JP3739143B2 - トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、消炎剤として利用されているＮ−アセチルヒドロキシプロリン，カルバペネム系抗生物質等の医薬品の合成原料または食品添加物として有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含有し、かつ、プロリン合成系の活性の強化された形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物を用いトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法としては、
１）エッシェリヒア属に属する微生物を用い、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸からトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法（特開平３−２６６９９５）、
２）細菌やかび類を用い直接発酵生産する方法(European Patent ApplicationEP 0 547 898 A2 、特開平５−２３６９８０、特開平６−２４５７８２) 、
３）ストレプトミセス属に属する微生物を用い、Ｌ−プロリンから製造する方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５４巻、６６８４〜６６９０ページ（１９７９年）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res.Comm. ）、１２０巻，４５〜５１ページ（１９８４年）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters ），３４巻，７４８９〜７４９２ページ( １９９３年) 、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters ）、３５巻，４６４９〜４６５２ページ（１９９４年）〕が知られている。
【０００３】
従来のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法は、１）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸等のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造するための基質が高価で入手困難である、２）トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産性が低い、３）トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造に関与する酵素の活性が極めて微弱である、等の理由から、工業化は困難である。 トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造に関与する酵素については、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素をダクチロスポランジウム．エスピー．ＲＨ１（Dactylosporangium sp．RH1 ）より精製したとの報告（特開平７−３２２８８５）、および前述のストレプトマイセス属に属する微生物より精製したとの報告［バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）、３１３巻、１８５−１９１ページ、（１９６６年）］がある。また、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、遊離のＬ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させる活性を有する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素をコードする遺伝子を前述のダクチロスポランジウム．エスピー．ＲＨ１（Dactylosporangium sp．RH1 ）よりクローニングし、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むプラスミドｐＲＨ７１を取得し、さらにトリプトファンタンデムプロモーター支配下でＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を発現させるプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨを構築し、大腸菌で活性を発現させたという報告（日本農芸化学会１９９６年度大会、講演要旨集２５７ページ）がある。
【０００４】
活性の高いＬ−プロリン４位水酸化酵素を用い、工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法が求められている。
一方、プロリン生合成経路に関する酵素およびその遺伝子は大腸菌などですでに明らかになっている［ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１１８巻、２８７−２９３ページ（１９８０年）、およびバイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１０４巻、３９７〜４０４ページ（１９６５年）］。また、プロリン生合成は例えば大腸菌などでは生合成経路の第一酵素であるガンマ−グルタミル キナーゼ（ＧＫ）が、生成物であるプロリンのフィードバック阻害を受けることにより調節されている事が知られている［バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１９２巻、４６２〜４６７ページ（１９６９年）］。
【０００５】
更に、ＧＫをコードする遺伝子ｐｒｏＢに変異を生じさせることにより、プロリンのフィードバック阻害を著しく減少させたＧＫを生成させ、プロリン高生産株を造成できることが知られている［モレキュラー・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、１８２巻、８２−８６ページ（１９８１年）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１５６巻、１２４９−１２６２ページ（１９８３年）、およびジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１６４巻、１０８８−１０９３ページ（１９８５年）］。該ｐｒｏＢに変異を起こさせた遺伝子としてｐｒｏＢ７４が知られており、ｐｒｏＢ７４の変異点はｐｒｏＢのコーディングリージョンの５’末端から３１９番目のＧがＡに置換することにより、ｐｒｏＢ蛋白のＮ末端から１０７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに変化していることが知られている［ジーン（Ｇｅｎｅ）、６４巻、１９９−２０５ページ（１９８８年）］。
【０００６】
プロリン分解に関する酵素系、それをコードする遺伝子、遺伝子系の制御についても、大腸菌、サルモネラ菌などで研究が進んでおりよく知られている［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１４６巻、８９５−９０１ページ（１９８１年）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー （Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１４８巻、２１−４４ページ（１９８１年）］。
【０００７】
プロリンの生合成系の活性の強化された株を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法は知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を用いて、効率的にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法において、より工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造するために、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含有し、これを高効率で発現させる組換え体ＤＮＡを保持し、かつ、プロリン生合成系の活性の強化された形質転換体を提供し、該形質転換体を用いてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に安価に製造する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有し、且つ、Ｌ−プロリンの生合成系の活性の強化された形質転換体、および該形質転換体を培養し、該培養物、菌体またはそれらの処理物を酵素源として、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、水性媒体中で、Ｌ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該水性媒体より採取することを特徴とするトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明にかかわるＬ−プロリン４位水酸化酵素は、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、遊離のＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する酵素である。
【００１１】
本発明のＬ−プロリン４位水酸化酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐＲＨ７１があげられる。ｐＲＨ７１を含む大腸菌であるEscherichia coli SOLR/pRH71 は、平成７年３月２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥＲＭ ＢＰ−５０２５として寄託されている。
【００１２】
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を宿主中で発現させるためには、まず、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主中に導入する。宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、等に属する微生物菌株の他、酵母菌株や動物細胞宿主等をあげることができる。
【００１３】
発現ベクターとしては、上記宿主において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
大腸菌等の微生物を宿主として用いる場合は、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現ベクターは微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００１４】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.), ４８巻, ６６９〜６７５ページ（１９８４年) 〕、ｐＬＳＡ１〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.)，５３巻，２７７ページ（１９８９年）〕、ｐＧＥＬ１〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci., USA) ，８２巻，４３０６ページ( １９８５年）〕、pBluescript （STRATAGENE社）、ｐＴｒｓ３０〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕およびｐＴｒｓ３２〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕等を例示することができる。
【００１５】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰL プロモーターＰR プロモーターなどの、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００１６】
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子はＬ−プロリン４位水酸化酵素をコードする遺伝子であればいずれも用いることができるが、該遺伝子のＤＮＡ配列を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換して用いることにより高発現化が達成できる。大腸菌を宿主として、発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子の具体例として、配列番号１で示される塩基配列等をあげることができる。
【００１７】
本遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主としては、Escherichia coli XL1-Blue 、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000 、 Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49 、Bacillus subtilis 、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium immario philum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067 、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
【００１８】
酵母菌株を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115 ）、ＹＥｐ２４（ATCC37051 ）、ＹＣｐ５０（ATCC37419 ）等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal 1 プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1 プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００１９】
宿主としては、Saccharomyces cerevisiae 、Schizosaccharomycespombe 、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomycesalluvius 等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）等を例示することができる。プロモーターとしては、動物細胞の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヒトＣＭＶのIE(immediate early)遺伝子のプロモーター等のプロモーターをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。宿主としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
【００２０】
動物細胞へのＤＮＡの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入することができればいかなる方法も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェルグナー（Philip L. Felgner)ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 84, 7413(1987)〕等を用いることができる。形質転換株の取得および培養は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００２１】
宿主をプロリン生合成系の活性の強化されたものにするためには、１）宿主中のプロリン合成系遺伝子のコピー数を増加させる、２）プロリンによってフィードバック阻害を受けるプロリン合成系の酵素をコードする遺伝子に変異を生ぜしめ、プロリンによるフィードバック阻害が著しく減少した酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する、３）プロリンの分解活性を欠失させる、または４）これらを組み合わせることにより達成することができる。
【００２２】
プロリン合成系遺伝子またはプロリンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子は宿主の染色体上に存在しても良いし、またプラスミドなどの宿主中のベクター上に存在してもよい。
プロリンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子としては、 ｐｒｏＢ７４遺伝子、ＤＨＰr ｐｒｏＢ遺伝子［ジーン（ｇｅｎｅ）、３９巻、１０９−１１２ページ、（１９８４年）］等、プロリンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子をあげることができる。
【００２３】
また、プロリン合成系遺伝子またはプロリンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子をプロリン４位水酸化酵素遺伝子と共にプラスミドなどの宿主中のベクター上に存在させる場合は、両遺伝子が一つのプラスミド上に存在していてもよいし、別の共存可能なプラスミド上に存在していてもよい。
【００２４】
共存可能なプラスミドとしては、例えば、大腸菌においては、コリシンＥ１系のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２）とｐＡＣＹＣ系のプラスミド、コリシンＥ１系のプラスミドとＦ因子系のプラスミド、コリシンＥ１系のプラスミドとＲ因子系のプラスミド等をあげることができる。
プロリン生合成系遺伝子を宿主中で発現させるためには、前述のＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子での発現と同様の方法を用いることができる。
【００２５】
宿主のプロリン分解活性を欠失させるには、変異剤で宿主を処理した後、例えば細菌などではＰｒｏ−ＴＴＣプレート［アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，）、３３巻、４３４−４４４ページ、（１９７７年）］上で白色のコロニーを形成するものを選択することで取得できる。
【００２６】
更に、大腸菌等ではｐｕｔ遺伝子の適当な位置にトランスポゾンが挿入されることでプロリンの資化性が失われることがわかっている［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、９２巻、７４１−７４７ページ（１９７９年）］ので、トランスポゾンを挿入した後、薬剤耐性と前述したＰｒｏ−ＴＴＣプレートにより、プロリン分解活性欠失株を取得することもできる。
【００２７】
また、トランスポゾンによりプロリン分解活性が欠失した株より、Ｐ１トランスダクション［A Short Course In Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Esherichia coli and Related Bacteria, J. H. Miller, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1922, Laboratory Manual, pp.263 ］により別の菌株にプロリン分解活性欠失という形質を移すこともできる。
【００２８】
上記のようにしてプロリン生合成系の活性の強化された宿主を用いて得られた形質転換体の培養は、通常の培養方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として用いた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００２９】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００３０】
無機物としては、りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜１００時間である。培養中ｐＨは、３. ０〜９. ０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００３１】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３２】
動物細胞を宿主として用いた形質転換体を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、５％ＣＯ2 存在下等の条件下で行う。培養温度は３５〜３７℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間である。
【００３３】
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
このように培養して得た形質転換体中には、遺伝子源として用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム・エスピーＲＨ１等およびｐＴｒ２−４ＯＨを保有する組換え大腸菌と比較してＬ−プロリン４位水酸化酵素が著量生成蓄積しており、プロリン生合成活性も強く、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン製造を、遺伝子源として用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム・エスピーＲＨ１等およびｐＴｒ２−４ＯＨを保有する組換え大腸菌を用いた場合と比較して、はるかに効率的に行うことができる。
【００３４】
該形質転換体中にＬ−プロリン４位水酸化酵素が生成していることは、培養物、菌体またはそれらの処理物を、酵素反応に適した水性媒体中に、Ｌ−プロリン、二価鉄イオン、２−ケトグルタル酸とともに加え、また必要に応じて界面活性剤や有機溶剤を添加することにより、生成するトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを検出することにより知ることができる。生成されたＬ−プロリン４位水酸化酵素の活性は、下記測定条件下、１分間に１nmolのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。なお、ここでは、微生物菌体に加え、動物細胞を含めて菌体と呼ぶ。
【００３５】
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性の測定：
１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含有する２４０ｍＭのＭＥＳ〔２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〕緩衝液（ｐＨ６. ５）に菌体、菌体処理物または酵素標品等を添加して合計２５０μｌとし、３５℃、１０分間反応する。反応液を１００℃、２分間加熱して反応を停止した後に、反応液中に生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）を用いて定量する。
【００３６】
定量にはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量できる方法であればどのような方法を用いてもよいが、例えば、反応液中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを配位子交換クロマトグラフィーカラム、例えば、株式会社住化分析センター製SUMICHIRAL OA5000 等を用いてＨＰＬＣで分離溶出後、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル（以下、ＮＢＤと略記する）によってポストカラム誘導体化し検出する方法( ポストカラム誘導体化法) 、あるいは反応液中の目的化合物をあらかじめＮＢＤ誘導体化しておき、これをＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラフィーにかけてＮＢＤ誘導体化物を分離後検出する方法〔William J. Lindblad and Robert F. Diegelmann, アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）、１３８巻、３９０〜３９５ページ、１９８４年〕（プレカラム誘導体化法）等があげられる。ＮＢＤ誘導体化物の検出は、いずれもその蛍光( 励起波長５０３ｎｍ、蛍光波長５４１ｎｍ) 測定によって行われる。
【００３７】
上記のようにして培養菌体中にＬ−プロリン４位水酸化酵素の生成が確認された形質転換体を、前述の形質転換体の培養条件と同様の条件で培養し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成蓄積させ、該培養物よりトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取することにより、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することができる。
【００３８】
該培養において、必要に応じて２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンを培養液中に添加してもよい。
本発明により製造されたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、前述のポストカラム誘導体化法やプレカラム誘導体化法によって、定量分析することができる。
【００３９】
【実施例】
実施例１ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素高発現プラスミッドの構築
配列番号２記載のＤＮＡと配列番号３記載のＤＮＡをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成ＤＮＡの３’末端２５ｂｐは互いに相補的な配列となるように設計されている。さらに、該合成ＤＮＡには、Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素蛋白のＮ末端部分をコードする塩基配列が含有されているが、該塩基配列には、Dactylosporangium sp. RH1 由来の塩基配列を、大腸菌での発現に最適なコドンとなるように部位特異的な塩基置換がほどこされている。
【００４０】
該合成ＤＮＡをプライマーかつ鋳型としてＰＣＲを行った。
ＰＣＲはPfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社製）０．５Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（STRATAGENE社製）２μｌ、ＤＭＳＯ ２μｌ、各２．５ｍＭｄＮＴＰ液１μｌ、配列番号２記載の合成ＤＮＡと配列番号３記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベーションの後、９６℃−２分間、５０℃−１分間、７５℃−１分間のインキュベーション工程を３５回繰り返す条件で行った。
【００４１】
反応終了後、該反応液を、１５％ポリアクリルアミドゲル（アトー株式会社製、パジェルNPU-15L ）電気泳動にかけ、１０７ｂｐの増幅断片の生成を確認した。
該１０７ｂｐの増幅断片を日本エイドー株式会社製のダヴィンチくん（ペンタッチリカバリーＮＢ−７０００型）を用いて回収後、該１０７ｂｐのＤＮＡ断片の両末端をHind IIIおよびSal I で切断した。
【００４２】
該Hind III−Sal I 切断断片をBio, Inc. 製 MERmaid Kitを用いて回収した。回収液量は１６μｌとなった。
参考例１に記載の方法に従って作成したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨＤＮＡをBam HIおよびPvu IIで切断後、反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、２つの断片が生成していることを確認した。該断片の内、Ｌ−プロリン水酸化酵素の構造遺伝子を含む長い断片をバイオラッド社製のPrep-A-gene を用いて回収し、宝酒造社製のブランティングキットを用いて末端を平滑化した後、宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結環状化した。
【００４３】
該連結環状化したプラスミドを用い、E. coli JM109 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で１晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
【００４４】
以上の結果、ｐＴｒ２−４ＯＨの一部の配列を削除したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔ（図１）を得た。
取得したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔＤＮＡをHind IIIおよびSal I で切断後、該切断部位に、Hind IIIおよびSal I 処理した上記ＰＣＲ増幅断片を、宝酒造社製のライゲーションキットを用いて、挿入した。
【００４５】
得られたプラスミドを用い、E. coli XL1-Blue MRF' 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で１晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、プラスミドｐＷＦＨ１（図２）を取得した。
【００４６】
該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した。ＰＣＲ増幅断片挿入部分についてはアプライドバイオシステムズ社製の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用いて、塩基配列を決定した。該塩基配列を配列番号１に示す。
該プラスミドは、構造遺伝子の５’末端からSal I 部位においてDactylospora ngium sp. RH1 由来の塩基配列と一部異なる以外は、Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素とまったく同じアミノ酸配列をコードする構造遺伝子ＤＮＡ断片が、Ｐtrp×２の転写方向と同方向に挿入された構造を有していた（図２）。
【００４７】
第１表に示したように、ｐＷＦＨ１を保有する形質転換体は、遺伝子源として用いたダクチロスポランジウムエスピーＲＨ１株と比較して１４００倍、ｐＴｒ２−４ＯＨを保有する形質転換体と比較して約５．４倍のＬ−プロリン水酸化酵素を生産していた。
【００４８】
【表１】
【００４９】
実施例２ プロリン分解系欠損株の造成
E. coli ATCC12435 のプロリン分解に関与する遺伝子putAを以下の方法で破壊し、プロリン分解系欠損株を造成した。
国立遺伝学研究所保存菌株であるE. coli ME8395 株［Ｆ- ：pyrD34 trp-45 his-68 thyA25 thi deoR33 galK35 xyl-7 mtl-2 malA1 rpsL118 λR ( λ) - appA1 putA::Tn5 (Mu+) ］を３５μg/ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に植菌し、終夜培養した。
【００５０】
該培養液１００μｌにＰ１ファージ液１００μｌを添加・混合し、５分間放置した。
【００５１】
該放置液を１０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含む３ｍｌのＬＢ軟寒天培地と混合し、１０ｍＭＣａＣｌ2 を含むＬＢ寒天培地上に重層後、３７℃で７時間培養した。
培養後、得られた寒天培地表面のライゼートを１０ｍＭＣａＣｌ2 を含む２ｍｌのＬＢ培地中に回収した。
該回収液に０．５ｍｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスミキサーを用いて混合後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、得られた上清をＰ１ファージライゼートとして用いた。
【００５２】
該Ｐ１ファージライゼート液５０μｌと１０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含むＬＢ培地で培養したE. coli ATCC12435 培養液１００μｌとを混合し、３７℃で２０分間静置した。
該静置液をエフ・トップ・サイトレイト（F-top-citrate ：ＮａＣｌ ８. ５ｇ/ ｌ、クエン酸２ナトリウム１００ｍＭ、寒天０. ７％）３ｍｌと混合し、３５μg/ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に塗布後、３７℃で１日培養した。
【００５３】
該培養により生育してきたカナマイシン耐性株を０．８５％のＮａＣｌに懸濁した後、Ｐｒｏ−ＴＴＣプレート（Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ/ ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ３ｇ/ ｌ、ＭｇＳＯ4 ０. １ｇ/ ｌ、プロテオースペプトン２ｇ/ ｌ、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド０. ０２５ｇ/ ｌ、Ｌ- Ｐｒｏ ２ｇ/ ｌ、寒天１５ｇ/ ｌ、ｐＨ７. ２) に塗布し、３７℃で１〜２日間培養した。
【００５４】
該培養によりＰｒｏ−ＴＴＣプレート上に白色のコロニーを形成した株を、プロリンを分解資化する能力の失われた株として選択し、プロリン分解活性欠損株 E. coliＷＴ１株を取得した。該菌株は平成８年８月７日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥＲＭ ＢＰ−５６１８として寄託されている。
【００５５】
実施例３ プロリン生合成系遺伝子proB74およびproA発現プラスミドの構築
大腸菌由来のγ-glutamyl kinaseをコードするproB遺伝子をプロリンによるフィードバック阻害に対して脱感作された変異型遺伝子に変換したproB74遺伝子および大腸菌由来のγ-glutamyl phosphate reductase をコードするproA遺伝子の発現プラスミドｐＰＦ１を以下の方法により構築した。
【００５６】
大腸菌由来のproBおよびproA遺伝子を含むプラスミドｐＰＲＯ−１［大腸菌Ｋ８３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８０７）より取得］をEcoRVで消化し、アガロースゲル電気泳動後、Prep-A-gene DNA Purification System (BIO-RAD社製）でproB遺伝子の一部を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９（宝酒造社製）のSma I 消化物と連結し、プラスミドｐＢＡＢ５１を得た（図３）
該プラスミド中のproB遺伝子を、以下の方法により、公知[A. M. Dandekar and S. L. Uratsu, J. Bacteriol. 170, 5943 (1988)] のプロリンによるフィードバック阻害に対して脱感作された変異型遺伝子proB74に変換した。
【００５７】
配列番号４に示したオリゴヌクレオチドＡ１および配列番号５に示したオリゴヌクレオチドＡ２をアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
オリゴヌクレオチドＡ１とＭ１３プライマーＭ３（宝酒造社製、カタログＮｏ．３８３１）を一組のプライマーとして、ｐＢＡＢ５１を鋳型として用い、ＰＣＲ法により変異型proB遺伝子であるproB74遺伝子の部分配列を増幅した。
【００５８】
ＰＣＲは、ｐＢＡＢ５１を０．１μｇ、オリゴヌクレオチドＡ１とＭ１３プライマーＭ３を各２μＭ、Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造社製）を１Ｕ、ｄＮＴＰミクスチャー（宝酒造社製、カタログＮｏ．４０３０）を１．６μｌ、添付バッファー２μｌを含む反応液２０μｌを用い、９４℃−３０秒間、５２℃−３０秒間、７２℃−１分間のインキュベーション工程を３０回繰り返し、最後に７２℃−５分間インキュベーションすることにより行った。
【００５９】
同様の方法で、オリゴヌクレオチドＡ２とＭ１３プライマーＲＶ（宝酒造社製、カタログＮｏ．３８３０Ａ）を一組のプライマーとして、ｐＢＡＢ５１を鋳型として用い、ＰＣＲ法により変異型proB遺伝子の部分配列を増幅した。
ＰＣＲ法により増幅された該２種類のＤＮＡをそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけた後、Prep-A-gene DNA Purification System (BIO-RAD社製）を用いて精製した。
【００６０】
該２種の精製ＤＮＡ断片を混合したものを鋳型とし、Ｍ１３プライマーＭ３およびＭ１３プライマーＲＶをプライマーとして用い、上記と同様の方法により、ＰＣＲおよび精製を行い、proB74遺伝子の塩基配列を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該ＤＮＡ断片をEco O65IおよびSac IIで消化し、Eco O65I−Sac II消化断片を取得した。
【００６１】
該消化断片と、ｐＰＲＯ−１のEco O65I−Sac II消化ＤＮＡ断片（約６．８ｋｂｐ）とを連結し、ｐＰＲＯ−１のproB遺伝子を脱感作型proB74遺伝子に変換したプラスミドｐＰＲＯ７４を作製した（図４）。
配列番号６に示したオリゴヌクレオチドｐ１および配列番号７に示したオリゴヌクレオチドｐ２をアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００６２】
該ｐ１、ｐ２をプライマーとして、プラスミドｐＰＲＯ７４を鋳型として用い、ＰＣＲ法によりproB74およびproA遺伝子を増幅した。
ＰＣＲは、ｐＰＲＯ７４を０．１μｇ、ｐ１、ｐ２を各２μＭ、タカラ・イーエックス・タック（TaKaRa Ex Taq ：宝酒造社製、コードRR001Q）１Ｕ、ｄＮＴＰミクスチャー（宝酒造社製、カタログＮｏ．4030）を１．６μｌ含む反応液２０μｌを用い、９４℃−１分間、４２℃−２分間、７２℃−３分間のインキュベーション工程を３０回繰り返すことにより行った。
【００６３】
該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、proB74およびproAを含む２３７０ｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収した。回収した２３７０ｂｐのＤＮＡ断片をHind IIIおよびBam HIで切断後、エタノール沈殿法によりエタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解し、proB74およびproA断片として用いた。
【００６４】
該proB74およびproA断片と、プラスミドｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）のHind III−Bam HI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、proB74およびproA断片の挿入されたプラスミドを構築した。
該プラスミドをE. coli JM109 株に常法に従って形質転換後、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、０．１ｍＭＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
【００６５】
該培養により白色コロニーを形成した株より常法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した。
上記の方法により、脱感作型γ-glutamyl kinaseのＮ末端にβ−ガラクトシダーゼのαフラグメントのＮ末端８アミノ酸残基（lacZ.Nterm）が結合した融合蛋白をコードする遺伝子およびproA遺伝子がＰlac支配下に存在するプラスミドｐＰＦ１を取得した（図５）。
【００６６】
該融合蛋白の構造遺伝子（lacZ.Nterm-proB74 ）の塩基配列とアミノ酸配列を配列番号８に示す。
実施例４ プロリン生合成系遺伝子発現プラスミドを含む形質転換体によるトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
実施例３で構築したプラスミドｐＰＦ１を用いて、実施例２で取得したE. coli WT1 株を形質転換し、形質転換株E. coli WT1/pPF1を取得した。
【００６７】
実施例１で構築したプロリン４位水酸化酵素発現プラスミドｐＷＦＨ１で、実施例２で取得したＷＴ１株を形質転換しE. coli WT1/pWFH1 を取得した。
該形質転換株E. coli WT1/pWFH1 より塩化カルシウム法にてコンピテントセルを作製し、実施例３で作製したプラスミドｐＰＦ１を導入し、両プラスミドを保有する形質転換株E. coli WT1/pWFH1/pPF1を３０μｇ/ ｍｌのクロラムフェニコールと５０μｇ/ ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に生育してくるコロニーを選択することにより取得した。
【００６８】
WT1 、WT1/pPF1、WT1/pWFH1 およびWT1/pWFH1/pPF1をそれぞれカナマイシン３７．５μｇ/ ｍｌ、アンピシリン１００μｇ/ ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ/ ｍｌ、そしてアンピシリン１００μｇ/ ｍｌおよびクロラムフェニコール３０μｇ/ ｍｌを含むＬＢ培地で３７℃で１６時間培養した。
該培養液それぞれ１００μｌを、２％（Ｗ/ Ｖ）の炭酸カルシウムを含む１０ｍｌのＭｅｄ７培地（グルコース２％、硫酸アンモニウム１％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％、ＮａＣｌ ０. ２％、ＭｇＳＯ4 ０. ０５％、ＦｅＳＯ4 ０. ０２７８％、ＣａＣｌ2 ０. ００１５％、ペプトン０. ８％）をいれた太型試験管（φ２０×２００ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間培養した。
【００６９】
該培養上清中のＬ−プロリンおよびトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を第２表に示した。
【００７０】
【表２】
【００７１】
プロリン生合成系遺伝子発現プラスミドｐＰＦ１保有菌株においてはＬ−プロリンの生成が著しく増加し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミドｐＷＦＨ１およびプロリン生合成系遺伝子発現プラスミドｐＰＦ１の共存する形質転換体においてはＬ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミドを単独で保持する形質転換体に比べてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成量が顕著に増加することが確認できた。
【００７２】
実施例５ L ―プロリン４位水酸化酵素とプロリン生合成系遺伝子proB74およびproA発現プラスミドの構築
Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子、プロリン生合成系遺伝子proB74およびproAの全ての遺伝子を単一のプラスミド上に保持し、これを発現させるような発現プラスミドｐＷＦＰ１を以下の方法により構築した。
【００７３】
実施例１で作成したｐＷＦＨ１をテンプレートとし、ＰＣＲ法にてＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子を増幅した。
ＰＣＲはｐＷＦＨ１プラスミド０．１μg 、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社製）0.5 Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（STRATAGENE社製）２μｌ、ＤＭＳＯ ２μｌ、各２．５ｍＭｄＮＴＰ液１μｌ、配列番号９記載の合成ＤＮＡと配列番号１０記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベーションの後、９６℃−２分間、５８℃−１分間、７５℃−３分間のインキュベーション工程を３０回繰り返す条件で行った。
【００７４】
反応終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子を含む約８００ｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収した。
該回収ＤＮＡ断片をHind IIIおよびEco RIで切断後、アガロースゲル電気泳動にかけ、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いてＬ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子を有する該Hind III−Eco RI切断ＤＮＡ断片を回収した。
【００７５】
該Ｌ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子断片と、プラスミドpBluescriptII KS(+)（stratagene社製）のHind III―Eco RI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素断片の挿入されたプラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨを構築した（図６）。
実施例３で作成したｐＰＲＯ７４をテンプレートとしＰＣＲ法にてproB74およびproA遺伝子を増幅した。
【００７６】
ＰＣＲはｐＰＲＯ７４プラスミド0.1 μg 、タカラ・イーエックス・タック（TaKaRa Ex Taq ：宝酒造社製、コードRR001Q）１Ｕ、タカラ・イーエックス・タック用×１０緩衝液（宝酒造社製）２μｌ、各２．５ｍＭｄＮＴＰ液１．６μｌ、配列番号１１記載の合成ＤＮＡと配列番号１２記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含む反応液２０μｌを用い、９４℃−１分間、４２℃−２分間、７５℃−３分間のインキュベーション工程を３０回繰り返す条件で行った。
【００７７】
反応終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、proB74およびproA遺伝子を含む約２．３ｋｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片をBam HIおよびEco RIで切断後、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、該ＤＮＡ断片を回収した。このproB74およびproA遺伝子を含むＤＮＡ断片と、上記プラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨのHind III―Eco RI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、proB74およびproAを含むプラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨＢＡを構築した（図７）。
【００７８】
プラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨＢＡをHind IIIおよびBam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、proB74およびproAを含む約３．１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。また、実施例１で作成したｐＷＦＨ１をHind IIIおよびBam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含まず、複製開始点を含む方の約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。取得した２つのＤＮＡ断片を宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、トリプトファンタンデムプロモーター下でＬ−プロリン４位水酸化酵素、proB74タンパク、proAタンパクを発現させうるプラスミドｐＷＦＰ１を構築した（図８）。
【００７９】
実施例６ 形質転換体E. coli WT1/pWFH1/pPF1およびE. coli WT1/pWFP1 を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
形質転換株WT1/pWFH1/pPF1株をアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌ Ｍｅｄ４Ｇ培地［グルコース ２％、ポリペプトン（日本製薬社製） １％、イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５％、ＮａＣｌ １％、炭酸カルシウム ２％、ｐＨ７．０］に、形質転換株WT1/pWFP1 株をアンピシリン１００μｇ/ ｍｌを含む５０ｍｌ Ｍｅｄ４Ｇ培地に、それぞれ植菌した後、３０℃で１６時間振とう培養した。
【００８０】
該培養液を種培養液とし、２リッターのＭｅｄ７培地を入れた５リッタージャーファーメンターにそれぞれ植菌し、WT1/pWFH1/pPF1株の培養においては、アンピシリン１００μｇ/ ｍｌおよびクロラムフェニコール３０μｇ/ ｍｌを、WT1/pWFP1 株の培養においては、アンピシリン１００μｇ/ ｍｌを更に添加し、培養温度３０℃、撹拌数４００回転／分、通気量１リッター／培養液１リッター／分の条件で培養した。
【００８１】
また、WT1/pWFH1/pPF1の培養においては、培養８時間目に、ＩＰＴＧを０. ２ｍＭとなるように添加した。
更に、両菌株とも、培養２４時間目に、培養開始時と同種、同濃度の抗生物質を添加した。
培養中、グルコースをほぼ１％の濃度となるように適時培養液に添加し、ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ６. ５に下限コントロールした。また、培養５時間以降に、撹拌数を２５０〜７００ｒｐｍに変化させることにより、培養液の溶存酸素濃度が培養開始時点の１／１５となるようにコントロールした。
【００８２】
９９時間培養後、該培養液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を定量した結果、WT1/pWFH1/pPF1株において１５６ｍＭ（２０．５ｇ/ ｌ）、WT1/pWFP1 株において１９１ｍＭ（２５．０ｇ/ ｌ）のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成蓄積が認められた。
【００８３】
実施例７ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子およびプロリン生合成系遺伝子発現プラスミドを含む形質転換体によるトランスー４―ヒドロキシーＬ−プロリンの生産
実施例５で構築したプラスミドｐＷＦＰ１を用いて、実施例２で取得したE. coli WT1株を形質転換し、形質転換株E. coli WT1/pWFP1 を取得した。
【００８４】
WT1/pWFP1 をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で３７℃で１６時間培養した。該培養液１００μｌを、２％（Ｗ/ Ｖ）の炭酸カルシウムを含む１０ｍｌのＭｅｄ７培地を入れた太型試験管（φ２０×２００ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間培養した。
該培養上清中のＬ−プロリンは０．５６ｇ／Ｌであり、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは２．４ｇ／Ｌであった。
【００８５】
実施例８ 形質転換体の菌体を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
形質転換体E. coli ATCC12435/pTr2-4OHを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌＬＢ培地に植菌し３０℃、一晩振とう培養後、該培養液を遠心分離し、E. coli ATCC12435/pTr2-4OHの湿菌体を取得した。
【００８６】
形質転換体E. coli ATCC12435/pWFH1 をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌ Ｍｅｄ４培地〔ポリペプトン（日本製薬社製）１％、イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、ＮａＣｌ１％〕に植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。
該培養液を、２リッターのＭｅｄ７培地（グルコース２％、硫酸アンモニウム１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、ＮａＣｌ ０．２％、ＭｇＳＯ4 ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ０．０２７８％、ＣａＣｌ2０．００１５％、ペプトン ０．４％）を入れた５リッタージャーファーメンターに植菌後、Ｌ−Ｐｒｏを２００ｍＭ添加し、培養温度３３℃、通気量１リッター／培養液１リッター／分という条件で４８時間培養した。
【００８７】
溶存酸素濃度が初期値の１５分の１に達した時点で、撹拌数４００回転／分を基準とし、７００回転／分を上限として攪拌数を変化させることにより、溶存酸素濃度を初期値の１５分の１となるようにコントロールした。
培養中、グルコースは無くならぬように、Ｌ−プロリンは約５０ｍＭとなるように適時添加し、ＮＨ4ＯＨを用いて、ｐＨ６．５に下限コントロールした。
【００８８】
該培養により得られた培養液を遠心分離し、E. coli ATCC12435/pTr2-4OH および E. coliATCC12435/pWFH1 の湿菌体を取得した。
該両菌株の湿菌体は必要に応じて−２０℃で凍結保存することが可能で、使用時に解凍し用いることができる。
反応液〔２４０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６. ５）中に、１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含有する〕２５０μｌに湿菌体量として４％（ｗ／ｖ）となるように加え、３５℃で１０分間反応した。反応液を１００℃、２分間加熱することにより反応を停止した。
【００８９】
該反応停止液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を定量した結果、E. coli ATCC12435/pTr2-4OH株において３ｍｍｏｌ／ｌ、E. coli ATCC12435/pWFH1 株において１６ｍｍｏｌ／ｌのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産が認められた。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素に対する菌体活性はそれぞれ、７．５および４０U/mg・ wet cells であった。
【００９０】
参考例１ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミッドの構築
配列番号１３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号１４に記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとして、ｐＲＨ７１［該プラスミドを含有するEscherichia coli SOLR/pRH71 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２５）より定法により取得］を鋳型としてＰＣＲを行った。
【００９１】
ＰＣＲは、ｐＲＨ７１を０. １μｇ、センス鎖およびアンチセンス鎖ＤＮＡプライマー各２μＭ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社製）０. １２５Ｕ／μｌ、ＤＭＳＯ１０％、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８. ２）２０ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、硫酸アンモニウム６ｍＭ、塩化マグネシウム２ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０００. １％、Bovine Serum Albumine １０ｎｇ／μｌを含む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベーション後、９６℃−２分間、５８℃−１分間、７５℃−１分間のインキュベーション工程を３０回繰り返す条件で行った。
【００９２】
反応終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードする８４４ｂｐの増幅断片が生成されていることを確認した。
該８４４ｂｐの増幅断片をアガロースゲルより常法により抽出し、バイオラッド社製のPrep-A-gene を用いて断片を回収した。回収した８４４ｂｐのＤＮＡ断片の両末端をHind IIIおよびBam HIで切断後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。
【００９３】
ｐＢＲ３２２を基本とし、Ｐtrpを２つ直列させたプロモーターＰtrp×２を持つプラスミドｐＫＹＰ２００〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.), ４８巻, ６６９〜６７５ページ（１９８４年) 〕と合成リンカーを組み合わせて作製されたＡＴＧベクターｐＴｒＳ３２〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕をHind IIIおよびBam HIで切断した。該切断部位に、Hind IIIおよびBam HIで切断処理した上記のＬ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝子断片を、宝酒造社製のライゲーションキットを用いて、挿入した。
【００９４】
得られたプラスミドを用い、E. coli XL1-Blue MRF' 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で１晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。構造遺伝子部分についてはアプライドバイオシステムズ社製の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用いて、塩基配列を決定し、配列番号１５で示した塩基配列であることを確認した。
【００９５】
該方法により、Ｐtrp×２の転写方向と同方向にＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨ（図９）を得た。
【００９６】
参考例２ ダクチロスポランジウム・エスピーの菌体を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
ＳＲ３培地（グルコース１．０％、可溶性澱粉１．０％、酵母エキス０．５
％、トリプトン０．５％、肉エキス０．３％およびリン酸マグネシウム０．０５％を含み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した培地）を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、ＨＴ寒天平板培地に生育したダクチロスポランジウム・エスピー（Dactylosporangium sp.）RH1 を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種培養液として用いた。
【００９７】
Ｄｆ１培地（可溶性澱粉５％、ソイビーンミール１．５％、リン酸１カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％および炭酸カルシウム０．５％を含み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した培地）を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、上記種培養液１ｍｌを無菌的に接種し、２８℃、２日間振盪培養した。
【００９８】
得られた培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離し、菌体を取得した。
該菌体を８０ｍＭＴＥＳ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸］緩衝液（ｐＨ７. ５）で洗浄後、遠心分離し、湿菌体を取得した。
【００９９】
該湿菌体１５０ｍｇを、１. ５ｍｌの反応液［４ｍＭ Ｌ−プロリン、８ｍＭα−ケト−グルタル酸、４ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、２ｍＭ 硫酸第一鉄、を含有する８０ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ５）にナイミーン溶液（ナイミーンＳ−２１５（日本油脂株式会社製）４ｇをキシレン１０ｍｌに溶解）を１. ４％( ｖ／ｖ) 添加］に懸濁し、３０℃、３０分間反応を行った。
【０１００】
反応終了後、該反応液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を定量した結果、８４μｍｏｌ／ｌトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産が認められた。該菌株における、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素にたいする菌体活性は０．０２８U/mg・ wet cells であった。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬品の合成原料または食品添加物として有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含有し、かつ、プロリン合成系の活性の強化された形質転換体を提供することができる。
【０１０２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：８１６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
【０１０３】
配列番号：２
配列の長さ：６４
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
【０１０４】
配列番号：３
配列の長さ：６６
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
【０１０５】
配列番号：４
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
【０１０６】
配列番号：５
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
【０１０７】
配列番号：６
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
【０１０８】
配列番号：７
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
【０１０９】
配列番号：８
配列の長さ：１１２５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列：
【０１１０】
配列番号：９
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
【０１１１】
配列番号：１０
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
【０１１２】
配列番号：１１
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
【０１１３】
配列番号１２
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
【０１１４】
配列番号：１３
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
【０１１５】
配列番号：１４
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
【０１１６】
配列番号：１５
配列の長さ：８１６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Dactylosporangium sp.
株名：RH1
特徴を決定した方法：E
配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔの造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図２】図２は、プラスミドｐＷＦＨ１の造成工程を示す図である。
図中、網掛けの太線で示した部分が、Hind IIIおよびSal I 処理したＰＣＲ増幅断片の挿入部分を示す。黒塗の太線で示した部分が、Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図３】図３は、プラスミドｐＢＡＢ５１の造成工程を示す図である。
図中、黒の網掛けで示した部分が、プロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分である。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。ＴｃはｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図４】図４は、プラスミドｐＰＲＯ７４の造成工程を示す図である。
図中、黒の網掛けで示した部分が、プロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分である。黒塗りの部分はｐｒｏＢ７４とｐｒｏＢで唯一異なる塩基対を含むｐｒｏＢ７４遺伝子の一部分を示す。ＴｃはｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図５】図５は、プラスミドｐＰＦ１の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、プロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分を示す。ＣｍｒはＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む部分を示す。ｐＡＣＹＣ．ｏｒｉはｐＡＣＹＣ１８４由来の複製開始基点を、Ｐlacはlacプロモーターを、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。ｌａｃＺ．Ｎｔｅｒｍ- ｐｒｏＢ７４はβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子のＮ末端部分とｐｒｏＢ７４遺伝子との融合した遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図６】図６は、プラスミドｐＢＩＩ−４ＯＨの造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図７】図７は、プラスミドｐＢＩＩ−４ＯＨＢＡの造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含
む部分を示す。黒の網掛け部分はプロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図８】図８は、プラスミドｐＷＦＰ１の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。黒の網掛け部分はプロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図９】図９は、プラスミドｐＴｒ２−４ＯＨの造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【発明の属する技術分野】
本発明は、消炎剤として利用されているＮ−アセチルヒドロキシプロリン，カルバペネム系抗生物質等の医薬品の合成原料または食品添加物として有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含有し、かつ、プロリン合成系の活性の強化された形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物を用いトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法としては、
１）エッシェリヒア属に属する微生物を用い、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸からトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法（特開平３−２６６９９５）、
２）細菌やかび類を用い直接発酵生産する方法(European Patent ApplicationEP 0 547 898 A2 、特開平５−２３６９８０、特開平６−２４５７８２) 、
３）ストレプトミセス属に属する微生物を用い、Ｌ−プロリンから製造する方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５４巻、６６８４〜６６９０ページ（１９７９年）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res.Comm. ）、１２０巻，４５〜５１ページ（１９８４年）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters ），３４巻，７４８９〜７４９２ページ( １９９３年) 、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters ）、３５巻，４６４９〜４６５２ページ（１９９４年）〕が知られている。
【０００３】
従来のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法は、１）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸等のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造するための基質が高価で入手困難である、２）トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産性が低い、３）トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造に関与する酵素の活性が極めて微弱である、等の理由から、工業化は困難である。 トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造に関与する酵素については、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素をダクチロスポランジウム．エスピー．ＲＨ１（Dactylosporangium sp．RH1 ）より精製したとの報告（特開平７−３２２８８５）、および前述のストレプトマイセス属に属する微生物より精製したとの報告［バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）、３１３巻、１８５−１９１ページ、（１９６６年）］がある。また、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、遊離のＬ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させる活性を有する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素をコードする遺伝子を前述のダクチロスポランジウム．エスピー．ＲＨ１（Dactylosporangium sp．RH1 ）よりクローニングし、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むプラスミドｐＲＨ７１を取得し、さらにトリプトファンタンデムプロモーター支配下でＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を発現させるプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨを構築し、大腸菌で活性を発現させたという報告（日本農芸化学会１９９６年度大会、講演要旨集２５７ページ）がある。
【０００４】
活性の高いＬ−プロリン４位水酸化酵素を用い、工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法が求められている。
一方、プロリン生合成経路に関する酵素およびその遺伝子は大腸菌などですでに明らかになっている［ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１１８巻、２８７−２９３ページ（１９８０年）、およびバイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１０４巻、３９７〜４０４ページ（１９６５年）］。また、プロリン生合成は例えば大腸菌などでは生合成経路の第一酵素であるガンマ−グルタミル キナーゼ（ＧＫ）が、生成物であるプロリンのフィードバック阻害を受けることにより調節されている事が知られている［バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１９２巻、４６２〜４６７ページ（１９６９年）］。
【０００５】
更に、ＧＫをコードする遺伝子ｐｒｏＢに変異を生じさせることにより、プロリンのフィードバック阻害を著しく減少させたＧＫを生成させ、プロリン高生産株を造成できることが知られている［モレキュラー・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、１８２巻、８２−８６ページ（１９８１年）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１５６巻、１２４９−１２６２ページ（１９８３年）、およびジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１６４巻、１０８８−１０９３ページ（１９８５年）］。該ｐｒｏＢに変異を起こさせた遺伝子としてｐｒｏＢ７４が知られており、ｐｒｏＢ７４の変異点はｐｒｏＢのコーディングリージョンの５’末端から３１９番目のＧがＡに置換することにより、ｐｒｏＢ蛋白のＮ末端から１０７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに変化していることが知られている［ジーン（Ｇｅｎｅ）、６４巻、１９９−２０５ページ（１９８８年）］。
【０００６】
プロリン分解に関する酵素系、それをコードする遺伝子、遺伝子系の制御についても、大腸菌、サルモネラ菌などで研究が進んでおりよく知られている［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１４６巻、８９５−９０１ページ（１９８１年）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー （Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１４８巻、２１−４４ページ（１９８１年）］。
【０００７】
プロリンの生合成系の活性の強化された株を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法は知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を用いて、効率的にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法において、より工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造するために、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含有し、これを高効率で発現させる組換え体ＤＮＡを保持し、かつ、プロリン生合成系の活性の強化された形質転換体を提供し、該形質転換体を用いてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に安価に製造する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有し、且つ、Ｌ−プロリンの生合成系の活性の強化された形質転換体、および該形質転換体を培養し、該培養物、菌体またはそれらの処理物を酵素源として、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、水性媒体中で、Ｌ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該水性媒体より採取することを特徴とするトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明にかかわるＬ−プロリン４位水酸化酵素は、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、遊離のＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する酵素である。
【００１１】
本発明のＬ−プロリン４位水酸化酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐＲＨ７１があげられる。ｐＲＨ７１を含む大腸菌であるEscherichia coli SOLR/pRH71 は、平成７年３月２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥＲＭ ＢＰ−５０２５として寄託されている。
【００１２】
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を宿主中で発現させるためには、まず、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主中に導入する。宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、等に属する微生物菌株の他、酵母菌株や動物細胞宿主等をあげることができる。
【００１３】
発現ベクターとしては、上記宿主において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
大腸菌等の微生物を宿主として用いる場合は、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現ベクターは微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００１４】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.), ４８巻, ６６９〜６７５ページ（１９８４年) 〕、ｐＬＳＡ１〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.)，５３巻，２７７ページ（１９８９年）〕、ｐＧＥＬ１〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci., USA) ，８２巻，４３０６ページ( １９８５年）〕、pBluescript （STRATAGENE社）、ｐＴｒｓ３０〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕およびｐＴｒｓ３２〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕等を例示することができる。
【００１５】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰL プロモーターＰR プロモーターなどの、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００１６】
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子はＬ−プロリン４位水酸化酵素をコードする遺伝子であればいずれも用いることができるが、該遺伝子のＤＮＡ配列を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換して用いることにより高発現化が達成できる。大腸菌を宿主として、発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子の具体例として、配列番号１で示される塩基配列等をあげることができる。
【００１７】
本遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主としては、Escherichia coli XL1-Blue 、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000 、 Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49 、Bacillus subtilis 、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium immario philum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067 、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
【００１８】
酵母菌株を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115 ）、ＹＥｐ２４（ATCC37051 ）、ＹＣｐ５０（ATCC37419 ）等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal 1 プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1 プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００１９】
宿主としては、Saccharomyces cerevisiae 、Schizosaccharomycespombe 、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomycesalluvius 等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）等を例示することができる。プロモーターとしては、動物細胞の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヒトＣＭＶのIE(immediate early)遺伝子のプロモーター等のプロモーターをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。宿主としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
【００２０】
動物細胞へのＤＮＡの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入することができればいかなる方法も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェルグナー（Philip L. Felgner)ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 84, 7413(1987)〕等を用いることができる。形質転換株の取得および培養は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００２１】
宿主をプロリン生合成系の活性の強化されたものにするためには、１）宿主中のプロリン合成系遺伝子のコピー数を増加させる、２）プロリンによってフィードバック阻害を受けるプロリン合成系の酵素をコードする遺伝子に変異を生ぜしめ、プロリンによるフィードバック阻害が著しく減少した酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する、３）プロリンの分解活性を欠失させる、または４）これらを組み合わせることにより達成することができる。
【００２２】
プロリン合成系遺伝子またはプロリンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子は宿主の染色体上に存在しても良いし、またプラスミドなどの宿主中のベクター上に存在してもよい。
プロリンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子としては、 ｐｒｏＢ７４遺伝子、ＤＨＰr ｐｒｏＢ遺伝子［ジーン（ｇｅｎｅ）、３９巻、１０９−１１２ページ、（１９８４年）］等、プロリンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子をあげることができる。
【００２３】
また、プロリン合成系遺伝子またはプロリンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子をプロリン４位水酸化酵素遺伝子と共にプラスミドなどの宿主中のベクター上に存在させる場合は、両遺伝子が一つのプラスミド上に存在していてもよいし、別の共存可能なプラスミド上に存在していてもよい。
【００２４】
共存可能なプラスミドとしては、例えば、大腸菌においては、コリシンＥ１系のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２）とｐＡＣＹＣ系のプラスミド、コリシンＥ１系のプラスミドとＦ因子系のプラスミド、コリシンＥ１系のプラスミドとＲ因子系のプラスミド等をあげることができる。
プロリン生合成系遺伝子を宿主中で発現させるためには、前述のＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子での発現と同様の方法を用いることができる。
【００２５】
宿主のプロリン分解活性を欠失させるには、変異剤で宿主を処理した後、例えば細菌などではＰｒｏ−ＴＴＣプレート［アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，）、３３巻、４３４−４４４ページ、（１９７７年）］上で白色のコロニーを形成するものを選択することで取得できる。
【００２６】
更に、大腸菌等ではｐｕｔ遺伝子の適当な位置にトランスポゾンが挿入されることでプロリンの資化性が失われることがわかっている［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、９２巻、７４１−７４７ページ（１９７９年）］ので、トランスポゾンを挿入した後、薬剤耐性と前述したＰｒｏ−ＴＴＣプレートにより、プロリン分解活性欠失株を取得することもできる。
【００２７】
また、トランスポゾンによりプロリン分解活性が欠失した株より、Ｐ１トランスダクション［A Short Course In Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Esherichia coli and Related Bacteria, J. H. Miller, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1922, Laboratory Manual, pp.263 ］により別の菌株にプロリン分解活性欠失という形質を移すこともできる。
【００２８】
上記のようにしてプロリン生合成系の活性の強化された宿主を用いて得られた形質転換体の培養は、通常の培養方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として用いた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００２９】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００３０】
無機物としては、りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜１００時間である。培養中ｐＨは、３. ０〜９. ０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００３１】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３２】
動物細胞を宿主として用いた形質転換体を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、５％ＣＯ2 存在下等の条件下で行う。培養温度は３５〜３７℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間である。
【００３３】
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
このように培養して得た形質転換体中には、遺伝子源として用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム・エスピーＲＨ１等およびｐＴｒ２−４ＯＨを保有する組換え大腸菌と比較してＬ−プロリン４位水酸化酵素が著量生成蓄積しており、プロリン生合成活性も強く、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン製造を、遺伝子源として用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム・エスピーＲＨ１等およびｐＴｒ２−４ＯＨを保有する組換え大腸菌を用いた場合と比較して、はるかに効率的に行うことができる。
【００３４】
該形質転換体中にＬ−プロリン４位水酸化酵素が生成していることは、培養物、菌体またはそれらの処理物を、酵素反応に適した水性媒体中に、Ｌ−プロリン、二価鉄イオン、２−ケトグルタル酸とともに加え、また必要に応じて界面活性剤や有機溶剤を添加することにより、生成するトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを検出することにより知ることができる。生成されたＬ−プロリン４位水酸化酵素の活性は、下記測定条件下、１分間に１nmolのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。なお、ここでは、微生物菌体に加え、動物細胞を含めて菌体と呼ぶ。
【００３５】
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性の測定：
１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含有する２４０ｍＭのＭＥＳ〔２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〕緩衝液（ｐＨ６. ５）に菌体、菌体処理物または酵素標品等を添加して合計２５０μｌとし、３５℃、１０分間反応する。反応液を１００℃、２分間加熱して反応を停止した後に、反応液中に生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）を用いて定量する。
【００３６】
定量にはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量できる方法であればどのような方法を用いてもよいが、例えば、反応液中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを配位子交換クロマトグラフィーカラム、例えば、株式会社住化分析センター製SUMICHIRAL OA5000 等を用いてＨＰＬＣで分離溶出後、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル（以下、ＮＢＤと略記する）によってポストカラム誘導体化し検出する方法( ポストカラム誘導体化法) 、あるいは反応液中の目的化合物をあらかじめＮＢＤ誘導体化しておき、これをＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラフィーにかけてＮＢＤ誘導体化物を分離後検出する方法〔William J. Lindblad and Robert F. Diegelmann, アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）、１３８巻、３９０〜３９５ページ、１９８４年〕（プレカラム誘導体化法）等があげられる。ＮＢＤ誘導体化物の検出は、いずれもその蛍光( 励起波長５０３ｎｍ、蛍光波長５４１ｎｍ) 測定によって行われる。
【００３７】
上記のようにして培養菌体中にＬ−プロリン４位水酸化酵素の生成が確認された形質転換体を、前述の形質転換体の培養条件と同様の条件で培養し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成蓄積させ、該培養物よりトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取することにより、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することができる。
【００３８】
該培養において、必要に応じて２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンを培養液中に添加してもよい。
本発明により製造されたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、前述のポストカラム誘導体化法やプレカラム誘導体化法によって、定量分析することができる。
【００３９】
【実施例】
実施例１ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素高発現プラスミッドの構築
配列番号２記載のＤＮＡと配列番号３記載のＤＮＡをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成ＤＮＡの３’末端２５ｂｐは互いに相補的な配列となるように設計されている。さらに、該合成ＤＮＡには、Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素蛋白のＮ末端部分をコードする塩基配列が含有されているが、該塩基配列には、Dactylosporangium sp. RH1 由来の塩基配列を、大腸菌での発現に最適なコドンとなるように部位特異的な塩基置換がほどこされている。
【００４０】
該合成ＤＮＡをプライマーかつ鋳型としてＰＣＲを行った。
ＰＣＲはPfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社製）０．５Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（STRATAGENE社製）２μｌ、ＤＭＳＯ ２μｌ、各２．５ｍＭｄＮＴＰ液１μｌ、配列番号２記載の合成ＤＮＡと配列番号３記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベーションの後、９６℃−２分間、５０℃−１分間、７５℃−１分間のインキュベーション工程を３５回繰り返す条件で行った。
【００４１】
反応終了後、該反応液を、１５％ポリアクリルアミドゲル（アトー株式会社製、パジェルNPU-15L ）電気泳動にかけ、１０７ｂｐの増幅断片の生成を確認した。
該１０７ｂｐの増幅断片を日本エイドー株式会社製のダヴィンチくん（ペンタッチリカバリーＮＢ−７０００型）を用いて回収後、該１０７ｂｐのＤＮＡ断片の両末端をHind IIIおよびSal I で切断した。
【００４２】
該Hind III−Sal I 切断断片をBio, Inc. 製 MERmaid Kitを用いて回収した。回収液量は１６μｌとなった。
参考例１に記載の方法に従って作成したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨＤＮＡをBam HIおよびPvu IIで切断後、反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、２つの断片が生成していることを確認した。該断片の内、Ｌ−プロリン水酸化酵素の構造遺伝子を含む長い断片をバイオラッド社製のPrep-A-gene を用いて回収し、宝酒造社製のブランティングキットを用いて末端を平滑化した後、宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結環状化した。
【００４３】
該連結環状化したプラスミドを用い、E. coli JM109 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で１晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
【００４４】
以上の結果、ｐＴｒ２−４ＯＨの一部の配列を削除したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔ（図１）を得た。
取得したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔＤＮＡをHind IIIおよびSal I で切断後、該切断部位に、Hind IIIおよびSal I 処理した上記ＰＣＲ増幅断片を、宝酒造社製のライゲーションキットを用いて、挿入した。
【００４５】
得られたプラスミドを用い、E. coli XL1-Blue MRF' 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で１晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、プラスミドｐＷＦＨ１（図２）を取得した。
【００４６】
該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した。ＰＣＲ増幅断片挿入部分についてはアプライドバイオシステムズ社製の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用いて、塩基配列を決定した。該塩基配列を配列番号１に示す。
該プラスミドは、構造遺伝子の５’末端からSal I 部位においてDactylospora ngium sp. RH1 由来の塩基配列と一部異なる以外は、Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素とまったく同じアミノ酸配列をコードする構造遺伝子ＤＮＡ断片が、Ｐtrp×２の転写方向と同方向に挿入された構造を有していた（図２）。
【００４７】
第１表に示したように、ｐＷＦＨ１を保有する形質転換体は、遺伝子源として用いたダクチロスポランジウムエスピーＲＨ１株と比較して１４００倍、ｐＴｒ２−４ＯＨを保有する形質転換体と比較して約５．４倍のＬ−プロリン水酸化酵素を生産していた。
【００４８】
【表１】
実施例２ プロリン分解系欠損株の造成
E. coli ATCC12435 のプロリン分解に関与する遺伝子putAを以下の方法で破壊し、プロリン分解系欠損株を造成した。
国立遺伝学研究所保存菌株であるE. coli ME8395 株［Ｆ- ：pyrD34 trp-45 his-68 thyA25 thi deoR33 galK35 xyl-7 mtl-2 malA1 rpsL118 λR ( λ) - appA1 putA::Tn5 (Mu+) ］を３５μg/ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に植菌し、終夜培養した。
【００５０】
該培養液１００μｌにＰ１ファージ液１００μｌを添加・混合し、５分間放置した。
【００５１】
該放置液を１０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含む３ｍｌのＬＢ軟寒天培地と混合し、１０ｍＭＣａＣｌ2 を含むＬＢ寒天培地上に重層後、３７℃で７時間培養した。
培養後、得られた寒天培地表面のライゼートを１０ｍＭＣａＣｌ2 を含む２ｍｌのＬＢ培地中に回収した。
該回収液に０．５ｍｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスミキサーを用いて混合後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、得られた上清をＰ１ファージライゼートとして用いた。
【００５２】
該Ｐ１ファージライゼート液５０μｌと１０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含むＬＢ培地で培養したE. coli ATCC12435 培養液１００μｌとを混合し、３７℃で２０分間静置した。
該静置液をエフ・トップ・サイトレイト（F-top-citrate ：ＮａＣｌ ８. ５ｇ/ ｌ、クエン酸２ナトリウム１００ｍＭ、寒天０. ７％）３ｍｌと混合し、３５μg/ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に塗布後、３７℃で１日培養した。
【００５３】
該培養により生育してきたカナマイシン耐性株を０．８５％のＮａＣｌに懸濁した後、Ｐｒｏ−ＴＴＣプレート（Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ/ ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ３ｇ/ ｌ、ＭｇＳＯ4 ０. １ｇ/ ｌ、プロテオースペプトン２ｇ/ ｌ、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド０. ０２５ｇ/ ｌ、Ｌ- Ｐｒｏ ２ｇ/ ｌ、寒天１５ｇ/ ｌ、ｐＨ７. ２) に塗布し、３７℃で１〜２日間培養した。
【００５４】
該培養によりＰｒｏ−ＴＴＣプレート上に白色のコロニーを形成した株を、プロリンを分解資化する能力の失われた株として選択し、プロリン分解活性欠損株 E. coliＷＴ１株を取得した。該菌株は平成８年８月７日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥＲＭ ＢＰ−５６１８として寄託されている。
【００５５】
実施例３ プロリン生合成系遺伝子proB74およびproA発現プラスミドの構築
大腸菌由来のγ-glutamyl kinaseをコードするproB遺伝子をプロリンによるフィードバック阻害に対して脱感作された変異型遺伝子に変換したproB74遺伝子および大腸菌由来のγ-glutamyl phosphate reductase をコードするproA遺伝子の発現プラスミドｐＰＦ１を以下の方法により構築した。
【００５６】
大腸菌由来のproBおよびproA遺伝子を含むプラスミドｐＰＲＯ−１［大腸菌Ｋ８３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８０７）より取得］をEcoRVで消化し、アガロースゲル電気泳動後、Prep-A-gene DNA Purification System (BIO-RAD社製）でproB遺伝子の一部を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９（宝酒造社製）のSma I 消化物と連結し、プラスミドｐＢＡＢ５１を得た（図３）
該プラスミド中のproB遺伝子を、以下の方法により、公知[A. M. Dandekar and S. L. Uratsu, J. Bacteriol. 170, 5943 (1988)] のプロリンによるフィードバック阻害に対して脱感作された変異型遺伝子proB74に変換した。
【００５７】
配列番号４に示したオリゴヌクレオチドＡ１および配列番号５に示したオリゴヌクレオチドＡ２をアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
オリゴヌクレオチドＡ１とＭ１３プライマーＭ３（宝酒造社製、カタログＮｏ．３８３１）を一組のプライマーとして、ｐＢＡＢ５１を鋳型として用い、ＰＣＲ法により変異型proB遺伝子であるproB74遺伝子の部分配列を増幅した。
【００５８】
ＰＣＲは、ｐＢＡＢ５１を０．１μｇ、オリゴヌクレオチドＡ１とＭ１３プライマーＭ３を各２μＭ、Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造社製）を１Ｕ、ｄＮＴＰミクスチャー（宝酒造社製、カタログＮｏ．４０３０）を１．６μｌ、添付バッファー２μｌを含む反応液２０μｌを用い、９４℃−３０秒間、５２℃−３０秒間、７２℃−１分間のインキュベーション工程を３０回繰り返し、最後に７２℃−５分間インキュベーションすることにより行った。
【００５９】
同様の方法で、オリゴヌクレオチドＡ２とＭ１３プライマーＲＶ（宝酒造社製、カタログＮｏ．３８３０Ａ）を一組のプライマーとして、ｐＢＡＢ５１を鋳型として用い、ＰＣＲ法により変異型proB遺伝子の部分配列を増幅した。
ＰＣＲ法により増幅された該２種類のＤＮＡをそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけた後、Prep-A-gene DNA Purification System (BIO-RAD社製）を用いて精製した。
【００６０】
該２種の精製ＤＮＡ断片を混合したものを鋳型とし、Ｍ１３プライマーＭ３およびＭ１３プライマーＲＶをプライマーとして用い、上記と同様の方法により、ＰＣＲおよび精製を行い、proB74遺伝子の塩基配列を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該ＤＮＡ断片をEco O65IおよびSac IIで消化し、Eco O65I−Sac II消化断片を取得した。
【００６１】
該消化断片と、ｐＰＲＯ−１のEco O65I−Sac II消化ＤＮＡ断片（約６．８ｋｂｐ）とを連結し、ｐＰＲＯ−１のproB遺伝子を脱感作型proB74遺伝子に変換したプラスミドｐＰＲＯ７４を作製した（図４）。
配列番号６に示したオリゴヌクレオチドｐ１および配列番号７に示したオリゴヌクレオチドｐ２をアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００６２】
該ｐ１、ｐ２をプライマーとして、プラスミドｐＰＲＯ７４を鋳型として用い、ＰＣＲ法によりproB74およびproA遺伝子を増幅した。
ＰＣＲは、ｐＰＲＯ７４を０．１μｇ、ｐ１、ｐ２を各２μＭ、タカラ・イーエックス・タック（TaKaRa Ex Taq ：宝酒造社製、コードRR001Q）１Ｕ、ｄＮＴＰミクスチャー（宝酒造社製、カタログＮｏ．4030）を１．６μｌ含む反応液２０μｌを用い、９４℃−１分間、４２℃−２分間、７２℃−３分間のインキュベーション工程を３０回繰り返すことにより行った。
【００６３】
該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、proB74およびproAを含む２３７０ｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収した。回収した２３７０ｂｐのＤＮＡ断片をHind IIIおよびBam HIで切断後、エタノール沈殿法によりエタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解し、proB74およびproA断片として用いた。
【００６４】
該proB74およびproA断片と、プラスミドｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）のHind III−Bam HI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、proB74およびproA断片の挿入されたプラスミドを構築した。
該プラスミドをE. coli JM109 株に常法に従って形質転換後、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、０．１ｍＭＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
【００６５】
該培養により白色コロニーを形成した株より常法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した。
上記の方法により、脱感作型γ-glutamyl kinaseのＮ末端にβ−ガラクトシダーゼのαフラグメントのＮ末端８アミノ酸残基（lacZ.Nterm）が結合した融合蛋白をコードする遺伝子およびproA遺伝子がＰlac支配下に存在するプラスミドｐＰＦ１を取得した（図５）。
【００６６】
該融合蛋白の構造遺伝子（lacZ.Nterm-proB74 ）の塩基配列とアミノ酸配列を配列番号８に示す。
実施例４ プロリン生合成系遺伝子発現プラスミドを含む形質転換体によるトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
実施例３で構築したプラスミドｐＰＦ１を用いて、実施例２で取得したE. coli WT1 株を形質転換し、形質転換株E. coli WT1/pPF1を取得した。
【００６７】
実施例１で構築したプロリン４位水酸化酵素発現プラスミドｐＷＦＨ１で、実施例２で取得したＷＴ１株を形質転換しE. coli WT1/pWFH1 を取得した。
該形質転換株E. coli WT1/pWFH1 より塩化カルシウム法にてコンピテントセルを作製し、実施例３で作製したプラスミドｐＰＦ１を導入し、両プラスミドを保有する形質転換株E. coli WT1/pWFH1/pPF1を３０μｇ/ ｍｌのクロラムフェニコールと５０μｇ/ ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に生育してくるコロニーを選択することにより取得した。
【００６８】
WT1 、WT1/pPF1、WT1/pWFH1 およびWT1/pWFH1/pPF1をそれぞれカナマイシン３７．５μｇ/ ｍｌ、アンピシリン１００μｇ/ ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ/ ｍｌ、そしてアンピシリン１００μｇ/ ｍｌおよびクロラムフェニコール３０μｇ/ ｍｌを含むＬＢ培地で３７℃で１６時間培養した。
該培養液それぞれ１００μｌを、２％（Ｗ/ Ｖ）の炭酸カルシウムを含む１０ｍｌのＭｅｄ７培地（グルコース２％、硫酸アンモニウム１％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％、ＮａＣｌ ０. ２％、ＭｇＳＯ4 ０. ０５％、ＦｅＳＯ4 ０. ０２７８％、ＣａＣｌ2 ０. ００１５％、ペプトン０. ８％）をいれた太型試験管（φ２０×２００ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間培養した。
【００６９】
該培養上清中のＬ−プロリンおよびトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を第２表に示した。
【００７０】
【表２】
プロリン生合成系遺伝子発現プラスミドｐＰＦ１保有菌株においてはＬ−プロリンの生成が著しく増加し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミドｐＷＦＨ１およびプロリン生合成系遺伝子発現プラスミドｐＰＦ１の共存する形質転換体においてはＬ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミドを単独で保持する形質転換体に比べてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成量が顕著に増加することが確認できた。
【００７２】
実施例５ L ―プロリン４位水酸化酵素とプロリン生合成系遺伝子proB74およびproA発現プラスミドの構築
Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子、プロリン生合成系遺伝子proB74およびproAの全ての遺伝子を単一のプラスミド上に保持し、これを発現させるような発現プラスミドｐＷＦＰ１を以下の方法により構築した。
【００７３】
実施例１で作成したｐＷＦＨ１をテンプレートとし、ＰＣＲ法にてＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子を増幅した。
ＰＣＲはｐＷＦＨ１プラスミド０．１μg 、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社製）0.5 Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（STRATAGENE社製）２μｌ、ＤＭＳＯ ２μｌ、各２．５ｍＭｄＮＴＰ液１μｌ、配列番号９記載の合成ＤＮＡと配列番号１０記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベーションの後、９６℃−２分間、５８℃−１分間、７５℃−３分間のインキュベーション工程を３０回繰り返す条件で行った。
【００７４】
反応終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子を含む約８００ｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収した。
該回収ＤＮＡ断片をHind IIIおよびEco RIで切断後、アガロースゲル電気泳動にかけ、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いてＬ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子を有する該Hind III−Eco RI切断ＤＮＡ断片を回収した。
【００７５】
該Ｌ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子断片と、プラスミドpBluescriptII KS(+)（stratagene社製）のHind III―Eco RI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素断片の挿入されたプラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨを構築した（図６）。
実施例３で作成したｐＰＲＯ７４をテンプレートとしＰＣＲ法にてproB74およびproA遺伝子を増幅した。
【００７６】
ＰＣＲはｐＰＲＯ７４プラスミド0.1 μg 、タカラ・イーエックス・タック（TaKaRa Ex Taq ：宝酒造社製、コードRR001Q）１Ｕ、タカラ・イーエックス・タック用×１０緩衝液（宝酒造社製）２μｌ、各２．５ｍＭｄＮＴＰ液１．６μｌ、配列番号１１記載の合成ＤＮＡと配列番号１２記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含む反応液２０μｌを用い、９４℃−１分間、４２℃−２分間、７５℃−３分間のインキュベーション工程を３０回繰り返す条件で行った。
【００７７】
反応終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、proB74およびproA遺伝子を含む約２．３ｋｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片をBam HIおよびEco RIで切断後、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、該ＤＮＡ断片を回収した。このproB74およびproA遺伝子を含むＤＮＡ断片と、上記プラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨのHind III―Eco RI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、proB74およびproAを含むプラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨＢＡを構築した（図７）。
【００７８】
プラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨＢＡをHind IIIおよびBam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、proB74およびproAを含む約３．１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。また、実施例１で作成したｐＷＦＨ１をHind IIIおよびBam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含まず、複製開始点を含む方の約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。取得した２つのＤＮＡ断片を宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、トリプトファンタンデムプロモーター下でＬ−プロリン４位水酸化酵素、proB74タンパク、proAタンパクを発現させうるプラスミドｐＷＦＰ１を構築した（図８）。
【００７９】
実施例６ 形質転換体E. coli WT1/pWFH1/pPF1およびE. coli WT1/pWFP1 を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
形質転換株WT1/pWFH1/pPF1株をアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌ Ｍｅｄ４Ｇ培地［グルコース ２％、ポリペプトン（日本製薬社製） １％、イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５％、ＮａＣｌ １％、炭酸カルシウム ２％、ｐＨ７．０］に、形質転換株WT1/pWFP1 株をアンピシリン１００μｇ/ ｍｌを含む５０ｍｌ Ｍｅｄ４Ｇ培地に、それぞれ植菌した後、３０℃で１６時間振とう培養した。
【００８０】
該培養液を種培養液とし、２リッターのＭｅｄ７培地を入れた５リッタージャーファーメンターにそれぞれ植菌し、WT1/pWFH1/pPF1株の培養においては、アンピシリン１００μｇ/ ｍｌおよびクロラムフェニコール３０μｇ/ ｍｌを、WT1/pWFP1 株の培養においては、アンピシリン１００μｇ/ ｍｌを更に添加し、培養温度３０℃、撹拌数４００回転／分、通気量１リッター／培養液１リッター／分の条件で培養した。
【００８１】
また、WT1/pWFH1/pPF1の培養においては、培養８時間目に、ＩＰＴＧを０. ２ｍＭとなるように添加した。
更に、両菌株とも、培養２４時間目に、培養開始時と同種、同濃度の抗生物質を添加した。
培養中、グルコースをほぼ１％の濃度となるように適時培養液に添加し、ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ６. ５に下限コントロールした。また、培養５時間以降に、撹拌数を２５０〜７００ｒｐｍに変化させることにより、培養液の溶存酸素濃度が培養開始時点の１／１５となるようにコントロールした。
【００８２】
９９時間培養後、該培養液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を定量した結果、WT1/pWFH1/pPF1株において１５６ｍＭ（２０．５ｇ/ ｌ）、WT1/pWFP1 株において１９１ｍＭ（２５．０ｇ/ ｌ）のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成蓄積が認められた。
【００８３】
実施例７ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子およびプロリン生合成系遺伝子発現プラスミドを含む形質転換体によるトランスー４―ヒドロキシーＬ−プロリンの生産
実施例５で構築したプラスミドｐＷＦＰ１を用いて、実施例２で取得したE. coli WT1株を形質転換し、形質転換株E. coli WT1/pWFP1 を取得した。
【００８４】
WT1/pWFP1 をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で３７℃で１６時間培養した。該培養液１００μｌを、２％（Ｗ/ Ｖ）の炭酸カルシウムを含む１０ｍｌのＭｅｄ７培地を入れた太型試験管（φ２０×２００ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間培養した。
該培養上清中のＬ−プロリンは０．５６ｇ／Ｌであり、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは２．４ｇ／Ｌであった。
【００８５】
実施例８ 形質転換体の菌体を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
形質転換体E. coli ATCC12435/pTr2-4OHを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌＬＢ培地に植菌し３０℃、一晩振とう培養後、該培養液を遠心分離し、E. coli ATCC12435/pTr2-4OHの湿菌体を取得した。
【００８６】
形質転換体E. coli ATCC12435/pWFH1 をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌ Ｍｅｄ４培地〔ポリペプトン（日本製薬社製）１％、イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、ＮａＣｌ１％〕に植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。
該培養液を、２リッターのＭｅｄ７培地（グルコース２％、硫酸アンモニウム１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、ＮａＣｌ ０．２％、ＭｇＳＯ4 ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ０．０２７８％、ＣａＣｌ2０．００１５％、ペプトン ０．４％）を入れた５リッタージャーファーメンターに植菌後、Ｌ−Ｐｒｏを２００ｍＭ添加し、培養温度３３℃、通気量１リッター／培養液１リッター／分という条件で４８時間培養した。
【００８７】
溶存酸素濃度が初期値の１５分の１に達した時点で、撹拌数４００回転／分を基準とし、７００回転／分を上限として攪拌数を変化させることにより、溶存酸素濃度を初期値の１５分の１となるようにコントロールした。
培養中、グルコースは無くならぬように、Ｌ−プロリンは約５０ｍＭとなるように適時添加し、ＮＨ4ＯＨを用いて、ｐＨ６．５に下限コントロールした。
【００８８】
該培養により得られた培養液を遠心分離し、E. coli ATCC12435/pTr2-4OH および E. coliATCC12435/pWFH1 の湿菌体を取得した。
該両菌株の湿菌体は必要に応じて−２０℃で凍結保存することが可能で、使用時に解凍し用いることができる。
反応液〔２４０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６. ５）中に、１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含有する〕２５０μｌに湿菌体量として４％（ｗ／ｖ）となるように加え、３５℃で１０分間反応した。反応液を１００℃、２分間加熱することにより反応を停止した。
【００８９】
該反応停止液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を定量した結果、E. coli ATCC12435/pTr2-4OH株において３ｍｍｏｌ／ｌ、E. coli ATCC12435/pWFH1 株において１６ｍｍｏｌ／ｌのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産が認められた。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素に対する菌体活性はそれぞれ、７．５および４０U/mg・ wet cells であった。
【００９０】
参考例１ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミッドの構築
配列番号１３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号１４に記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとして、ｐＲＨ７１［該プラスミドを含有するEscherichia coli SOLR/pRH71 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２５）より定法により取得］を鋳型としてＰＣＲを行った。
【００９１】
ＰＣＲは、ｐＲＨ７１を０. １μｇ、センス鎖およびアンチセンス鎖ＤＮＡプライマー各２μＭ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社製）０. １２５Ｕ／μｌ、ＤＭＳＯ１０％、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８. ２）２０ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、硫酸アンモニウム６ｍＭ、塩化マグネシウム２ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０００. １％、Bovine Serum Albumine １０ｎｇ／μｌを含む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベーション後、９６℃−２分間、５８℃−１分間、７５℃−１分間のインキュベーション工程を３０回繰り返す条件で行った。
【００９２】
反応終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードする８４４ｂｐの増幅断片が生成されていることを確認した。
該８４４ｂｐの増幅断片をアガロースゲルより常法により抽出し、バイオラッド社製のPrep-A-gene を用いて断片を回収した。回収した８４４ｂｐのＤＮＡ断片の両末端をHind IIIおよびBam HIで切断後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。
【００９３】
ｐＢＲ３２２を基本とし、Ｐtrpを２つ直列させたプロモーターＰtrp×２を持つプラスミドｐＫＹＰ２００〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.), ４８巻, ６６９〜６７５ページ（１９８４年) 〕と合成リンカーを組み合わせて作製されたＡＴＧベクターｐＴｒＳ３２〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕をHind IIIおよびBam HIで切断した。該切断部位に、Hind IIIおよびBam HIで切断処理した上記のＬ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝子断片を、宝酒造社製のライゲーションキットを用いて、挿入した。
【００９４】
得られたプラスミドを用い、E. coli XL1-Blue MRF' 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で１晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。構造遺伝子部分についてはアプライドバイオシステムズ社製の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用いて、塩基配列を決定し、配列番号１５で示した塩基配列であることを確認した。
【００９５】
該方法により、Ｐtrp×２の転写方向と同方向にＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨ（図９）を得た。
【００９６】
参考例２ ダクチロスポランジウム・エスピーの菌体を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
ＳＲ３培地（グルコース１．０％、可溶性澱粉１．０％、酵母エキス０．５
％、トリプトン０．５％、肉エキス０．３％およびリン酸マグネシウム０．０５％を含み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した培地）を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、ＨＴ寒天平板培地に生育したダクチロスポランジウム・エスピー（Dactylosporangium sp.）RH1 を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種培養液として用いた。
【００９７】
Ｄｆ１培地（可溶性澱粉５％、ソイビーンミール１．５％、リン酸１カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％および炭酸カルシウム０．５％を含み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した培地）を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、上記種培養液１ｍｌを無菌的に接種し、２８℃、２日間振盪培養した。
【００９８】
得られた培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離し、菌体を取得した。
該菌体を８０ｍＭＴＥＳ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸］緩衝液（ｐＨ７. ５）で洗浄後、遠心分離し、湿菌体を取得した。
【００９９】
該湿菌体１５０ｍｇを、１. ５ｍｌの反応液［４ｍＭ Ｌ−プロリン、８ｍＭα−ケト−グルタル酸、４ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、２ｍＭ 硫酸第一鉄、を含有する８０ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ５）にナイミーン溶液（ナイミーンＳ−２１５（日本油脂株式会社製）４ｇをキシレン１０ｍｌに溶解）を１. ４％( ｖ／ｖ) 添加］に懸濁し、３０℃、３０分間反応を行った。
【０１００】
反応終了後、該反応液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を定量した結果、８４μｍｏｌ／ｌトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産が認められた。該菌株における、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素にたいする菌体活性は０．０２８U/mg・ wet cells であった。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬品の合成原料または食品添加物として有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含有し、かつ、プロリン合成系の活性の強化された形質転換体を提供することができる。
【０１０２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：８１６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号：２
配列の長さ：６４
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号：３
配列の長さ：６６
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号：４
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
配列番号：５
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
配列番号：６
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
配列番号：７
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
配列番号：８
配列の長さ：１１２５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列：
配列番号：９
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号：１０
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号：１１
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号１２
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号：１３
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
配列番号：１４
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
配列番号：１５
配列の長さ：８１６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Dactylosporangium sp.
株名：RH1
特徴を決定した方法：E
配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔの造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図２】図２は、プラスミドｐＷＦＨ１の造成工程を示す図である。
図中、網掛けの太線で示した部分が、Hind IIIおよびSal I 処理したＰＣＲ増幅断片の挿入部分を示す。黒塗の太線で示した部分が、Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図３】図３は、プラスミドｐＢＡＢ５１の造成工程を示す図である。
図中、黒の網掛けで示した部分が、プロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分である。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。ＴｃはｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図４】図４は、プラスミドｐＰＲＯ７４の造成工程を示す図である。
図中、黒の網掛けで示した部分が、プロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分である。黒塗りの部分はｐｒｏＢ７４とｐｒｏＢで唯一異なる塩基対を含むｐｒｏＢ７４遺伝子の一部分を示す。ＴｃはｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図５】図５は、プラスミドｐＰＦ１の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、プロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分を示す。ＣｍｒはＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む部分を示す。ｐＡＣＹＣ．ｏｒｉはｐＡＣＹＣ１８４由来の複製開始基点を、Ｐlacはlacプロモーターを、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。ｌａｃＺ．Ｎｔｅｒｍ- ｐｒｏＢ７４はβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子のＮ末端部分とｐｒｏＢ７４遺伝子との融合した遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図６】図６は、プラスミドｐＢＩＩ−４ＯＨの造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図７】図７は、プラスミドｐＢＩＩ−４ＯＨＢＡの造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含
む部分を示す。黒の網掛け部分はプロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図８】図８は、プラスミドｐＷＦＰ１の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。黒の網掛け部分はプロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図９】図９は、プラスミドｐＴｒ２−４ＯＨの造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
Claims (8)
- ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有し、且つ、Ｌ−プロリンの生合成系の活性の強化された形質転換体。
- Ｌ−プロリン生合成系の活性の強化が、宿主中のプロリン合成系遺伝子のコピー数を増加させる、プロリンによってフィードバック阻害を受けるプロリン合成系酵素遺伝子に変異を生ぜしめ、プロリンによるフィードバック阻害が著しく減少した酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する、プロリンの分解活性を欠失させる、またはこれらを組み合わせることにより達成されることを特徴とする、請求項１記載の形質転換体。
- Ｌ−プロリン生合成系の活性の強化が、Ｌ−プロリンの生合成に係わる酵素をコードする遺伝子の導入により達成されることを特徴とする、請求項１記載の形質転換体。
- 遺伝子が、大腸菌由来のｐｒｏＢまたはｐｒｏＡ遺伝子である、請求項３記載の形質転換体。
- 遺伝子が、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害の低減したプロリン生合成に係わる酵素をコードする遺伝子である、請求項３記載の形質転換体。
- 遺伝子が、大腸菌由来のｐｒｏＢ７４遺伝子である、請求項５記載の形質転換体。
- 請求項１〜６いずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養して得られる培養物、菌体またはそれらの処理物を酵素源として、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、水性媒体中で、Ｌ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該水性媒体より採取することを特徴とするトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
- 水性媒体が培養液であることを特徴とする、請求項７記載の製造法。
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