JPWO2016076159A1

JPWO2016076159A1 - シス−５−ヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造方法

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Abstract

Ｌ−ピペコリン酸に、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を作用させて、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させることを特徴とし、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が以下の(A)、(B)又は(C)に示すポリペプチドを含む、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。(A) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；(B) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド；又は(C) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド。

Description

本発明は、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生産する能力を有する酵素を利用したシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法に関するものである。

シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（以下「５ＯＨ‐ＰＡ」と称することがある。）は、医薬品の中間体等として有用な化合物である。シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、Ｌ−ピペコリン酸から生物学的な方法により製造できることが知られている。

ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９由来のＢＡＢ５２６０５タンパク質やアルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１由来のＣＡＣ４７６８６タンパク質（以下「ＳｍＰＨ」と称することがある。）は、Ｌ−プロリンをシス−４−ヒドロキシプロリンに変換する能力を有することが報告されている（特許文献１）。

ＢＡＢ５２６０５タンパク質は、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力を有するが、その生産性は比較的低いことが報告されている（特許文献２）。

ＣＡＣ４７６８６タンパク質も、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力を有することが報告されているが、Ｌ−ピペコリン酸から、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸と共に、シス−３−ヒドロキシピペコリン酸（以下「３ＯＨ‐ＰＡ」と称することがある。）もほぼ同量生産するものである（特許文献２）。

また、特許文献２には、セグニリパラス・ルゴサス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓｒｕｇｏｓｕｓ）ＡＴＣＣＢＡＡ−９７４由来のＥＦＶ１２５１７タンパク質のアノテーションよりも４８塩基（１６アミノ酸相当）上流から発現させたポリヌクレオチド（ｃｉｓ遺伝子）にコードされたタンパク質（以下「ＳｒｕＰＨ」と称することがある。）を発現する大腸菌が、Ｌ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有しており、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換できることが報告されている。しかしながら、本明細書の実施例で示すとおり、このタンパク質は、Ｌ−ピペコリン酸から、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸と共に、シス−３−ヒドロキシピペコリン酸を２％程度生産するものである。

特許文献３には、Ｌ−ピペコリン酸から、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生産する方法が報告されている。特許文献３では、不要なシス−３−ヒドロキシピペコリン酸の生産を抑えるためにＳｍＰＨの遺伝子を改変しているが、改変してもシス−３−ヒドロキシピペコリン酸が９％程度生産されることが報告されている。

非特許文献１でも、ＳｍＰＨがＬ−ピペコリン酸からシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸とシス−３−ヒドロキシピペコリン酸を生産することが報告されている。非特許文献１では、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生産性を高めるためにＳｍＰＨ遺伝子を改変しているが、改変してもシス−３−ヒドロキシピペコリン酸が４％程度生産されることが報告されている。

ＷＯ２００９／１３９３６５ＷＯ２０１３／１８７４３８ＷＯ２０１３／１６９７２５

Koketsuら、ACS Synth. Biol, DOI: 10.1021/sb500247a

このように、Ｌ−ピペコリン酸から、生物学的な方法によりシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する方法は知られているが、いずれもシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生産性が低く、また、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸をある程度生産するものである。したがって、高い純度が要求される医薬品の中間体等の製造方法として、より効率的に、高純度のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する方法が望まれている。

本発明は、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生成が少なく、より効率的に、光学純度の高いシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する新規な方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、キセノラブダス・ドウセティエ（Xenorhabdus doucetiae）ＦＲＭ１６株由来のタンパク質（以下「ＸｄＰＨ」と称することがある。）及びキセノラブダス・ロマニ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｒｏｍａｎｉｉ）ｓｔｒ．ＰＲ０６−Ａ株由来のタンパク質（以下「ＸｒＰＨ」と称することがある。）が、高いＬ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有することを見出した。そして、これらのタンパク質をコードするＤＮＡを用いて形質転換体を作製し、該形質転換体細胞、その調製物及び／又は培養液をＬ−ピペコリン酸に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。

すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］Ｌ−ピペコリン酸に、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法であって、
前記２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が、以下の(A)、(B)又は(C)に示すポリペプチドを含む、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法：
(A) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(B) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド；又は
(C) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
［２］前記２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡが以下の(D)、(E)又は（F）に示すＤＮＡを含む、［１］に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法：
(D) 配列番号１、９、又は１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
(E) 配列番号１、９、又は１０で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加された塩基配列を含み、かつ２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は
(F) 配列番号１、９、又は１０で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［３］２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下、前記Ｌ−ピペコリン酸に作用させる、［１］又は［２］に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
［４］Ｌ−ピペコリン酸に作用してｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有し、かつ、以下の(A)、(B)又は(C)に示すポリペプチドを含む、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素タンパク質：
(A) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(B) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド；又は
(C) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
［５］配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。

本発明によれば、Ｌ−ピペコリン酸から、より効率的に光学純度の高いシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造することができる。さらに、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生成が少ないため、工業的な規模の製造において、低コストで、高純度のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造することができる。

各種Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素遺伝子を導入した大腸菌のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法の結果を示す図（電気泳動写真）である。矢印がＬ−ピペコリン酸水酸化酵素のバンドを示す。各種Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素遺伝子を導入した大腸菌による反応生成物の分析結果を示す図である。各種Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素の活性の温度依存性を示す図である。

以下に、本発明を詳細に説明する。

本明細書において、「Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力」とは、２−オキソグルタル酸依存的にＬ−ピペコリン酸の５位の炭素原子にヒドロキシ基を付加する能力を意味する。

「Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力」を有するか否かは、例えば、Ｌ−ピペコリン酸を基質として含有し、さらに２−オキソグルタル酸を補酵素として含有する反応系において、Ｌ−ピペコリン酸に、測定の対象とする酵素を作用させ、Ｌ−ピペコリン酸から変換されたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の量を直接的に測定することにより確認することができる。

また、本明細書における「酵素」には、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）や、公知の固定化技術を用いて固定化したもの、例えば、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等も含まれる。

本明細書において、「Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力を有する微生物若しくは細胞」（以下、「本発明の微生物若しくは細胞」と称することがある。）とは、「Ｌ−ピペコリン酸の５位の炭素原子にヒドロキシ基を付加しうる能力」を有していれば特に制限はなく、内在的に前記能力を有する微生物若しくは細胞であってもよいし、育種により前記能力を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。育種により前記能力を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理など、公知の方法を採用することができる。形質転換の方法としては、目的とする遺伝子を導入する、染色体上でプロモーターなどの発現調節配列を改変することなどにより目的の遺伝子の発現を強化するなどの方法を用いることができる。

なお、「微生物若しくは細胞」の種類としては、後述の宿主生物若しくは宿主細胞に記載のものが挙げられる。また、本明細書において、「Ｌ−ピペコリン酸の５位の炭素原子にヒドロキシ基を付加しうる能力を有する微生物若しくは細胞」としては、生きている微生物若しくは細胞に限られず、生体としては死んでいるが酵素能力を有するものも含まれる。

本明細書において、「宿主生物」とする生物の種類は特に限定されず、大腸菌、枯草菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌等の原核生物、酵母、糸状菌等の菌類、植物、動物等の真核生物が挙げられる。中でも、好ましくは、大腸菌、酵母、コリネ型細菌であり、特に好ましくは大腸菌である。

本明細書において、「宿主細胞」とする細胞の種類は特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。

本明細書において、「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。

本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクターなどを用いて目的の遺伝子が導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった微生物又は細胞を意味する。

本明細書において、「微生物若しくは細胞の処理物」とは、微生物若しくは細胞を培養し、当該微生物若しくは細胞を、１）有機溶媒等により処理したもの、２）凍結乾燥したもの、３）担体などに固定化したもの、４）物理的又は酵素的に破壊したものであり、かつ、所望の機能を有するタンパク質を含有するもの等を意味する。

本明細書において、「微生物若しくは細胞を培養して得られた酵素を含む培養液」とは、１）微生物若しくは細胞の培養液、２）微生物若しくは細胞の培養液を有機溶媒等により処理をした培養液、３）微生物若しくは細胞の細胞膜を物理的又は酵素的に破壊してある培養液を意味する。

＜２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法＞
本発明のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、Ｌ−ピペコリン酸に、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させることを特徴とする。本発明の製造方法は、後述するように、２−オキソグルタル酸及び２価鉄イオンの存在下、行なうことが好ましい。

本発明で使用される２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素（以下、「本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素」と称することがある。）は、Ｌ−ピペコリン酸を水酸化する際の位置選択性及び立体選択性が高いため、これを用いることにより、効率よく、光学純度の高いシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を得ることができる。

本発明の２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素は、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力を有する酵素であれば特に制限はないが、配列番号４又は１１に記載のアミノ酸配列を有するもの、又は該アミノ酸配列のホモログであって２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するものであることが好ましい。即ち、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素は、以下の(A)、(B)又は(C)に示すポリペプチドを含むものであることが好ましい。
(A) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(B) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性を有するポリペプチド；又は
(C) 配列番号４又は１１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性を有するポリペプチド。

本発明において使用しうる、配列番号４又は１１に記載のアミノ酸配列を有する２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素のホモログとしては、前記(B)に記載の通り、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性を保持する限り、配列番号４又は１１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ここで「１又は数個のアミノ酸」とは、例えば、１個〜１００個、好ましくは１個〜５０個、より好ましくは１個〜２０個、さらに好ましくは１個〜１０個、特に好ましくは１個〜５個のアミノ酸である。

また、上記ホモログは、前記(C)に記載の通り、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性を保持する限り、配列番号４又は１１に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。

配列番号４に記載のアミノ酸配列は、キセノラブダス・ドウセティエ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｄｏｕｃｅｔｉａｅ）ＦＲＭ１６株の公知のゲノム情報に基づくものである。
配列番号１１に記載のアミノ酸配列は、キセノラブダス・ロマニ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｒｏｍａｎｉｉ）ｓｔｒ．ＰＲ０６−Ａ株からＰＣＲを用いた公知の方法によってクローン化された遺伝子情報に基づくものである。

配列番号４又は１１のアミノ酸配列、及びそのホモログを含む本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素は、Ｌ−ピペコリン酸の５位の炭素原子を選択的に水酸化するので、高効率でシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成することができる。

なお、本発明の製造方法において、複数の２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を併用してもよい。

本発明に使用しうる２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素は、キセノラブダス・ドウセティエ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｄｏｕｃｅｔｉａｅ）ＦＲＭ１６株又はキセノラブダス・ロマニ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｒｏｍａｎｉｉ）ｓｔｒ．ＰＲ０６−Ａ株から精製して得ることもできるが、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡをＰＣＲやハイブリダイゼーションなどの公知の方法で当該遺伝子をクローン化し、それを適当な宿主で発現させることによって得ることもできる。

配列番号４又は１１に示されるアミノ酸配列を有する２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡとしては、それぞれ、配列番号１、９又は１０の塩基配列を含むＤＮＡが挙げられ、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１、９又は１０の塩基配列を含むＤＮＡのホモログでもよい。即ち、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡとしては、以下の(D)、(E)又は(F)に示す塩基配列が挙げられる。
(D) 配列番号１、９又は１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
(E) 配列番号１、９又は１０で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加された塩基配列を含み、かつ２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は
(F) 配列番号１、９又は１０で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

ホモログとしては、例えば、前記(E)に記載の通り、配列番号１、９又は１０の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含むものが挙げられる。ここでいう１又は数個の塩基とは、例えば、１個〜３００個、好ましくは１個〜１５０個、より好ましくは１個〜６０個、さらに好ましくは１個〜３０個、特に好ましくは１個〜１５個、の塩基である。
なお、配列番号１は、配列番号４のアミノ酸配列をコードするキセノラブダス・ドウセティエ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｄｏｕｃｅｔｉａｅ）ＦＲＭ１６株の遺伝子を大腸菌発現用にコドンを最適化した塩基配列である。このように形質転換対象の宿主に応じてコドンが最適化されたＤＮＡも当然に本発明に使用し得る２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡに包含される。

さらに、上記ＤＮＡのホモログは、前記(F)に記載の通り、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１、９又は１０の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法及びプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液の存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
各ハイブリダイゼーションは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．等に記載されている方法に準じて行うことができる。

当業者であれば、配列番号１、９又は１０のＤＮＡに部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＰＣＲＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈＩＲＬＰｒｅｓｓｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／又は付加変異を導入することにより、上記のようなＤＮＡホモログを得ることが可能である。

また、配列番号４又は１１のアミノ酸配列又はその一部や、配列番号１、９又は１０で表される塩基配又はその一部をもとに、例えばＤＮＡＤａｔａｂａｎｋｏｆＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素のアミノ酸情報又はそれをコードするＤＮＡの塩基配列情報を手に入れることも可能である。

本発明のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法においては、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を直接反応に使用してもよいが、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を含む微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましい。

２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を含む微生物若しくは細胞としては、もともと２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を有する微生物若しくは細胞を用いてもよいが、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードする遺伝子で形質転換された微生物若しくは細胞を用いることが好ましい。

また、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を含む微生物若しくは細胞の調製物としては、例えば、該微生物若しくは細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の微生物若しくは細胞の調製物、微生物若しくは細胞中の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いることができる。

２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を含む微生物若しくは細胞を培養して得られた培養液としては、例えば、該微生物若しくは細胞と液体培地の懸濁液や、該微生物若しくは細胞が分泌発現型微生物若しくは細胞である場合は該微生物若しくは細胞を遠心分離等で除去した上清やその濃縮物を用いることができる。

上記のようにして単離された、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能な形態で挿入することにより、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素発現ベクターが提供される。そして、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を得ることができる。形質転換体は、宿主の染色体ＤＮＡに２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡを相同組み換えなどの手法によって発現可能な状態で組み込むことによっても得ることができる。

形質転換体の作製方法としては、具体的には、微生物などの宿主細胞において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターやウイルスベクター中に、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該宿主細胞中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に該ＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる方法が例示される。このとき、宿主において適当なプロモーターをＤＮＡの５"−側上流に連結させることが好ましく、さらに、ターミネーターを３"−側下流に連結させることがより好ましい。このようなプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、例えば、「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに宿主微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターが詳細に記述されている。

２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体がＬ−ピペコリン酸の反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。

エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。

ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。

ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。

形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築及び宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇに記載の方法）。

以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。

エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。

バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。

シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，２７３−８２（１９８３））などを挙げることができる。

ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ３９，２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。

コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。

サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドなどが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。

シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターなどを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、タカラバイオ株式会社から市販されており容易に利用できる。

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７，２８３−２８７（１９８９））。

また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。

また、微生物以外でも、植物や動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に昆虫（例えば、蚕）などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系や、大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。

本発明の製造方法では、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、２−オキソグルタル酸の存在下、反応基質であるＬ−ピペコリン酸に作用させることにより、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造することができる。

本発明の製造方法は、Ｌ−ピペコリン酸に、２−オキソグルタル酸、及び２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させることができれば特に制限はないが、通常、水性媒体中、もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われることが好ましい。本発明の製造方法は、さらに、２価の鉄イオンの存在下で行なうことが好ましい。

前記水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。

また、前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール系溶媒、アセトン、ジメチルスルホキシド等の反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。前記有機溶媒としては、また、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等を使用することもできる。

反応基質となるＬ−ピペコリン酸は、通常、基質濃度が０．０１％ｗ／ｖ〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。

２−オキソグルタル酸は、通常、基質と等モル又はそれ以上、好ましくは等モル〜１．２倍モルの範囲で添加する。２−オキソグルタル酸は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素への阻害作用があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。または、２−オキソグルタル酸の代わりにグルコース等の宿主が代謝可能な安価な化合物を添加し、宿主に代謝させ、その過程で生じる２−オキソグルタル酸を反応に使用させることも可能である。

本発明の製造方法は、２価の鉄イオンの存在下で行なうことが好ましい。２価の鉄イオンは、通常０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で用いることが好ましい。２価の鉄イオンは、硫酸鉄などとして、反応開始時に一括して添加することができるが、反応中に、添加した２価の鉄イオンが３価に酸化されたり、沈殿を形成して減少してしまったりした場合には追添加することも効果的である。また、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液に既に充分な量の２価の鉄イオンが含まれている場合は必ずしも添加しなくてもよい。

反応は、通常４℃〜６０℃、好ましくは１５℃〜４５℃、特に好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜ｐＨ１１、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ８で行われる。反応時間は通常、１時間〜７２時間程度である。

反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、例えば細胞を添加する場合は反応液にその細胞の濃度が通常、湿菌体重で０．１％ｗ／ｖ〜５０％ｗ／ｖ程度、好ましくは１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖとなるように添加し、処理物を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。

本発明の製造方法により生成するヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質などを遠心分離、膜処理などにより分離した後に、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールなどの有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。

［実施例］
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

２−オキソグルタル酸依存型ピペコリン酸水酸化酵素遺伝子のクローニング
キセノラブダス・ドーセティエ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｄｏｕｃｅｔｉａｅ）ＦＲＭ１６株由来の推定上のＬ−プロリンｃｉｓ−４−ヒドロキシラーゼＸｄＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ. ＣＤＧ１６６３９、配列番号４）をコードする大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列（ｘｄｐｈ＿Ｅｃｏｄｏｎ、配列番号１）をＤＮＡ２．０社にて人工合成し、ｐＪＥｘｐｒｅｓｓ４１１（ＤＮＡ２．０）に挿入されたプラスミドｐＪ４１１ＸｄＰＨを作製した。
同様に、公知のピペコリン酸５位水酸化活性を示す代表的な酵素遺伝子のクローニングも行った。セグニリパラス・ルゴサス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓｒｕｇｏｓｕｓ）ＮＢＲＣ１０１８３９株由来のＬ−ピペコリン酸ｃｉｓ−５−ヒドロキシラーゼＳｒｕＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ. ＥＦＶ１２５１７、配列番号６）と、シノメゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１株由来のＬ−プロリンｃｉｓ−４−ヒドロキシラーゼＳｍＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ. ＣＡＣ４７６８６、配列番号５）をコードする大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列である、それぞれｓｒｕｐｈ＿Ｅｃｏｄｏｎ（配列番号３）とｓｍｐｈ＿Ｅｃｏｄｏｎ（配列番号２）をＤＮＡ２．０社にて人工合成し、それぞれｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１１（ＤＮＡ２．０）とｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１に挿入されたプラスミドｐＪ４１１ＳｒｕＰＨ、ｐＪ４０１ＳｍＰＨを作製した。ｓｍｐｈ＿Ｅｃｏｄｏｎに対してはプライマーｓｍｐｈ＿ｆ（配列番号７）とｓｍｐｈ＿ｒ（配列番号８）を合成し、それらを用いてプラスミドＤＮＡを鋳型とし常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化したｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法に従ってライゲーションすることにより、それぞれｐＥＴ２４ＳｍＰＨを得た。

２−オキソグルタル酸依存型ピペコリン酸水酸化酵素遺伝子発現菌体の取得と発現量の確認
次に、得られた各プラスミドを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロジェン製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＸｄＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＳｒｕＰＨ、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４ＳｍＰＨを得た。導入した遺伝子を発現する菌体を得るために、各組換え大腸菌について、カナマイシン及びｌａｃプロモーター誘導物質を含む液体ＬＢ培地を用いて、２８℃で４時間〜６時間培養後、１５℃でさらに約４０時間培養した後に集菌した。
得られた組換え大腸菌を濁度ＯＤ₆₃₀が約１０となるように、ｐＨ７の５０ｍｍｏｌ／ＬＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）バッファーに懸濁した。その懸濁液０．５ｍＬを氷上で超音波破砕処理を行い、その後１２，０００ｒｐｍの回転数で遠心分離することにより上清と残渣に分離した。得られた上清を可溶性画分とし、残渣を不溶性画分とした。
得られた可溶性画分と不溶性画分を常法に従って処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により発現されたタンパク質発現量を確認した。結果を図１に示した。

２−オキソグルタル酸依存型ピペコリン酸水酸化酵素の活性確認
プラスチックチューブ内で５ｍｍｏｌ／ＬＬ−ピペコリン酸、１０ｍｍｏｌ／Ｌ２−オキソグルタル酸、１ｍｍｏｌ／ＬＬ−アスコルビン酸、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸鉄、そして、実施例２で得られた各粗酵素液を約２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で添加された液０．２ｍＬを、３０℃で１時間振盪させた。
反応産物を１−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−５−Ｌ−ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）により誘導体化し、その後ＵＰＬＣ‐ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ製）により分析した。その結果、図２に示す通り、各粗酵素液を用いた反応後の液から５−ヒドロキシピペコリン酸標準品の保持時間５．３分に一致する化合物を生成することが確認された。各酵素液の示した５−ヒドロキシピペコリン生成活性（Ｕ／ｇ）は、タンパク質量（ｇ）当りそれぞれ４．１Ｕ／ｇ、８．９Ｕ／ｇ、３．１Ｕ／ｇと算出された。ここでのユニット（Ｕ）は１分間に１μモルの基質を生成する能力を表す。
また、ＳｍＰＨ反応生成物からは、シス−３−ヒドロキシピペコリン酸と考えられる保持時間６．０分の化合物が生成することが確認された。クロマトグラム上のヒドロキシピペコリン酸ピークの面積値から全ヒドロキシピペコリン酸量に占めるシス−３−ヒドロキシピペコリン酸の割合を比較した結果を表２に示した。ＸｄＰＨ反応生成物中には０．１７％しかシス−３−ヒドロキシピペコリン酸が生成されなかったことが示されている。
なお、ＨＰＬＣによるヒドロキシピペコリン酸の分析条件は、以下の表１に示す通りである。

水酸化反応の温度依存性の確認
各酵素反応の温度依存性を確認するため、各水酸化酵素の粗酵素液を種々の温度で１時間３０分インキュベートした後に、３０℃で１時間反応させた後の５−ヒドロキシピペコリン酸生成量を測定した。得られた結果を、各酵素の最高の活性値を１００（％）とした際の相対活性として、図３に示した。

２−オキソグルタル酸依存型ピペコリン酸水酸化酵素遺伝子のクローニング
キセノラブダス・ドーセティエ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｄｏｕｃｅｔｉａｅ）ＦＲＭ１６株、及びその類縁種であるキセノラブダス・ロマニ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｒｏｍａｎｉｉ）ｓｔｒ．ＰＲ０６−Ａ株由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、推定上のＬ−プロリンｃｉｓ‐４−ヒドロキシラーゼＸｄＰＨ遺伝子（ＸｄＰＨｏｒｉ：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ. ＦＯ７０４５５０−ＸＤＤ１＿０９３６、配列番号９）を増幅させるプライマーであるＸｄＰＨｆｕｓ‐ｆ（配列番号１２）とＸｄＰＨｆｕｓ‐ｒ（配列番号１３）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりそれぞれ約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。得られた２種のＤＮ断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、制限酵素ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化したｐＱＥ６０（ＱＩＡＧＥＮ）に常法に従って挿入し、それぞれｐＱＥＸｄＰＨｏｒｉ、ｐＱＥＸｒＰＨｏｒｉを得た。

次に得られた各プラスミドを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を常法に従い形質転換し組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＱＥＸｄＰＨｏｒｉ、及びＪＭ１０９／ｐＱＥＸｒＰＨｏｒｉを得た。常法に従って、ｐＱＥ６０に挿入された遺伝子配列を確認し、キセノラブダス・ロマニ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｒｏｍａｎｉｉ）ｓｔｒ．ＰＲ０６−Ａ株由来のアミノ酸水酸化酵素の遺伝子配列（ｘｒｐｈ＿ｏｒｉ、配列番号１０）とアミノ酸配列（ＸｒＰＨ、配列番号１１）を決定した。ＸｒＰＨはＸｄＰＨに対し、９９％の同一性を有するものであった。

導入した遺伝子を発現する菌体を得るために、各組換え大腸菌についてアンピシリンを含む液体ＬＢ培地を用いて一晩培養した後に集菌した。
プラスチックチューブ内で２０ｍｍｏｌ／ＬＬ−ピペコリン酸、１５ｍｍｏｌ／Ｌ２−オキソグルタル酸、１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＣＥＰ）、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸鉄、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、１％Ｎｙｍｅｅｎ、及び得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＱＥＸｄＰＨｏｒｉ、及びＪＭ１０９／ｐＱＥＸｒＰＨｏｒｉの培養液０．４ｍｌから得た菌体をｐＨ６．５の５０ｍｍｏｌ／ＬＢｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅバッファーで懸濁した液０．２ｍＬを加えて、全容量１ｍＬの反応液とし、これを２０℃で２０時間振盪させた。
反応後の液を、ＡｃｃＱ・Ｔａｇ（ウォーターズ社製）を用いて誘導体化した後、下記条件のＨＰＬＣ条件にて分析して、生成した５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を測定した。

カラム：ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８５μｍ（２．１×１５０ｍｍ）（ウォーターズ社製）
溶離液Ａ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）
溶離液Ｂ：メタノール（０〜０．５ｍｉｎ（０％⇒１％）, ０．５〜１８ｍｉｎ（１％⇒５％）, １８〜１９ｍｉｎ（５％⇒９％）, １９〜２９．５ｍｉｎ（９％⇒１７％）, ２９．５〜４０ｍｉｎ（１７％⇒６０％）, ４０〜４３ｍｉｎ（６０％）)
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出：蛍光検出器
温度：３０℃

測定結果を表３に示す。キセノラブダス・ドーセティエ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｄｏｕｃｅｔｉａｅ）ＦＲＭ１６株由来の水酸化酵素ＸｄＰＨだけでなく、キセノラブダス・ロマニ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｒｏｍａｎｉｉ）ｓｔｒ．ＰＲ０６−Ａ株由来の水酸化酵素についても、ピペコリン酸５位水酸化活性を保持していることが確認された。

Claims

Ｌ−ピペコリン酸に、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させることを特徴とする、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法であって、
前記２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が、以下の(A)、(B)又は(C)に示すポリペプチドを含む、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法：
(A) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(B) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド；又は
(C) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
前記２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡが以下の(D)、(E)又は（F）に示すＤＮＡを含む、請求項１に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法：
(D) 配列番号１、９、又は１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
(E) 配列番号１、９、又は１０で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加された塩基配列を含み、かつ２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は
(F) 配列番号１、９、又は１０で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下、前記Ｌ−ピペコリン酸に作用させる、請求項１又は２に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
Ｌ−ピペコリン酸に作用してｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有し、かつ、以下の(A)、(B)又は(C)に示すポリペプチドを含む、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素タンパク質：
(A) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(B) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド；又は
(C) 配列番号４、又は１１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、２−オキソグルタル酸依存型Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。