CN106085931A - 生产反式‑4‑羟脯氨酸的工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产反式‑4‑羟脯氨酸的工程菌及其应用，所述工程菌通过将优化的脯氨酸4‑羟化酶基因与色氨酸串联启动子经全基因合成后连接到插入有透明颤菌血红蛋白基因的表达载体，再将所述表达载体导入大肠杆菌后获得；所述优化的脯氨酸4‑羟化酶基因包括：将脯氨酸4‑羟化酶基因中低使用率密码子替换为大肠杆菌中高使用率密码子，并调整脯氨酸4‑羟化酶基因的CG％使其接近宿主菌的CG％；消除了脯氨酸4‑羟化酶基因的酶切位点；调整脯氨酸4‑羟化酶基因的二级结构以避免脯氨酸4‑羟化酶基因的mRNA的5’端形成二级结构。本发明的工程菌可大量、高效地生产反式‑4‑羟脯氨酸。

Description

生产反式-4-羟脯氨酸的工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及生产反式-4-羟脯氨酸的工程菌及其应用。
背景技术
反式-4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。
反式-4-羟脯氨酸的生产方法主要有生物提取法和微生物合成法。目前国内厂家多采用生物提取法制备反式-4-羟脯氨酸。目前，常用的生物提取法需经过强酸强碱处理，纯化步骤长，而且羟脯氨酸提取率在4％-7％，提取和原料成本高，不仅浪费大量原料，而且废弃物污染严重，随着目前环境压力的增加和资源原料价格的上升，传统的生物提取法容易被市场淘汰。微生物酶法即利用酶的立体专一性反应，以发酵法生产的底物或者化学合成的底物生产具有活性的产物。反应多在常温常压的细胞内或者细胞外下进行，可高选择性地制备所需的光学活性物质。微生物转化法与生物提取法或者合成法相比具有诸多优点：(1)反应条件温和、能耗低，而且毒副产物少，环境污染少。(2)微生物转化的本质是利用细胞内酶的催化反应，因此具有高度的立体选择性，适合对立体结构要求高的药物以及药物前体。(3)与单纯的酶催化反应相比，微生物转化由于是在大肠杆菌细胞内进行的酶催化反应，酶所处的生态系统可保证酶催化所需要的环境，重组酶在细胞内能保持较高的酶活。(4)微生物转化由于不需对重组酶进行分离纯化，直接回收细胞或者利用活性细胞做生物催化，只需要在培养时加入一部分前体物，甚至直接以培养基的碳源氮源为前体物，就可获得高纯度的产品。(5)微生物转化可实现多步催化反应。
但目前的微生物酶法生产反式-4-羟脯氨酸的产量及转化率仍然 较低，例如：1999年，Shibasaki等人将指孢囊菌RH 1脯氨酸4-羟化酶基因置于一个强启动子的调控下，导入到大肠杆菌中构建重组菌，反式-4-羟脯氨酸在大肠杆菌中代谢图如图1所示，在以脯氨酸为底物的发酵液中，脯氨酸4-羟化酶将大肠杆菌胞内的2-酮戊二酸和脯氨酸分别转化为反式-4-羟脯氨酸和琥珀酸，在发酵罐中发酵100h后，反式-4-羟脯氨酸的积累量可达到41g/L。Shibasaki等人为了进一步降低反式-4-羟脯氨酸的生产成本，将脯氨酸代谢中的关键酶基因导入到反式-4-羟脯氨酸生产菌重组质粒中，在以葡萄糖为底物的发酵培养基中培养96h后反式-4-羟脯氨酸产量达到25g/L。
因此，研究高产量及高转化率的工程菌对反式-4-羟脯氨酸的工业化生产及应用具有重要意义。
发明内容
本发明提供了生产反式-4-羟脯氨酸的工程菌及其应用，该工程菌可大量、高效地生产反式-4-羟脯氨酸。
本发明的一个方面，提供一种生产反式-4-羟脯氨酸的工程菌，所述工程菌通过将优化的脯氨酸4-羟化酶基因与色氨酸串联启动子经全基因合成后连接到插入有透明颤菌血红蛋白基因的表达载体，再将所述表达载体导入大肠杆菌后获得；
所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因包括：将脯氨酸4-羟化酶基因中低使用率密码子替换为大肠杆菌中高使用率密码子，并调整脯氨酸4-羟化酶基因的CG％使其接近宿主菌的CG％；消除了脯氨酸4-羟化酶基因的酶切位点；调整脯氨酸4-羟化酶基因的二级结构以避免脯氨酸4-羟化酶基因的mRNA的5’端形成二级结构。
以上所述的工程菌，其中，所述表达载体为pUC19质粒。
以上所述的工程菌，其中，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
以上所述的工程菌，其中，所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因的CG％为59.27％。
以上所述的工程菌，其中，所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因消除了EcoR I酶切位点。
以上所述的工程菌，其中，所述透明颤菌血红蛋白基因插入于所述表达载体的EcoRI和NdeI酶切位点之间。
以上所述的工程菌，其中，所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因与色氨酸串联启动子经全基因合成后连接到所述表达载体的BamH I和EcoRI酶切位点之间。
以上所述的工程菌，其中，所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述色氨酸串联启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述透明颤菌血红蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明的另一个方面，提供一种利用以上任一所述的工程菌生产反式-4-羟脯氨酸的方法。
本发明的优势包括以下方面：
(1)为了使脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌中得到高表达，首先通过同义转换调整密码子偏好性，将脯氨酸4-羟化酶基因的低使用率密码子替换为在大肠杆菌中使用频率高的密码子，并消除脯氨酸4-羟化酶基因的酶切位点。然后再利用软件预测并调整脯氨酸4-羟化酶基因二级结构，使得脯氨酸4-羟化酶基因的mRNA的5’端避免形成二级结构，可促进mRNA的转录和翻译。最终使脯氨酸4-羟化酶基因序列得到优化。
(2)选择色氨酸串联启动子控制脯氨酸4-羟化酶的表达，经优化后的脯氨酸4-羟化酶基因序列和色氨酸串联启动子经全基因合成后，连接到pAMP质粒上，构建重组质粒pAMP-ptrp2-Hyp，为了提高脯氨酸4-羟化酶的表达量和反式-4-羟脯氨酸产率，对宿主菌和质粒进行了优化，最终选择脯氨酸4-羟化酶表达量最高的重组大肠杆菌作为反式-4-羟脯氨酸生产菌。
(3)为了改善重组大肠杆菌高密度发酵的溶氧条件，在分子水平上引入透明颤菌血红蛋白VHb，构建可表达VHb的重组大肠杆菌。当发酵液溶氧较低时，VHb基因自身的启动子控制VHb的表达，提高大肠杆菌的氧气利用率，促进脯氨酸4-羟化酶的表达，最终强化反式-4-羟脯氨酸产量。
附图说明
图1为大肠杆菌中反式-4-羟脯氨酸代谢过程图；
图2为本发明的脯氨酸4-羟化酶mRNA机构预测结果，A为密码子调整前的序列，B为进行了同义密码子调整后的序列；
图3为本发明pAMP-prtp2-Hyp重组质粒的构建过程图；
图4为本发明pUC19-ptrp2-Hyp重组质粒的构建过程图；
图5为本发明的重组质粒pAMP-ptrp2-Hyp经双酶切后的电泳图；
图6为本发明pUC19-ptrp2-Hyp-VHb重组质粒的构建过程图；
图7为本发明重组质粒pAMP-ptrp2-Hyp分别转化不同大肠杆菌后的全细胞酶活对比图；
图8为本发明优化后的脯氨酸4-羟化酶基因和色氨酸串联启动子序列经双酶切后连接到不同质粒再转化大肠杆菌后再提取重组质粒双酶切验证电泳图；泳道1为：1kb DNALadder Maker，泳道2、3、4、5分别为：pAMP-ptrp2-Hyp、pK19mobsacB-ptrp2-Hyp、pET28a-ptrp2-Hyp、pUC19-ptrp2-Hyp双酶切电泳图；
图9为本发明的重组菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp、BL21(DE3)/pAMP-ptrp2-Hyp、BL21(DE3)/pK19mobsacB-ptrp2-Hyp和BL21(DE3)/pET2 8a-ptrp 2-Hyp的全细胞酶活对比图；
图10为本发明的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb菌落PCR电泳图；
图11为本发明重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp-VHb经EcoRI单酶切后的电泳图(泳道2)，pUC19-VHb经EcoRI单酶切后的电泳图(泳道3)；
图12为本发明重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb细胞破碎上清液CO差异光谱分析图；
图13为本发明重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb摇瓶发酵发酵液OD600随时间的变化情况图；
图14为本发明重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb摇瓶发酵反式-4-羟脯氨酸浓度随时间的变化情况图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所有的DNA序列由上海旭冠公司合成(中国，上海)。T4DNA连接酶和限制性内切酶均购自Takara公司(中国，大连)。质粒pAMP由pUC19质粒构建而成。E.coli BL21(DE3)、E.coli JM1 09、E.coli DH5α和E.coli SCS110购自Novagen公司。pK19mobs acB由提供(在Schafer A，Tauch A，Jager W，et al.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichi a coli plasmids pK18 andpK19：selection of defined deletion s in the chromosome of Corynebacteriumglutamicum[J].Gene，1994，145(1)：69-73.中公开)pET28a、pUC19和pAMP来自商业购买。
本发明的葡萄糖、氯化钠、硫酸镁、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸铵、L-脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、琼脂粉、氯化钙、硫酸亚铁、甘油、糊精、可溶性淀粉、柠檬酸、氢氧化钠、结晶乙酸钠、正丙醇、氯胺T、高氯酸、对二甲氨基苯甲酸、异丙醇、氯化铵购自上海国药。胰蛋白胨、酵母抽提物、EB、琼脂糖M、dNTP、小量质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、氨苄青霉素、卡那霉素购自BBI公司(上海生工代理)；限制性内切酶EcoRI、BamHI、HindIII、NdeI、1kb DNA Ladder Marker均购自大连宝生物公司(TaKa Ra)；T4 DNA ligase购自Fermentas公司；Taq DNA聚合酶购自上海生工。
本发明所使用的培养基配方如下：
(1)LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl，pH 7.0，固体培养基补充2％的琼脂粉。
(2)氨苄抗性平板：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，2％ 琼脂，pH 7.0，灭菌后，待培养基冷却到60℃左右，加入氨苄青霉素母液(过滤除菌，50mg/mL)，至培养基氨苄青霉素终浓度为50μg/mL(稀释1000倍)，混匀后，倒平板。
(3)卡那霉素抗性平板：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，2％琼脂，pH7.0，灭菌后，待培养基冷却到60℃左右，加入卡那霉素母液(过滤除菌，50mg/mL)，至培养基卡那霉素终浓度为50μg/mL(稀释1000倍)，混匀后倒平板。
(4)TSB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，10％PEG3350，5％DMSO，10mM MgCl2，10mM MgSO4，10％甘油，pH 6.1。
(5)初始发酵培养基：葡萄糖2％，硫酸铵1％，磷酸氢二钾0.1％，氯化钠0.2％，蛋白胨0.8％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁1mM，氯化钙0.0015％，L-脯氨酸200mM，pH8.0。
本发明主要试剂的配制：
(1)50×TAE DNA电泳缓冲液
称取242g Tris，冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)100mL后，用去离子水补充至1L，电泳前用去离子水稀释50倍。
(2)10mg/mL溴化乙锭(EB)溶液
将EB粉末溶于水配成10mg/mL，用锡箔纸或者黑纸包裹，暗处室温储存。
(3)5×KCM
0.15M CaCl2，0.5M KCl，0.25M MgCl2，高温灭菌后分装保存。
(4)反式-4-羟脯氨酸标准液
用分析天平称取一定量的反式-4-羟脯氨酸，用去离子水溶解后得到10g/L反式-4-羟脯氨酸母液。将其稀释100倍，得到100mg/L反式-4-羟脯氨酸标准液，于4℃冷藏备用。
(5)缓冲溶液
准确称取50g柠檬酸，26.3g氢氧化钠，146.1g结晶乙酸钠，溶于1L水中。将此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。
(6)氯胺T试剂
准确称取1.41g氯胺T，溶于10mL水中，依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液。
(7)显色剂
准确称取5g对二甲氨基苯甲醛，溶于17.5mL高氯酸中，溶解后缓慢加入32.5mL异丙醇。
(8)MES吗啉乙磺酸缓冲液
用分析天平准确称取4.6855g MES，定容至100mL，吗啉乙磺酸浓度为240mM，然后用2M NaOH调节pH至6.5，MES缓冲液在2-8℃可保存数月。
(9)500mM 2-酮戊二酸母液
用分析天平准确称取7.305g酮戊二酸，定容至100mL，然后分装保存。
(10)500mM L-脯氨酸母液
用分析天平准确称取5.75g L-脯氨酸，用水溶解后，定容至100mL，然后分装保存。
(11)100mM硫酸亚铁母液
用分析天平准确称取2.78g七水合硫酸亚铁，用水溶解后，定容至100mL，分装保存。
(12)200mM维生素C母液
用分析天平准确称取3.522g维生素C，用水溶解后定容至100mL，分装保存。
实施例1脯氨酸4-羟化酶基因初步密码子优化
脯氨酸4-羟化酶来源于指孢囊菌，脯氨酸4-羟化酶基因密码子使用频率分析由数据库(http：//www.kazusa.or.jp/codon)完成，分析结果如表1所示，来源于指孢囊菌的初始脯氨酸4-羟化酶基因部分密码子在大肠杆菌中的使用频率很低，如CAC(His)、CUC(Leu)、CGG(Arg)、UCG(Ser)、GUC(Val)，这些密码子的使用频率均低于15％，具体分析结果如表1所示，虽然单个低频密码子并不会对蛋白表达有明显影响，但是如果这些低频密码子以集群形式分布在基因上，会降低 蛋白的表达量，通过分析脯氨酸4-羟化酶基因，发现其基因上低频密码子以集群形式成串地分布在脯氨酸4-羟化酶基因上，因此，有必要通过对脯氨酸4-羟化酶基因进行密码子优化。
表1
利用密码子优化软件JCAT(Java Codon Adaptation Tool)对脯氨酸4-羟化酶基因进行优化，该软件根据Carbone等人提出的密码子适用指数(CAI)来对基因进行评估，密码子适用指数CAI根据宿主菌高表达基因密码子作为参考进行运算，CAI越接近1，表明该基因高频密码子越多，其高表达可能性越高。单个密码子相对适用性用Wi的运算方法如公式(1)所示：
Wi＝fi/f(max)i (1)
其中，fi表示基因序列中某一密码子在宿主菌的使用频率，f(max)i表示宿主菌翻译同一氨基酸的密码子的最高使用频率。基因密码子适用指数CAI的运算如公式(2)所示：
CAI g = ( Π i = 1 N W i ) 1 / N - - - ( 2 )
其中，N为基因‘g’的密码子数，密码子数不包括终止密码子和起始密码子。根据运算结果，来源于指孢囊菌的脯氨酸4-羟化酶基因的密码子的相对适用性Wi大多数小于0.25，其CAI值经计算只有0.3992，远小于最优值1，且GC百分比含量为73.626％，远高于大肠杆菌高表达基因的GC百分比含量50.7995％。
利用软件JCAT进行优化，消除脯氨酸4-羟化酶基因上的低频密码子，并通过同义转化，替换掉脯氨酸4-羟化酶基因上的常用限制性酶切位点。脯氨酸4-羟化酶基因经优化后，其密码子相对适用性Wi大多数为1，CAI值高达0.9941，接近于1，GC百分比含量降至59.340％，与大肠杆菌高表达基因的GC百分比接近。
通过对脯氨酸4-羟化酶基因进行初步的密码子优化，改变了138个密码子，同时脯氨酸4-羟化酶基因的GC含量从73.62％降低到59.34％，更接近大肠杆菌基因GC百分比。同时，通过同义转化消除脯氨酸4-羟化酶基因的EcoRI酶切位点。
实施例2脯氨酸4-羟化酶基因mRNA二级结构优化
除了优化脯氨酸4-羟化酶基因密码子外，还要考虑到mRNA的二级结构，利用RNA折叠分析软件5.3预测脯氨酸4-羟化酶基因的mRNA二级结构，mRNA折叠自由能，通过改变同义密码子调整脯氨酸4-羟化酶基因的mRNA的5’端结构，使得脯氨酸4-羟化酶基因的mRNA的5’端避免形成二级结构，如图2所示，起始密码子用箭头标出，优化之前的mRNA折叠能ΔG为-306.1kcal/mol，且mRNA5’端形成二级结构，不利于核糖体的延伸。与优化前的相比，虽然折叠能ΔG为-287.2kcal/mol，与优化之前的mRNA折叠能接近。但是经二级结构优化后的脯氨酸4-羟化酶基因mRNA保证AUG起始密码子后及其后的几个碱基组成的密码子翻译口袋呈打开状态，降低了核糖体结合到mRNA上的能势，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译，经优化后的脯氨酸4-羟化酶基因可促进mRNA的转录和翻译。
来源于指孢囊菌的脯氨酸4-羟化酶基因，经密码子优化、mRNA二级结构调整后，优化后的脯氨酸4-羟化酶基因共改变了137个密码子和139个核苷酸，同时，GC百分比从73.62％降低到59.27％，更接近大肠杆菌高表达基因的GC百分比含量，优化后的脯氨酸4-羟化酶基因如SEQ ID NO：1所示。
实施例3脯氨酸4-羟化酶基因和色氨酸串联启动子的全基因合成
为了高效表达脯氨酸4-羟化酶基因并利用脯氨酸4-羟化酶高效转化L-脯氨酸生产反式-4-羟脯氨酸，引入组成型启动子-色氨酸串联启动子，色氨酸串联启动子(序列如SEQ ID NO：2所示)由色氨酸和色氨酸结构类似物调控，当发酵液中缺少色氨酸时，色氨酸串联启动子控制脯氨酸4-羟化酶基因的表达，同时，细胞代谢生成的2-酮戊二酸和发酵液中的L-脯氨酸在脯氨酸4-羟化酶的催化下，分别生产琥珀酸和反式-4-羟脯氨酸。
优化后的脯氨酸4-羟化酶基因和色氨酸串联启动子序列由上海旭冠公司合成，为了便于基因操作，在优化后的脯氨酸4-羟化酶基因5’和3’端分别加入HindIII和BamHI酶切位点，在色氨酸串联启动子基因5’和3’端分别加入EcoRI和HindIII酶切位点。
实施例4大肠杆菌高效感受态的制备
(1)接种大肠杆菌JM 109、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌SCS 110、大肠杆菌BL21(DE3)于50mL新鲜LB培养液中34℃，220rpm过夜培养。
(2)取过夜种子液按1％接种量接种到新鲜的LB培养基中，34℃，220rpm振荡培养。
(3)培养约2小时直至OD600值达到0.5-0.6。
(4)将培养液分装于50mL离心管中，置于冰上预冷10min。
(5)4℃，1000×g离心5分钟，弃去上清，回收细胞。
(6)重悬于原培养体积的5％的TSB培养基中，缓慢吹打均匀。
(7)冰上放置10min后分装至1.5mL的离心管中，每管分装60μL。
(8)将分装好的感受态细胞放置于-80℃冰箱，感受态效率可达到1×108以上，可保存一年不影响效率。
实施例5宿主菌的优化
将合成好的脯氨酸4-羟化酶基因连接到pAMP质粒上，构建重组质粒pAMP-Hyp，然后将合成后的色氨酸串联启动子基因ptrp2经EcoRI和HindIII双酶切后，连接到经同样酶双酶切后的pAMP-Hyp质粒上，构建重组质粒pAMP-ptrp2-Hyp，重组质粒pAMP-ptrp2-Hyp的构建过程如图3，将重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，挑取单菌落。将重组大肠杆菌单菌落扩大培养，提取重组质粒，重组质粒pAMP-ptrp2-Hyp经EcoRI和BamHI双酶切后，形成1850bp和1063bp两条条带，如图5所示。重组质粒经DNA测序，序列完全正确。
将经测序验证后的重组质粒pAMP-ptrp2-Hyp，分别转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，SCS110，JM109，DH5α中，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)/pAMP-ptrp2-Hyp，大肠杆菌SCS110/pAMP-ptrp2-Hyp，大肠杆菌JM 109/pAMP-ptrp2-Hyp，大肠杆菌DH5α/pAMP-ptrp2-Hyp。然后将四株不同的重组大肠杆菌涂布至氨苄抗性平板，挑取单菌落，分别接种至LB培养基中培养12h后，测定四株重组大肠杆菌的全细胞酶活。结果如图7所示，BL21(DE3)/pAMP-ptrp2-Hyp的全细胞酶活最高，全细胞活性高达0.0525±0.0023U/g，比全细胞酶活最低的SCS110/pAMP-ptrp2-Hyp高60％，在四株大肠杆菌中，大肠杆菌BL21(DE3)最适合用于表达脯氨酸4-羟化酶，因此，最终选择BL21(DE3)作为宿主菌。
实施例6重组质粒的优化
将优化后的脯氨酸4-羟化酶基因和色氨酸串联启动子序列经双酶切后，分别连接到pUC19、pK19mobsacB、pET28a质粒上，构建重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp、pK19mobsacB-ptrp2-Hyp、pET28a-ptrp2-Hyp，然后将重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp、pK19mobsacB-ptrp2-Hyp、pET28a-ptrp-Hyp分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组菌。其中，重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp的构建过程如图4所述。
新构建的三株重组大肠杆菌经扩大培养后，分别提取重组质粒，提取后的重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp、pK19mobsacB-ptrp2-Hyp、pET28a-ptrp2-Hyp经EcoRI和BamHI双酶切后，分别形成不同大小的两条带，其中，pAMP-ptrp2-Hyp双酶切后形成1850bp和1063bp两条条带，pK19mobsacB-ptrp2-Hyp双酶切生成5.6kb和1063bp两条条带，pET28a-ptrp2-Hyp双酶切生成5.3kb和1063bp两条条带，pUC19-ptrp2-Hyp经双酶切后生成2.6kb和1063bp两条条带。双酶切结果如图8所示。三株新构建的重组质粒经测序验证，序列完全正确。
将重组菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp和BL21(DE3)/pAMP-ptrp2-Hyp涂布至氨苄抗性平板，重组菌BL21(DE3)/pK19mobsacB-ptrp2-Hyp、BL21(DE3)/pET28a-ptrp2-Hyp涂布至卡那霉素抗性平板上，挑取单菌落，分别接种至LB培养基中培养12h，其中重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp的全细胞酶活最高，如图9所示，重组菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp的全细胞活性达到0.075±0.004U/mg，比最低水平高74.4％，因此，最终选择重组菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp 2-Hyp作为发酵生产菌。
实施例7透明颤菌血红蛋白在重组大肠杆菌中的克隆
透明颤菌血红蛋白基因(其序列如SEQ ID NO：3所示)序列由上海旭冠公司合成，为了便于基因操作，在血红蛋白基因在透明颤菌血红蛋白基因溶氧诱导启动子前插入EcoRI酶切位点，同时，在血红蛋白基因终止密码子后插入NdeI酶切位点。将合成后的透明颤菌血红蛋白基因连接至pUC19质粒上，构建重组质粒pUC19-VHb，将重组质粒pUC19-VHb经EcoRI和NdeI双酶切后，回收透明颤菌 血红蛋白基因片段，将回收片段连接到经同样酶双酶切后的重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp的质粒上，构建重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp-VHb，构建过程如图6所示。
将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落，做菌落PCR，阳性菌菌落PCR可获得一条大小约1600bp大小的条带。菌落PCR电泳图如图10所示，挑取10个单菌种做菌落PCR，电泳结果显示10个单菌落均有一个大小约1600bp的特异性条带，且条带较粗，说明10个单菌落均为阳性菌。
挑取经菌落PCR验证为阳性菌的单菌落扩大培养，提取重组质粒，重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp-VHb经EcoRI单酶切后，形成一条大小约4.2kb的条带，pUC19-VHb经EcoR I单酶切后，形成一条约3kb的条带，如图11所示。重组质粒经DNA测序，序列完全正确。新构建的重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp-VHb转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb。
测定大肠杆菌血红蛋白活性，将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb和不含血红蛋白基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp接种至含Amp 50μg/mL的LB培养基中培养48h后，取30mL发酵液8000×g离心5min，回收菌体后，再用5mL0.1mMTris-HCl(pH 7.5)重悬，超声破碎后，离心弃去细胞碎片，回收含可溶蛋白上清。收集上清后，向上清液中通入CO，以BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp菌体碎片上清液作为空白对照，在分光光度计上扫描400-500nm处的的吸光度。分析结果如图12所示，以不含血红蛋白基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp细胞破碎液上清为空白对照，重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb细胞破碎上清液与CO结合后，在419nm处出现一个吸收峰，同时，在436nm处有一个明显的波谷。说明重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb能表达出具有活性的透明颤菌血红蛋白。
实施例8重组大肠杆菌摇瓶发酵
重组大肠杆菌摇瓶发酵的方法如下：
从Amp抗性平板上挑取单菌落，接种至Amp终浓度为50μg/mL装有30mL LB培养基的250mL三角摇瓶中，37℃，220rpm培养8h后，按照6％的接种量接到发酵培养基中(30mL/250mL三角瓶)，发酵培养基：葡萄糖10g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨8g/L，硫酸铵5g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁3mM，氯化钙0.015g/L，L-脯氨酸400mM，培养温度35℃，220rpm培养64h，以不含VHb重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp作为对照，每组三个平行样。发酵结束后，对其发酵液OD600，反式-4-羟脯氨酸产量进行比较。结果如图13、14所示。
由图可知，VHb能够延长菌体的生长对数期，促进菌体的生长，同时还有助于反式-4-羟脯氨酸的积累。发酵初期0-12h，VHb对菌体的生长和蛋白表达影响小，不含VHb的重组大肠杆菌的OD600与含有VHb基因的重组菌接近，反式-4-羟脯氨酸的积累量也相近，可能是在重组大肠杆菌发酵的对数期，菌体快速生长，发酵液中的溶氧足以满足菌体的代谢需求，或者可能是因为初期溶氧浓度较高，而VHb基因只有当发酵液中溶解氧低于5-20％时，启动子才开始控制VHb的表达。由于发酵过程中溶氧随着发酵时间的延长而逐渐降低，VHb基因在溶氧诱导型启动子的控制下开始表达。不含VHb的重组菌在发酵12h后进入生长稳定期，由于菌体生长速率减小，反式-4-羟脯氨酸的生成速率下降，而含有VHb的重组菌在12-28h时仍处于菌体快速生长阶段，同时，产酸速率较BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp高，在28h时反式-4-羟脯氨酸的积累量达到3.02±0.16g/L。BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb重组菌在发酵64h后，产酸量高达6.19±0.28g/L，是对照组BL21(DE 3)/pUC19-ptrp2-Hyp的2.57倍，同时，菌体OD600达到9.26±0.42，较对照组提高了56％。
透明颤菌血红蛋白在高产反式-4-羟脯氨酸的重组大肠杆菌中表达，既可将氧传递给呼吸链，改善氧化磷酸化效率，促进重组菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb在微氧条件下的生长代谢和产酸。由于透明颤菌血红蛋白分布在细胞质中，在细胞内有可能将氧气直接传递 给脯氨酸4-羟化酶，氧气参与酶催化反应，从而强化了反式-4-羟脯氨酸的生产，提高L-脯氨酸的转化率。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种生产反式-4-羟脯氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌通过将优化的脯氨酸4-羟化酶基因与色氨酸串联启动子经全基因合成后连接到插入有透明颤菌血红蛋白基因的表达载体，再将所述表达载体导入大肠杆菌后获得；
所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因包括：将脯氨酸4-羟化酶基因中低使用率密码子替换为大肠杆菌中高使用率密码子，并调整脯氨酸4-羟化酶基因的CG％使其接近宿主菌的CG％；消除了脯氨酸4-羟化酶基因的酶切位点；调整脯氨酸4-羟化酶基因的二级结构以避免脯氨酸4-羟化酶基因的mRNA的5’端形成二级结构。
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述表达载体为pUC19质粒。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因的CG％为59.27％。
5.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因消除了EcoR I酶切位点。
6.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述透明颤菌血红蛋白基因插入于所述表达载体的EcoR I和Nde I酶切位点之间。
7.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因与色氨酸串联启动子经全基因合成后连接到所述表达载体的BamH I和EcoR I酶切位点之间。
8.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述优化的脯氨酸4-羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述色氨酸串联启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述透明颤菌血红蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
9.一种利用权利要求1至8中任一所述的工程菌生产反式-4-羟脯氨酸的方法。
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