CN116685683A - 突变型l-哌可酸羟化酶及利用其的顺式-5-羟基-l-哌可酸的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于，提供用于将L‑哌可酸羟化而以高生产率及高选择性制造顺式‑5‑羟基‑L‑哌可酸的突变型L‑哌可酸羟化酶、并且提供由L‑哌可酸以高生产率及低成本工业化制造顺式‑5‑羟基‑L‑哌可酸的新方法。本发明提供具有在序列号2所示的氨基酸序列中导入特定氨基酸突变而得到的氨基酸序列的突变型L‑哌可酸羟化酶。

Description

突变型L-哌可酸羟化酶及利用其的顺式-5-羟基-L-哌可酸的 制造方法

技术领域

本发明涉及突变型L-哌可酸羟化酶及利用其的顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法。详细而言，涉及将L-哌可酸羟化而生产顺式-5-羟基-L-哌可酸的能力高的突变型L-哌可酸羟化酶及通过利用该酶而以高的生产率由L-哌可酸制造顺式-5-羟基-L-哌可酸的方法。

背景技术

顺式-5-羟基-L-哌可酸(以下有时称为“5HPA”)是作为药品的中间体等有用的化合物。已知顺式-5-羟基-L-哌可酸可以由L-哌可酸通过生物学方法制造。

例如，已知苜蓿根瘤菌中苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeli loti)1021来源的CAC47686蛋白(以下有时称为“SmPH”)、褶皱慢反应脂肪酸菌(Segniliparus rugosus)ATCCBAA-974来源的EFV12517蛋白的注释的上游48个碱基(相当于16个氨基酸)起所表达的多核苷酸(cis基因)所编码的蛋白(以下有时称为“SruPH”)具有L-哌可酸的顺式-5位羟化酶活性，能够将L-哌可酸转化为5HPA。

但是，这些蛋白不仅生产5HPA，还以数％程度生产顺式-3-羟基哌可酸(以下有时称为“3HPA”)。

因此，需要对L-哌可酸的5位碳原子添加羟基的能力高的(对5位具有高的位置选择性的)蛋白，作为与SmPH、SruPH相比对5位具有高的位置选择性的L-哌可酸羟化酶，报道有Xenorhabdus doucetiae FRM16株来源的蛋白(以下有时称为“XdPH”)(专利文献1)。但是，XdPH存在如下课题：以大肠杆菌为宿主进行表达时，大部分以非活性的不溶性蛋白形式表达。

另外，从成本方面，也期望工业上能够通过大肠杆菌等异种宿主以活性型酶、可溶性蛋白形式表达酶蛋白，但是用异种表达系统进行表达时，存在天然情况下为活性型酶但未以活性型酶形式表达或者天然情况下为可溶性蛋白但以不溶性蛋白形式表达的情况。

因此，作为工业上由L-哌可酸制造5HPA时的L-哌可酸羟化酶，期望以大肠杆菌为宿主进行表达时具有L-哌可酸羟化活性(对L-哌可酸的5位碳原子添加羟基的能力)且以可溶性蛋白形式表达。

在此报道了使在异种表达系统中不以活性型酶或可溶性蛋白形式表达或即使表达活性型酶也为微量的酶以活性型突变酶或可溶性蛋白形式表达的方法(专利文献2)。专利文献2记载了：用异种表达系统表达具有如下碱基序列的基因，以活性型突变酶或可溶性蛋白形式表达，所述碱基序列编码存在于α螺旋结构部分的亲水性区域中的疏水性氨基酸的至少1个被置换(其中，被置换的氨基酸置换为与该氨基酸相比亲水度高或疏水度低的氨基酸)和/或存在于α螺旋结构部分的疏水性区域中的亲水性氨基酸的至少1个被置换(其中，被置换的氨基酸置换为疏水度高或亲水度低的氨基酸)的氨基酸序列。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2016/076159

专利文献2：WO2016/199898

发明内容

发明所要解决的问题

本发明要解决的课题在于，提供用于将L-哌可酸羟化而以高生产率及高选择性制造顺式-5-羟基-L-哌可酸的突变型L-哌可酸羟化酶。进而，本发明要解决的课题在于，提供以高生产率及低成本由L-哌可酸工业化制造顺式-5-羟基-L-哌可酸的新方法。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述课题，参照专利文献2记载的方法对XdPH的突变体进行了深入研究，结果发现，将XdPH的氨基酸序列中第15位的谷氨酸、第28位的异亮氨酸、第31位的缬氨酸、第76位的半胱氨酸、第108位的异亮氨酸、第142位的亮氨酸、第202位的谷氨酰胺、第239位的丙氨酸、第246位的苯丙氨酸或第271位的异亮氨酸分别置换为其它氨基酸的突变体将L-哌可酸的5位碳原子选择性羟化而生产顺式-5-羟基-L-哌可酸的能力(L-哌可酸羟化活性)高，以大肠杆菌为宿主进行表达时L-哌可酸羟化活性高，以可溶性蛋白形式表达，从而完成了本发明。

即，本发明的主旨如下所述。

[1]一种突变型L-哌可酸羟化酶，其具有在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由以下的(a)～(o)组成的组中的至少1种氨基酸突变而得到的氨基酸序列。

(a)第15位的谷氨酸被置换为丙氨酸的氨基酸突变

(b)第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸的氨基酸突变

(c)第28位的异亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(d)第31位的缬氨酸被置换为谷氨酸的氨基酸突变

(e)第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸突变

(f)第108位的异亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(g)第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(h)第142位的亮氨酸被置换为赖氨酸的氨基酸突变

(i)第142位的亮氨酸被置换为天冬酰胺的氨基酸突变

(j)第142位的亮氨酸被置换为谷氨酰胺的氨基酸突变

(k)第142位的亮氨酸被置换为组氨酸的氨基酸突变

(l)第202位的谷氨酰胺被置换为脯氨酸的氨基酸突变

(m)第239位的丙氨酸被置换为天冬氨酸的氨基酸突变

(n)第246位的苯丙氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸突变

(o)第271位的异亮氨酸被置换为甘氨酸的氨基酸突变

[2]根据[1]所述的突变型L-哌可酸羟化酶，其特征在于，其具有在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由上述(a)～(o)组成的组中的至少2种氨基酸突变而得到的氨基酸序列。

[3]根据[1]或[2]所述的突变型L-哌可酸羟化酶，其特征在于，其具有在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由上述(a)～(o)组成的组中的至少3种氨基酸突变而得到的氨基酸序列。

[4]一种顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法，其特征在于，使[1]～[3]中任一项所述的突变型L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液与L-哌可酸接触，生成顺式-5-羟基-L-哌可酸。

[5]根据[4]所述的顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法，其特征在于，使上述突变型L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液在2-酮戊二酸及2价铁离子存在下与L-哌可酸接触。

发明效果

本发明的突变型L-哌可酸羟化酶将L-哌可酸的5位碳原子选择性羟化而生产顺式-5-羟基-L-哌可酸的能力(L-哌可酸羟化活性)高。进而，以大肠杆菌为宿主进行表达时也具有高的L-哌可酸羟化活性，以可溶性蛋白形式进行表达。因此，本发明的突变型L-哌可酸羟化酶在由L-哌可酸工业化制造顺式-5-羟基-L-哌可酸时有用。

另外，根据利用上述突变型L-哌可酸羟化酶的本发明的顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法，能够以高生产率及低成本由L-哌可酸工业化制造顺式-5-羟基-L-哌可酸。

附图说明

图1为示出实施例6中的、XdPH突变体(单一突变导入)的低温培养后的可溶性评价结果的图(电泳照片)。图1中，被四方形(虚线)包围的部分表示被表达为可溶性级分的XdPH突变体。

图2为示出实施例6中的、XdPH突变体(单一突变或多个突变导入)的低温培养后及常规培养后的可溶性评价结果的图(电泳照片)。图2中，被四方形(虚线)包围的部分表示被表达为可溶性级分的XdPH突变体。

图3为示出实施例7中的、XdPH突变体的低温(15℃)培养后的可溶性评价结果的图(电泳照片)。图3中，被四方形(虚线)包围的部分表示被表达为可溶性级分的XdPH突变体。

图4为示出实施例7中的XdPH突变体的低温(20℃)培养后的可溶性评价结果的图(电泳照片)。图4中，被四方形(虚线)包围的部分表示被表达为可溶性级分的XdPH突变体。

图5为示出实施例4中的HPLC分析结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明详细进行说明。

本说明书中，“L-哌可酸羟化活性”是指对L-哌可酸的5位碳原子添加羟基的能力(由L-哌可酸转化为顺式-5-羟基-L-哌可酸的能力)。

本说明书中，“L-哌可酸羟化活性”例如可以通过使测定对象的酶与L-哌可酸接触并测定由L-哌可酸转化而得的顺式-5-羟基-L-哌可酸的量来评价。具体而言，例如可以使加入了L-哌可酸、作为反应助剂的2-酮戊二酸、L-抗坏血酸及二价铁离子、以及测定对象的酶(或者，具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液、或者由该微生物或细胞纯化而得的蛋白)的反应液在适当的温度(例如10℃～45℃左右)、压力(例如大气压左右)下反应，测定所生成的顺式-5-羟基-L-哌可酸的量，从而以反应液中所加入的每单位细胞量(单位：g、浊度)或总蛋白量(单位：g)的顺式-5-羟基-L-哌可酸生成量(U/g等)形式来进行评价。在此，单位(U)表示1分钟内生成1微摩尔顺式-5-羟基-L-哌可酸的能力。

本说明书中，“酶”还包括纯化酶(包括部分纯化的酶)、使用公知的固定化技术固定化于载体的酶、例如固定化于聚丙烯酰胺、卡拉胶凝胶等载体的酶等。

另外，本说明书中，异种表达后的蛋白是否以可溶性蛋白表达这一点可以通过异种表达后的提取液中的可溶性蛋白的量来判断。该可溶性蛋白的量例如可以如下测定：将异种表达中使用的菌体在缓冲液存在下以化学、物理或机械方式破坏(例如表面活性剂处理、超声波破碎、磨碎、弗氏压碎等)而得到提取液后，通过离心分离、过滤等除去该提取液中所含的不溶性蛋白等不溶成分，并测定所得到的上清液中所包含的蛋白的量。该测定可以使用公知的蛋白定量方法，例如可以通过电泳法、ELISA法、以及免疫印迹法等方法进行。

1.本发明的突变型L-哌可酸羟化酶

本发明的突变型L-哌可酸羟化酶具有在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由以下的(a)～(o)组成的组中的至少1种氨基酸突变而得到的氨基酸序列。

(a)第15位的谷氨酸被置换为丙氨酸的氨基酸突变

(b)第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸的氨基酸突变

(c)第28位的异亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(d)第31位的缬氨酸被置换为谷氨酸的氨基酸突变

(e)第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸突变

(f)第108位的异亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(g)第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(h)第142位的亮氨酸被置换为赖氨酸的氨基酸突变

(i)第142位的亮氨酸被置换为天冬酰胺的氨基酸突变

(j)第142位的亮氨酸被置换为谷氨酰胺的氨基酸突变

(k)第142位的亮氨酸被置换为组氨酸的氨基酸突变

(l)第202位的谷氨酰胺被置换为脯氨酸的氨基酸突变

(m)第239位的丙氨酸被置换为天冬氨酸的氨基酸突变

(n)第246位的苯丙氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸突变

(o)第271位的异亮氨酸被置换为甘氨酸的氨基酸突变

本发明中，序列号2所示的氨基酸序列是作为野生型L-哌可酸羟化酶的Xenorhabdus doucetiae FRM16株来源的蛋白(XdPH)的氨基酸序列。

本发明的突变型L-哌可酸羟化酶具有与XdPH同等以上的L-哌可酸羟化活性。另外，以大肠杆菌为宿主进行表达时具有与XdPH同等以上的L-哌可酸羟化活性，另外，以可溶性蛋白形式进行表达。

在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由上述(a)～(n)组成的组中的至少1种氨基酸突变而得到的氨基酸序列具有L-哌可酸羟化活性提高、另外可溶性提高的倾向，因此优选。特别地，认为导入选自由上述(g)～(k)组成的组中的至少1种氨基酸突变而得到的氨基酸序列、即序列号2所示的氨基酸序列中第142位的亮氨酸被置换为其它氨基酸的氨基酸序列即使在以大肠杆菌良好生长的28℃～30℃左右的温度进行培养时也显示高的L-哌可酸羟化活性，因此更优选。作为该其它氨基酸，可列举疏水度低于亮氨酸且不带有负电荷的氨基酸。更优选为(g)的氨基酸突变。

在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由上述(a)～(o)组成的组中的至少2种氨基酸突变而得到的氨基酸序列具有L-哌可酸羟化活性提高、另外可溶性提高的倾向，因此优选。

突变的组合是任意的，可例示例如(g)与(g)以外的任意1种的组合，可例示(g)与(a)、(g)与(b)、(g)与(c)、(g)与(d)、(g)与(e)、(g)与(n)。进而，可例示(b)与(b)以外的任意1种的组合，可例示(b)与(e)。进而，可例示(e)与(e)以外的任意1种的组合，可例示(e)与(b)。

另外，在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由上述(a)～(o)组成的组中的至少3种氨基酸突变而得到的氨基酸序列由于L-哌可酸羟化活性进一步提高而进一步优选。

突变的组合是任意的，可例示例如(g)与(g)以外的任意2种的组合，可例示(g)与选自(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(n)中的2种的组合，可例示(g)与(b)与(e)、(g)与(b)与(d)、(g)与(b)与(n)的组合。

本发明的突变型L-哌可酸羟化酶可以由序列号2所示的氨基酸序列通过本领域技术人员公知的方法、例如定点突变法、PCR法等周知技术来制造。

另外，本发明的突变型L-哌可酸羟化酶还可以通过培养含有编码其的核酸的转化体、并由得到的培养物分离纯化该突变型L-哌可酸羟化酶来制造。编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的核酸可以为DNA也可以为RNA，或者可以为DNA/RNA嵌合体。可优选列举DNA。另外，该核酸可以为双链也可以为单链。在双链的情况下，可以为双链DNA、双链RNA或DNA：RNA杂交体。在单链的情况下，可以为有义链(即，编码链)，也可以为反义链(即，非编码链)。

作为成为编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的DNA的基础的DNA，可列举从Xenorhabdus doucetiae FRM16株克隆的DNA等。例如，可以从由Xenorhabdus doucetiaeFRM16株来源的细胞或组织制备的DNA级分通过公知的PCR、杂交获得。另外，可列举使用由Xenorhabdus doucetiae FRM16株来源的细胞或组织制备的总RNA或mRNA级分作为模板、通过逆转录酶-PCR直接扩增而得的全长L-哌可酸羟化酶cDNA等。对于这样的DNA，使用公知的试剂盒、例如Mutan-super Express Km(TAKARA BIO INC.)、Mutan-K(TAKARA BIO INC.)等按照ODA-LA PCR法、缺口双链体(Gapped duplex)法、Kunkel法等本身公知的方法或基于它们的方法进行转换(突变导入)，由此可以获得编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的DNA。或者，对于通过菌落或噬菌斑杂交法或PCR法等从将上述总RNA或mRNA的片段插入到适当的载体中而制备的cDNA文库克隆出的cDNA，按照上述方法进行转换，也可以获得。文库所使用的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等中的任一种。

作为编码具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白的核酸，可列举例如包含序列号1所示的碱基序列的核酸。序列号1所示的碱基序列是为了用于大肠杆菌表达而对编码序列号2的氨基酸序列的Xenorhabdus doucetiae FRM16株的基因进行了密码子优化的合成碱基序列。不仅是Xenorhabdus doucetiae的基因，如此地根据转化对象的宿主优化了密码子的核酸当然也包括在编码本发明的具有L-哌可酸羟化活性的蛋白的核酸中。

本领域技术人员可以对序列号1所示的核酸使用定点突变法(Nucleic AcidsRes.10,pp.6487(1982)、Methods in Enzymol.100,pp.448(1983)、Molecular Cloning、PCR A Practical Approach IRL Presspp.200(1991))等适宜地进行置换、缺失、插入和/或添加而导入产生期望突变的碱基置换，由此得到编码包含上述(a)～(o)的突变的突变型L-哌可酸羟化酶的氨基酸序列的核酸。

后述的本发明的制造方法中，可以使上述突变型L-哌可酸羟化酶与作为底物的L-哌可酸直接反应而使用，优选使用具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液。

作为具有生产本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞，可以使用本来就具有生产该突变型L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞，也可以为通过育种而赋予了上述生产能力的微生物或细胞。作为微生物或细胞，与其存活/死亡无关，例如可以适宜使用休眠菌体等。作为具有生产本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞的种类，可列举后文作为“宿主微生物”或“宿主细胞”说明的微生物或细胞。

作为通过育种而赋予上述生产能力的手段，可采用基因重组处理(转化)、突变处理等公知方法。作为转化的方法，可列举导入目标DNA的方法、在染色体上改变启动子等表达调节序列而增强目标DNA的表达的方法等。

这些中，优选使用利用编码上述本发明的蛋白(突变型L-哌可酸羟化酶)的DNA进行了转化的微生物或细胞。

如上所述，编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的核酸(DNA)例如可以如下得到：使用Xenorhabdus doucetiae FRM16株来源的染色体DNA作为模板，使用合适的引物进行PCR而进行克隆，进行转换，由此得到。

另外，如上所述，编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的核酸(DNA)例如可以如下得到：使用Xenorhabdus doucetiae FRM16株来源的总RNA或mRNA作为模板，通过RT-PCR法直接扩增而制备全长突变型L-哌可酸羟化酶cDNA后，使用合适的引物进行PCR而进行克隆，进行转换，从而得到。

例如，通过将如上得到的编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的DNA以可表达的配置插入到公知的表达载体中，从而提供本发明的蛋白基因表达载体。另外，通过用该表达载体转化宿主细胞，可得到导入有编码本发明的蛋白的DNA的转化体。转化体也可以通过将编码本发明的蛋白的DNA利用同源重组等方法以可表达方式整合于宿主的染色体DNA而得到。

本说明书中，“表达载体”是指：用于通过整合编码具有期望功能的蛋白的多核苷酸、并导入到宿主生物中而在上述宿主生物中复制及表达具有期望功能的蛋白的遗传因子。可列举例如质粒、病毒、噬菌体、粘粒等，但是不限于此。表达载体优选为质粒。

本说明书中，“转化体”是指：使用上述表达载体等导入目标基因、从而能够表现出与具有期望功能的蛋白相关的期望性状的微生物或细胞。

作为转化体的制作方法，具体可例示如下方法：向在宿主细胞中稳定存在的质粒载体、噬菌体载体、病毒载体中导入编码本发明的蛋白(突变型L-哌可酸羟化酶)的DNA，将构建的表达载体导入到该宿主细胞中的方法；直接向宿主基因组中导入该DNA，对其遗传信息进行转录、翻译的方法。这种情况下，优选使适合于宿主的启动子连接于DNA的5'-侧上游，进而，更优选使终止子连接于3’-侧下游。作为这样的启动子及终止子，只要是已知在用作宿主的细胞中发挥功能的启动子及终止子则没有特别限定，可使用例如“微生物学基础讲座8基因工程·共立出版”中详细记载的载体、启动子和终止子。

作为用于表达本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的、成为转化对象的宿主微生物，只要宿主本身不会对作为底物的L-哌可酸、作为目标物的顺式-5-羟基-L-哌可酸产生不利影响就没有特别限定，可列举例如以下所示的微生物。

属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷氏菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链球菌(Streptococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属等的已建立了宿主载体系统的细菌。

属于红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属等的已建立了宿主载体系统的放线菌。

属于酵母(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、耶氏酵母(Yarrowia)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、汉逊酵母(Hansenula)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属等的已建立了宿主载体系统的酵母。

属于脉孢菌(Neurospora)属、曲霉(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、木霉(Trichoderma)属等的已建立了宿主载体系统的霉菌。

用于制作转化体的步骤、适合于宿主的重组载体的构建及宿主的培养方法可以基于分子生物学、生物工程、基因工程的领域中惯用的技术来进行(例如，Green et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4thed.)Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,NY(2012)中记载的方法)。

以下具体列举优选的宿主微生物、各微生物的优选转化方法、载体、启动子、终止子等的例子，但本发明不限于这些例子。

在埃希氏菌属、特别是大肠杆菌(Escherichia coli)中，作为质粒载体，可列举pBR、pUC系质粒等，可列举lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌体PL、PR、T7噬菌体等来源的启动子等。另外，作为终止子，可列举trpA来源、噬菌体来源、rrnB核糖体RNA来源的终止子等。

在芽孢杆菌属中，作为载体，可列举pUB110系质粒、pC194系质粒等，另外也可以整合到染色体中。作为启动子和终止子，可以利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等酶基因的启动子、终止子等。

在假单胞菌属中，作为载体，可列举在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)等中建立的通常的宿主载体系统、参与甲苯化合物的分解的质粒、以TOL质粒为基础的广宿主载体(包含来自RSF1010等的自主复制所需要的基因)pKT240(Gene,26,273-82(1983))等。

在短杆菌属、特别是乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中，作为载体，可列举pAJ43(Gene 39,281(1985))等质粒载体。作为启动子和终止子，可以利用在大肠杆菌中的各种启动子和终止子。

在棒状杆菌属、特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，作为载体，可列举pCS11(日本特开昭57-183799号公报)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196,175(1984))等质粒载体。

在酵母(Saccharomyces)属、特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作为载体，可以列举YRp系、YEp系、YCp系、YIp系质粒等。另外，可以利用醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶等各种酶基因的启动子、终止子。

在裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属中，作为载体，可列举Mol.Cell.Biol.6,80(1986)中记载的粟酒裂殖酵母来源的质粒载体等。特别是pAUR224，由宝生物株式会社销售，可以容易地利用。

在曲霉(Aspergillus)属中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等在霉菌中研究得最多，可以利用能够整合到质粒、染色体中且来自菌体外蛋白酶或淀粉酶的启动子(Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989))。

另外，除了上述以外，还建立了适应于各种微生物的宿主载体系统，也可以适当使用它们。

另外，除了微生物以外，在植物、动物中也建立了各种宿主、载体系统，特别地，在昆虫(例如蚕)等动物中(Nature 315,592-594(1985))以及菜籽、玉米、马铃薯等植物中建立了大量表达异种蛋白的系统及使用大肠杆菌无细胞提取液、小麦胚芽等无细胞蛋白合成系统的系统，可以适当地利用。

作为具有生产本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞的处理物，可列举例如：将该微生物或细胞用丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯等有机溶剂、表面活性剂处理而得到的物质、冷冻干燥处理而得到的物质、经物理破碎或酶破碎而得到的物质等细胞制备物；以粗制物或精制物形式取出微生物或细胞中的酶级分而得到的物质；以及，将这些固定化于以聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶凝胶等为代表的载体而得的物质等。

作为培养具有生产本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液，可列举例如该微生物或细胞和液体培养基的悬浮液；在该微生物或细胞为分泌表达型细胞时通过离心分离等除去该微生物或细胞而得到的上清液或其浓缩物。关于培养，只要适合于微生物或细胞的培养的条件即可，另外，可以为为了优化本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的活性、物性、生产能力等而进行了适宜调整的条件。例如，作为以大肠杆菌为宿主时的培养条件，例如通常为15℃～37℃的培养温度下12小时～48小时左右。从酶活性及可溶性的观点出发，有时优选低温培养，这种情况下，优选在15℃～25℃或15℃～20℃的培养温度下进行培养。

2.本发明的顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法

本发明的顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法包括下述步骤：使本发明的突变型L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液(以下有时统称为“本发明的突变型L-哌可酸羟化酶等”)与L-哌可酸接触，使其进行反应。

本发明的制造方法中，可以使用经精制或粗制的本发明的突变型L-哌可酸羟化酶、具有生产本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞(例如，具有编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的DNA的转化体等)、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液。这些中，优选使用具有生产本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞(例如，具有编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的DNA的转化体等)、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液，更优选使用具有编码本发明的突变型L-哌可酸羟化酶的DNA的转化体。

本发明的制造方法中，可以将多种突变型L-哌可酸羟化酶组合使用。

与L-哌可酸接触的本发明的突变型L-哌可酸羟化酶等的量只要为能够生成顺式-5-羟基-L-哌可酸的量即可，没有特别限定。例如，在向包含L-哌可酸的反应液中添加上述微生物或细胞的情况下，以使反应液中的该微生物或细胞的浓度通常以湿菌体重量计为0.1w/v％～50w/v％左右、优选1w/v％～20w/v％的方式进行添加。另外，例如在向包含L-哌可酸的反应液中添加上述处理物、培养液的情况下，求出所使用的突变型L-哌可酸羟化酶的比活性，添加使反应液中的微生物或细胞浓度达到上述浓度的量。在此，w/v％表示重量(weight)/体积(volume)％。

接触的方法没有特别限定，例如，可以向包含本发明的突变型L-哌可酸羟化酶等的液体中加入成为底物的L-哌可酸。另外，可以向包含成为底物(反应底物)的L-哌可酸的液体中加入本发明的突变型L-哌可酸羟化酶等。通过使L-哌可酸与本发明的突变型L-哌可酸羟化酶等进行接触，从而L-哌可酸被羟化而生成顺式-5-羟基-L-哌可酸。

成为底物的L-哌可酸的量可以根据所制造的顺式-5-羟基-L-哌可酸的量适宜选择。另外，L-哌可酸以包含L-哌可酸及本发明的突变型L-哌可酸羟化酶等的液体(以下有时称为“反应液”)中的底物浓度计，可以以通常0.01w/v％～90w/v％、优选0.1w/v％～30w/v％的范围使用。

L-哌可酸、本发明的突变型L-哌可酸羟化酶等可以在反应开始时一次性添加，从降低存在酶的底物抑制时的影响的观点、提高生成物的蓄积浓度的观点出发，可以连续或间歇地添加。

上述接触优选在2-酮戊二酸及2价的铁离子的存在下进行。

2-酮戊二酸通常以与作为底物的L-哌可酸等摩尔或其以上、优选等摩尔～2倍摩尔的范围来添加。2-酮戊二酸可以在反应开始时一次性添加，从降低存在对酶的抑制作用时的影响的观点、提高生成物的蓄积浓度的观点出发，可以连续或间歇地添加。另外，也可以添加葡萄糖等宿主可代谢的廉价化合物来代替2-酮戊二酸，使其在宿主中代谢，将在该过程中产生的2-酮戊二酸用于反应。

2价的铁离子可以以反应液中的浓度计以通常0.001mmol/L～100mmol/L、优选0.01mmol/L～50mmol/L、特别优选0.1mmol/L～10mmol/L的范围使用。2价的铁离子可以以硫酸铁等形式在反应开始时一次性添加。另外，添加到反应中的2价的铁离子被氧化为3价或形成沉淀而减少时，进行追加添加也有效。需要说明的是，本发明的突变型L-哌可酸羟化酶等中已经包含了足够量的2价的铁离子时，也可以不添加。

另外，上述接触优选在还存在L-抗坏血酸下进行。L-抗坏血酸可以以反应液中的浓度计以通常0.001mmol/L～50mmol/L、优选0.01mmol/L～30mmol/L、特别优选0.1mmol/L～25mmol/L的范围使用。通过添加L-抗坏血酸，可以减轻2价的铁离子的氧化。

上述接触通常可以在水性介质中、或水性介质与有机溶剂的混合物中进行。从反应后的处理、工业化的观点出发，优选在水性介质中进行。

作为水性介质，可列举例如水或good’s缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液等公知的缓冲液(buffer)。作为有机溶剂，可使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等作为底物的L-哌可酸的溶解度高的有机溶剂。另外，作为有机溶剂，可以使用能够有效进行反应副产物的除去等的有机溶剂，例如可以使用乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。

上述接触例如可以在大气压程度的压力下在通常4℃～60℃、优选10℃～45℃、特别优选15℃～40℃的温度范围内进行。另外，上述接触可以在通常pH为3～11、优选pH为5～8的条件下进行。接触时间只要是使L-哌可酸羟化而生成顺式-5-羟基-L-哌可酸的时间即可，没有特别限定，通常为10分钟以上、优选为30分钟以上，另外，通常为90小时以内、优选为72小时以内。

生成的顺式-5-羟基-L-哌可酸可以在通过离心分离、膜处理等本领域技术人员公知的分离或纯化方法分离反应液中的菌体、蛋白等之后，将利用1-丁醇、叔丁醇等有机溶剂的萃取、蒸馏、使用离子交换树脂或硅胶等的柱层析、等电点结晶或以一盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的结晶等本领域技术人员公知的方法适宜组合而进行纯化。

通过本发明的制造方法，可以以高生产率及低成本工业化制造作为药品中间体等有用的顺式-5-羟基-L-哌可酸。

实施例

以下，通过实施例进一步详细地说明本发明，但是本发明不受这些限定。

需要说明的是，实施例中有时用以下简写符号表示氨基酸。

[表1]

表1

<实施例1：XdPH基因的获得及对XdPH基因的突变导入1>

由DNA2.0公司(现ATUM公司)人工合成了编码Xenorhabdus doucetiae FRM16株来源的L-脯氨酸顺式-4-羟化酶XdPH(Gen Bank Accession No.CDG16639、序列号2)的为了用于大肠杆菌表达而进行了密码子优化的基因序列(xdph_Ecodon、序列号1)，插入到pJExpress411(DNA2.0公司制)中而制作质粒pJ411XdPH。进而，以得到的质粒pJ411XdPH为模板，按照常规方法制作表1所示的突变体表达质粒(No.m1～m25及m37～m59)。

<实施例2：对XdPH基因的突变导入2>

以实施例1中得到的保有第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的突变体基因的质粒pJ411XdPH_m15为模板，通过与实施例1同样的方法进一步导入突变，得到表达二重突变体的质粒pJ411XdPH_m26。该质粒保有编码第142位的亮氨酸被置换为精氨酸、且氨基酸编号第15位的谷氨酸被置换为丙氨酸的突变体酶XdPHm26的基因。同样制作了表2所示的突变体表达质粒(pJ411XdPH_m27～pJ411XdPH_m36)。

[表2-1]

表2：制作的突变体表达质粒

[表2-2]

表2(续)

m51	1232E	pJ411XdPH	pJ411XdPH m51
				m52	D75P	pJ411XdPJ	pJ411XdPH m52
m53	G151A	pJ411XdPH	pJ411XdPH m53
				m54	A154P	pJ411XdPH	pJ411XdPH m54
m55	K165R	pJ411XdPH	pJ411XdPH m55
				m56	Q202P	pJ411XdPH	pJ411XdPH m56
m57	C252I	pJ411XdPH	pJ411XdPH m57
				m58	P257G	pJ411XdPH	pJ411XdPH m58
m59	Y258D	pJ411XdPH	pJ411XdPH m59

<实施例3：突变型XdPH基因表达菌体的获得1>

使用野生型质粒pJ411XdPH及实施例1及2中得到的各突变体表达质粒按照常规方法转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(インビトロジエン公司制)，得到各重组大肠杆菌。

<实施例4：突变型L-哌可酸羟化酶(XdPH突变体)的活性评价1>

(1)酶液的准备

为了得到表达所导入的基因的菌体，对于实施例3中得到的各重组大肠杆菌(使用野生型质粒pJ411XdPH、突变体表达质粒pJ411XdPH_m1～pJ411XdPH_m31及pJ411XdPH_m33～pJ411XdPH_m36转化而得的各重组大肠杆菌)，使用含有卡那霉素及lac启动子诱导物质的液体LB培养基1mL，在30℃下进行约5小时的事先培养。之后，进行常规培养或低温培养，收集菌体。在常规培养的情况下，事先培养后在28℃或30℃下培养约20小时后收集菌体。在低温培养的情况下，事先培养后在15℃下培养约24小时后收集菌体。

接着，通过离心分离对各重组大肠杆菌0.6mL分别收集菌体，悬浮于pH6.5的50mmol/L MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid，2-吗啉乙磺酸)缓冲液。将装有0.5mL所得到的悬浮液的容器浸于冰水中进行超声波破碎处理后，以12000rpm的转速进行离心分离。将得到的上清液作为L-哌可酸羟化活性评价时的酶液使用。

(2)活性评价

向塑料管中加入以使各成分的浓度成为表3所示的浓度的方式混合而得到的反应液0.2mL，在30℃下振荡30分钟。

[表3]

表3

成分	浓度
		L-哌可酸	20mmol/L
2-酮戊二酸	40mmol/L
		L-抗坏血酸	1mmol/L
硫酸铁	0.5mmol/L
		上述(1)中准备的各酶液	以总蛋白浓度计为约2mg/mL

向振荡后的反应液中加入浓度1mmol/L的盐酸0.1mL而使反应停止后，加入浓度1mmol/L的氢氧化钠水溶液0.1mL而将反应液中和。对中和后的反应液进行离心分离，除去沉淀，将得到的溶液按照以下条件进行HPLC(High Performans Liquid Chromatography，高效液相色谱)分析，测定生成的顺式-5-羟基-L-哌可酸的浓度。

<HPLC分析条件>

使用设备：Chromaster(注册商标)(日立ハイテクサイエンス公司制)

柱：Astec(注册商标)CLC-D Chiral HPLC Column、5μm、150×4.6mm

检测波长：254nm

注入量：10μL

展开液：2mmol/L硫酸铜

流速：1mL/分钟

柱温：45℃

将野生型酶XdPH及各XdPH突变体的L-哌可酸羟化活性的评价结果示于表4[低温培养]及表5[常规培养]。

表4及表5中，L-哌可酸羟化活性以每单位总蛋白量(单位：g)的顺式-5-羟基-L-哌可酸生成量(U/g总蛋白)形式进行评价。在此，单位(U)表示1分钟内生成1微摩尔顺式-5-羟基-L-哌可酸的能力。表4及表5中的L-哌可酸羟化活性的表示是指以下含义。

[表4]

表4：低温培养

[表5]

表5:常规培养

由表4及表5可知，野生型酶XdPH是在低温(15℃～20℃左右的温度)下培养重组大肠杆菌时微弱表现L-哌可酸羟化活性、但在大肠杆菌良好生长的28℃～30℃左右的温度下培养时完全不表现L-哌可酸羟化活性的酶。

由表4可知，对导入了单一突变的XdPH突变体评价低温培养(15℃)后的L-哌可酸羟化活性的结果是，在序列号2所示的氨基酸序列中第15位的谷氨酸被置换为丙氨酸的m9、第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸的m10、第28位的异亮氨酸被置换为精氨酸的m11、第31位的缬氨酸被置换为谷氨酸的m12、第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的m13、第108位的异亮氨酸被置换为精氨酸的m14、第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的m15及第246位的苯丙氨酸被置换为酪氨酸的m23与野生型酶XdPH相比L-哌可酸羟化活性提高。其中，m15特别使L-哌可酸羟化活性提高。

另外，将多种通过导入单一突变而提高了L-哌可酸羟化活性的突变组合，从而进一步提高了L-哌可酸羟化活性(m26～m36)。其中，在序列号2所示的氨基酸序列中具有第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的突变的突变体(m26～m31及m34～m36)、具有第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸的突变的突变体(m27及m33～m36)及具有第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的突变的突变体(m29及m33～m34)，L-哌可酸羟化活性大幅提高。特别是第142位的亮氨酸被置换为精氨酸、第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸及第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的突变体(m34)，L-哌可酸羟化活性显著提高。

由表5可知，对导入了单一突变的XdPH突变体评价常规培养(28℃或30℃)后的L-哌可酸羟化活性的结果是，在常规培养的情况下，野生型酶XdPH不表现L-哌可酸羟化活性，但m15、m26～m36表现出良好的L-哌可酸羟化活性。特别是导入了多个突变的突变体m26～m36，表现出极高的L-哌可酸羟化活性。

另外，将多种通过导入单一突变而提高了L-哌可酸羟化活性的突变组合，从而进一步提高了L-哌可酸羟化活性(m26～m36)。其中，在序列号2所示的氨基酸序列中具有第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的突变的突变体(m26～m31及m34～m36)、具有第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸的突变的突变体(m27及m33～m36)及具有第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的突变的突变体(m29及m33～m34)，L-哌可酸羟化活性大幅提高。特别是第142位的亮氨酸被置换为精氨酸、第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸及第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的突变体(m34)，L-哌可酸羟化活性显著提高。

进而，对于m29～m30及m33～m36而言，在大肠杆菌良好生长的28℃～30℃左右的温度下培养时，与低温培养时相比，L-哌可酸羟化活性更高。

需要说明的是，突变体XdPHm1～XdPHm8、XdPHm16～XdPHm22、XdPHm24及XdPHm25在低温培养和常规培养中的任一情况下都微弱表现或不表现L-哌可酸羟化活性。

另外，将对进行常规培养而得的野生型酶XdPH及突变体XdPHm27测定L-哌可酸羟化活性时的HPLC分析结果(图)示于图5。由图5也可知，利用突变体XdPHm27，生成了顺式-5-羟基-L-哌可酸。

＜实施例5：XdPH突变体的活性评价2＞

(1)酶液的准备

为了得到表达所导入的基因的菌体，对于实施例3中得到的各重组大肠杆菌(使用野生型质粒pJ411XdPH、突变体表达质粒pJ411XdPH_m34及pJ411XdPH_m37～pJ411XdPH_m59转化而得的各重组大肠杆菌)，使用包含卡那霉素及lac启动子诱导物质的液体LB培养基1mL，在30℃下进行约5小时的事先培养。之后进行低温培养(15℃或20℃下培养约24小时)，收集菌体。

通过离心分离对培养后的培养液分别收集菌体，悬浮于pH7的50mmol/L MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲液0.5mL。将装有0.5mL所得到的悬浮液的容器浸入冰水中进行超声波破碎处理后，以12000rpm的转速进行离心分离而分离为上清液和残渣。将得到的上清液作为L-哌可酸羟化活性评价时的酶液使用。

(2)活性评价

向塑料管中加入以使各成分的浓度成为表6所示的浓度的方式混合而得到的反应液0.1mL，在30℃下振荡30分钟。

[表6]

表6

成分	浓度
		L-哌可酸	20mmol/L
2-酮戊二酸	40mmol/L
		L-抗坏血酸	25mmol/L
硫酸铁	0.5mmol/L
		上述(1)中准备的各酶液	以总蛋白浓度计为约2mg/mL

将振荡后的反应液20μL分取到包含10μL的浓度1mmol/L的盐酸的其它塑料管中而使反应停止后，添加浓度1mmol/L的氢氧化钠水溶液10μL而将反应液中和。进而，添加浓度2mmol/L硫酸铜水溶液40μL后，通过离心分离去除沉淀。向得到的上清液20μL中添加浓度1mol/L的硼酸缓冲液(pH9.0)20μL及浓度20mmol/L的FDAA(1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺)的乙腈溶液50μL，在40℃下反应60分钟。

添加浓度1mol/L的盐酸10μL而使反应停止，加入100μL的甲醇后，通过离心分离去除沉淀，将得到的上清液150μL按照以下的条件进行UPLC(注册商标)(Ultra PerformanceLC，超高效液相色谱)分析，测定生成的顺式-5-羟基-L-哌可酸浓度。

<UPLC(注册商标)分析条件>

使用设备：ACQUITY UPLC(注册商标)系统(Waters公司制)

柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm)2.1×100mm(Waters公司制)

检测波长：340nm

注入量：5μL

洗脱液A：0.1％甲酸

洗脱液B：乙腈(0.1％甲酸)

流速：0.2mL/分钟

梯度条件：

将野生型酶XdPH及各XdPH突变体的L-哌可酸羟化活性的评价结果示于表7。

表7中，L-哌可酸羟化活性以设使用野生型酶XdPH的反应中得到的顺式-5-羟基-L-哌可酸生成量(峰面积)为1时的相对活性来进行评价。表7中的L-哌可酸羟化活性的表示是指以下含义。

[表7]

表7

对导入了单一突变的XdPH突变体评价低温培养(15℃或20℃)后的L-哌可酸羟化活性的结果是，由表7可知，在序列号2所示的氨基酸序列中第239位的丙氨酸被置换为天冬氨酸的m50及第202位的谷氨酰胺被置换为脯氨酸的m56与野生型酶XdPH相比，L-哌可酸羟化活性提高。

另外，导入了多个(3个)突变的m34与野生型酶XdPH相比，L-哌可酸羟化活性显著提高。

需要说明的是，导入了单一突变的XdPH突变体中，m37～m49、m51～m55及m57～m59与野生型酶XdPH相比，L-哌可酸羟化活性未提高。

＜实施例6：XdPH突变体的可溶性评价1＞

(1)可溶性评价用溶液的准备

为了得到表达所导入的基因的菌体，对于实施例3中得到的各重组大肠杆菌(用野生型质粒pJ411XdPH、突变体表达质粒pJ411XdPH_m1～pJ411XdPH_m23、pJ411XdPH_m26～pJ411XdPH_m30及pJ411XdPH_m34转化而得的各重组大肠杆菌)，用包含卡那霉素及lac启动子诱导物质的液体LB培养基1mL，在30℃下进行约5小时的事先培养后，进行常规培养(28℃下培养约20小时)或低温培养(15℃下培养约24小时)，以12000rpm的转速进行离心分离，收集菌体。

将得到的各重组大肠杆菌全部量以浊度(OD630)达到约10的方式悬浮于pH7的50mmol/L MES缓冲液。将装有0.5mL所得到的悬浮液的容器浸入冰水中进行超声波破碎处理后，以12000rpm的转速进行离心分离而分离为上清液和残渣。将得到的上清液作为可溶性级分，将残渣作为不溶性级分。

(2)可溶性评价

对于得到的各可溶性级分，按照常规方法定量蛋白浓度后，以总蛋白量达到10μg的方式分别分取至塑料管，用含有SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)的增溶缓冲液悬浮后，在90℃加热约10分钟，将所得溶液作为可溶性评价用溶液使用。

对于得到的各不溶性级分，用0.5mL的含有SDS的增溶缓冲液悬浮后，在90℃加热10分钟而增溶，形成溶液，将其作为可溶性评价用溶液使用。

对于得到的各溶液，按照常规方法供于SDS-聚丙烯酰胺电泳法，确认表达的XdPH蛋白的量。

对于导入了单一突变的XdPH突变体，将低温培养后的可溶性评价结果示于表8及图1。

另外，对于导入了单一突变或多个突变的XdPH突变体，将低温培养后及常规培养后的可溶性评价结果示于表9及图2。

可溶性评价中，通过目视确认上述电泳结果，将以野生型酶XdPH的可溶性表达量为基准的可溶性水平作为指标进行评价。表8及表9中的可溶性水平的表示是指以下含义。

[表8]

表8

[表9]

表9

野生型酶XdPH是在低温培养重组大肠杆菌时作为活性型在大肠杆菌内微弱表现可溶性、但是在大肠杆菌良好生长的28℃～30℃左右的温度下培养时难以作为活性型在大肠杆菌内表现可溶性的蛋白。

对于导入了单一突变的表8所示的XdPH突变体进行低温培养(15℃)后的可溶性评价的结果是，在序列号2所示的氨基酸序列中第262位的精氨酸被置换为缬氨酸的m6、第271位的异亮氨酸被置换为酪氨酸的m8、第15位的谷氨酸被置换为丙氨酸的m9及第108位的异亮氨酸被置换为精氨酸的m14与野生型酶XdPH相比，可溶性微弱提高。

在序列号2所示的氨基酸序列中第271位的异亮氨酸被置换为甘氨酸的m7、第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸的m10、第28位的异亮氨酸被置换为精氨酸的m11、第31位的缬氨酸被置换为谷氨酸的m12、第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的m13、第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的m15及第246位的苯丙氨酸被置换为酪氨酸的m23与野生型酶XdPH可溶性稍稍提高。

另外，对于导入了单一突变或多个突变的表9所示的XdPH突变体，进行了低温培养(15℃)后和常规培养(28℃)后的可溶性评价。

导入了单一突变的XdPH突变体中，在序列号2所示的氨基酸序列中第108位的异亮氨酸被置换为精氨酸的m14不论是在低温培养(15℃)后还是在常规培养(28℃)后，与野生型酶XdPH相比，可溶性均微弱提高。

导入了单一突变的XdPH突变体中，在序列号2所示的氨基酸序列中第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸的m10、第28位的异亮氨酸被置换为精氨酸的突变体m11、第31位的缬氨酸被置换为谷氨酸的m12、第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的m13及第246位的苯丙氨酸被置换为酪氨酸的m23不论是在低温培养(15℃)后还是在常规培养(28℃)后，与野生型酶XdPH相比，可溶性均提高。

导入了单一突变的XdPH突变体中，在序列号2所示的氨基酸序列中第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的m15在低温培养(15℃)后，与野生型酶XdPH相比，可溶性稍稍提高，在常规培养(28℃)后，与野生型酶XdPH相比，可溶性显著提高。

对于导入了多个突变的m26～m30、m34而言，在低温培养(15℃)后，与野生型酶XdPH相比，可溶性显著提高。另外，导入了多个突变的m26～m29在常规培养(28℃)后，与野生型酶XdPH相比，可溶性也显著提高。由此可确认，通过导入多个突变，可溶性表达的效率提高。

需要说明的是，表8及表9所示的XdPH突变体中，m1～m5、m16～m22的可溶性为野生型酶XdPH以下。

＜实施例7：XdPH突变体的可溶性评价2＞

(1)酶液的准备

为了得到表达所导入的基因的菌体，对于实施例3中得到的各重组大肠杆菌(使用野生型质粒pJ411XdPH、突变体表达质粒pJ411XdPH_m34及pJ411XdPH_m37～pJ411XdPH_m59转化而得的各重组大肠杆菌)，使用包含卡那霉素及lac启动子诱导物质的液体LB培养基1mL，在30℃下进行约5小时的事先培养后，进行低温培养(15℃或20℃下培养约24小时)，以12000rpm的转速进行离心分离而收集菌体。

将得到的重组大肠杆菌全部量悬浮于0.5mL的pH7的50mmol/LMES缓冲液。将装有所得物的容器浸入冰水中进行超声波破碎处理后，以12000rpm的转速进行离心分离而分离为上清液和残渣。将得到的上清液作为可溶性级分，将残渣作为不溶性级分。

(2)可溶性评价

将得到的各可溶性级分20μL分别分取至塑料管，用含有SDS的增溶缓冲液悬浮后，在100℃加热约10分钟，将所得溶液作为可溶性评价用溶液使用。

对于得到的各不溶性级分，用0.5mL的含有SDS的增溶缓冲液悬浮后，在100℃加热10分钟而增溶，形成溶液，将其作为可溶性评价用溶液使用。

对于得到的各溶液，按照常规方法供于SDS-聚丙烯酰胺电泳法，确认表达的XdPH蛋白的量。将可溶性评价结果示于表10、图3及图4。

可溶性评价中，通过目视确认上述电泳结果，将以野生型酶XdPH的可溶性表达量为基准的可溶性水平作为指标进行评价。表10中的可溶性水平的表示是指以下含义。

[表10]

表10

/>

导入了单一突变的XdPH突变体中，在序列号2所示的氨基酸序列中第239位的丙氨酸被置换为天冬氨酸的m50及第202位的谷氨酰胺被置换为脯氨酸的m56与野生型酶XdPH相比，可溶性稍稍提高。

另外，导入了多个突变的m34与野生型酶XdPH相比，可溶性显著提高，确认了通过导入多个突变而提高了可溶性表达的效率。

需要说明的是，表10所示的XdPH突变体中，m37～m49、m51～m55及m57～m59的可溶性为野生型酶XdPH以下。

＜实施例8：对XdPH基因的突变导入3＞

以实施例1中得到的质粒pJ411XdPH为模板，按照常规方法制作插入到质粒pET-28a(+)(Merck Millipore公司制)中而得到的质粒pET28aXdPH。进而，以得到的pET28aXdPH为模板，按照常规方法制作表11所示的第142位的氨基酸进行了位点特异性改造的突变体表达质粒(No.m15及m60～m77)。

[表11]

表11:制作的突变体表达质粒

＜实施例9：突变型XdPH基因表达菌体的获得2＞

使用野生型质粒pET28aXdPH及实施例8中得到的各突变体表达质粒，按照常规方法转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(インビトロジェン公司制)，得到各重组大肠杆菌。

＜实施例10：XdPH突变体的活性评价3＞

(1)酶液的准备

为了得到表达所导入的基因的菌体，对于实施例9中得到的各重组大肠杆菌(使用野生型质粒pET28aXdPH、突变体表达质粒pET28aXdPH_m15及pET28aXdPH_m60～pET28aXdPH_m77转化而得的各重组大肠杆菌)，使用LB自诱导培养基(Novagen公司制)，在30℃下培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，然后，在15℃下培养约24小时，收集菌体。

接着，通过离心分离对各重组大肠杆菌2mL分别收集菌体，悬浮于pH6.5的100mmol/L MES缓冲液。将装有得到的悬浮液0.5mL的容器浸入冰水中进行超声波破碎处理后，以20000rpm的转速进行离心分离。将得到的上清液作为L-哌可酸羟化活性评价时的酶液使用。

(2)活性评价

向塑料管中加入0.05mL的以使各成分的浓度达到表12所示的浓度的方式混合而得到的反应液，在20℃下静置10分钟而使其反应。

[表12]

表12

成分	浓度
		L-哌可酸	20mmol/L
2-酮戊二酸	40mmol/L
		L-抗坏血酸	1mmol/L
柠檬酸	2mmol/L
		硫酸铁	0.5mmol/L
MES(pH6.5)	150mmol/L
		上述(1)中准备的各酶液.	以总蛋白浓度计为约1mg/mL

将得到的反应液12.5μL加入到装有25μL的浓度31.8mmol/L的FDLA(1-氟-2,4-硝基苯基-L-亮氨酰胺)的丙酮溶液的其它塑料管中而使反应停止后，添加浓度1mol/L的碳酸钠5μL，在37℃下反应60分钟。添加浓度2mol/L盐酸的5μL而使反应停止后，加入洗脱液(包含26.5mmol/L的甲酸的3.83mol/L乙腈水溶液)427.5μL而进行稀释。使得到的稀释液从过滤器通过而除去沉淀。对于通过液，按照与实施例5相同的条件进行UPLC(注册商标)分析，测定生成的顺式-5-羟基-L-羟化哌可酸浓度。

将野生型XdPH及XdPH突变体(m15及m60～m77)的L-哌可酸羟化活性的评价结果示于表13。

表13中，L-哌可酸羟化活性以相对于使用野生型酶XdPH的反应中得到的每单位总蛋白量(单位：g)的顺式-5-羟基-L-哌可酸生成量(U/g总蛋白)的相对生成量(相对活性)形式进行评价。在此，单位(U)表示1分钟中生成1微摩尔顺式-5-羟基-L-哌可酸的能力。表13中的L-哌可酸羟化活性的表示是指以下含义。

[表13]

表13

/>

导入了单一突变的XdPH突变体中，第142位的亮氨酸被置换为精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸或半胱氨酸的m15、m60、m61、m63、m65、m72及m74与野生型酶XdPH相比，L-哌可酸羟化活性提高，这些中，第142位的亮氨酸被置换为精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或组氨酸的m15、m60、m61、m63及m65的L-哌可酸羟化活性尤其提高。

通过将作为疏水度高的氨基酸的亮氨酸置换为作为疏水度低(亲水性高)于亮氨酸的氨基酸的精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸或半胱氨酸、优选精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或组氨酸，从而具有L-哌可酸羟化活性提高的倾向。

另外，置换成虽然为疏水度低的氨基酸但具有负电荷的氨基酸(m64：谷氨酸、m62：天冬氨酸)时，未观察到L-哌可酸羟化活性的提高。

利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对野生型酶XdPH的晶体结构进行建模，结果，第142位的亮氨酸被配置在酶表面，认为通过由疏水度高的氨基酸置换为疏水度低的氨基酸，从而在水中的可溶性提高，以可溶性蛋白形式的表达量提高，L-哌可酸羟化活性提高。

＜序列表的说明＞

序列号1：针对大肠杆菌进行了密码子优化的XdPH基因序列

序列号2：XdPH氨基酸序列

序列表

<110> 株式会社API

<120> 突变型L-哌可酸羟化酶及利用其的顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法

<130> APJ366-12383

<150> JP2020-216765

<151> 2020-12-25

<150> JP2021-043441

<151> 2021-03-17

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 885

<212> DNA

<213> Xenorhabdus doucetiae

<400> 1

atgatgagcg caaaactgct ggcaagcatt gaattgaacc aagaacagat cgagcatgat 60

ctgaatattg ttggtagcga gatcctggac gtggcgtaca gcgagtatgc gtgcggcaat 120

tggggtacca ttaccctgtg gaaccacagc ggcgatgctg gcgaccagac gagccgcgaa 180

tacgttggtc aggcccgtcc gactgagctg ggccagcaat tagactgcat taatcagctg 240

atccgtaaca atttcaacat cagcctgatc aagagcgtgc gcatcttccg tagctataac 300

ggtggtgcga tctatccgca cattgactac ttggaattca accaaggttt taagcgcgtg 360

cacctggttc tgaaatccga ccgttcatgt ctgaatagcg aagagaacac ggtttatcac 420

atgctgcctg gtgaagtgtg gtttgtcgat ggtcatagcg cgcactcggc gatgagcctg 480

agccgtgtcg gcaagtactc gctggtcctg gactttgatt ctggcgccaa attcgaagat 540

ctgtattctg agagccacac cctgtgtgtt gataacctgg agccggacat tatccatgac 600

cgccagccac tgccgaccag cctgcgtgat agcctggcac acattgctga gcatgcggat 660

gaattcaata tccaatccat tctgttcctg gccacccgtt ttcactttag ctacgcagtg 720

agcattcgtg agtacttcca actcctggac gagtgctttt ctcgcaaccc gtacaagtcc 780

gttcgcgagc gttacgaagc gctgaaagac attttggtgc gtagcggtta taccagccac 840

aatgtcaatc atttcaacag cttgtccggt gtcacgatcg gctaa 885

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> Xenorhabdus doucetiae

<400> 2

Met Met Ser Ala Lys Leu Leu Ala Ser Ile Glu Leu Asn Gln Glu Gln

1 5 10 15

Ile Glu His Asp Leu Asn Ile Val Gly Ser Glu Ile Leu Asp Val Ala

20 25 30

Tyr Ser Glu Tyr Ala Cys Gly Asn Trp Gly Thr Ile Thr Leu Trp Asn

35 40 45

His Ser Gly Asp Ala Gly Asp Gln Thr Ser Arg Glu Tyr Val Gly Gln

50 55 60

Ala Arg Pro Thr Glu Leu Gly Gln Gln Leu Asp Cys Ile Asn Gln Leu

65 70 75 80

Ile Arg Asn Asn Phe Asn Ile Ser Leu Ile Lys Ser Val Arg Ile Phe

85 90 95

Arg Ser Tyr Asn Gly Gly Ala Ile Tyr Pro His Ile Asp Tyr Leu Glu

100 105 110

Phe Asn Gln Gly Phe Lys Arg Val His Leu Val Leu Lys Ser Asp Arg

115 120 125

Ser Cys Leu Asn Ser Glu Glu Asn Thr Val Tyr His Met Leu Pro Gly

130 135 140

Glu Val Trp Phe Val Asp Gly His Ser Ala His Ser Ala Met Ser Leu

145 150 155 160

Ser Arg Val Gly Lys Tyr Ser Leu Val Leu Asp Phe Asp Ser Gly Ala

165 170 175

Lys Phe Glu Asp Leu Tyr Ser Glu Ser His Thr Leu Cys Val Asp Asn

180 185 190

Leu Glu Pro Asp Ile Ile His Asp Arg Gln Pro Leu Pro Thr Ser Leu

195 200 205

Arg Asp Ser Leu Ala His Ile Ala Glu His Ala Asp Glu Phe Asn Ile

210 215 220

Gln Ser Ile Leu Phe Leu Ala Thr Arg Phe His Phe Ser Tyr Ala Val

225 230 235 240

Ser Ile Arg Glu Tyr Phe Gln Leu Leu Asp Glu Cys Phe Ser Arg Asn

245 250 255

Pro Tyr Lys Ser Val Arg Glu Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp Ile Leu

260 265 270

Val Arg Ser Gly Tyr Thr Ser His Asn Val Asn His Phe Asn Ser Leu

275 280 285

Ser Gly Val Thr Ile Gly

290

Claims (5)

1.一种突变型L-哌可酸羟化酶，其具有在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由以下的(a)～(o)组成的组中的至少1种氨基酸突变而得到的氨基酸序列，

(a)第15位的谷氨酸被置换为丙氨酸的氨基酸突变

(b)第28位的异亮氨酸被置换为脯氨酸的氨基酸突变

(c)第28位的异亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(d)第31位的缬氨酸被置换为谷氨酸的氨基酸突变

(e)第76位的半胱氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸突变

(f)第108位的异亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(g)第142位的亮氨酸被置换为精氨酸的氨基酸突变

(h)第142位的亮氨酸被置换为赖氨酸的氨基酸突变

(i)第142位的亮氨酸被置换为天冬酰胺的氨基酸突变

(j)第142位的亮氨酸被置换为谷氨酰胺的氨基酸突变

(k)第142位的亮氨酸被置换为组氨酸的氨基酸突变

(l)第202位的谷氨酰胺被置换为脯氨酸的氨基酸突变

(m)第239位的丙氨酸被置换为天冬氨酸的氨基酸突变

(n)第246位的苯丙氨酸被置换为酪氨酸的氨基酸突变

(o)第271位的异亮氨酸被置换为甘氨酸的氨基酸突变。

2.根据权利要求1所述的突变型L-哌可酸羟化酶，其特征在于，其具有在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由所述(a)～(o)组成的组中的至少2种氨基酸突变而得到的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的突变型L-哌可酸羟化酶，其特征在于，其具有在序列号2所示的氨基酸序列中导入选自由所述(a)～(o)组成的组中的至少3种氨基酸突变而得到的氨基酸序列。

4.一种顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法，其特征在于，使权利要求1～3中任一项所述的突变型L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液与L-哌可酸接触，生成顺式-5-羟基-L-哌可酸。

5.根据权利要求4所述的顺式-5-羟基-L-哌可酸的制造方法，其特征在于，使所述突变型L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下与L-哌可酸接触。