］ＧＦ３５４６の同定
　ＧＦ３５４６の微生物学的特徴は、表２にまとめたとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 　１６Ｓ－ｒＤＮＡの解析によりＧＦ３５４６を同定した。１６Ｓ－ｒＤＮＡの塩基配列は、MicroSeq Full Gene 16S rDNA PCR/Sequencing kit（ＡＢＩ製）により解析した。解析操作はキットの指示書に従った。得られた塩基配列を配列番号：１に示した。配列番号：１の塩基配列を元に、アポロンＤＢ（株式会社テクノスルガ、商品名）を用いて、Ｂｌａｓｔ検索を行った結果、次の菌株の１６Ｓ－ｒＤＮＡ配列にそれぞれ９８．６％の同一性を示した。
　　Streptomyces pulveraceus NBRC3855
　　Streptomyces gelaticus NBRC12866
　　Streptomyces sannanensis NBRC14239
　得られた結果を元に分子系統樹を作成した結果を図１に示した。クラスター解析の結果、ＧＦ３５４６をストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.)と同定した。
［実施例３］ＧＦ３５４６による（Ｓ）－２－メチルピロリジンの合成
　酵母エキス ２０ｇ／Ｌ、肉エキス ３０ｇ／Ｌ、ＮＺアミン １０ｇ／Ｌ、グルコース ２０ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・７水和物 １ｍｇ／Ｌ、塩化マンガン・４水和物 １ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・７水和物 １ｍｇ／ＬからなるｐＨ７．３に調製した液体培地を、振とうフラスコに４０ｍＬずつ分注し、オートクレーブ中１２１℃、１５分間加熱滅菌した。ここに、Streptomyces sp. GF 3546を一白金耳接種し、２８℃、７２時間、振とう培養した。
　得られた培養液からろ過によって菌体を集め、２－メチル－１－ピロリン ３０ｍＭ、グルコース２％を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加え、２５℃で振とう反応させた。
　適宜、反応後、実施例１に従い、ＧＩＴＣ化した後、ＨＰＬＣで分析を行った。結果を、図２に示す。７２ｈｒ反応後、２７．５ｍＭの（Ｓ）－２－メチルピロリジンが、９７％ｅｅの選択性で生じていることが確認できた。光学純度の測定方法は以下のとおりである。
　反応液５０μＬに以下の成分を添加して、４０℃、１時間反応することにより生成したアミンをＧＩＴＣ化し、ＨＰＬＣにより分離し定量した。
　２ｍｇ／ｍＬトリエチルアミン ５０μＬおよび
　８ｍｇ／ｍＬ２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ） １００μＬ
　ＨＰＬＣの条件は、以下のとおりである。
－ＨＰＬＣカラム：和光純薬株式会社製 Wakosil II 5C18 (4.6mm x 150 mm)
－溶離液：１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）：メタノール＝５５：４５
－流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
－検出：２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収
　上記条件下で、（Ｒ）－２－メチルピロリジンは２６．３分に、（Ｓ）－２－メチルピロリジンは２４．９分に溶出された。各溶出フラクションの２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づいて光学純度を決定した。
［実施例４］ＧＦ３５４６からイミン還元酵素の精製
　実施例３の方法によりＧＦ３５４６株を培養し、ろ過により菌体を調製した。得られた湿菌体を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で澱懸し、ビードビーター（Ｂｉｏｓｐｅｃ社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。その上清に硫酸アンモニウムを３０％飽和になるまで添加し、３０％飽和の硫酸アンモニウムを含む標準緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール）で平衡化したPhenylSepharose HP 26/10に添加し、硫酸アンモニウム濃度を３０％飽和→０％の勾配溶出を行った。イミン還元活性は、勾配溶出部分に観察され、溶出したピーク部分を回収し、限外濾過により濃縮した。なお、イミン還元活性は、以下の方法にて測定した。
－イミン還元活性の標準測定方法－
　１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１０ｍＭ ２－メチル－１－ピロリン及び酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの減少にともなう３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。
　濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ　１６／１０に添加し、０Ｍ→０．５Ｍ塩化ナトリウムの勾配溶出を行った。溶出した活性画分の内、最も比活性が高かった画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した結果、単一バンドであった。精製酵素の比活性は１２０ｍＵ／ｍｇであった。精製の要約を表３に示す。
表３：ＧＦ３５４６株からのイミン還元酵素の精製
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
［実施例５］イミン還元酵素による（Ｓ）－２－メチルピロリジンの合成
　１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、４０ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２０ｍＭ ２－メチル－１－ピロリンおよび実施例４で得られた酵素を含む反応液中で、２５℃で終夜反応させた。生成した２－メチルピロリジンは、実施例３にしたがって定量および光学純度の測定を行った。その結果、本酵素によって生成した２－メチルピロリジンは、９２．７％ｅｅのＳ体であった。また、反応収率は７７．５％であった。
［実施例６］イミン還元酵素の分子量測定
　実施例４で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより求めた結果、約３０，５００であった。また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００のゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、約８１，５００であった。
［実施例７］イミン還元酵素の至適ｐＨ
　リン酸カリウム緩衝液、トリス－塩酸緩衝液、グリシン－塩化カリウム－水酸化カリウム緩衝液を用いてｐＨを変化させて、実施例３で得られた酵素の２－メチル－１－ピロリンの還元活性および（Ｓ）－２－メチルピロリジンの酸化活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３、図４に示した。還元反応の至適ｐＨは７．４～８．０、酸化反応の至適ｐＨは１０．５であった。なお、（Ｓ）－２－メチルピロリジンの酸化活性は以下の標準測定方法のｐＨだけを変化させて測定した。
－（Ｓ）－２－メチルピロリジン酸化活性の標準測定方法－
　１００ｍＭグリシン－塩化カリウム－水酸化カリウム緩衝液 １０．５、２．５ｍＭＮＡＤＰ＋、１０ｍＭ （Ｓ）－２－メチルピロリジン及び酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの増加にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定する。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの増加を触媒する酵素量とした。
［実施例８］イミン還元酵素の至適温度
　実施例４で得られた酵素をイミン還元標準反応条件のうち温度だけを変化させて、２－メチル－１－ピロリンの還元活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図５に示した。最大活性の８０％以上を示したのは３５℃～４５℃であった。
［実施例９］イミン還元酵素の基質特異性
　実施例４で得られた酵素を種々のイミン化合物と反応させ、その還元反応の活性を２－メチル－１－ピロリンの還元を１００とした相対活性で表し、表４に示した。
表４：イミン還元酵素の基質特異性
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
［実施例１０］イミン還元酵素の部分アミノ酸配列
　実施例９で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号：４に示した。また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルより、イミン還元酵素を含むゲル断片を切り出し、２回洗浄後、トリプシンを用いて、３５℃で終夜イン・ゲル・ダイジェションを行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ　（東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、 2.0mm × 250mm）を用い、０．１％トリフルオロ酢酸中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離し、分取した。
　分取したペプチドピーク１種をＴ６１とし、プロテインシーケンサー（Hewlett Packard G1005A Protein Sequencer System）によりアミノ酸配列の解析を行った。Ｔ６１のアミノ酸配列を配列番号：５で示した。
［実施例１１］Streptomyces sp. GF 3546からの染色体ＤＮＡの精製
　実施例３の方法によりＧＦ３５４６を培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体ＤＮＡの精製は、J.Dairy Sci. , 75 , 1186-1191(1992)に記載の方法により行った。
［実施例１２］イミン還元酵素遺伝子のコア領域のクローニング
　Ｎ末端、Ｔ６１のアミノ酸配列を元にそれぞれセンスプライマー、アンチセンスプライマーを合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：６および配列番号：７に示した。
　プライマー各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ １０ｎｍｏｌ、Streptomyces sp. GF 3546由来染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、Ｅｘ－Ｔａｑ用緩衝液（タカラバイオ製）、５％ＤＭＳＯ、Ｅｘ－Ｔａｑ １Ｕ（タカラバイオ製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（４５℃、３０秒）、伸長（７０℃、１分５秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。
　ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、９００ｂｐあたりに特異的と思われるバンドが検出できた。このＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、決定されたコア領域の塩基配列を配列番号：８として示した。
［実施例１３］　イミン還元酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解析
　Streptomyces sp. GF 3546由来染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃIで消化し、Ｔ４リガーゼを用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次に、配列番号：９および配列番号：１０に示したプライマーを各１００ｐｍｏｌ、環化ＤＮＡを２５ｎｇ、Ｅｘ－Ｔａｑ用緩衝液（タカラバイオ製）、５％ＤＭＳＯ、Ｅｘ－Ｔａｑ １Ｕ（タカラバイオ製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、７分）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、約２，０００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。このＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果、イミン還元酵素遺伝子のＯＲＦ配列を決定することができた。決定したＤＮＡ配列は配列番号：２に、予想されるアミノ酸配列を配列番号：３に示した。
［実施例１４］イミン還元酵素遺伝子のクローニング
　イミン還元酵素の構造遺伝子配列を基にＯＲＦのみをクローニングするために配列番号：１１（ＳｓＳＩＲ－ＡＴＧ１）および配列番号：１２（ＳｓＳＩＲ－ＴＡＡ１）に示したプライマーを合成した。プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ １０ｎｍｏｌ、Streptomyces sp. GF 3546由来染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、Pfu Turbo-DNA Polymerase用緩衝液（STRATAGENE製）、５％ＤＭＳＯ、Pfu Turbo-DNA Polymerase １．９Ｕ（STRATAGENE製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９８℃、３０秒）、アニール（６０℃、１分）、伸長（７２℃、１分１０秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。
　得られたＤＮＡ断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア製）により精製して回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨI、ＸｂａIで２重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア製）により精製した。
　得られたＤＮＡ断片を、ＮｃｏI、ＸｂａIで２重消化したｐＳＥ４２０Ｄ（Invitrogen製のプラスミドベクターｐＳＥ４２０のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開２０００－１８９１７０）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
　形質転換株を、アンピシリンを含むＬＢ培地で生育させ、生育した形質転換体からプラスミドを抽出し、イミン還元酵素遺伝子が挿入されている事が確認できたプラスミドをｐＳＵＳ２ＭＰ１とした。プラスミド構築の過程を図６に示した。
［実施例１５］組換えイミン還元酵素の活性評価
　イミン還元酵素を発現するプラスミドｐＳＵＳ２ＭＰ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
　菌体を遠心分離により集菌した後、１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ－２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収した。また該遺伝子を含まない大腸菌ＪＭ１０９をＬＢ培地で終夜培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ添加後さらに４時間培養した菌体を同様に破砕して、菌体抽出液を回収した。
　それぞれの菌体抽出液を用いて２－メチル－１－ピロリンに対するイミン還元活性を測定した。結果を表５に示した。活性測定の方法は実施例４と同様とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
［実施例１６］イミン還元酵素と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素を共発現するプラスミドｐＳＧ－Ｓ２ＭＰの構築
　実施例１４と同様にしてＰＣＲを行い、増幅したイミン還元酵素を含むＤＮＡ断片をＢｓｐＨI、ＸｂａIで２重消化した。次に、枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を発現するプラスミドｐＳＥ－ＢＳＧ１（特開２０００－１８９１７０）をＮｃｏI、ＸｂａIの２つの制限酵素で二重消化し、イミン還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションし、イミン還元酵素とグルコース脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドであるｐＳＧ－Ｓ２ＭＰを得た。プラスミド構築の過程を図７に示した。
［実施例１７］イミン還元酵素とグルコース脱水素酵素の大腸菌による同時発現
　ｐＳＧ－Ｓ２ＭＰで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
　菌体を遠心分離により集菌した後、１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ－２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収し、２－メチル－１－ピロリンに対するイミン還元活性とグルコース脱水素活性を測定した。結果を表５に示した。なお、グルコース脱水素活性の測定は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１００ｍＭグルコースおよび菌体抽出液を含む反応液中で、３０℃で行った。１Ｕは、上記反応条件において１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨ生成を触媒する酵素量とした。
［実施例１８］組換え大腸菌による（Ｓ）－２－メチルピロリジンの製造
　ｐＳＧ－Ｓ２ＭＰで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をアンピシリンを含む５ｍＬの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
　菌体を遠心分離により集菌した後、５０ｍＭ２－メチル－１－ピロリン、１００ｍＭグルコースを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに懸濁し、終夜２５℃で振とう反応を行った。反応後、生成した２－メチルピロリジンの光学純度、及び、反応液中における２－メチル－１－ピロリンと２－メチルピロリジンの濃度を実施例８と同様にして分析した。その結果、生成した（Ｓ）－２－メチルピロリジンの光学純度は９２．０％ｅｅであった。
　本発明は、微生物の還元能を使用した立体選択的還元により、光学活性なアミン誘導体を効率的に製造する方法を提供する。本発明の方法は、高い立体選択性を期待できるので、工業的にも有利である。本発明によって製造される光学活性なアミン誘導体は、光学活性な医薬の合成原料として有用である。たとえば、（Ｓ）－２－メチルピロリジンは、医薬品原料として有用な化合物である。
[規則26に基づく補充 22.10.2009]　
Figure WO-DOC-FIGURE-RO134

Claims (16)

  1. 　次の（１）～（５）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素；
    （１）作用：還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略す）依存的に、２－メチル－１－ピロリンを還元し、（Ｓ）－２－メチルピロリジンを生成する。ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋と略す）依存的に、（Ｓ）－２－メチルピロリジンを酸化し、２－メチル－１－ピロリンを生成する；、および
    （２）補酵素依存性：還元反応の補酵素としてＮＡＤＰＨを利用する。酸化反応の補酵素としてＮＡＤＰ＋を利用する。
    （３）至適ｐＨ：還元反応は７．４～８．０、酸化反応は１０．５
    （４）至適温度：還元反応は３５～４５℃
    （５）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと略す）が約３０，５００、ゲルろ過による分子量が約８１，５００。
  2. 　請求項１の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、イミン還元酵素。
    （ａ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
    （ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
  3. 　式（I）で示されるイミン誘導体に、請求項１又は２に記載のイミン還元酵素、当該イミン還元酵素を生産する微生物、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
    式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１～３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１～３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
  4. 　式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
    式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１～３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１～３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
  5. 　式（Ｉ）の化合物が下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体であり、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＶ）で表されるアミン誘導体である請求項４に記載の方法。
    式（ＩＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     式（ＩＶ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中Ｒ基は炭素数１～３個のアルキル基を、ｎは、１～４の整数を表す）
  6. 　式（ＩＩＩ）の化合物が２－メチル－１－ピロリンであり、式（ＩＶ）で表される化合物が、２－メチルピロリジンである請求項５に記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法
  7. 　微生物が、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物であることを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
  8. 　微生物が、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）であることを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
  9. 　微生物が、ストレプトマイセス・エスピー NITE P-593（Streptomyces sp. NITE P-593）であることを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
  10. 　請求項１の（１）および（２）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
    （ａ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
    （ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
  11. 　請求項１０に記載されたポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
  12. 　更に、ＮＡＤＰ＋を補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、請求項１１に記載された組換えベクター。
  13. 　脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である、請求項１２に記載のベクター。
  14. 　グルコース脱水素酵素がバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来する、請求項１２に記載の組換えベクター。
  15. 　請求項１０に記載されたポリヌクレオチド、または請求項１２に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
  16. 　請求項１５に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の製造方法。
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