JP6370712B2 - ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法およびｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸（ｃｉｓ−５−ヒドロキシピペコリン酸とも呼ばれる）の誘導体を製造する工業的方法に関する。また、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を精製する方法に関する。

ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸は、有用な医薬中間体である。しかし、この化合物は、２つの不斉炭素を有するため、４種類の異性体が存在し、単一の異性体、あるいは単一のジアステレオマーを選択的に合成することが非常に難しい。そのため、化学変換による不要な異性体の分離や精製により純度を向上させることが必要である。

例えば、微生物や酵素を用いた水酸化反応により、２−ピペリジンカルボン酸に水酸基を導入してｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を得る方法が報告されている。しかし、目的のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の生成と同時に、３位水酸化体などの他の位置に水酸基が置換した化合物が副生することが報告されており、その分離については言及されていない(非特許文献１)。また、酵素反応により５−ヒドロキシリジンから５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を合成する方法も報告されているが(特許文献１)、生成するｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体の分離については記載されていない。特許文献１と類似の手法で５−ヒドロキシリジンから５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を合成する報告では(特許文献２)、イオン交換樹脂カラムによって異性体を分離している。この方法では、基質に対して大過剰の充填剤と溶離液を用いる必要があり、工業生産という観点においては現実的でない。
以上のように、微生物や酵素を用いて合成されたｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸から、必要な立体異性体のみを高純度で取得する方法は知られていない。

また、化学合成においては、２つの不斉炭素のうち２位の立体化学を固定できるＬ−アミノ酸を原料として使う方法が知られている。例えば、Ｌ−ピログルタミン酸を原料とする方法（特許文献３）が報告されているが、この方法では、ピペリジン環を形成する際に高価なイリジウム触媒を用いなければならないという問題があった。また、Ｌ−グルタミン酸を原料とする方法（非特許文献２、３）やプロリン誘導体を原料とする方法（非特許文献４）が報告されているが、いずれも危険性の高いジアゾ化合物を用いる必要があり、さらに多段階の複雑な工程を経由している。また、(２Ｓ,５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の分離に際して、５−オキソ−２−ピペリジンカルボン酸を経由し、これを還元して(２Ｓ,５Ｓ）体を優先的に得ているが（非特許文献４）、異性体等の不純物の除去のためにシリガゲルカラムでの分離を要し、工程負荷が大きいため、工業的に満足のいく方法ではない。

さらに、(２Ｓ,５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸やそのエステルが、ラクトン化して（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルとなることも知られているが（非特許文献４、５）、これらのラクトン化の例は、異性体等の不純物について言及しておらず、精製効果については不明であった。また、非特許文献４においては、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルは、シリカゲルカラム精製後に油状物質で得られたと記載されている。非特許文献５において、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルが結晶化することが記載されているが、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を原料としてラクトン化しているため、異性体等の不純物の挙動や精製効果については不明である。また、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸メチルのｃｉｓ／ｔｒａｎｓ混合物を酸処理して分離する報告がなされているが（非特許文献３）、カルボン酸エステルであるため、ｃｉｓ体から得られるラクトンと、ｔｒａｎｓ体のエステルを溶媒抽出等の簡便な方法により分離することが不可能であった。さらに、非特許文献３ではこの工程の収率は記載されていない。本発明者らがこの方法について検討したところ、ｃｉｓ体から得られるラクトン（（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル）と残存するｔｒａｎｓ体（(２Ｓ,５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エステル)が反応する副反応が顕著に起こり、収率が低下した。
以上のように、工業的に、安価な方法で高純度のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を製造するためには、課題が残されている。

特許第４５９０９８１号 特開２０１０−８８３９５号 ＷＯ２０１０／１２６８２０号

Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，２０１１，３５３，１３７５． Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９６，３４９． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９８８，２９，２２３１． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍ．，２００６，１７，２４７９． Ｒｅｃ.Ｔｒａｖ.Ｃｈｉｍ.Ｐａｙｓ−Ｂａｓ，１９５９, ７８, ６４８.

本発明は、医薬中間体として有用なｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法ならびにその誘導体の製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。そして、本発明者らは、不純物を含有する純度の低いｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させる工程を経て、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体へと誘導することにより、上記課題を解決した。
より具体的な一態様において、本発明者らは、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させてアミノ基が保護されたラクトンへと変換し、晶析および／または溶媒抽出をすることにより、異性体等の不純物を分離できることを見出した。すなわち、本発明者らの検討により、本発明のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体のみが、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応することによりラクトンへと変換できること、このラクトンは特定の条件下で結晶化することが明らかとなった。そして、本発明者らは、このラクトンを結晶化させ、結晶性の低い異性体等の不純物を晶析により除去する方法を開発した。
また、具体的な他の態様において、本発明者らは、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させた後、酸触媒存在下でアルコールと反応させて、アミノ基が保護されたエステルへと変換することにより、カルボキシル基を有する異性体等の不純物を溶媒抽出で除去することができることを見出した。すなわち、本発明者らの検討により、酸触媒存在下、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体のみをラクトンへ変換し、反応系中に存在するアルコールと反応させることにより、副反応を抑制してｃｉｓ体のみを効率的にエステルへと変換し、残存するカルボキシル基を有する異性体等の不純物を溶媒抽出で除去する方法を開発した。
そして、本発明者らは、得られるラクトンおよび／またはエステルを加水分解してｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とした後に、アミノ基の保護基を除去することにより、高純度のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を得られることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
[１] ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、式（１）および／または式（２）（Ｒ¹はアミノ基の保護基を表し、Ｒ²はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。）の化合物へ変換する工程を含むことを特徴とする、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法。

[２] ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させて式（１）の化合物へ変換する工程を含むことを特徴とする、[１]に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法。
[３] ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させた後、酸触媒存在下でアルコールと反応させて式（２）の化合物へ変換する工程を含むことを特徴とする、[１]に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法。
[４] ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、式（１）および／または式（２）（Ｒ¹はアミノ基の保護基を表し、Ｒ²はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。）の化合物へ変換する工程、式（１）および／または式（２）の化合物をｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に変換する工程を含むことを特徴とする、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の再生方法。

[５] ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸が、菌体反応および／または酵素反応により合成されたものであることを特徴とする、[１]〜[３]のいずれかに記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法。
[６] ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸が、菌体反応および／または酵素反応により合成されたものであることを特徴とする、[４]に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の再生方法。
[７] ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸と不純物を含む混合物を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物、または、酸ハロゲン化物および／または酸無水物ならびにアルコールと反応させて、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を式（１）および／または式（２）の化合物に変換し、次いで、該化合物を分離した後に、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に変換する工程を含むことを特徴とする、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。

[８] 不純物が２−ピペリジンカルボン酸類である、[７]に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。
[９] ２-ピペリジンカルボン酸類がｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸である、[８]に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。
[１０] 式（１）および／または式（２）の化合物の分離工程を晶析または溶媒抽出によって行うことを特徴とする、[７] から[９]のいずれかに記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。
[１１] ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸と不純物を含む混合物が、菌体反応および／または酵素反応により合成されたものであることを特徴とする、[７]から[１０]のいずれかに記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。

本発明の方法によれば、純度の高いｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸およびその誘導体を提供することができる。

不純物を含んでいてもよいｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸からｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を精製するルートの模式図。ルート１は、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させて、直接、またはｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を経由して式（１）の化合物とし、その後、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸へと変換するルートである。ルート２は、ｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を酸触媒と反応させて式（１）の化合物とし、その後、加水分解により、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸へと変換するルートである。ルート３は、ｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を酸触媒存在下、アルコールと反応させて式（２）の化合物とし、その後、加水分解により、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸へと変換するルートである。 組換えリジン水酸化酵素により得られたヒドロキシリジンのＨＰＬＣ分析の結果を示す図。 組換えリジン水酸化酵素により得られたヒドロキシリジンのＨＰＬＣ分析の結果を示す図。

以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明において、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とは、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、（２Ｒ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、またはこれらの混合物を含み、ラセミ体であってもよい。また、酸または塩基と塩を形成していてもよい。

本発明のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法は、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、式（１）および／または式（２）の化合物へ変換する工程を含む。

式（１）および（２）において、Ｒ¹はアミノ基の保護基を示すが、その具体例は以下に挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
アミノ基の保護基としては、ホルミル基、アセチル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基等のアシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；ベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−ブロモベンジル基、１−フェネチル等のアリールアルキル基；メタンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、２−ニトロベンゼンスルホニル基等のスルホニル基が挙げられる。

これらの中で好ましくは、容易に除去可能なアシル基、アルコキシカルボニル基であり、より好ましくは、アセチル基、クロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基であり、更に好ましくは工業的に安価なアセチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基である。特に好ましくは、水素添加により除去できて、不揮発性の成分を残さないためｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製負荷が軽減できる、ベンジルオキシカルボニル基である。

式（２）において、Ｒ²はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表わし、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等の１級アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、イソペンチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等の２級アルキル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の３級アルキル基等が挙げられる。これらの中で好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基であり、更に好ましくはエチル基、イソプロピル基である。

本発明において、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体は式（１）および／または式（２）の化合物そのものでもよい。
式（１）の化合物の具体例としては、５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル、５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、５−アセチル−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタンなどが挙げられる。
また、式（２）の化合物の具体例としては、ｃｉｓ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸メチル、ｃｉｓ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチル、ｃｉｓ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸イソプロピル、ｃｉｓ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸メチル、ｃｉｓ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチル、ｃｉｓ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸イソプロピルなどが挙げられる。

また、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体は式（１）および／または式（２）の化合物を化学変換して得られる化合物でもよい。
このようなｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体としては、具体的には、ｃｉｓ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、ｃｉｓ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸などのカルボン酸；ｃｉｓ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸ベンジル、ｃｉｓ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸ベンジルなどのエステル；ｃｉｓ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸アミド、ｃｉｓ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸アミド、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−（メチルカルバモイル）ピペリジン−１−カルボン酸ベンジル、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−（メチルカルバモイル）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、ｃｉｓ−２−（１−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルバモイルピロリジン−３−イルカルバモイル）−５−ヒドロキシピペリジン−１−カルボン酸ベンジル、ｃｉｓ−２−（１−ベンジルオキシカルバモイルピロリジン−３−イルカルバモイル）−５−ヒドロキシピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、ｃｉｓ−２−（１−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルバモイルピペリジン−４−イルカルバモイル）−５−ヒドロキシピペリジン−１−カルボン酸ベンジル、ｃｉｓ−２−（１−ベンジルオキシカルバモイルピペリジン−４−イルカルバモイル）−５−ヒドロキシピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルなどのカルボン酸アミド；などが挙げられる。

本発明の方法の一態様においては、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させることにより、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸のアミノ基が保護され、さらにラクトン化することにより、式（１）の化合物へ変換する。

酸ハロゲン化物および／または酸無水物としては、アミノ基を保護することができ、さらにラクトン化できるものであれば、特に限定されるものではない。酸ハロゲン化物としては、酸塩化物、酸臭化物などが挙げられるが、取扱いの容易さから酸塩化物が好ましい。酸無水物としては、カルボン酸無水物、スルホン酸無水物などが挙げられるが、入手の容易さや価格が安価であることからカルボン酸無水物が好ましい。
酸ハロゲン化物および／または酸無水物としては、具体例には、ギ酸−無水酢酸、無水酢酸、アセチルクロリド、クロロアセチルクロリド、ジクロロアセチルクロリド、トリクロロアセチルクロリド、無水トリフルオロ酢酸、プロピオニルクロリド、ベンゾイルクロリド、４−クロロベンゾイルクロリド、アセチルブロミド、プロピオニルブロミド、ベンゾイルブロミド等のアシル化剤；ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート、ベンジルオキシカルボニルクロリド、アリルオキシカルボニルクロリド、ベンジルオキシカルボニルブロミド、アリルオキシカルボニルブロミド等のアルコキシカルボニル化剤；メタンスルホニルクロリド、ｐ−トルエンスルホニルクロリド、２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド、メタンスルホニルブロミド、ｐ−トルエンスルホニルブロミド、２−ニトロベンゼンスルホニルブロミド等のスルホニル化剤などが挙げられる。
これらの中で好ましくは、アシル化剤、アルコキシカルボニル化剤であり、より好ましくはアミノ基の保護を行った後に容易に除去可能な無水酢酸、クロロアセチルクロリド、トリクロロアセチルクロリド、無水トリフルオロ酢酸、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート、ベンジルオキシカルボニルクロリド、アリルオキシカルボニルクロリドであり、更に好ましくは工業的に安価な、無水酢酸、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート、ベンジルオキシカルボニルクロリドである。特に好ましくは、水素添加により除去できて、不揮発性の成分を残さないためにｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製負荷が軽減できる、ベンジルオキシカルボニルクロリドである。

本発明においては、２種類以上の酸ハロゲン化物および／または酸無水物を用いてもよい。２種類以上の酸ハロゲン化物および／または酸無水物を用いる場合には、同時に反応系に添加することもできるが、アミノ基の保護とラクトン化の工程それぞれにおいて、別々の酸ハロゲン化物および／または酸無水物を用いることが好ましい。例えば、アミノ基の保護においてベンジルオキシカルボニルクロリドを用い、ラクトン化において無水酢酸を用いるなどの方法を行うことが好ましい。同一反応器中でアミノ基の保護とラクトン化を行う場合には、保護基の異なる副生物を抑制できるため、単一の酸ハロゲン化物および／または酸無水物を用いることが好ましい。一方、アミノ基の保護とラクトン化を別の反応器で行う場合には、反応の最適化とコスト削減の観点から、２種類以上の酸ハロゲン化物および／または酸無水物を用いることが好ましい。これらのうち、製造に必要な反応器の数を減らしコスト削減につながるため、同一反応器中でアミノ基の保護とラクトン化を行うことが、好ましい。

用いる酸ハロゲン化物および／または酸無水物の量は、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸および保護されうるアミン化合物の合計量に対して、通常１倍モル〜１０倍モル、好ましくは１．２倍モル〜５倍モル、さらに好ましくは１．５倍モル〜３倍モルである。なお、酸ハロゲン化物および／または酸無水物は複数回に分けて添加してもよい。

酸ハロゲン化物および／または酸無水物との反応の際には、必要に応じて塩基を用いてもよい。用いられる塩基の具体例は以下に挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、キヌクリジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン等の３級アミン；ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、２，６−ルチジン等のピリジン類；１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、テトラメチルグアニジン等の有機強塩基；リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド等の金属アミド；ｎ−ブチルリチウム、ｓｅｃ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、イソプロピルマグネシウムブロミド等のアルキル金属；水素化ナトリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等の金属アルコキシド；炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩；リン酸カリウム、リン酸水素ナトリウム等のリン酸塩；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム等の水酸化物；シアン化ナトリウム、シアン化カリウム等のシアン化物等が挙げられる。
好ましい塩基は、用いる保護試薬によって異なり、好ましい保護試薬である無水酢酸、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート、ベンジルオキシカルボニルクロリドを用いた場合は、好ましくは、３級アミン、ピリジン類、炭酸塩、水酸化物であり、特に好ましい保護試薬であるベンジルオキシカルボニルクロリドを用いた場合は、安価な水酸化物が特に好ましい。
塩基を用いる場合、反応液のｐＨが７〜１２となる量の塩基を加えることが好ましい。ここで、反応液のｐＨとは、水を溶媒として用いた場合には水を含む層のｐＨ、水以外の溶媒を用いた場合には、反応液と同体積の水を加えた時の水を含む層のｐＨである。水を溶媒として用いた場合には、反応液の塩基性が強すぎると式（１）の化合物が加水分解を受けるので、ｐＨが７〜１２であることがより好ましく、７〜１１であることが特に好ましい。

反応溶媒としては、水；酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル類；メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、２−ブタノールなどのアルコール類；ジエチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン類；アセトニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジノン等のアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホラン等のスルホン類；ヘキサン、ヘプタン、トルエンなどの炭化水素類；およびこれらの混合溶媒などが使用できる。これらの中では水、または水と上記の混合溶媒が好ましい。特に、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸が菌体反応および／または酵素反応により合成されたものである場合は、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸が水を主たる溶媒とした溶液として得られるため、溶液をそのまま、若しくは一部濃縮して、水を主たる溶媒として反応を行うことが、製造プロセスを簡略化できるため好ましい。

反応温度は、通常、−２０℃〜１００℃、好ましくは−１０℃〜５０℃である。高温での反応は試薬や生成物の分解を招くおそれがあるため、さらに好ましくは、０℃〜３０℃である。

なお、アミノ基の保護とラクトン化は、酸ハロゲン化物および／または酸無水物を加えることによって行うことが好ましい（図１のルート１）。特にアミノ基の保護とラクトン化を単一の酸ハロゲン化物および／または酸無水物を用いて、同一反応器で行うことが、操作を簡略化できるため好ましい（図１のルート１の上式）。

また、アミノ基の保護とラクトン化を異なる反応条件で行ってもよい（図１のルート２）。すなわち、酸ハロゲン化物および／または酸無水物を加えてアミノ基を保護し、その後、酸触媒を用いてラクトン化させてもよい。アミノ基の保護とラクトン化を異なる反応条件で行う際には、アミノ基の保護の段階では式（１）の化合物の生成を抑制することが好ましい。酸ハロゲン化物および／または酸無水物の使用量をアミノ基に対して１倍モルにする、または、酸ハロゲン化物および／または酸無水物がアミノ基に対して過剰に存在しないよう、分割して添加し、原料であるｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸がほぼ消失したところで反応を停止することにより、アミノ基の保護のみを効率的に行うことができる。また、水を含む溶媒中でアミノ基の保護を行う場合には、反応液のｐＨを強塩基性にする、室温以上に昇温する、長時間反応させるなどの方法、あるいはこれらを組み合わせることによって、ラクトン化により式（１）の化合物が生じていても加水分解されるので、アミノ基の保護体を得ることができる。次いで、アミノ基が保護された化合物を酸触媒と反応させることにより式（１）の化合物が得られる。

生成した式（１）の化合物は後述の晶析などの方法により単離できる。

本発明の方法の他の態様においては、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させた後、酸触媒存在下でアルコールと反応させて式（２）の化合物へ変換する（図１のルート３）。酸触媒存在下でアルコールと反応させることにより、酸ハロゲン化物および／または酸無水物との反応により生成した式（１）の化合物が式（２）の化合物に変換される。この際、式（１）の化合物以外のカルボキシル基を有する不純物、特に後述の２−ピペリジンカルボン酸類が含まれる場合、この化合物は式（１）の化合物のようなラクトンに変換されないため、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に由来する化合物を選択的にエステルである式（２）の化合物に変換することができ、それ以外の化合物をカルボン酸のまま反応系中に残すことができる。そして、塩基性水溶液で抽出することにより、式（２）の化合物を有機層へ、それ以外の不純物を水層へと分離することができる。

ここで使用されるアルコールとしては、Ｃ１〜Ｃ６のアルコールであれば、特に限定されるものではないが、メタノール、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール等の１級アルコール；２−プロパノール、２−ブタノール、シクロペンタノール、シクロヘキサノール等の２級アルコール；ｔｅｒｔ-ブタノール等の３級アルコールなどが挙げられる。これらの中で好ましくは２級アルコールであり、安価かつ沸点が低く除去の容易な２−プロパノールがより好ましい。１級アルコールを用いる場合、酸触媒の存在下でカルボン酸から直接エステルに変換される副反応があるために、不純物の除去の効果が低下するおそれがある。また、３級アルコールを用いる場合、式（１）の化合物との反応性が低いため、２級アルコールである式（２）の化合物が式（１）の化合物と反応して一部二量化し、式（２）の化合物の収率が低下するおそれがある。そのため、本発明においては２級アルコールを用いることが好ましい。
なお、酸触媒と水の存在下に、上記アルコールのエステルを添加し、該エステルの加水分解反応により反応系にアルコールが存在するようにして、酸触媒存在下に、ｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とアルコールを反応させてもよい。
加えるアルコールまたはアルコールを生じるエステルは過剰に用いることができ、その使用量は、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して通常１倍モル〜５００倍モルである。使用量が少ないと式（２）の化合物が式（１）の化合物と反応して２量化する副反応が起きる一方、使用量が多いと酸触媒の効果を弱めるため、２倍モル〜１００倍モルが好ましく、３倍モル〜５０倍モルがより好ましく、５倍モル〜２０倍モルが特に好ましい。

酸触媒としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ポリリン酸等の無機酸；ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸等のスルホン酸類；酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、安息香酸、シュウ酸等のカルボン酸類などが挙げられる。これらの中で好ましくは、有機溶媒に対する溶解度が高く、反応を進行させる上で十分強い酸性度を有するスルホン酸類であり、より好ましくは工業的に安価なｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸である。
加える酸触媒の量は、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して通常０．００１倍モル〜１０倍モルである。少なすぎると反応が遅く、多すぎると後処理の負荷が大きくなるので、０．０１倍モル〜５倍モルが好ましく、０．０２倍モル〜１倍モルがより好ましく、０．０５倍モル〜０．５倍モルが特に好ましい。

反応溶媒としては、ギ酸、酢酸などの有機酸類；酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル類；メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、２−ブタノールなどのアルコール類；ジエチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン類；アセトニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジノン等のアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホラン等のスルホン類；ヘキサン、ヘプタン、トルエンなどの炭化水素類；およびこれらの混合溶媒などが使用できる。これらのうち、プロトンが配位しない溶媒が酸触媒の活性を弱めないため好ましく、具体的には、炭化水素類が好ましい。また、それ自身が酸である有機酸類、加水分解により酸を生成するエステル類も好ましい。更に好ましくは、安価かつ高い反応速度が得られ、酸触媒の溶解度も高いトルエンである。

反応温度は、通常０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜１２０℃である。高温での反応は副反応を引き起こすが、低温では反応が遅く長時間を必要とするため、さらに好ましくは、４０℃〜８０℃である。

生成した式（２）の化合物は後述の有機溶媒を用いた抽出法などの方法により単離できる。

上記式（１）および（２）の化合物は塩基で処理することにより、ｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に変換することができる。

ここで用いる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム等の水酸化物；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム等のリン酸塩；炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム等の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸水素塩等が挙げられ、好ましくは水酸化物である。
用いる塩基の量は、上記式（１）および（２）の化合物の合計量に対して、通常０．１倍モル〜１０倍モル、好ましくは０．５倍モル〜５倍モル、さらに好ましくは０．９倍モル〜３倍モルである。

また、ｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して、アミノ基の脱保護を行うことにより、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸（ｃｉｓ−５−ヒドロキシピぺコリン酸）を製造することができる。特に、上記式（１）および（２）の化合物においてＲ¹がベンジルオキシカルボニル基の場合、水素添加反応によりアミノ基の脱保護を行うことができる。水素添加反応は、例えば、パラジウム炭素触媒を用いることにより行うことができる。以上の反応によってｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸が再生される。

本発明のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法は、不純物を含有するｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸から、純度の高いｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を精製する方法である。

不純物としては、２−ピペリジンカルボン酸類、アミノ酸類、ペプチド類、糖類、脂肪酸類などが挙げられる。これらの中で、２−ピペリジンカルボン酸類、アミノ酸類、およびペプチド類はアミノ基とカルボキシル基を有しているため、イオン交換樹脂精製などの通常の精製方法では、目的のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸との分離が困難である。特に２−ピペリジンカルボン酸類は、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸と共通の骨格を有しているため、その分離が非常に難しく、その除去方法の確立は非常に重要である。
２−ピペリジンカルボン酸類としては、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の異性体、２−ピペリジンカルボン酸とその類縁体が挙げられる。ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の異性体としては、ｔｒａｎｓ体を含む立体異性体や水酸基の位置などが異なる構造異性体などが挙げられる。なお、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の光学異性体は、本発明の不純物には含まない。
ｔｒａｎｓ体としては、ｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、すなわち（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、（２Ｒ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、及びそれらの混合物が挙げられる。構造異性体としては、ｃｉｓ−２−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、ｔｒａｎｓ−２−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、ｃｉｓ−３−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸などが挙げられる。なお、ｃｉｓ−４−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸は、本発明の不純物には含まない。
２−ピペリジンカルボン酸とその類縁体としては、２−ピペリジンカルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロ−２−ピリジンカルボン酸などが挙げられる。
アミノ酸類としては、プロリン、リジン、イソロイシン等の必須アミノ酸；３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン等の非天然アミノ酸などが挙げられる。
ペプチド類としては、ジペプチド、オリゴペプチド、タンパク質などが挙げられる。
糖類としては、グルコース、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム等が挙げられる。
脂肪酸類としては、炭素数２〜４個の低級脂肪酸、炭素数５〜１２個の中鎖脂肪酸、炭素数１３個以上の長鎖脂肪酸、グリセロールエステル類などが挙げられる。

ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸と不純物を含む混合物を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物、または、酸ハロゲン化物および／または酸無水物ならびにアルコールと反応させて、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を式（１）および／または式（２）の化合物に変換する。次いで、該化合物を晶析や溶媒抽出などによって分離した後、これを塩基で処理することによってｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に変換し、さらにアミノ基の脱保護を行うことにより、不純物が分離された、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を得ることができる。
すなわち、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸が特異的にラクトン化される性質を利用して不純物と分離することができる。また、混合物中に上記以外の不純物が含まれている場合、それらの不純物とも分離することができる。
本明細書中において、晶析とは、溶液中に貧溶媒、酸、塩基等を添加する、又は水等の良溶媒を共沸除去することによって、目的物の溶解度を下げ、結晶として取り出す通常の晶析に加え、一旦得られた粗結晶等を適当な溶媒に溶解させた後、再度結晶化させる再結晶も含む。また、溶液中に種結晶を添加することにより、結晶化を促進してもよい。
式（１）の化合物の晶析においては、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させて得た式（１）の化合物の粗生成物から晶析を行うことが好ましい。これは、酸ハロゲン化物および／または酸無水物から生じる酸性成分や、その他の試薬由来の成分が微量に残存し、結晶化を誘発すると考えられるためである。

晶析処理における晶析溶媒としては、水；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルなどのエステル類：メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、２−ブタノールなどのアルコール類；ジエチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン類；アセトニトリルなどのニトリル類；ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類；トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；およびこれらの混合溶媒などが使用できるが、これらの中では、式（１）および／または式（２）の化合物に対する溶解度が十分低いアルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、およびこれらの混合溶媒が好ましく、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、およびこれらの混合溶媒がより好ましく、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、およびこれらの混合溶媒が特に好ましい。

抽出に用いる有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルなどのエステル類；ジエチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類；ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類；トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類などの非水溶性溶媒が挙げられる。

上記方法は、特に、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の混合物からｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を精製するときに特に有効である。

すなわち、本発明の精製方法の一態様（図１のルート１または２）においては、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の混合物を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させて、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を式（１）の化合物に変換する。これを晶析または有機溶媒抽出によって分離し、該化合物を塩基で処理することによりｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に変換し、さらにアミノ基の脱保護を行うことにより、ｔｒａｎｓ体と分離されたｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を得ることができる。
この場合、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の合計量に対して１倍モルを超える過剰量の酸ハロゲン化物および／または酸無水物を用いることが好ましい。酸ハロゲン化物および／または酸無水物の量は、通常１倍モル〜１０倍モル、好ましくは１．２倍モル〜５倍モル、さらに好ましくは１．５倍モル〜３倍モルである。なお、酸ハロゲン化物と酸無水物の両方を用いる場合は、合計量がｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の合計量に対して１倍モルを超えるようにする。
酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させることによりｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸は式（１）の化合物に変換される。一方、ｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸は、変換されないまま反応系中に残存するか、下記に示すｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の混合酸無水物に変換される。この混合酸無水物は後処理によってｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に戻すこともできる。よって、晶析反応により、これらを分離することができる。

本発明の精製方法の他の態様（図１のルート３）においては、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の混合物を、酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させ、アミノ基を保護した後、生じたｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、酸触媒の存在下、アルコール（またはアルコールを生じるエステル）と反応させることにより、式（１）の化合物を経由して（２）の化合物に変換する。これを有機溶媒抽出によって分離し、該化合物を塩基で処理することによりｃｉｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に変換し、さらにアミノ基の脱保護を行うことにより、ｔｒａｎｓ体と分離されたｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を得ることができる。
この場合、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の合計量に対して１倍モル程度の酸ハロゲン化物および／または酸無水物を用いることが好ましい。
酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させ、アミノ基を保護した後、酸触媒の存在下、アルコール（またはアルコールを生じるエステル）と反応させることによりｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸は式（２）の化合物に変換されるが、ｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸は下記のｔｒａｎｓ−Ｎ−保護−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に変換される。よって、有機溶媒抽出により、これらを分離することができる。

なお、上記「不純物を含有するｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸」や「ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の混合物」は菌体反応および／または酵素反応により合成されたものであってもよい。例えば、特許第４５９０９８１号の実施例２９に記載の方法により、「ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の混合物」を得ることができる。また、上記「不純物を含有するｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸」や「ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の混合物」は、本発明の方法によりｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体を分離した後の回収物であってもよい。

菌体反応および／または酵素反応により合成された「不純物を含有するｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸」や「ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸とｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の混合物」から、本発明の方法によってｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を精製する場合、得られたｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸について、さらに、活性炭を用いた吸着精製および／または、水を含む溶媒を用いた晶析を行って、着色物質などの不純物を除いてｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の純度をさらに上げることが好ましい。

活性炭としては、石炭系、木質系、ヤシ穀系、樹脂系など任意の公知のものを用いることができる。また、これら石炭系、木質系、ヤシ穀系、樹脂系などの各種原料活性炭を、ガス賦活法、水蒸気賦活法、塩化亜鉛やリン酸などの薬品賦活法などの方法により賦活した活性炭を用いることができる。
具体的には、三菱化学カルゴン株式会社製のカルゴンＣＰＧ、カルゴンＣＡＬ、カルゴンＳＧＬ、ダイアソーブＷ、ダイアホープＭＳ１０、ダイアホープＭ０１０、ダイアホープＭＳ１６、ダイアホープ６ＭＤ、ダイアホープ６ＭＷ、ダイアホープ８ＥＤ、ダイアホープＺＧＮ４、ＣＥＮＴＵＲ、日本ノリット株式会社製のＧＡＣ、ＧＡＣ ＰＬＵＳ、ＧＣＮ ＰＬＵＳ、Ｃ ＧＲＡＮ、ＲＯ、ＲＯＸ、ＤＡＲＣＯ、ＣＮ、ＳＸ、ＳＸ ＰＬＵＳ、ＳＡ、ＳＸ、ＰＫ，Ｗ、クラレケミカル株式会社製のＧＷ、ＧＷＨ、ＧＬＣ、４ＧＣ、ＫＷ、ＰＷ、ＰＫ、株式会社ツルミコール社製のＨＣ−３０Ｓ、ＧＬ−３０Ｓ、４Ｇ−３Ｓ、ＰＳ、ＰＣ、フタムラ化学株式会社製のＰ、Ｗ、ＣＷ、ＳＧ、ＳＧＰ、Ｓ、ＧＢ、ＣＡ、Ｋ、日本エンバイロケミカルズ株式会社製の白鷺ＫＬ、白鷺Ｗ２Ｃ、白鷺ＷＨ２Ｃ、白鷺Ｗ５Ｃ、白鷺ＷＨ５Ｃ、白鷺ＷＨ５Ｘ、白鷺ＸＳ７１００Ｈ−３、カルボラフィン、白鷺Ａ、白鷺Ｃ、白鷺Ｍ、味の素ファインテクノ株式会社社製のホクエツＣＬ−Ｋ、ホクエツＨＳ、ホクエツＫＳなどが挙げられる。
この操作により、波長４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲に吸収を有する不純物を除去できる。

また、晶析に用いられる水を含む溶媒としては、水溶性の有機溶媒が使用できる。具体的には、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類；酢酸エチルなどのエステル類；メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノールなどのアルコール類；テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトンなどのケトン類；アセトニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジノン等のアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホラン等のスルホン類；およびこれらの混合溶媒が挙げられ、これを用いてｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の晶析を行い、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の純度をさらに上げることも好ましい。これらのうち、好ましくはより水溶性の高い有機酸類、アルコール類、ケトン類であり、より好ましくはアルコール類、ケトン類であり、特に好ましくはエタノール、アセトンである。

［実施例］
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。

本実施例における定量分析は、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用い、以下の条件で測定を行った。
＜ＨＰＬＣ−１＞
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ製Ａｓｔｅｃ ＣＬＣ−Ｄ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ)
移動相：２ｍｍｏｌ／Ｌ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４５℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ

＜ＨＰＬＣ−２＞
カラム：化学物質評価研究機構製Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ)
、移動相：
Ａ：０．１重量％トリフルオロ酢酸水溶液
Ｂ：メタノール
Ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｂ濃度）：０分２０％→２分２０％→１０分８０％→２０分８０％流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２００ｎｍ

＜ＨＰＬＣ−３＞
カラム：アジレント社製ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、１.８μｍ)
移動相：
Ａ：０．１重量％リン酸水溶液
Ｂ：アセトニトリル
Ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｂ濃度）：０分５５％→６分５５％→９分８０％→１２分８０％
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ

＜ＨＰＬＣ−４＞
カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ₁₈−ＡＲ−ＩＩ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ)
移動相：５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．７）
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ３４０ｎｍ

＜ＨＰＬＣ−５＞
カラム：住化分析センター社製ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−６１００（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ)
移動相：１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸銅
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：３０℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ

＜ＨＰＬＣ−６＞
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ社製ＣＬＣ−Ｄ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ)
移動相：２ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸銅
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：３０℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ

[参考例１]
［Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＤｐｋＡ）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（以下、ＡＩＰ）、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）、及びアミノ酸ラセマーゼ（以下、ＫＲ）を共発現した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）の調製例］
（１）遺伝子のクローニング
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来ＤｐｋＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＤ８９７４３、配列番号２）をコードする遺伝子配列（以下ｄｐｋＡ、配列番号１）を元に、ｄｐｋＡ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｄｐｋＡ＿Ｆ（配列番号９）とｄｐｋＡ＿Ｒ（配列番号１０）を設計、合成した。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲを行い、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
マサバ（Ｓｃｏｍｂｅｒ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＣ００４９９）からシグナルペプチドを除いた配列のタンパク質ＡＩＰ（配列番号４）をコードする遺伝子配列（以下ａｉｐ、配列番号３）を設計し、人工合成した。さらにａｉｐ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーａｉｐ＿Ｆ（配列番号１１）とａｉｐ＿Ｒ（配列番号１２）を設計、合成した。常法に従ってＰＣＲを行い、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来ＧＤＨ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿３８８２７５）において９６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したタンパク質（配列番号６）をコードする遺伝子配列（以下ｇｄｈ、配列番号５）を元に、ｇｄｈの遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｇｄｈ＿Ｆ（配列番号１３）とｇｄｈ＿Ｒ（配列番号１４）を設計、合成した。常法
に従ってＰＣＲを行い約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のＫＲ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿７４５８５５、配列番号８）をコードする遺伝子配列（以下ｋｒ、配列番号７）を元に、ｋｒ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｋｒ＿Ｆ（配列番号１５）とｋｒ＿Ｒ（配列番号１６）を設計、合成した。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲを行い、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。

（２）発現用プラスミドの調製
上記（１）で得られたＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＸｂａＩにより消化した国際公開公報ＷＯ２０１２／０２９８１９号に記載のプラスミドｐＫＷ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、それぞれｐＫＷ３２ｄｐｋＡ，ｐＫＷ３２ａｉｐ，ｐＫＷ３２ｇｄｈ，ｐＫＷ３２ｋｒを得た。
続いて、ｐＫＷ３２ａｉｐをＳｐｅＩ及びＮｄｅＩにより消化してａｉｐを含む約２．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＫＷ３２ｄｐｋＡをＸｂａＩ及びＮｄｅＩにより消化して得られた開環プラスミド約４．２ｋｂｐのｄｐｋＡの下流に導入して、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ）を得た。
さらに、ｐＫＷ３２ｇｄｈをＳｐｅＩ及びＮｄｅＩにより消化してｇｄｈを含む約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ、ａｉｐ）をＸｂａＩ及びＮｄｅＩにより消化して得られた開環プラスミド約５．７ｋｂｐのａｉｐの下流に導入して、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ）を得た。
最後に、ｐＫＷ３２ｋｒをＳｐｅＩ及びＮｄｅＩにより消化してｋｒを含む約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ）をＸｂａＩ及びＮｄｅＩにより消化して得られた開環プラスミド約６．５ｋｂｐのｇｄｈの下流に導入して、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）を得た。

（３）発現株の調製
上記（２）で得られたプラスミドｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）を用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）を得た。

[参考例２]
［５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸反応液の調製例］
１Ｌのジャーファーメンタ−（エイブル社製、型式ＢＭＪ）に、５−ヒドロキシリジン塩酸塩を４５ｇ（２３０ｍｍｏｌ、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９６２，３５，２００６に記載の方法に準じて調製）、アデカノールＬＧ−１０９を２．２７ｍＬ、グルコースを６７．３４ｇ（３７４ｍｍｏｌ）仕込み、水で溶解した後、２０重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨを８にした。この液に、牛肝臓由来カタラーゼ（和光純薬社製）を２，０００Ｕ／Ｌ、ＮＡＤＰ⁺（オリエンタル酵母社製）を０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、参考例1で調製した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）の湿菌体を２５ｇ／Ｌとなるように添加し、水を加えて液量を５６６ｍＬとして、３０℃、攪拌数５００ｒｐｍ、通気量約１Ｌ／ｍｉｎで４３時間反応させた。反応中は、２０重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨを８に保持した。全く同様の操作をさらに２回実施し、得られた計３回分（５−ヒドロキシリジン塩酸塩１３５ｇ、６９０ｍｍｏｌ）の反応液を混合した液に、濃度６ｍｏｌ／Ｌの硫酸を滴下してｐＨを２．５にした。その後、２０重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨを４とした液を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶性不純物を除去した。さらに、得られた上清を精密ろ過膜（旭化成社製）、続いて限外ろ過膜（旭化成社製）に通して、不純物を除去した。得られた溶液に含まれる５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を、＜ＨＰＬＣ−１＞の条件でＨＰＬＣ分析した結果、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の収量は４３．９ｇ（３０２ｍｍｏｌ、収率４４％）、（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の収量は、２９．７ｇ（２０５ｍｍｏｌ、収率３０％）であった。

＜１−１＞ （１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルの製造
参考例２の方法に準じて得られた、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸２０．７ｇ（１４３ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸１８．０ｇ（１２４ｍｍｏｌ）を含有する反応液１１５３ｇ[（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝５３．６：４６．４（モル比）]に１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（６０ｍＬ）を添加し、ｐＨを３．６５から１０．８１に調整した。減圧下で濃縮を行い、４２２．４ｇのスラリー溶液を得た。得られたスラリーを２１１．２ｇずつに分けて、２つのフラスコに仕込み、それぞれ内温を５℃〜７℃に冷却し、それぞれのフラスコについて以下の操作を実施した。
[以下、一方のフラスコでの操作について記載する。１つのフラスコには、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸１０．４ｇ（７２ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸９．０ｇ（６２ｍｍｏｌ）を含有する]。

フラスコに、ベンジルオキシカルボニルクロリド１８．８ｍＬ（１３３ｍｍｏｌ）を滴下した後、１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１３．３ｍＬ（１３３ｍｍｏｌ）を添加してｐＨを９〜１０程度に調整し、１０℃〜２０℃の範囲内で１０分間反応させた。更に、ベンジルオキシカルボニルクロリド１８．８ｍＬ（１３３ｍｍｏｌ）を滴下した後、１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１３．５ｍＬ（１３５ｍｍｏｌ）を添加して、ｐＨ９〜１１に調整し、１０℃〜２０℃の範囲内で３時間反応させた。水１９ｍＬを添加した後、更に、ベンジルオキシカルボニルクロリド６．２ｍＬ（４４ｍｍｏｌ）を滴下した後、徐々に室温まで昇温した。トルエン２００ｍＬを添加し、１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液４ｍＬ（４０ｍｍｏｌ）を添加してｐＨ１１に調整した後、有機層を分離した。水層にトルエン１００ｍＬを添加して再抽出を行い、水層を分離して有機層を取得した。先に取得した有機層と合わせた後、水１０ｍＬで洗浄し、有機層を分離した。２つのフラスコそれぞれから得られた有機層を、減圧下、３５℃で溶媒を留去し、黄色油状物質６４．９ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルを４５重量％（１１１ｍｍｏｌ、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して収率７８％）、（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸＝ベンジルオキシギ酸＝無水物を１５重量％（２３ｍｍｏｌ、（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して収率１９％）、ベンジルアルコールを３６重量％、トルエンを５重量％含有する混合物であった。このように、原料の５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸において、（２Ｓ,５Ｓ）：（２Ｓ：５Ｒ）＝５３．６：４６．４（モル比）であったが、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルへと変換することにより、（２Ｓ，５Ｒ）の立体化学を有する化合物を効果的に除去することが出来、（２Ｓ,５Ｓ）：（２Ｓ：５Ｒ）＝８２．８：１７．２（モル比）にまで（２Ｓ，５Ｓ）の立体化学を有する化合物の純度を上げることができた。

この粗生成物を１０℃〜１５℃に冷却し、トルエン３６ｍＬとヘキサン３６ｍＬを添加したところ、白色固体が析出した。析出した白色固体をろ過し、ヘキサン１００ｍＬを振りかけて洗浄した後、得られた白色固体を室温で減圧乾燥し、２０．７ｇの白色固体を取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この白色固体は、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルを９２．５重量％（（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して収率５１％）、（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸＝ベンジルオキシギ酸＝無水物を７．５重量％含有する混合物であることが確認された。晶析の結果、（２Ｓ,５Ｓ）：（２Ｓ：５Ｒ）＝９２．５：７．５（モル比）にまで（２Ｓ，５Ｓ）の立体化学を有する化合物の純度を上げることができた。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）
δ１．７７−１．８５（１Ｈ，ｍ），２．０２−２．２５（３Ｈ，ｍ），３．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），３．７０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１２．２，３．３Ｈｚ），４．７０−４．８６（２Ｈ，ｍ），５．１２−５．２１（２Ｈ，ｍ），７．３２−７．４０（５Ｈ，ｍ）．

＜１−１’＞ （１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルの製造
参考例２の方法に準じて得られた、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸１．７４ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸１．０１ｇ（７．０ｍｍｏｌ）を含有する反応液８０ｇ[（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝６３．２：３６．８（モル比）]に１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを３．６５から９．８に調整した。減圧下で濃縮を行い、３８ｇの溶液を得た。その溶液に２−プロパノールを３．１ｍＬ添加した。得られた溶液の内温を２５℃付近に設定した。ベンジルオキシカルボニルクロリド３．２ｇ（１８．８ｍｍｏｌ）を滴下した後、４０重量％水酸化ナトリウム水溶液２．３ｇ（２２．６ｍｍｏｌ）を添加して２０℃〜２５℃の範囲内で３０分間反応させた。更に、ベンジルオキシカルボニルクロリド３．２ｇ（１８．８ｍｍｏｌ）を滴下した後、４０重量％水酸化ナトリウム水溶液２．３ｇ（２２．６ｍｍｏｌ）を添加して、２０℃〜２５℃の範囲内で３０分間反応させた。その後、ベンジルオキシカルボニルクロリド１．６ｇ（９．４ｍｍｏｌ）を滴下した後、４０重量％水酸化ナトリウム水溶液を１．１ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）滴下して２０℃〜２５℃の範囲内で３０分間反応させる操作を３回繰り返した。その後、反応液を０℃〜５℃まで冷却し、系内に生成した結晶をろ過した。得られた結晶を４０℃〜４５℃にて減圧乾燥を行ない、２ｇの白色結晶を得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、得られた結晶は、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル（８０重量％、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して収率５６％）であった。

＜１−１’’＞ （１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルの製造
参考例２の方法に準じて得られた、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸３．２６ｇ（２２．５ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸２．２４ｇ（１５．４ｍｍｏｌ）を含有する反応液１６０ｇ[（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝５９．４：４０．６（モル比）]に１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを３．６５から９．５に調整した。減圧下で濃縮を行い、７４ｇの溶液を得た。その溶液に２−プロパノールを６．０ｍＬ添加した。得られた溶液の内温を２５℃付近に設定した。ベンジルオキシカルボニルクロリド６．４ｇ（３７．６ｍｍｏｌ）を滴下した後、４０重量％水酸化ナトリウム水溶液４．５ｇ（４５．２ｍｍｏｌ）を添加して２０℃〜２５℃の範囲内で３０分間反応させた。ベンジルオキシカルボニルクロリド６．４ｇ（３７．６ｍｍｏｌ）を滴下した後、４０重量％水酸化ナトリウム水溶液４．５ｇ（４５．２ｍｍｏｌ）を添加して２０℃〜２５℃の範囲内で、更に３０分間反応させた。その後、ベンジルオキシカルボニルクロリド３．２ｇ（１８．８ｍｍｏｌ）を滴下した後、４０重量％水酸化ナトリウム水溶液を２．３ｇ（２２．６ｍｍｏｌ）滴下して２０℃〜２５℃の範囲内で３０分間反応させた。その後、ベンジルオキシカルボニルクロリド１．９ｇ（１１．１ｍｍｏｌ）を滴下した後、４０重量％水酸化ナトリウム水溶液を１．４ｇ（１４．０ｍｍｏｌ）滴下して２０℃〜２５℃の範囲内で３０分間反応させた。その反応液に７１ｍＬのトルエンを添加後、分液操作を実施した。抽出した有機層に１３ｍＬの水と４０重量％水酸化ナトリウム水溶液を６．２ｇ添加した後、さらに分液操作を実施した。得られた水層３２ｇは２分割し、精製法ＡおよびＢを行なった。

精製法Ａ：無水酢酸添加
＜１−１’’＞で得られた水層１６ｇに９．１ｇ（８９ｍｍｏｌ）の無水酢酸を添加した。得られた結晶をろ過し、４０℃〜４５℃にて減圧乾燥を行なった。乾燥後の結晶の概観は白色であり、重量は１．５ｇであった。
得られた結晶を、＜ＨＰＬＣ−３＞の条件でＨＰＬＣ分析した結果、得られた結晶は、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル（１００重量％、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して収率５０％）であった。

精製法Ｂ：酸性にして抽出
＜１−１’’＞で得られた水層１６ｇに３０ｍＬの水を添加し、５ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えて系内のｐＨを１．０７とした。その後、酢酸エチルを５５ｍＬ添加して分液操作を実施した。分液後、得られた水層に５５ｍＬの酢酸エチルを添加して、再度分液操作を実施した。得られた有機層を合わせて、重量が半分になるまで減圧下で濃縮を行った。得られた有機層にトリエチルアミン２．９ｇ（２８．１ｍｍｏｌ）と無水酢酸２．９ｇ（２８．１ｍｍｏｌ）を２０℃〜２５℃にて添加した。３０分攪拌した後、トリエチルアミン０．５７ｇ（５．６ｍｍｏｌ）と無水酢酸０．５７ｇ（５．６ｍｍｏｌ）を２０℃〜２５℃にて追加した。３０分攪拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｇを反応液に添加した。分液後、得られた水層にトルエン７１ｍＬを添加して、再度抽出操作を行なった。
得られた有機層を合わせて、減圧下で濃縮を行った。得られた濃縮液を０℃〜５℃に冷却すると、結晶が析出した。得られた結晶をろ過し、４０℃〜４５℃にて減圧乾燥を行なった。乾燥後の結晶は白色であり、重量は２．４ｇであった。得られた結晶を、＜ＨＰＬＣ−３＞の条件でＨＰＬＣ分析した結果、得られた結晶は、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル（９
８重量％、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に対して収率７０％）であった。

＜１−２＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜１−１＞で得られた（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル２０．０ｇ（９２．５重量％、７１ｍｍｏｌ）、エタノール６０ｍＬを仕込み、室温で、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液７６．５ｍＬを添加し、１時間攪拌した。減圧下、３５℃〜４０℃で溶媒を留去し、黄色油状物質６１．２ｇを取得した。これに酢酸エチル１００ｍＬを添加して、有機層を分離した。得られた水層に５ｍｏｌ／Ｌ塩酸１４ｍＬを添加して、ｐＨ１．２に調整した。酢酸エチル２００ｍＬを用いて、水層を２回抽出し、得られた有機層を水２ｍＬで洗浄した。有機層を分離した後、減圧下、３５℃〜４０℃で溶媒を留去し、薄黄色油状物質２４．０ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この薄黄色油状物質は（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸（純度７６重量％、６５ｍｍｏｌ、収率９２％）であることが確認された。なお、¹Ｈ−ＮＭＲで（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸のピークは全く観測されなかった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，回転異性体混合物）
δ１．２７−１．３９（１Ｈ，ｍ），１．７０−１．８５（１Ｈ，ｍ），１．９８−２．０６（１Ｈ，ｍ），２．２７−２．３９（１Ｈ，ｍ），２．８０（０．４Ｈ, ｔ, Ｊ＝１１．８Ｈｚ），２．８７（０．６Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），３．６１−３．７２（１Ｈ，ｍ）４．１８−４．３３（１Ｈ，ｍ），４．８１−４．８８（０．４Ｈ，ｍ），４．９３−４．９８（０．６Ｈ，ｍ），５．１２−５．２１（２Ｈ，ｍ），７．２８−７．４０（５Ｈ，ｍ）．

＜１−３＞ （２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜１−２＞で得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸１８．０ｇ（６４．５ｍｍｏｌ）、エタノール９０ｍＬ、１０％パラジウム炭素２．５ｇ（エヌ・イー ケムキャット社製、ＰＥ−ｔｙｐｅ、５５．３％含水品）を仕込み、常温、常圧の条件で水素添加を行った。３時間後、水２２ｍＬを添加し、常温、常圧の条件で水素添加を行い、８．５時間後に原料の消失を確認した。ろ過によりパラジウム炭素を除去し、水１００ｍＬを振りかけて洗浄した。得られた濾液を、減圧下、４５℃〜５５℃で溶媒を留去して、１１．６ｇの白色スラリーを取得した。
得られたスラリーを、＜ＨＰＬＣ−１＞の条件でＨＰＬＣ分析した結果、スラリー中に含有される５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸は、純度６５重量％、６４．５ｍｍｏｌ、収率８１％であった。異性体比は、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸：（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸＝９８．８：１．２であった。＜１−１＞で使用した原料は、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝５３．７：４６．３（モル比）と低純度であったが、本発明の手法により、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝９８．８：１．２（モル比）まで精製された。

＜１−４＞ 活性炭処理、結晶化
フラスコに、＜１−３＞で得たスラリー０．３８ｇ（純度６５重量％、１．７ｍｍｏｌ）、水２．５ｍＬ、三菱カルゴン社製活性炭ＣＡＬ ０．０２５ｇ、三菱カルゴン社製活性炭６ＥＤ ０．０２５ｇを入れ、室温で１時間攪拌後、活性炭をろ過により除き、水溶液を０．５ｍＬまで濃縮した。濃縮液を攪拌しながら、エタノール５．０ｍＬを滴下し、５℃まで冷却した。徐々に結晶が析出した。５℃を保ちながら、1時間攪拌を続け、５℃のままアセトン２．０ｍＬを滴下し、さらに０．５時間攪拌した。その後、析出した結晶をろ過し、氷冷したエタノール／アセトン溶液（＝５／２容量比）１．０ｍＬを結晶に振りかけて洗浄した。結晶を６０℃で減圧乾燥を行い、０．２５ｇ（純度９８重量％、収率９９．２％）の結晶を得た。
得られた結晶を、＜ＨＰＬＣ−１＞の条件でＨＰＬＣ分析した結果、得られた結晶中に含有する５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の異性体比は、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸：（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸＝９９．５：０．５であった。

＜２−１＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
参考例２の方法に準じて得られた（２Ｓ,５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．７２３ｇ（４．９８ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ,５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．８３０ｇ（５．７２ｍｍｏｌ）を含有する反応液１２４ｍＬ[（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝４６．５：５３．５（モル比）]に５０重量％水酸化ナトリウム水溶液２．８８ｍＬ（３６ｍｍｏｌ）を添加した後、バス温４０℃、５０ｈＰａで減圧下で濃縮し、１３２ｇの溶液を得た。得られた溶液に、水浴下、ベンジルオキシカルボニルクロリド３．１ｍＬ（２２ｍｍｏｌ）と５０重量％水酸化ナトリウム水溶液０．４４ｍＬ（５．５ｍｍｏｌ）をｐＨ９程度に調整しながら、分割して添加した。一晩放置後、酢酸エチル６０ｍＬ、５０重量％水酸化ナトリウム水溶液０．８８ｍＬ（１１ｍｍｏｌ）を添加した後、セライトろ過した。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで洗浄した。水層に濃塩酸２．９ｍＬ（３３ｍｍｏｌ）を添加してｐＨ３に調整した後、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を、減圧下、３５℃で溶媒を留去し、黄色油状物質２．４４ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を８０重量％（６．９１ｍｍｏｌ、収率６５％、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝４：６（モル比））、酢酸エチルを１２重量％、酢酸を８重量％含有する混合物であった。

＜２−２＞ （１Ｓ，４Ｓ）−３−オキソ−２−オキサ−５−アザビシクロ[２．２．２]オクタン−５−カルボン酸ベンジルの製造
フラスコに、＜２−１＞で得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−
５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸２．３５ｇ[６．７２ｍｍｏｌ、
（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝４：６（モル比）]、トルエン１０ｍＬ、ｐ−トルエ
ンスルホン酸１水和物１１６ｍｇ（０．６７ｍｍｏｌ）を添加し、６０℃で２時間反応させた。室温に冷却後、酢酸エチル３０ｍＬ、水５ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液７ｍＬを添加したところ、水層のｐＨは９となった。水層を分離後、酢酸エチルで再抽出し、得られた有機層を飽和重層水、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を濃縮し、褐色油状物質０．４４ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−
３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルを７５重量％（１．２７ｍｍｏｌ、収率１９％）、酢酸エチルを１７重量％、トルエンを９重量％含有する混合物であった。
原料のＮ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸において（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝４：６（モル比）であったが、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルへと変換することにより、（２Ｓ，５Ｒ）の立体化学を有する化合物を効果的に除去することができた。
しかしながら、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルの収率が１９％であったことから、（２Ｓ，５Ｓ）体についての収率は約５０％と中程度であった。反応で生じた（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルと、反応せず系内に残存する（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸が反応してエステル化する副反応が起きることが確認されており、そのため収率が中程度であったと考えられる。

＜２−３＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜２−２＞で得られた（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル０．４４ｇ（純度７５重量％、１．２７ｍｍｏｌ）、メタノール２．６ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液２．６ｍＬを添加し、一晩放置した。反応液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸１．３ｍＬを添加して、ｐＨ４に調整後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を濃縮し、褐色油状物質０．３３ｇを取得した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、無色油状物質として、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．２５ｇ（０．８８ｍｍｏｌ、収率６９％）を得た。

＜３−１＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、（２Ｓ,５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ,５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．７６ｇ[５．２４ｍｍｏｌ、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝７：３（モル比）]、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液６．３ｍＬを仕込み、氷冷下でベンジルオキシカルボニルクロリド０．９３ｍＬ（５．３ｍｍｏｌ）を添加した。徐々に室温に昇温し、テトラヒドロフラン２ｍＬと１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液５．２ｍＬをｐＨ９程度に調整しながら、分割して添加した。一晩放置後、有機層を分離し、水層を酢酸エチルで洗浄した。水層に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸３．２ｍＬを添加してｐＨ３に調整した後、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を濃縮し、黄色油状物質０．７９ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を７６重量％（２．１５ｍｍｏｌ、収率４１％、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝７：３（モル比））、酢酸エチルを２４重量％含有する混合物であった。

＜３−２＞ （１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルの製造
フラスコに、＜３−１＞で得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．７９ｇ（純度７６重量％、２．１５ｍｍｏｌ、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝７：３（モル比））、トルエン５ｍＬ、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物４９ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）を添加し、６０℃で２時間反応させた。室温に冷却後、酢酸エチル１０ｍＬ、水３ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液１．２ｍＬを添加したところ、水層のｐＨは７となった。水層を分離後、酢酸エチルで再抽出し、得られた有機層を飽和重層水、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を濃縮し、褐色油状物質０．３４ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−
３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルを６２重量％（０．８０ｍｍｏｌ、収率３７％）、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を２１重量％（０．２５ｍｍｏｌ、収率１２％）、トルエンを１７重量％含有する混合物であった。
原料のＮ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸において（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝７：３（モル比）であったが、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸
ベンジルへと変換することにより、（２Ｓ，５Ｒ）の立体化学を有する化合物を効果的に除去することができた。また、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルと（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の合計収率が４９％であり、（２Ｓ，５Ｓ）体についての収率は約７０％と中程度であった。
＜２−１＞と同様に、反応で生じた（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルと、反応せず系内に残存する（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸が反応してエステル化する副反応が起きるが、出発原料中の（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の量が少ないために、（２Ｓ，５Ｓ）体のみを比較的効率よく回収できた。

＜３−３＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜３−２＞で得られた油状物質０．３４ｇ[（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル０．８０ｍｍｏｌと（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．２５ｍｍｏｌを含む）、メタノール２ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１．９ｍＬを添加し、一晩静置した。反応液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸２ｍＬを添加して、ｐＨ４に調整後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を濃縮し、褐色油状物質０．３９ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を７６重量％（１．０５ｍｍｏｌ、収率１００％、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝８７：１３（モル比））、酢酸エチルを２３重量％、酢酸を１重量％含有する混合物であった。

＜３−４＞ （２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜３−３＞で得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．３９ｇ（純度７７重量％、１．０６ｍｍｏｌ）、メタノール２ｍＬ、１０％パラジウム炭素６１ｍｇ（エヌ・イー ケムキャット社製、ＰＥ−ｔｙｐｅ、５５．３％含水品）を仕込み、常温、常圧の条件で３時間水素添加を行った。セライトろ過によりパラジウム炭素を除去し、メタノール−水で洗浄した。得られた濾液を濃縮し、淡黄色油状物質として、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．２１ｇを取得した。

＜４−１＞ （１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル及び（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチルの製造
フラスコに、＜２−１＞の方法に準じて得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．２６ｇ（純度８２重量％、０．７６ｍｍｏｌ、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝５：５（モル比））、酢酸エチル１ｍＬ、メタンスルホン酸５μＬ（０．０８ｍｍｏｌ）を添加し、６０℃で３時間反応させた。室温に冷却後、酢酸エチル１０ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液１ｍＬを添加したところ、水層のｐＨは約１０となった。水層を分離後、酢酸エチルで再抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた有機層を濃縮し、淡褐色油状物質０．１２ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルを２６重量％（０．１１ｍｍｏｌ、収率１５％）、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチルを５２重量％（０．２０ｍｍｏｌ、収率２６％）、酢酸エチルを１３重量％、トルエンを８重量％含有する混合物であった。
本実施例において、酢酸エチルから生じた少量のエタノールが、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルと反応し、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチルを生じたと考えられる。原料のＮ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸において（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝５：５（モル比）であったが、¹Ｈ−ＮＭＲ解析およびＨＰＬＣ分析（＜ＨＰＬＣ−２
＞の条件）の結果より、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチルにおいて（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＞１０：１（モル比）であり、（２Ｓ，５Ｒ）の立体化学を有する化合物を効果的に除去することができた。また、（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジルと（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチルを合わせて収率４１％であったことから、（２Ｓ，５Ｓ）体についての収率は約８０％であり、（２Ｓ，５Ｓ）体のみを効率よく回収できた。

＜４−２＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜４−１＞で得られた油状物質０．１２ｇ（（１Ｓ，４Ｓ）−５−アザ−２−オキサ−３−オキソビシクロ［２．２．２］オクタン−５−カルボン酸ベンジル０．１１ｍｍｏｌと（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチル０．２０ｍｍｏｌを含む）、エタノール１ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．６６ｍＬを添加し、一晩放置した。反応液を濃縮後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸０．７ｍＬを添加して、ｐＨ３に調整後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を減圧下で濃縮し、褐色油状物質０．１１ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を８４重量％（０．３３ｍｍｏｌ、定量的、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝１０：１（モル比））、酢酸エチルを１１重量％、トルエンを５重量％含有する混合物であった。

＜４−３＞ （２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜４−２＞で得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．１１ｇ（純度８２重量％、０．３３ｍｍｏｌ）、メタノール１ｍＬ、１０％パラジウム炭素１８ｍｇ（エヌ・イー ケムキャット社製、ＰＥ−ｔｙｐｅ、５５．３％含水品）を仕込み、常温、常圧の条件で９時間水素添加を行った。セライトろ過によりパラジウム炭素を除去し、メタノール−水で洗浄した。得られた濾液を濃縮し、淡黄色油状物質として、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸５８ｍｇを取得した（（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝１０：１（モル比）、¹Ｈ−ＮＭＲ解析）。

＜５−１＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチルの製造
フラスコに、＜２−１＞の方法に準じて得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．５５ｇ（純度７８重量％、１．５２ｍｍｏｌ、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝３：７（モル比））、トルエン２ｍＬ、エタノール０．５ｍＬ、メタンスルホン酸１０μＬ（０．１５ｍｍｏｌ）を添加し、４０℃で５時間反応させた。
反応液を、＜ＨＰＬＣ−２＞の条件でＨＰＬＣ分析したところ、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチル：（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸エチル：（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸：（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸＝２４：８：７：５７であった。
原料と生成物それぞれの吸光係数が同等と仮定すると、（２Ｓ，５Ｓ）体の転化率はおよそ７７％、（２Ｓ，５Ｒ）体の転化率はおよそ１２％となり、（２Ｓ，５Ｓ）体がよりエステル化されていた。

＜５−１’＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸イソプロピルの製造
フラスコに、＜２−１＞の方法に準じて得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸及び（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．６２ｇ（純度７８重量％、１．７２ｍｍｏｌ、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝３：７（モル比））、トルエン２ｍＬ、２−プロパノール０．５ｍＬ、メタンスルホン酸１１μＬ（０．１７ｍｍｏｌ）を添加し、５０℃で５時間反応させた。室温に冷却後、トルエン３ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液１．２ｍＬを添加したところ、水層のｐＨは約９となった。水層を分離後、トルエンで再抽出し、得られた有機層を濃縮し、淡褐色油状物質０．１７ｇを取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸イソプロピルを９１重量％（０．４７ｍｍｏｌ、収率２７％、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝１０：１（モル比））、トルエンを９重量％含有する混合物であった。
本実施例において原料であるＮ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸は（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝３：７（モル比）であったが、¹Ｈ−ＮＭＲ分析の結果より、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸イソプロピルにおいて（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝１０：１（モル比）であり、（２Ｓ，５Ｒ）の立体化学を有する化合物を効果的に除去することができた。また、（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸イソプロピルの収率が２７％であったことから、（２Ｓ，５Ｓ）体についての収率は約８０％であり、（２Ｓ，５Ｓ）体が選択的に効率よく回収できた。

＜５−２＞ （２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜５−１’＞で得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸イソプロピル０．１７ｇ（純度９１重量％、０．４７ｍｍｏｌ）、メタノール０．７ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．７１ｍＬを添加し、６０℃で４時間反応させた。反応液をトルエンで洗浄後、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸０．４５ｍＬを添加して、ｐＨ３に調整後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を濃縮し、褐色油状物質０．１７ｇを取得した。¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この油状物質は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を７０重量％（０．４１ｍｍｏｌ、収率８８％、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝７：１（モル比））、酢酸エチルを２６重量％、トルエンを４重量％含有する混合物であった。

＜５−３＞ （２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、＜５−２＞で得られた（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸０．１７ｇ（純度７０重量％、０．４１ｍｍｏｌ、（２Ｓ，５Ｓ）：（２Ｓ，５Ｒ）＝７：１（モル比））、メタノール１ｍＬ、１０％パラジウム炭素２２ｍｇ（エヌ・イー ケムキャット社製、ＰＥ−ｔｙｐｅ、５５．３％含水品）を仕込み、常温、常圧の条件で３時間水素添加を行った。セライトろ過によりパラジウム炭素を除去し、メタノール−水で洗浄した。得られた濾液を濃縮し、淡黄色油状物質として、（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸８９ｍｇを取得した。

[参考例３]
＜３−１＞リジン水酸化酵素遺伝子のクローニング
フラボバクテリウム・ジョンソネ（ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）ＮＢＲＣ１４９４２株由来Ｌ−アルギニンβヒドロキシラーゼＶｉｏＣホモログＨｙｌ−１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＢＱ０６１８６、配列番号１８）をコードする遺伝子配列（ｈｙｌ−１、配列番号１７）を元に、ｈｙｌ−１遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｈｙｌ１＿Ｆ（配列番号２９）とｈｙｌ１＿Ｒ（配列番号３０）を設計、合成した。フラボバクテリウム・ジョンソネの染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
同様に、キネオコッカス・ラジオトレランス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０１８３９ 株、キチノファーガ・ピネンシス（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｐｉｎｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ１５９６８株、クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ）ＮＢＲＣ１５０５４株、ニア
ステラ・コリエンシス（Ｎｉａｓｔｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ１０６３９２株由来のＶｉｏＣホモログについて、それぞれＨｙｌ−２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢＳ０５４２１、配列番号２０）、Ｈｙｌ−３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣＵ６０３１３、配列番号２２）、Ｈｙｌ−４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＦＫ３４７３７、配列番号２４）、Ｈｙｌ−５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥＶ９９１００、配列番号２６）とした。各酵素をコードする遺伝子配列（ｈｙｌ−２（配列番号１９）、ｈｙｌ−３（配列番号２１）、ｈｙｌ−４（配列番号２３）、ｈｙｌ−５（配列番号２５））を元に、各遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーを設計、合成した。ｈｙｌ−２に対してはプライマーｈｙｌ２＿ｆ（配列番号３１）とｈｙｌ２＿ｒ（配列番号３２）、ｈｙｌ−３に対してはプライマーｈｙｌ３＿ｆ（配列番号３３）とｈｙｌ３＿ｒ（配列番号３４）、ｈｙｌ−４に対してはプライマーｈｙｌ４＿ｆ（配列番号３５）とｈｙｌ４＿ｒ（配列番号３６）、ｈｙｌ−５に対してはプライマーｈｙｌ５＿ｆ（配列番号３７）とｈｙｌ５＿ｒ（配列番号３８）を合成し、各株の染色体ＤＮＡを鋳型とし常法に従ってＰＣＲ反応を行った。それぞれ約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
得られた５種のＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩにより消化し、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩにより消化したｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に定法に従ってライゲーションすることにより、それぞれｐＥＨＹＬ１、ｐＥＨＹＬ２、ｐＥＨＹＬ３、ｐＥＨＹＬ４、ｐＥＨＹＬ５を得た。
また、海洋性放線菌ｍａｒｉｎｅ ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＨＳＣ２０Ｃ１由来Ｈｙｌ−６（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢＳ０５４２１、配列番号２８）をコードする遺伝子配列（ｈｙｌ−６、配列番号２７）を人工合成し、ｐＪＥｘｐｒｅｓｓ４０１（ＤＮＡ２．０）に挿入されたプラスミドｐＪＨＹＬ６を作製した。
次に得られた各プラスミドを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロジェン製）を定法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ４、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＨＹＬ６を得た。当該遺伝子を発現する菌体を得るために、各組換え大腸菌についてアンピシリン、およびｌａｃプロモーター誘導物質を含む液体ＬＢ培地を用いて３０℃で培養し、培養約２０時間後に集菌した。

＜３−２＞休止菌体反応によるリジン水酸化酵素の活性確認
プラスチックチューブ内で、５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−リジン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ２−オキソグルタル酸、１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−アスコルビン酸、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸鉄、そして、参考例＜３−１＞に準ずる方法で得られた組換え大腸菌を濁度ＯＤ₆₀₀＝１０となるように反応液を混合した。調製された混合液０．５ｍＬを３０℃、ｐＨ７．０で３時間反応させた。反応産物を１−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−５−Ｌ−ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）により誘導体化し、その後＜ＨＰＬＣ−４＞の条件でヒドロキシリジンをＨＰＬＣ分析した。その結果、図２及び図３に示す通り、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＨＹＬ６が３−ヒドロキシリジン標準品の保持時間８．０４分に一致する化合物を生成することが確認された。また、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ４、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ５が４−ヒドロキシリジン標準品の保持時間８．１６分に一致する化合物を生成することが確認された。

＜３−３＞（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジンの合成
１Ｌジャーファーメンターに、１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３５ｍＬ、脱塩水３０４ｍＬ、Ｌ−リジン塩酸塩１．２８ｇ、２−オキソグルタル酸２．０５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１４ｇ、硫酸鉄０．０２ｇ、アデカノールＬＧ１０９ ０．３５ｇ、及び参考例＜３−１＞に準ずる方法で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＨＹＬ２の湿菌体８ｇを混合し、３０℃、ｐＨ７．０、撹拌数５００ｒｐｍ、空気の通気量２．０ｖｖｍで１７時間反応させた。反応終了は、＜ＨＰＬＣ−５＞の条件でＨＰＬＣ分析を行ってＬ−リジンのピーク消失を確認することにより判断した。反応終了後の液から遠心分離および精密ろ過により菌体及び菌体残渣を取り除き、３９０ｇの濾液が得られた。
濾液３９０ｇをイオン交換樹脂カラム（ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ−１Ｂ（Ｈ型）６０．０ｇ）に通液し、水で洗浄した後、１５０ｍｍｏｌのアンモニアを含む水溶液で溶出させた。アンモニア溶出液を濃縮し、（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジン１．０ｇ（６．１７ｍｍｏｌ、収率８８％）を得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）δ，１．４５−１．５８（２Ｈ，ｍ），１．６３−１．７３（１Ｈ，ｍ），１．７４−１．８８（１Ｈ，ｍ），２．９３−３．０４（２Ｈ，ｍ），３．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），３．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．４, ４．５Ｈｚ）

＜３−４＞（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジンの立体化学決定
フラスコに、参考例＜３−３＞に準ずる方法で得られた（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジン８．３ｍｇ（０．０５１ｍｍｏｌ）、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．２６ｍｌ、ベンジルオキシカルボニルクロリド１８μＬ（０．１３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。さらに１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．２６ｍＬ、ベンジルオキシカルボニルクロリド１８μＬ（０．１３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩反応させた後、テトラヒドロフラン０．５ｍＬを添加して、６０℃でさらに２時間反応させた。室温に冷却後、水酸化ナトリウム９５ｍｇを添加し、室温で一晩反応させた。反応液をトルエン−テトラヒドロフラン（１：１）で２回洗浄した後、濃塩酸２５０μＬを添加して強酸性にし、さらに酢酸エチルで３回洗浄した後、水層を１−ブタノールで４回抽出した。１−ブタノール層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後に濃縮し、白色固体として（４Ｓ，５Ｓ）−５−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル）−２−オキソ−４−オキサゾリジンカルボン酸１４．６ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ、収率８９％）を得た。
得られた（４Ｓ，５Ｓ）−５−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル）−２−オキソ−４−オキサゾリジンカルボン酸の立体化学はＮＯＥＳＹ測定により決定した。ＮＯＥＳＹ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ社製ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ５００分光計（クライオプローブ付き）を用い、２５℃、ｍｉｘｉｎｇ ｔｉｍｅ＝０．８ｍｓｅｃで実施した。化学シフトの基準は、メタノールを３．３１ｐｐｍとした。ＮＯＥＳＹ測定結果を以下に示す。

４位水素原子（Ｈ⁴）と５位水素原子（Ｈ⁵）の間にクロスピークが観測され、４位と１’位間には観測されなかったことから、４位と５位の置換基はシス配置であることが確かめられた。酵素反応に用いたリジンの絶対配置はＳであることから、本参考例で得られた５−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル）−２−オキソ−４−オキサゾリジンカルボン酸は（４Ｓ，５Ｓ）の立体化学を持ち、その原料である３−ヒドロキシリジンは（２Ｓ，３Ｓ）の立体化学を有することが確かめられた。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ₄）δ，１．３９−１．５３（３Ｈ，ｍ，Ｈ^1'，Ｈ^2'ｘ２），１．５９−１．６８（１Ｈ，ｍ，Ｈ^1'），３．０２−３．０８（２Ｈ，ｍ，Ｈ^3'），３．６０−３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｈ⁴），３．９３−４．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ⁵），４．９０−５．０２（２Ｈ，ｍ，Ｂｎ），７．１８−７．２８（５Ｈ，ｍ，Ｂｎ）．

[参考例４]
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシピペコリン酸［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸］の製造
プラスチックチューブに、１ｍｏｌ／Ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．０）０．７５ｍＬ、脱塩水９．２１ｍＬ、参考例＜３−３＞で得られた（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジン８６ｍｇ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰＨ ０．０８３ｍＬ、１．０ｍｏｌ／Ｌグルコース０．７ｍＬ、及び参考例１で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ，ｋｒ）の１００ｇ／Ｌけん濁液１．２５ｍＬを混合し、３０℃、ｐＨ８．０、撹拌数１０００ｒｐｍで２０時間反応させた。反応終了は、＜ＨＰＬＣ−６＞の条件でＨＰＬＣ分析を行って（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシリジンのピーク消失を確認することにより判断した。反応終了後の液から、遠心分離により菌体及び菌体残渣を取り除いた１０．５ｇの上清を得た。
上清１０．５ｇをイオン交換樹脂カラム（ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ−１Ｂ（Ｈ型）４．０ｇ）に通液し、水で洗浄した後、１６．４ｍｍｏｌのアンモニアを含む水溶液で溶出させた。アンモニア溶出液を濃縮し、褐色固形物質２５５ｍｇを取得した。ＮＭＲ解析の結果、この固形物質は、（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシピペコリン酸を２０重量％（０．３５ｍｍｏｌ、収率６６．３％）、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを８０重量％含有する混合物であった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, Ｄ₂Ｏ）δ，１．３８−１．５６（２Ｈ, ｍ），１．７３−１．８５（２Ｈ, ｍ），２．７１−２．７９（１Ｈ, ｍ），３．０４−３．１１（１Ｈ, ｍ），３．２３（１Ｈ, ｄ, Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．７９−３．８６（１Ｈ, ｍ）．

（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の製造
フラスコに、実施例１の方法に準じて得られた（２Ｓ，５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸７８．７ｍｇ（０．５４２ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸２．８ｍｇ（０．０１９ｍｍｏｌ）及び参考例４の方法に準じて得られた（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸９８．５ｍｇ（純度２０重量％、０．１３６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７８．８ｍｇを含む）を仕込み、室温で、水０．２００ｍＬ、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．６７４ｍＬを添加した。ベンジルオキシカルボニルクロリド０．１９０ｍＬ（１．３５ｍｍｏｌ）を滴下した後、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．５００ｍＬを添加して、ｐＨを９から１０に調整した。室温で２５分反応させた後、ベンジルオキシカルボニルクロリド０．０９８ｍＬ（０．６９７ｍｍｏｌ）を滴下した後、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．４００ｍＬを添加して、ｐＨを１０から１１に調整した。更に、室温で４０分反応させた後、ベンジルオキシカルボニルクロリド０．０９８ｍＬ（０．６９７ｍｍｏｌ）を滴下して、室温で２時間反応させた。その反応液にトルエン３ｍＬを添加後、分液操作を実施した。抽出した有機層に水０．５００ｍＬを添加した後、更に分液操作を実施した。得られた有機層を濃縮し、３３０ｍｇの薄黄色油状物質を取得した。この油状物質にエタノール２ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１．１ｍＬ、水０．３ｍＬを添加し、室温で約１時間反応させた。反応液を濃縮してエタノールを留去した後、エタノール１ｍＬ、水０．３ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬ、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬを添加して室温で２時間反応させた。反応液を濃縮してエタノールを留去した後、トルエン３ｍＬを用いて分液操作を実施した。得られた水層に、水１ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸０．７５ｍＬを添加して、水溶液のｐＨを１に調整した。酢酸エチル４ｍＬを用いて水層を２回抽出し、得られた有機層を濃縮して９２．０ｍｇの薄黄色油状物質を取得した。
¹Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、この薄黄色油状物質は（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を８０．５重量％（０．２６５ｍｍｏｌ、収率４９％）、酢酸エチルを１９．５重量％含有していた。なお、¹Ｈ−ＮＭＲで（２Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸、（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−３−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸のピークは全く観測されなかった。

医薬中間体として有用なｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法ならびにその誘導体の製造方法として、使用できる。

Claims (8)

1. （ｉ）菌体反応および／または酵素反応により合成された、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸と不純物を含む混合物を、同一反応器中で酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させてアミノ基の保護とラクトン化を行い、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を式（１）で表される化合物に変換する工程、または、（ｉｉ）菌体反応および／または酵素反応により合成された、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸と不純物を含む混合物を酸ハロゲン化物および／または酸無水物と反応させてアミノ基を保護した後、酸触媒存在下でＣ１〜Ｃ６の２級アルコールと反応させて、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を式（１）および／または式（２）で表される化合物に変換する工程、及び、
   （ｉｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた式（１）で表される化合物、または、前記工程（ｉｉ）で得られた式（１）および／または式（２）で表される化合物を分離した後に、加水分解及び脱保護によりｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸に変換する工程、
   を含むことを特徴とする、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。
   

   

   
   式（１）および式（２）において、Ｒ¹はアミノ基の保護基を表し、Ｒ²はＣ１〜Ｃ６の２級アルキル基を表す。
2. 式（１）および式（２）において、Ｒ¹がベンジルオキシカルボニル基である、請求項１
   に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。
3. 不純物が２−ピペリジンカルボン酸類である、請求項１または２に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。
4. ２−ピペリジンカルボン酸類がｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸である、請求項３に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。
5. 式（１）および／または式（２）の化合物の分離工程を晶析または溶媒抽出によって行うことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸の精製方法。
6. （ｉ）菌体反応および／または酵素反応により合成された、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸と不純物を含む混合物を、同一反応器中でベンジルオキシカルボニルクロリドと反応させてアミノ基の保護とラクトン化を行い、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸を式（１）で表される化合物に変換する工程、または、
   （ｉｉ）菌体反応および／または酵素反応により合成された、ｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸と不純物を含む混合物をベンジルオキシカルボニルクロリドと反応させてアミノ基を保護した後、酸触媒存在下でＣ１〜Ｃ６の２級アルコールと反応させて、式（１）および／または式（２）で表される化合物へ変換する工程、
   を含むことを特徴とする、式（１）および／または式（２）で表されるｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法。
   

   

   
   式（１）および式（２）において、Ｒ¹がベンジルオキシカルボニル基を表し、Ｒ²はＣ１〜Ｃ６の２級アルキル基を表す。
7. 不純物が２−ピペリジンカルボン酸類である、請求項６に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法。
8. ２−ピペリジンカルボン酸類がｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸である、請求項７に記載のｃｉｓ−５−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボン酸誘導体の製造方法。

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