CN114231549B

CN114231549B - 一种用于生产l-羟脯氨酸的重组表达载体、工程菌株和方法

Info

Publication number: CN114231549B
Application number: CN202111412087.XA
Authority: CN
Inventors: 余伟; 李哲; 冉丁
Original assignee: Hebei Yuanda Jiufu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hebei Yuanda Jiufu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN114231549A

Abstract

本发明提供了一种用于生产L‑羟脯氨酸的重组表达载体、工程菌株和方法。所述载体包含编码脯氨酸羟基化酶的基因、编码谷氨酸激酶的基因、编码谷氨酸环化酶的基因、抗性基因和共用色氨酸启动子。所述方法包括采用包含所述重组表达载体的重组大肠埃希氏菌以葡萄糖为碳源进行发酵培养，在发酵过程中连续添加复合料，所述复合料包含谷氨酸和谷氨酸盐。与现有技术相比，本发明提供的方法通过采用重组大肠埃希氏菌，以及补加前体减少了菌体代谢流的负担，降低了副产物的生成，同时添加蛋白胨、维生素C、硫辛酸等营养物质，平衡菌体营养，维持菌体活力，进一步提高了产量。

Description

一种用于生产L-羟脯氨酸的重组表达载体、工程菌株和方法

技术领域

本发明属于微生物转化技术领域，具体地涉及一种用于生产L-羟脯氨酸的重组表达载体、包含其的工程菌株以及使用该菌株转化葡萄糖以生产 L-羟脯氨酸的方法。

背景技术

羟脯氨酸属于天然氨基酸，主要以多肽形式存在于动物的胶原蛋白中，羟脯氨酸目前主要应用在食品、化妆品和医药领域。在食品领域，羟脯氨酸可以用作增味剂、营养强化剂，主要用于果汁、清凉饮料、营养饮料等。在化妆品领域，羟脯氨酸具有美白、减少细小皱纹、延缓衰老的作用，用在面膜和美白产品中。在医药领域，羟脯氨酸可以用来合成培南类药物，例如美罗培南、厄他培南等的侧链。此外，乙酰羟脯氨酸还具有消炎的作用，用于治疗皮肤及关节疾病。因此，随着羟脯氨酸应用的进一步开发，市场需求也越来越大。

羟脯氨酸的生产方法主要有水解法、酶催化法和发酵法，其中水解法目前被逐渐淘汰，而酶催化法和发酵法目前是人们研究的热点。1999年， Shibasaki等从指孢囊菌RH1中分离并鉴定了L-脯氨酸4位的羟基化酶，并且完成了基因测序，通过对基因序列进行优化，并将该序列导入到L-脯氨酸的生产菌中，使羟脯氨酸的产量达到了25g/L，为工业化生产奠定了基础。

目前人们的研究热点主要是通过对来源于指孢囊菌RH1的羟基化酶基因序列进行优化，构建不同的表达载体，提高酶的表达量。另外就是通过对发酵工艺进行优化提高羟脯氨酸产量。公开号为CN103146720A和 CN103275998A的中国专利申请通过对孢囊菌RH1中的羟基化酶基因序列进行优化，提高了酶的表达量，使脯氨酸的转化率达到了91％和97.5％，更具有工业化潜力。

在发酵法生产羟脯氨酸的过程中，葡萄糖经过糖酵解生产丙酮酸，然后进行TCA循环，产生谷氨酸，谷氨酸在谷氨酸激酶和谷氨酸环化酶的作用下生产脯氨酸，最终脯氨酸在羟基化酶的作用下生成羟脯氨酸。

CN107435056A公开了一种羟脯氨酸的生产方法，以L-脯氨酸、α-酮戊二酸为底物，以含脯氨酸-4-羟化酶的工程菌全细胞为催化剂，再添加表面活性剂和添加剂建立生物转化体系进行转化反应，得到含有羟脯氨酸的转化液。该方法虽然转化率高，但是需要添加脯氨酸和α-酮戊二酸，这两者的价格相对葡萄糖较高，并且如果酶不能重复使用，则生产成本较高。

CN105420303A公开了一种羟脯氨酸的发酵方法，采用pH为1-6的除菌亚铁离子溶液，在发酵过程中以流加方式加入发酵罐，保持发酵罐内稳定的亚铁离子浓度，保证了酶的活力，提高了羟脯氨酸产量，达到了32.5g/L，葡萄糖转化率达到了18.5％，但是并没有针对葡萄糖代谢过程中的代谢流进行干预。

因此，当前对用于生产L-羟脯氨酸的高收率的生物发酵法还存在需求。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种生产L-羟脯氨酸的工程菌株以及方法，本发明提供的工程菌株和方法以葡萄糖为碳源进行发酵，并针对菌体代谢中中间体不足补加复合料，提高了羟脯氨酸的生产水平，提高了葡萄糖转化率，降低了生产成本，同时发酵副产物少，利于后续提取分离。

一方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述载体包含编码脯氨酸羟基化酶的基因、编码谷氨酸激酶的基因、编码谷氨酸环化酶的基因、抗性基因和共用色氨酸启动子。

优选地，所述编码脯氨酸羟基化酶的基因是PH4基因，其序列如SEQ ID NO:1所示；所述编码谷氨酸激酶的基因是proB74基因，其序列如SEQ ID NO:2所示；所述编码谷氨酸环化酶的基因是proA基因，其序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述脯氨酸羟基化酶的序列如SEQ ID NO:4所示；所述谷氨酸激酶的序列如SEQ ID NO:5所示；所述谷氨酸环化酶的序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述PH4基因位于HindIII和EcoRI之间，所述proB74基因和所述proA基因位于EcoRI和BamHI之间。

优选地，所述抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。

所述载体是在pTrS3克隆载体的基础上，按照《分子克隆实验指南第三版》([美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译)的操作方法构建的。所述载体的构建图谱见图1。

另一方面，本发明提供了一种用于将葡萄糖转化为L-羟脯氨酸的重组大肠埃希氏菌，该重组大肠埃希氏菌包含本发明所述的载体；优选地，该重组大肠埃希氏菌的保藏编号为CGMCC 22937。

又一方面，本发明提供了上述重组大肠埃希氏菌在制备L-羟脯氨酸中的用途。

一方面，本发明提供了一种L-羟脯氨酸的生产方法，所述方法包括采用重组大肠埃希氏菌以葡萄糖为碳源进行发酵培养，并且在发酵过程中连续添加复合料，所述复合料包含谷氨酸和谷氨酸盐。

优选地，当可见分光光度计检测的发酵液菌体密度达到30到80，优选 50时连续添加复合料。

优选地，所述重组大肠埃希氏菌为保藏编号为CGMCC 22937的重组大肠埃希氏菌。该重组大肠埃希氏菌(W1485 proA)于2021年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

优选地，所述谷氨酸盐为谷氨酸钠和/或谷氨酸钾；更优选地，所述谷氨酸盐为谷氨酸钠。

优选地，所述复合料中的谷氨酸与谷氨酸盐的重量比为2.5:1到9:1，优选为5:1到8:1；更优选为6.25:1。

优选地，所述复合料还可以包含一种或多种选自蛋白胨、甜菜碱、硫辛酸和维生素C的其他添加剂；更优选地，所述蛋白胨选自胰酪蛋白胨、肉蛋白胨、骨蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨和酵母蛋白胨中的一种或多种；最优选地，所述蛋白胨为鱼蛋白胨。

在本发明的方法中，优选地，所述复合料包含谷氨酸50-90份、谷氨酸盐10-20份、蛋白胨2-8份、甜菜碱1-4份、硫辛酸0.05-0.2份和维生素C 0.05-0.2份；更优选地，所述复合料包含谷氨酸80份、谷氨酸盐12.8份、蛋白胨5份、甜菜碱2份、硫辛酸0.1份和维生素C0.1份。

优选地，所述复合料与发酵培养基的质量/体积比为10g/L到50g/L，优选20g/L。

根据本发明的方法还包括以下步骤：

(1)在发酵培养之前，对重组大肠埃希氏菌菌种进行种子培养；和

(2)将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。

优选地，所述种子培养包括以下步骤：

(a)在32-37℃的温度，优选为37℃的温度下，对所述菌种进行斜面培养8-16小时，优选为12小时；

优选地，用于所述斜面培养的斜面培养基包含：蛋白胨5-15g/L，酵母抽提物1-10g/L，氯化钠5-15g/L，琼脂粉1-3g/L；更优选地，所述斜面培养基包含：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2g/L；

优选地，所述斜面培养基在接种之前在121℃下灭菌30分钟，然后在凝固之前加入氨苄西林钠无菌溶液；

(b)在32-37℃的温度，优选为33℃的温度下，对步骤(a)得到的菌种进行种子培养8-15小时，优选为10小时；

优选地，所述种子培养基包含：蛋白胨2-8g/L，酵母浸粉8-12g/L，氯化钠1-8g/L，葡萄糖20-40g/L，聚醚类消泡剂0.05-0.15g/L；更优选地，所述种子培养基包含：蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠2.5g/L，葡萄糖30g/L，聚醚类消泡剂0.1g/L；更优选地，所述种子培养基的pH为6.5-7.5，进一步优选为7.0；

优选地，所述种子培养基在接种之前121℃下灭菌25分钟，然后降温到 33℃，并加入氨苄西林钠无菌溶液；

(c)当菌体密度大于11时，通过无菌空气将种子液压入发酵罐。

在本发明的方法中，所述发酵培养在发酵罐中进行，所述发酵培养的种子液接种量为发酵液体积的20％。

优选地，所述发酵培养基包含：酵母浸粉12-20g/L，硫酸镁0.2-0.8g/L，磷酸二氢钾1-4g/L，硫酸铵0.5-1.5g/L，硫酸亚铁0.1-0.5g/L，聚醚类消泡剂 0.05-0.15g/L；更优选地，所述发酵培养基包含：酵母浸粉15g/L，硫酸镁 0.54g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵1g/L，硫酸亚铁0.3g/L，聚醚类消泡剂 0.1g/L；

优选地，所述聚醚类消泡剂选自GP型甘油聚醚、GPE型聚氧乙烯(聚氧丙烯)醚和PPG型聚丙二醇中的一种或多种。

优选地，所述发酵培养基在接种之前灭菌、降温，并加入氨苄西林钠无菌溶液。

优选地，所述发酵培养的条件包括：

初始温度为32-37℃，优选33±0.5℃；

初始罐压为0.03-0.07MPa，优选为0.05MPa；

优选地，葡萄糖的浓度控制在5-10g/L；

优选地，发酵罐的溶解氧保持在30％以上；

优选地，发酵液的pH保持在6.6-6.8；

优选地，发酵培养时间为45-60h。

优选地，在发酵培养期间检测发酵进程，当菌体密度达到50时连续添加所述复合料，并在放罐前10h完成添加。

优选地，将所述复合料配制成100g/L到500g/L，优选300g/L的水溶液，蒸汽灭菌后再进行添加。

优选地，所述菌体密度的检测包括：取发酵液，用水稀释一定倍数，在可见分光光度计上检测600nm下的吸光度，如果检测值大于1则稀释更大倍数，检测值乘以稀释倍数即为菌体密度。

根据本发明的方法还包括从发酵液中提取L-羟脯氨酸。

在一个优选的实施方案中，本申请的方法包括以下步骤：

1.种子培养

1.1种子斜面制备

斜面培养基配方：蛋白胨5-15g/L，酵母抽提物1-10g/L，氯化钠5-15g/L，琼脂粉1-3g/L。

在试管中加入培养基20mL，置于自动灭菌锅中进行灭菌，温度121℃，时间30min，在斜面凝固之前，加入终浓度为100mg/L的无菌氨苄西林钠溶液。

斜面划线培养：取-70℃保藏的重组大肠埃希氏菌菌种的甘油管，在37℃溶解后，用接种环划线，置于37℃恒温培养箱培养12h，置于4度冰箱备用。

1.2种子悬浮液制备

用无菌生理盐水将斜面菌落冲洗下来，放到无菌三角瓶中，八层纱布密封。

1.3种子罐制备

种子罐为1t搅拌式发酵罐，装料体积为500L。

种子罐配方配比(g/L)：蛋白胨2-8g/L，酵母浸粉(安琪FM808)8-12g/L、氯化钠1-8g/L，葡萄糖20-40g/L，聚醚类消泡剂0.05-0.15g/L。

灭菌温度121℃，时间25min，灭菌完成后利用循环水降温到32-37℃，加入终浓度为100mg/L氨苄西林钠无菌溶液后，接入种子悬浮液。

发酵条件：转速100rpm，风量为50m³/h。

发酵过程中利用氨水控制pH在7.0。

当菌体OD大于11时移入发酵罐。

2.发酵培养

2.1发酵罐制备

发酵罐为5t搅拌式发酵罐，装料体积为2.5t。

发酵罐培养基配比(g/L)：酵母浸粉(安琪FM808)12-20g/L、硫酸镁0.2-0.8g/L、磷酸二氢钾1-4g/L、硫酸铵0.5-1.5g/L、硫酸亚铁0.1-0.5g/L、聚醚类消泡剂0.05-0.15g/L。

灭菌温度121℃，时间30min，灭菌完成后利用循环水降温到32-37℃，加入终浓度为100mg/L氨苄西林钠无菌溶液后，接入种子，接种量20％。

2.2发酵控制

发酵初始条件：温度：32-37℃，风量：60m³/h，转速120rpm，罐压 0.03-0.07MPa。

发酵过程中控制葡萄糖浓度5-10g/L。

通过提高风量和转速保持溶氧在30％以上。

用氨水控制pH在6.6-6.8。

3.补料

复合料组分：

组分	谷氨酸	谷氨酸钠	蛋白胨	甜菜碱	硫辛酸	维生素C
							重量份	50-90	10-20	2-8	1-4	0.05-0.2	0.05-0.2

用量：按照发酵液体积补加10g/L到50g/L，即2.5t发酵液需要补加25 到125kg。

补加方式：将上述复合料配成质量体积百分比为10％到50％的水溶液，蒸汽灭菌。

当发酵液菌体密度达到50时进行流加，放罐前10h补加完。

菌体密度的检测方法为OD法：取1mL发酵液，用水稀释25倍，在可见分光光度计上检测600nm下的吸光度，如果检测值大于1则稀释更大倍数，检测值乘以稀释倍数即为菌体密度。

4.从发酵培养基中提取L-羟脯氨酸。

与现有技术相比，本发明提供的方法具有以下有益效果：

1.促进产物的生物合成，提高了L-羟脯氨酸的产量。

2.复合料包括不同比例的前体物质以及营养物质，补加前体减少了菌体代谢流的负担，降低了副产物的生成。

3.同时添加蛋白胨、维生素C、硫辛酸等营养物质，平衡菌体营养，维持菌体活力，进一步提高了产量。

4.本申请的方法提高葡萄糖转化效率，降低生产成本。

5.本申请的副产物少，产品易于提取分离。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了本发明所述的重组载体的构建图谱。

图2是显示葡萄糖生成L-羟脯氨酸的代谢流的图；

图3是通过氨基酸分析仪检测的正常发酵液产品中其他氨基酸的含量图；和

图4是通过氨基酸分析仪检测的本发明的补料发酵液产品中的其他氨基酸的含量图。

生物材料保藏信息

本发明中使用的重组大肠埃希氏菌已经于2021年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22937，分类命名：大肠埃希菌 Escherichia coli。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，以下实施例只是描述性的，不意味着将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该意识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有改进方案、备选方案和等效方案。

实施例1重组表达载体和重组大肠埃希氏菌的构建

pTrS3质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，PH4核苷酸序列(如SEQ ID NO:1所示)、proB74(如SEQ ID NO:2所示)及proA 核苷酸序列(如SEQ ID NO:3所示)，以及三个序列的连接均委托专业第三方公司生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工合成。转化载体的构建以及阳性克隆的筛选按照本领域一般技术人员熟悉的方法进行操作，表达载体、试剂均可以从商业途径获得(所述的重组载体的构建图谱见图1)。

实验过程中采用限制性内切酶将目的基因连接到载体质粒，同时转化到宿主细胞，并通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。大肠埃希氏菌W1485购自美国ATCC菌种保藏中心，保藏号为12435。

感受态细胞的制备：

取-70℃冰冻大肠埃希氏菌W1485，用划线法接种细菌于培养皿，于37℃培养过夜。第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养8h。取试管菌液1mL接种至含有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，37℃摇床培养约2～3小时(200rpm)，当菌落600nm OD 值达到0.3-0.4时，将三角瓶取出放置冰上10～15分钟。在无菌条件下把菌液倒入50mL离心管中，4℃，4000g条件下离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液，加10mL 0.1M的氯化钙溶液到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。4℃，4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加4mL冰预冷的0.1M 的氯化钙溶液，重悬浮菌体。每管0.2mL分装到无菌EP管中，至4℃保存备用。

重组质粒转化感受态大肠埃希氏菌W1485：

在0.2mL感受态细胞中加入20μl重组质粒，用移液器轻柔混匀。冰上静置20min，42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min。整个过程不要振荡菌液。加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，取100μl菌液，至含有抗生素氨苄青霉素的LB固体培养基上，涂布均匀，37℃培养过夜，生长出来的单菌落即为含有重组质粒的大肠埃希氏菌W1485。

实施例2使用本发明的重组大肠埃希氏菌和微生物发酵法生产L-羟脯氨酸

1.种子培养

1.1种子斜面制备

斜面培养基配方：鱼蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2g/L。

在试管中加入培养基20mL，置于自动灭菌锅中进行灭菌，温度121℃，时间30min，在斜面凝固之前，加入终浓度为100mg/L的无菌氨苄青霉素钠溶液。

斜面划线培养：取-70℃保藏的实施例1制备的重组大肠埃希氏菌菌种的甘油管，在37℃溶解后，用接种环划线，置于37℃恒温培养箱培养12h，置于4度冰箱备用。

1.2种子悬浮液制备

1.3种子罐制备

种子罐为1t搅拌式发酵罐，装料体积为500L。

种子罐配方配比(g/L)：鱼蛋白胨5g/L，酵母浸粉(安琪FM808)10 g/L，氯化钠2.5g/L，葡萄糖30g/L，聚醚类消泡剂0.1g/L。

灭菌温度121℃，时间25min，灭菌完成后利用循环水降温到33℃，加入终浓度为100mg/L氨苄西林钠无菌溶液后，接入种子悬浮液。

发酵条件：转速100rpm，风量为50m³/h。

发酵过程中利用氨水控制pH在7.0。

当菌体OD大于11时移入发酵罐。

2.发酵培养

2.1发酵罐制备

发酵罐为5t搅拌式发酵罐，装料体积为2.5t。

发酵罐培养基配比：酵母浸粉(安琪FM808)15g/L，硫酸镁0.54g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵1g/L，硫酸亚铁0.3g/L，聚醚类消泡剂0.1g/L。

灭菌温度121℃，时间30min，灭菌完成后利用循环水降温到33℃，加入终浓度为100mg/L氨苄西林钠无菌溶液后，接入种子，接种量20％。

2.2发酵控制

发酵初始条件：温度：33±0.5℃，风量：60m³/h，转速120rpm，罐压 0.05MPa。

发酵过程中控制葡萄糖浓度5-10g/L。

通过提高风量和转速保持溶氧在30％以上。

用氨水控制pH在6.6-6.8。

3.补料

复合料组分：

组分	谷氨酸	谷氨酸钠	鱼蛋白胨	甜菜碱	硫辛酸	维生素C
							重量份	80	12.8	5	2	0.1	0.1

用量：按照发酵液体积补加20g/L，即2.5t发酵液需要补加50kg。

补加方式：将上述复合料配成30％的水溶液，蒸汽灭菌。

当发酵液菌体密度达到50时进行流加，放罐前10h补加完。

4.从发酵培养基中提取L-羟脯氨酸。

L-羟脯氨酸的检测参照如下文献进行：刘芳、穆畅道，过氧化氢氧化法测定羟脯氨酸含量的研究[J]。西部皮革，2008，30(z1)：43-46。

得到的羟脯氨酸产量为60-65g/L，葡萄糖转化率达到了35％。

实施例3使用本发明的微生物发酵法生产L-羟脯氨酸

如实施例1所述进行种子培养和发酵培养，不同之处在于改变复合料中谷氨酸和谷氨酸盐的比例，结果见表1。

表1谷氨酸和谷氨酸盐的比例对实验结果的影响

结论：由实验结果可看出，谷氨酸和谷氨酸盐的比例对本实验结果的影响较大。当谷氨酸和谷氨酸盐的比例低于2.5:1或者高于9:1时，发酵产物浓度较低；当谷氨酸和谷氨酸盐的比例为2.5:1至9:1时，产物浓度明显提高；当谷氨酸和谷氨酸盐的比例为6.25:1时，实验结果最佳。

实施例4使用本发明的微生物发酵法生产L-羟脯氨酸

如实施例1所述进行种子培养和发酵培养，不同之处在于改变复合料的组成，结果见表2。

表2复合料组分对发酵产物浓度(g/L)的影响

组别

谷氨酸

谷氨酸钠

鱼蛋白胨

甜菜碱

硫辛酸

维生素C

结果

1

80g

12.8g

5g

2g

0.1g

65

2

80g

12.8g

0g

58

3

80g

12.8g

5g

0g

60

4

80g

12.8g

3g

4g

0.15g

0.05g

64

5

80g

12.8g

8g

2g

0.2g

0g

62

6

80g

12.8g

2g

3g

0.1g

0.2g

63

7

80g

12.8g

6g

1g

0.05g

0.15g

64

结论：由实验结果可看出，在添加谷氨酸/谷氨酸盐后发酵最终产物浓度提高到55g/L以上，同时在此基础上增加蛋白胨，产物浓度可以提高到60g/L，进一步添加甜菜碱、硫辛酸、维生素C等营养物质可以延缓菌种衰老、补充菌体营养，使产物浓度进一步提高到60-65g/L。

实施例5补料时机对发酵产物浓度(g/L)的影响

如实施例1所述进行种子培养和发酵培养，不同之处在于改变复合料的加入时机，结果见表3。

表3补料时机对发酵产物浓度(g/L)的影响

组别	补料时的菌体密度	产物浓度g/L
			1	10	42
2	30	53
			3	50	65
4	80	61
			5	100	45

结论：由实验结果可看出，补料时机对发酵产物浓度具有明显的影响。当补料时的菌体密度低于30或者高于80时，发酵产物浓度较低；当补料时的菌体密度为50时，发酵产物浓度显著提高。

对比例1本发明的发酵方法与其他现有技术的方法的对比

将本发明的发酵方法与其他现有技术的方法，例如CN105238708A和CN105483069A进行比较，结果如表4：

表4本发明的发酵方法与其他现有技术的方法比较

可以看出，本发明的发酵方法明显优于CN105238708A和 CN105483069A的发酵方法，产物浓度和葡萄糖转化率明显更高，并且发酵周期与现有技术的发酵方法相当。

对比例2使用常规发酵法生产L-羟脯氨酸与使用本发明方法生产L- 羟脯氨酸的比较

1.种子制备：按照实施例1的方法进行制备。

2.发酵培养

2.1发酵罐制备

发酵罐为5t搅拌式发酵罐，装料体积为2.5t。

发酵罐培养基配比：酵母浸粉(安琪FM808)15g/L，硫酸镁0.54g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵1g/L，硫酸亚铁0.3g/L，消泡剂0.1g/L。

2.2发酵控制

发酵过程中控制葡萄糖浓度5-10g/L。

通过提高风量和转速保持溶氧在30％以上。

用氨水控制pH在6.6-6.8。

发酵结束：产物浓度2个小时内不再增加，升温放罐。

放罐检测产物浓度为42g/L，葡萄糖转化率为24％。

菌种常规发酵和补料发酵对比的结果见表5：

表5正常发酵和补料发酵的结果比较

	正常发酵	补料发酵
			产物浓度(g/L)	40-50	60-65
葡萄糖转化率(％)	20-25	30-35
			发酵周期(h)	60-70	45-50

通过氨基酸分析仪检测使用常规发酵法和本发明的方法获得的发酵液产品，发现使用本发明的方法生产的发酵液产品中的副产物种类少，并且副产物含量更低。结果参见图3和图4。图3显示了本发明的补料发酵产物中的其他氨基酸含量：苏氨酸0，谷氨酸0.02％，甘氨酸0.02％，半胱氨酸0.1％，苯丙氨酸0.01％。图4显示了常规发酵产物中的其他氨基酸含量：苏氨酸 0.15％，甘氨酸0.22％，半胱氨酸0.47％，苯丙氨酸0.13％。

由此可见，本发明通过补料发酵，不仅能够提高L-羟脯氨酸的产量，而且能够有效地降低副产物的生成，发酵周期短，有利于工业上的大规模制备。

尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过后附的权利要求书来确定。

序列表

<110> 保定九孚生化有限公司

<120> 一种用于生产L-羟脯氨酸的重组表达载体、工程菌株和方法

<130> DIC21110052

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 819

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgctgaccc cgaccgaact gaaacagtat cgtgaagcgg gctatctgct gattgaagat 60

ggcctgggcc cgcgtgaagt tgactgcctg cgtcgtgctg ctgctgctct gtacgctcag 120

gactctccgg accgtaccct ggaaaaagac ggtcgtaccg ttcgtgctgt tcacggttgc 180

caccgtcgtg acccggtttg ccgtgacctg gttcgtcacc cgcgtctgct gggtccggct 240

atgcagatcc tgtctggtga cgtttacgtt caccagttca aaatcaacgc taaagctccg 300

atgaccggtg acgtttggcc gtggcaccag gactacatct tctgggctcg tgaagacggt 360

atggaccgtc cgcacgttgt taacgttgct gttctgctgg acgaagctac ccacctgaac 420

ggtccgctgc tgttcgttcc gggtacccac gaactgggtc tgatcgacgt tgaacgtcgt 480

gctccggctg gtgacggtga cgctcagtgg ctgccgcagc tgtctgctga cctggactac 540

gctatcgacg ctgacctgct ggctcgtctg accgctggtc gtggtatcga atctgctacc 600

ggtccggctg gttctatcct gctgttcgac tctcgtatcg ttcacggttc tggtaccaac 660

atgtctccgc acccgcgtgg tgttgttctg gttacctaca accgtaccga caacgctctg 720

ccggctcagg ctgctccgcg tccggaattt ctggctgctc gtgacgctac cccgctggtt 780

ccgctgccgg ctggtttcgc tctggctcag ccggtttaa 819

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atgagtgaca gccagacgct ggtggtaaaa ctcggcacca gtgtgctaac aggcggatcg 60

cgccgtctga accgtgccca tatcgttgaa cttgttcgcc agtgcgcgca gttacatgcc 120

gccgggcatc ggattgttat tgtgacgtcg ggcgcgatcg ccgccggacg tgagcacctg 180

ggttacccgg aactgccagc gaccatcgcc tcgaaacaac tgctggcggc ggtagggcag 240

agtcgactca ttcaactgtg ggaacagctg ttttcgattt atggcattca cgtcgggcaa 300

atgctgctga cccgtgctgc tatggaagac cgtgaacgct tcctgaacgc tcgcagggtg 360

tcgcgggcgt tgctcgataa caatatcgtt ccggtaatca atgagaacga tgctgtcgct 420

acggcagaga ttaaggtcgg cgataacgat aacctttctg cgctggcggc gattcttgcg 480

ggtgccgata aactgttgct gctgaccgat caaaaaggtt tgtataccgc tgacccgcgc 540

agcaatccgc aggcagaact gattaaagat gtttacggca ttgatgacgc actgcgcgcg 600

attgccggtg acagcgtttc aggcctcgga actggcggca tgagtaccaa attgcaggcc 660

gctgacgtgg cttgccgtgc gggtatcgac accattattg ccgcgggcag caagccgggc 720

gttattggtg atgtgatgga aggcatttcc gtcggtacgc tgttccatgc ccaggcgact 780

ccgcttgaaa accgtaaacg ctggattttc ggtgcgccgc cggcgggtga aatcacggta 840

gatgaagggg caactgccgc cattctggaa cgcggcagct ccctgttgcc gaaaggcatt 900

aaaagcgtga ctggcaattt ctcgcgtggt gaagtcatcc gcatttgcaa cctcgaaggc 960

cgcgatatcg cccacggcgt cagtcgttac aacagcgatg cattacgccg tattgccgga 1020

caccactcgc aagaaattga tgcaatactg ggatatgaat acggcccggt tgccgttcac 1080

cgtgatgaca tgattacccg ttaa 1104

<210> 3

<211> 1254

<212> DNA

<213> Shigella sonnei

<400> 3

atgctggaac aaatgggcat tgccgcgaag caagcctcgt ataaattagc gcaactctcc 60

agccgcgaaa aaaatcgcgt gctggaaaaa atcgccgatg aactggaagc acaaagcgaa 120

atcatcctca acgctaacgc ccaggatgtt gctgacgcgc gtgccaatgg ccttggcgaa 180

gcgatgcttg accgtctggc actgacgccc gcacggctga aaggcattgc cgatgatgtg 240

cgccaggtgt gtaacctcgc cgatccggtg gggcaggtaa tcgatggcag cgtactggac 300

agcggcctgc gtcttgagcg tcgtcgcgta ccgctggggg ttattggcgt gatttatgaa 360

gcgcgcccga acgtgacggt tgatgtcgct tcgctgtgcc tgaaaaccgg taatgcggtg 420

atcctgcgcg gtggcaaaga aacgtgtcgc actaacgctg caacggtggc ggtgattcag 480

gacgccctga aatcctgcgg cttaccggcg ggtgccgtgc aggcgattga taatcctgac 540

cgtgcgctgg tcagtgaaat gctgcgtatg gataaataca tcgacatgct gatcccgcgt 600

ggtggcgctg gtttgcataa actgtgccgt gaacagtcga caatcccggt gatcacaggt 660

ggtataggcg tatgccatat ttacgttgat gaaagtgtag agatcgctga agcattaaaa 720

gtgatcgtca acgcgaaaac tcagcgtccg agcacatgta atacggttga aacgttgctg 780

gtgaataaaa acatcgccga tagcttcctg cccgcattaa gcaaacaaat ggcggaaagc 840

ggcgtgacat tacacgcaga tgcagctgca ctggcgcagt tgcaggcagg ccctgcgaag 900

gtggttgctg ttaaagccga agagtatgac gatgagtttc tgtcattaga tttgaacgtc 960

aaaatcgtca gcgatcttga cgatgccatc gcccatattc gtgaacacgg cacacaacac 1020

tccgatgcga tcctgacccg cgatatgcgc aacgcccagc gttttgttaa cgaagtggat 1080

tcgtccgctg tttacgttaa cgcctctacg cgttttaccg acggcggcca gtttggtctg 1140

ggtgcggaag tggcggtaag cacacaaaaa ctccacgcgc gtggcccaat ggggctggaa 1200

gcactgacca cttacaagtg gatcggcatt ggtgattaca ccattcgtgc gtaa 1254

<210> 4

<211> 272

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 4

Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu Glu

35 40 45

Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg Asp

50 55 60

Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala

65 70 75 80

Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn

85 90 95

Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr

100 105 110

Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His Val Val Asn

115 120 125

Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly Pro Leu Leu

130 135 140

Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg Arg

145 150 155 160

Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser Ala

165 170 175

Asp Leu Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala

180 185 190

Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu Leu

195 200 205

Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro His

210 215 220

Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala

245 250 255

Thr Pro Leu Val Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala Gln Pro Val

260 265 270

<210> 5

<211> 367

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 5

Met Ser Asp Ser Gln Thr Leu Val Val Lys Leu Gly Thr Ser Val Leu

1 5 10 15

Thr Gly Gly Ser Arg Arg Leu Asn Arg Ala His Ile Val Glu Leu Val

20 25 30

Arg Gln Cys Ala Gln Leu His Ala Ala Gly His Arg Ile Val Ile Val

35 40 45

Thr Ser Gly Ala Ile Ala Ala Gly Arg Glu His Leu Gly Tyr Pro Glu

50 55 60

Leu Pro Ala Thr Ile Ala Ser Lys Gln Leu Leu Ala Ala Val Gly Gln

65 70 75 80

Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Glu Gln Leu Phe Ser Ile Tyr Gly Ile

85 90 95

His Val Gly Gln Met Leu Leu Thr Arg Ala Ala Met Glu Asp Arg Glu

100 105 110

Arg Phe Leu Asn Ala Arg Arg Val Ser Arg Ala Leu Leu Asp Asn Asn

115 120 125

Ile Val Pro Val Ile Asn Glu Asn Asp Ala Val Ala Thr Ala Glu Ile

130 135 140

Lys Val Gly Asp Asn Asp Asn Leu Ser Ala Leu Ala Ala Ile Leu Ala

145 150 155 160

Gly Ala Asp Lys Leu Leu Leu Leu Thr Asp Gln Lys Gly Leu Tyr Thr

165 170 175

Ala Asp Pro Arg Ser Asn Pro Gln Ala Glu Leu Xaa Lys Asp Val Tyr

180 185 190

Gly Ile Asp Asp Ala Leu Arg Ala Ile Ala Gly Asp Ser Val Ser Gly

195 200 205

Leu Gly Thr Gly Gly Met Ser Thr Lys Leu Gln Ala Ala Asp Val Ala

210 215 220

Cys Arg Ala Gly Ile Asp Thr Ile Ile Ala Ala Gly Ser Lys Pro Gly

225 230 235 240

Val Ile Gly Asp Val Met Glu Gly Ile Ser Val Gly Thr Leu Phe His

245 250 255

Ala Gln Ala Thr Pro Leu Glu Asn Arg Lys Arg Trp Ile Phe Gly Ala

260 265 270

Pro Pro Ala Gly Glu Ile Thr Val Asp Glu Gly Ala Thr Ala Ala Ile

275 280 285

Leu Glu Arg Gly Ser Ser Leu Leu Pro Lys Gly Ile Lys Ser Val Thr

290 295 300

Gly Asn Phe Ser Arg Gly Glu Val Ile Arg Ile Cys Asn Leu Glu Gly

305 310 315 320

Arg Asp Ile Ala His Gly Val Ser Arg Tyr Asn Ser Asp Ala Leu Arg

325 330 335

Arg Ile Ala Gly His His Ser Gln Glu Ile Asp Ala Ile Leu Gly Tyr

340 345 350

Glu Tyr Gly Pro Val Ala Val His Arg Asp Asp Met Ile Thr Arg

355 360 365

<210> 6

<211> 417

<212> PRT

<213> Shigella sonnei

<400> 6

Met Leu Glu Gln Met Gly Ile Ala Ala Lys Gln Ala Ser Tyr Lys Leu

1 5 10 15

Ala Gln Leu Ser Ser Arg Glu Lys Asn Arg Val Leu Glu Lys Ile Ala

20 25 30

Asp Glu Leu Glu Ala Gln Ser Glu Ile Ile Leu Asn Ala Asn Ala Gln

35 40 45

Asp Val Ala Asp Ala Arg Ala Asn Gly Leu Gly Glu Ala Met Leu Asp

50 55 60

Arg Leu Ala Leu Thr Pro Ala Arg Leu Lys Gly Ile Ala Asp Asp Val

65 70 75 80

Arg Gln Val Cys Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Gln Val Ile Asp Gly

85 90 95

Ser Val Leu Asp Ser Gly Leu Arg Leu Glu Arg Arg Arg Val Pro Leu

100 105 110

Gly Val Ile Gly Val Ile Tyr Glu Ala Arg Pro Asn Val Thr Val Asp

115 120 125

Val Ala Ser Leu Cys Leu Lys Thr Gly Asn Ala Val Ile Leu Arg Gly

130 135 140

Gly Lys Glu Thr Cys Arg Thr Asn Ala Ala Thr Val Ala Val Ile Gln

145 150 155 160

Asp Ala Leu Lys Ser Cys Gly Leu Pro Ala Gly Ala Val Gln Ala Ile

165 170 175

Asp Asn Pro Asp Arg Ala Leu Val Ser Glu Met Leu Arg Met Asp Lys

180 185 190

Tyr Ile Asp Met Leu Ile Pro Arg Gly Gly Ala Gly Leu His Lys Leu

195 200 205

Cys Arg Glu Gln Ser Thr Ile Pro Val Ile Thr Gly Gly Ile Gly Val

210 215 220

Cys His Ile Tyr Val Asp Glu Ser Val Glu Ile Ala Glu Ala Leu Lys

225 230 235 240

Val Ile Val Asn Ala Lys Thr Gln Arg Pro Ser Thr Cys Asn Thr Val

245 250 255

Glu Thr Leu Leu Val Asn Lys Asn Ile Ala Asp Ser Phe Leu Pro Ala

260 265 270

Leu Ser Lys Gln Met Ala Glu Ser Gly Val Thr Leu His Ala Asp Ala

275 280 285

Ala Ala Leu Ala Gln Leu Gln Ala Gly Pro Ala Lys Val Val Ala Val

290 295 300

Lys Ala Glu Glu Tyr Asp Asp Glu Phe Leu Ser Leu Asp Leu Asn Val

305 310 315 320

Lys Ile Val Ser Asp Leu Asp Asp Ala Ile Ala His Ile Arg Glu His

325 330 335

Gly Thr Gln His Ser Asp Ala Ile Leu Thr Arg Asp Met Arg Asn Ala

340 345 350

Gln Arg Phe Val Asn Glu Val Asp Ser Ser Ala Val Tyr Val Asn Ala

355 360 365

Ser Thr Arg Phe Thr Asp Gly Gly Gln Phe Gly Leu Gly Ala Glu Val

370 375 380

Ala Val Ser Thr Gln Lys Leu His Ala Arg Gly Pro Met Gly Leu Glu

385 390 395 400

Ala Leu Thr Thr Tyr Lys Trp Ile Gly Ile Gly Asp Tyr Thr Ile Arg

405 410 415

Ala

Claims

1.一种用于将葡萄糖转化为L-羟脯氨酸的重组大肠埃希氏菌，其特征在于，所述重组大肠埃希氏菌的保藏编号为CGMCC No.22937，所述重组大肠埃希氏菌包含载体，所述载体包含编码脯氨酸羟基化酶的基因、编码谷氨酸激酶的基因、编码谷氨酸环化酶的基因、抗性基因和共用色氨酸启动子；

其中，所述编码脯氨酸羟基化酶的基因是PH4基因，其序列如SEQ ID NO:1所示；所述编码谷氨酸激酶的基因是proB74基因，其序列如SEQ ID NO:2所示；所述编码谷氨酸环化酶的基因是proA基因，其序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌，其特征在于，所述PH4基因位于HindIII和EcoRI之间，所述proB74基因和所述proA基因位于EcoRI和BamHI之间。

3.根据权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌，其特征在于，所述抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组大肠埃希氏菌在制备L-羟脯氨酸中的用途。

5.一种L-羟脯氨酸的生产方法，所述方法包括采用权利要求1至3中任一项述的重组大肠埃希氏菌以葡萄糖为碳源进行发酵培养，并且在发酵过程中连续添加复合料，所述复合料包含谷氨酸和谷氨酸盐。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其中当可见分光光度计检测的发酵液菌体密度达到30到80时连续添加复合料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中当可见分光光度计检测的发酵液菌体密度达到50时连续添加复合料。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸盐为谷氨酸钠和/或谷氨酸钾。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸盐为谷氨酸钠。

10.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述复合料中的谷氨酸与谷氨酸盐的重量比为2.5:1到9:1。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述复合料中的谷氨酸与谷氨酸盐的重量比为5:1到8:1。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述复合料中的谷氨酸与谷氨酸盐的重量比为6.25:1。

13.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述复合料还包含一种或多种选自蛋白胨、甜菜碱、硫辛酸和维生素C的其他添加剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述蛋白胨选自胰酪蛋白胨、肉蛋白胨、骨蛋白胨、大豆蛋白胨和酵母蛋白胨中的一种或多种。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述蛋白胨为鱼蛋白胨。

16.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于所述复合料包含谷氨酸50-90份、谷氨酸盐10-20份、蛋白胨2-8份、甜菜碱1-4份、硫辛酸0.05-0.2份和维生素C 0.05-0.2份。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述复合料包含谷氨酸80份、谷氨酸盐12.8份、蛋白胨5份、甜菜碱2份、硫辛酸0.1份和维生素C 0.1份。

18.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述复合料与发酵培养基的质量/体积比为10g/L到50g/L。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述复合料与发酵培养基的质量/体积比为20g/L。

20.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述种子培养包括以下步骤：

(a)在32-37℃的温度下，对所述菌种进行斜面培养8-16小时；

(b)在32-37℃的温度下，对步骤(a)得到的菌种进行种子培养8-15小时；

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，在37℃的温度下，对所述菌种进行斜面培养12小时。

23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，在33℃的温度下，对步骤(a)得到的菌种进行种子培养10小时。

24.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养在发酵罐中进行，所述发酵培养的种子液接种量为发酵液体积的20％。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：酵母浸粉12-20g/L，硫酸镁0.2-0.8g/L，磷酸二氢钾1-4g/L，硫酸铵0.5-1.5g/L，硫酸亚铁0.1-0.5g/L，聚醚类消泡剂0.05-0.15g/L。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：酵母浸粉15g/L，硫酸镁0.54g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵1g/L，硫酸亚铁0.3g/L，聚醚类消泡剂0.1g/L。

27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基在接种之前灭菌、降温，并加入氨苄西林钠无菌溶液。

28.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：

初始温度为32-37℃；

初始罐压为0.03-0.07MPa。

29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述初始温度为33±0.5℃。

30.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述初始罐压为0.05MPa。

31.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件还包括：葡萄糖的浓度控制在5-10g/L。

32.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件还包括：发酵罐的溶解氧保持在30％以上。

33.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件还包括：发酵液的pH保持在6.6-6.8。

34.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件还包括：发酵培养时间为45-60h。

35.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，在发酵培养期间检测发酵进程，当菌体密度达到50时连续添加所述复合料，并在放罐前10h完成添加。

36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，将所述复合料配制成100g/L到500g/L的水溶液，蒸汽灭菌后再进行添加。

37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，将所述复合料配制成300g/L的水溶液，蒸汽灭菌后再进行添加。

38.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述菌体密度的检测包括：取发酵液，用水稀释一定倍数，在可见分光光度计上检测600nm下的吸光度，如果检测值大于1则稀释更大倍数，检测值乘以稀释倍数即为菌体密度。

39.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从发酵液中提取L-羟脯氨酸。