CN103740629B - 过量表达辅酶pqq合成蛋白的基因工程醋酸菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组表达辅酶PQQ（吡咯喹啉醌）生物合成蛋白的基因工程醋酸菌的构建方法，所述PQQ生物合成蛋白为PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE，以及它们的功能等同物。将来源于巴氏醋杆菌中的乙醇脱氢酶启动子和辅酶PQQ合成蛋白基因簇pqqABCDE序列依次连接到可在醋酸菌中稳定复制的质粒中，构建重组质粒pBBR-padh-pqq；将重组质粒pBBR-padh-pqq转入醋酸菌中即可获得过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，从而提高醋酸发酵过程中醋酸菌体内辅酶PQQ的浓度。利用本发明的基因工程菌进行醋酸发酵，可以缩短发酵延迟期，提高醋酸发酵速率，从而降低生产成本。

Description

过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌及其构建方法，利用该菌株以乙醇为底物发酵生产醋酸具有较高的生产效率，属于生物技术领域。

背景技术

醋酸是食品、医药、化工、纺织等领域广泛应用的化合物之一。以醋酸为主要成分的食醋是全球消费量最大的调味品之一，也是食品工业最重要的辅料之一。食品行业使用的醋酸一般以发酵法进行生产。醋酸菌(Acetic acid bacteria)是一类能将乙醇氧化成醋酸等产物的细菌，有些还能氧化葡萄糖为葡萄糖酸，在医药、食品等领域应用广泛。醋酸菌都为革兰氏阴性菌，化能异养型，严格好氧，最常见的醋杆菌属（Acetobacter）葡萄糖杆菌属（Gluconobacter）以及葡萄糖酸杆菌属（Gluconacetobacter）等，其中醋杆菌属和葡萄糖杆菌属（Gluconobacter）由于具有较高的乙醇氧化能力，常用于醋酸的发酵生产。

醋酸的发酵是在醋酸菌脱氢酶系的作用下完成从乙醇到醋酸的氧化反应，主要分为二个阶段：乙醇在乙醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase,ADH）的催化下氧化成乙醛；乙醛吸水形成乙醛水化物接着由乙醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase,ALDH）氧化成醋酸。发酵过程中菌体浓度、乙醇浓度、菌体内催化酶的活性以及辅酶浓度，都是影响产酸速率的重要因素。其中，辅酶PQQ对乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的催化活性起着重要的作用。

辅酶PQQ的学名叫吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone)，是一种氧化还原酶辅基，参与呼吸链电子传递，存在于一些微生物、植物和动物组织中。PQQ不仅参与催化生物体内氧化还原反应，而且还具有一些特殊的生物活性和生理功能，如缩短醋酸菌醋酸发酵的延迟期等。辅酶PQQ在醋酸菌内是由一组排列成簇的相关基因即pqqABCDE所编码的一系列蛋白PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE控制合成的，但辅酶PQQ在生物体内的浓度很低。在发酵生产中提高菌体内辅酶PQQ的浓度有利于缩短发酵迟缓期，提高发酵速率，从而减少能源消耗、提高生产效率、降低生产成本、提高企业效益。

基因工程是提高相关蛋白表达量的有效策略之一，因此可利用基因工程的方法实现辅酶PQQ生物合成相关蛋白在醋酸菌中的过量表达，从而提高菌体内辅酶PQQ的浓度。利用基因工程的方法重组表达蛋白时常用的启动子一般有组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子是指在该类启动子控制下，基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同条件下蛋白表达水平没有明显差异。诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的诱导下，该类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，当环境中不存在这些诱导因子时，基因的转录是关闭的。因此，表达对宿主细胞具有一定毒性或者与催化活性相关的蛋白时，选择诱导型的启动子可以提高所构建工程菌活性和稳定性。醋酸菌发酵生产醋酸是在辅酶PQQ依赖的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶作用下实现的，本发明利用醋酸菌乙醇脱氢酶启动子重组表达PQQ生物合成相关蛋白，实现了辅酶PQQ和乙醇脱氢酶的同时合成，具有协同效果。并且，当培养基中不含有乙醇时，该启动子不进行辅酶PQQ生物合成蛋白的重组表达，提高了菌体的稳定性。

经过检索，发现了两篇与本专利申请相关的专利文献。一篇是吡咯喹啉醌合成相关基因及其编码蛋白（中国专利申请号：200510005037.4），另一篇是氧化葡糖杆菌吡咯喹啉醌合成蛋白系统及其编码的基因簇（中国专利申请号：201010588079.6），这两篇专利只涉及一种辅酶PQQ合成相关基因，并不涉及利用基因工程的方法构建过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，也不涉及通过过量表达辅酶PQQ合成蛋白，提高醋酸发酵效率的方法。目前尚未发现利用乙醇脱氢酶启动子构建过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，以及利用该基因工程醋酸菌进行醋酸发酵的方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可过量表达辅酶PQQ（吡咯喹啉醌）生物合成蛋白的基因工程醋酸菌及其构建方法，其是在醋酸菌中整合有乙醇脱氢酶启动子和辅酶PQQ合成蛋白基因簇pqqABCDE的基因工程醋酸菌。。

本发明的另一目的是将本发明的基因工程醋酸菌应用于醋酸发酵中。

本发明的思路是：利用基因重组技术，将来源于巴氏醋杆菌中的乙醇脱氢酶启动子和辅酶PQQ合成蛋白基因簇pqqABCDE序列依次连接到可在醋酸菌中稳定复制的质粒中，构建重组质粒；将重组质粒转入醋酸菌中即可获得过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，从而提高醋酸发酵过程中醋酸菌体内辅酶PQQ的浓度。利用本发明的基因工程菌进行醋酸发酵，可以缩短发酵延迟期，提高醋酸发酵速率，从而降低生产成本。

本发明的技术方案之一是，利用PCR的方法获得来源于巴氏醋杆菌中的乙醇脱氢酶启动子，并将其连接到可在醋酸菌中稳定复制的质粒pBBR1MCS-4中（Kovach M E,Elzer P H,Steven Hill D,et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,1995,166(1):175-176），获得重组质粒pBBR-Padh；利用PCR方法获得来源于巴氏醋杆菌中的辅酶PQQ合成蛋白基因簇pqqABCDE序列，并将其连接到质粒pBBR-padh上，获得重组质粒重组质粒pBBR-Padh-pqq；将重组质粒pBBR-Padh-pqq转入醋酸菌中即可获得利用乙醇脱氢酶启动子控制的过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌。上述技术方案主要包括以下步骤：

（1）乙醇脱氢酶启动子Padh序列的获得和重组质粒pBBR-Padh的构建

①设计引物Padh-1和Padh-2，PCR扩增巴氏醋杆菌中乙醇脱氢酶启动子Padh序列（序列1），为了便于重组质粒的构建，引物Padh-1上引入BamH I酶切位点，引物Padh-2上引入Spe I酶切位点，如下所示：

Padh-1：5'-CGCGGATCCATCCACCACAGCCTGCGTGCACCAGA-3'  BamH I

Padh-2：5'-AGCACTAGTGCGTTCATGTCCTCGACTATTATATA-3'  Spe I

②以巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）基因组为模板，优选的以Acetobacterpasteurianus CGMCC3089基因组为模板，利用引物Padh-1和Padh-2进行PCR，获得巴氏醋杆菌中乙醇脱氢酶启动子序列Padh（序列1）；PCR反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃30秒s，50-60℃20秒，72℃20-40秒，25-30个循环后72℃10分钟。

利用基因测序反应进行乙醇脱氢酶启动子序列的验证。

③将质粒pBBR1MCS-4和乙醇脱氢酶启动子序列Padh分别用限制性内切酶BamH I和SpeI处理（37℃，2-12小时），纯化回收，将酶切纯化后的质粒和乙醇脱氢酶启动子序列按物质的量之比1:0.2-5混合，利用T4DNA连接酶进行连接反应（14-16℃，4-12小时）。将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Padh。利用基因测序反应进行重组质粒pBBR-Padh的序列验证。

（2）辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE序列的获得和重组质粒pBBR-Padh-pqq的构建

①设计引物pqq-1和pqq-2，PCR扩增巴氏醋杆菌中辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE序列（序列2），为了便于重组质粒的构建，引物pqq-1上引入Spe I酶切位点；引物pqq-2上引入Xba I酶切位点，如下所示：

pqq-1：5'-CGCGGATCC ATGGCTTGGACTGCACCA-3'  Spe I

pqq-2：5’-TGCTCTAGATTACACTTTGGCGTTGCCATAG-3’  Xba I

②以巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）基因组为模板，优选的以Acetobacterpasteurianus CGMCC3089基因组为模板，利用引物pqq-1和pqq-2进行PCR，获得巴氏醋杆菌辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE序列（序列2）；PCR反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃30秒s，50-60℃20秒，72℃3-5分钟，25-30个循环后72℃10分钟。

利用基因测序反应进行辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE序列的验证。

③将质粒pBBR-Padh和基因簇pqqABCDE序列分别用限制性内切酶Spe I和Xba I处理（37℃，2-12小时），纯化回收，将酶切纯化后的质粒和基因簇pqqABCDE序列按物质的量之比1:0.2-5混合，利用T4DNA连接酶进行连接反应（14-16℃，4-12小时）。将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Padh-pqq。利用基因测序反应进行重组质粒pBBR-Padh-pqq的序列验证。

（3）重组表达辅酶PQQ生物合成蛋白基因工程醋酸菌的获得

利用电激转化法，将验证正确的质粒pBBR-Padh-pqq转入醋酸菌中，获得含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的基因工程醋酸菌，该醋酸菌可在乙醇脱氢酶启动子的作用下重组表达辅酶PQQ生物合成蛋白。

可以采用如下电激转化方法：

①挑取一株醋酸菌接种于YPG培养基（酵母膏3-10g/L蛋白胨5-20g/L葡萄糖5-30g/L）中，30℃、220转/分钟预培养12-24小时，至OD₅₅₀≥0.6，制备种子液；取1mL预培养的种子液接入装有50-100mL YPG培养基的三角瓶中，30℃、220转/分钟培养10-24小时，至OD₆₀₀到0.5-0.6；

②将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却15-30分钟，4℃下5000转/分钟离心3-10分钟，弃上清；

③加80mL预冷至0℃的10%甘油（质量比）溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃条件下5000转/分钟离心3-10分钟，弃上清；

④重复步骤③两次后，加3-5mL预冷的10%甘油溶液，摇匀，置于冰浴中，分装至小离心管中，每管100μL，加入构建好的重组质粒5-10μL，将该混合液加入到预冷的电脉冲杯内冰浴1-5分钟；

⑤打开电脉冲仪，1.0-2.5kV电压电激后，迅速加入1mL预冷的无菌YPG培养基，混匀后转入试管中，30℃缓慢振荡培养2-6小时后，涂布到加有适当氨苄青霉素的选择平板上，30℃倒置24-60小时，获得含有重组质pBBR-Padh-pqq的基因工程醋酸菌。

所述基因工程醋酸菌可重组表达辅酶PQQ生物合成蛋白PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE，其氨基酸序列分别如序列3、序列4、序列5、序列6、序列7所示；

本发明所述的醋酸菌可以为葡糖杆菌（Gluconobacter）、醋杆菌（Acetobacter）或葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter），优选的醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）、葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter oxydans）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus），更优选的巴氏醋杆菌CGMCC3089、巴氏醋杆菌NBRC3283。

本发明涉及的引物的制备、PCR反应、核苷酸片段的纯化、回收、酶切、连接、DNA导入、核苷酸序列人工合成等操作是本领域技术人员所熟知的，可以依据例如《分子克隆》（科学出版社，第二版，2002年）中记载的方法，或按照制造厂商所建议的条件来实施。

本发明的另一个目的是提供一种利用本发明的基因工程醋酸菌进行醋酸发酵的方法。其特征在于，醋酸发酵过程中该基因工程醋酸菌可以合成比原始菌更多的辅酶PQQ，利用该基因工程菌以乙醇为主要原料进行醋酸发酵具有发酵迟缓期短，发酵速率高等优点。

为实现上述目的，本发明技术方案如下。

所述方法主要包括以下步骤：

（1）培养基的制备：

培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，如葡萄糖或乙醇等碳源，尿素、铵盐、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸盐（磷源）和硫酸盐（硫源）等；另外还需要钠、钾、镁、钙、锌、铁、锰、铜、钴、硼和钼等金属离子，每种金属离子的含量大约在0.001mg/L-500mg/L；培养基中乙醇浓度为30-200g/L。

（2）种子培养：

利用250-1000mL的摇瓶，装有如上所述培养基30-100mL，接入含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的基因工程醋酸菌进行摇瓶培养，摇床转速为100-300转/分钟，温度为27-30℃，培养时间为20-30小时，制备种子液。

（3）醋酸发酵：

醋酸发酵可在发酵罐中进行，发酵罐接种量为5％-20％（体积比），温度为27-35℃。发酵过程中向发酵罐中通入空气，每分钟通气量为1：0.05-0.25v/v（液体与气体的体积比）。发酵方式可以是分批发酵、补料分批发酵或分割发酵。

分批发酵结束醋酸浓度可达到30-150g/L，发酵时间24-160小时。

补料分批发酵过程中连续补加乙醇，控制发酵液中乙醇浓度为10-40g/L，发酵结束醋酸浓度可达到80-200g/L，发酵时间60-150小时。

分割发酵每次取出发酵液10％-50％（体积比），补充同体积的新鲜培养基，每批发酵结束醋酸浓度可达到30-150g/L，发酵时间24-100小时。

本发明的基因工程醋酸菌可应用于发酵生产醋酸，以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料。

本发明的基因工程醋酸菌可应用于发酵生产苹果醋，以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料。

有益效果：

（1）本发明通过构建含有辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE的重组质粒并转入醋酸菌中，获得过量表达辅酶PQQ生物合成蛋白的基因工程醋酸菌，从而提高醋酸菌体内乙醇转化为醋酸过程需要的关键辅酶PQQ的浓度。

（2）本发明利用乙醇脱氢酶启动子控制重组质粒中辅酶PQQ生物合成蛋白的表达，实现了乙醇脱氢酶和辅酶PQQ的同时合成，具有协同效果。当培养基中不含有乙醇时，该启动子不进行辅酶PQQ生物合成蛋白的重组表达，提高了菌体的稳定性，并且，通过比较原始菌株和基因工程菌株生长曲线，发现基因工程质粒对菌体生长没有影响。

（3）利用该基因工程醋酸菌以乙醇为主要原料进行醋酸发酵具有发酵迟缓期短，发酵速率高等优点，从而减少能源消耗、提高生产效率、提高企业效益。

附图说明

图1质粒pBBR-Padh-pqq酶切产物琼脂糖凝胶电泳；

图2醋酸发酵过程曲线；

图3苹果醋发酵过程曲线；

其中，图1中，M：Marker；1：质粒pBBR1MCS-4用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切；2：质粒pBBR-Padh-pqq用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切；

图2和图3中，A：含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌；B：Acetobacter pasteurianus CGMCC3089原始菌株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

以下实验所用主要材料来源：大肠杆菌DH5α菌株、核酸操作工具酶来自宝生物工程（大连）有限公司，引物合成、核苷酸序列人工合成以及基因测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

实施例1制备含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的基因工程巴氏醋杆菌

（1）重组质粒pBBR-Padh的构建

以Acetobacter pasteurianus CGMCC3089（购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。授权专利号：ZL200810053141）基因组为模板，利用引物Padh-1和Padh-2进行PCR，扩增获得乙醇脱氢酶启动子Padh序列，PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃30秒s，56℃20秒，72℃30秒，26个循环后72℃10分钟。

将乙醇脱氢酶启动子Padh序列和质粒pBBR1MCS-4（Kovach M E,Elzer P H,Steven HillD,et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes.Gene,1995,166(1):175-176）分别用限制性内切酶BamHⅠ和SpeⅠ处理（37℃，4小时），利用PCR产物纯化试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）分别回收目的片段，将酶切后的质粒和乙醇脱氢酶启动子Padh序列按1:3（物质的量之比）的比例进行连接反应（16℃，12小时）；连接产物转入大肠杆菌DH5α，经筛选获得重组质粒pBBR-Padh。

（2）重组质粒pBBR-Padh-pqq的构建

以Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因组为模板，利用引物pqq-1和pqq-2进行PCR，扩增获得辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE序列，PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃30秒s，54℃20秒，72℃3分钟，26个循环后72℃10分钟。

将获得辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE序列和质粒pBBR-Padh分别用限制性内切酶SpeⅠ和XbaⅠ处理（37℃，4小时），利用PCR产物纯化试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）分别回收目的片段，将酶切后的质粒和基因簇pqqABCDE序列按1:3（物质的量之比）的比例进行连接反应（16℃，12小时）；连接产物转入大肠杆菌DH5α，经筛选获得重组质粒pBBR-Padh-pqq。

获得的重组质粒pBBR-Padh-pqq用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切琼脂糖凝胶电泳如图1所示。

（3）重组表达辅酶PQQ生物合成蛋白巴氏醋杆菌基因工程菌的获得

①Acetobacter pasteurianus CGMCC3089感受态细胞的制备：

挑取Acetobacter pasteurianus CGMCC3089接种于YPG培养基中，30℃、220转/分钟预培养12小时，至OD₅₅₀约0.6，取1mL预培养的菌液接入装有100mL YPG培养基的250mL三角瓶中，30℃、220转/分钟培养8h，至OD₆₀₀约0.6；将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却20分钟，4℃下5000转/分钟离心5分钟，弃上清；加80mL预冷至0℃的10%甘油（质量比）溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃下5000转/分钟离心8分钟，弃上清；加3mL预冷的10%甘油溶液摇匀，置于冰浴中，获得Acetobacter pasteurianus CGMCC3089感受态细胞。

②质粒pBBR-Padh-pqq的电激转化

取100μL Acetobacter pasteurianus CGMCC3089感受态细胞于小离心管中，加入10μL构建好的重组质粒pBBR-Padh-pqq，混合均匀后加入到预冷的电脉冲杯内冰浴3分钟；打开电脉冲仪，按设定的转化程序进行电激（2.0kV）；向电脉冲杯内迅速加入1mL预冷的无菌YPG培养基，混匀后，转入试管中，30℃缓慢振荡培养2小时后，涂布到加有适当抗生素的选择平板上，30℃倒置培养48小时，获得含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianusCGMCC3089基因工程菌。

实施例2利用含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌发酵生产醋酸

（1）制备种子液

分别从斜面取含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌和Acetobacter pasteurianus CGMCC3089原始菌接种于种子培养基中，在30℃，160转/分钟条件下摇床培养24小时。按10%（v/v）的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。

种子培养基组成:葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇3.5%（v/v），其余为水。

（2）醋酸发酵

按10％的接种量，将种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，在30℃条件下进行醋酸发酵。

发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇8％（v/v），醋酸10g/L，MgSO₄2g/L，CaCl₂3g/L，其余为水。

利用含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌在30℃，通风量1∶0.12（v/v）/min条件下发酵生产醋酸，50h发酵结束，醋酸终浓度为84g/L，初始醋酸浓度10g/L，则乙醇转酸率约为92.5%，平均产酸速率约为1.48g/(L·h)。

利用原始Acetobacter pasteurianus CGMCC3089在30℃，通风量1∶0.12（v/v）/min条件下发酵生产醋酸，66h发酵结束，醋酸终浓度为79g/L，初始醋酸浓度10g/L，则乙醇转酸率约为86%，平均产酸速率约为1.05g/(L·h)。

图2为含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌和原始菌株醋酸发酵比较。

实施例3利用含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌发酵生产苹果醋

（1）制备种子液

从斜面取含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌于种子培养基中，在30℃，160转/分钟条件下摇床培养25小时。按10%（v/v）的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。

种子培养基组成:葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，乙醇3.5％（v/v），其余为水。

（2）苹果醋发酵

按10％（v/v）的接种量，接种至含有苹果酒的发酵罐中，在30℃条件下进行苹果醋发酵。苹果酒中乙醇含量为8％（v/v）。

利用含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌在30℃，通风量1∶0.1（v/v）/min条件下发酵生产苹果醋，52h发酵结束，醋酸终浓度为74g/L，则乙醇转酸率约为92.5%，平均产酸速率约为1.35g/(L·h)。

利用普通Acetobacter pasteurianus CGMCC3089在30℃，通风量1∶0.1（v/v）/min条件下发酵生产苹果醋，68h发酵结束，醋酸终浓度为64g/L，则乙醇转酸率约为80%，平均产酸速率约为0.94g/(L·h)。

图3为利用含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的Acetobacter pasteurianus CGMCC3089基因工程菌以苹果酒为原料发酵生产苹果醋的过程曲线。

Claims (8)

1.过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，其特征在于，其是在醋酸菌中整合有乙醇脱氢酶启动子和辅酶PQQ合成蛋白基因簇pqqABCDE的基因工程醋酸菌；

所述醋酸菌的构建方法如下：将来源于巴氏醋杆菌中的乙醇脱氢酶启动子和辅酶PQQ合成蛋白基因簇pqqABCDE序列依次连接到质粒pBBR1MCS-4中，构建重组质粒；将重组质粒转入醋酸菌中即可获得过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，所述醋酸菌为巴氏醋杆菌。

2.如权利要求1所述的过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，其特征在于，所述醋酸菌的构建方法具体包括以下步骤：

(1)乙醇脱氢酶启动子Padh序列的获得和重组质粒pBBR-Padh的构建

①设计引物Padh-1和Padh-2，引物Padh-1上引入BamH I酶切位点，引物Padh-2上引入Spe I酶切位点，如下所示：

Padh-1：5'-CGCGGATCCATCCACCACAGCCTGCGTGCACCAGA-3'

Padh-2：5'-AGCACTAGTGCGTTCATGTCCTCGACTATTATATA-3'

②以巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)基因组为模板，利用引物Padh-1和Padh-2进行PCR，获得巴氏醋杆菌中乙醇脱氢酶启动子序列Padh；PCR反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃30秒，50-60℃20秒，72℃20-40秒，25-30个循环后72℃10分钟；

③将质粒pBBR1MCS-4和乙醇脱氢酶启动子序列Padh分别用限制性内切酶BamH I和SpeI处理，37℃，2-12小时，纯化回收；将酶切纯化后的质粒和乙醇脱氢酶启动子序列按物质的量之比1:0.2-5混合，利用T4DNA连接酶进行连接反应，14-16℃，4-12小时；将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Padh；

(2)辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE序列的获得和重组质粒pBBR-Padh-pqq的构建

①设计引物pqq-1和pqq-2，引物pqq-1上引入Spe I酶切位点；引物pqq-2上引入Xba I酶切位点，如下所示：

pqq-1：5'-CGCGGATCCATGGCTTGGACTGCACCA-3'

pqq-2：5’-TGCTCTAGATTACACTTTGGCGTTGCCATAG-3’

②以巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)基因组为模板，利用引物pqq-1和pqq-2进行PCR，获得巴氏醋杆菌辅酶PQQ生物合成蛋白基因簇pqqABCDE序列；PCR反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃30秒，50-60℃20秒，72℃3-5分钟，25-30个循环后72℃10分钟；

③将质粒pBBR-Padh和基因簇pqqABCDE序列分别用限制性内切酶Spe I和Xba I处理，37℃，2-12小时，纯化回收；将酶切纯化后的质粒和基因簇pqqABCDE序列按物质的量之比1:0.2-5混合，利用T4DNA连接酶进行连接反应，14-16℃，4-12小时；将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Padh-pqq；利用基因测序反应进行重组质粒pBBR-Padh-pqq的序列验证；

(3)重组表达辅酶PQQ生物合成蛋白基因工程醋酸菌的获得

利用电激转化法，将验证正确的质粒pBBR-Padh-pqq转入醋杆菌Acetobacter中，获得含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的基因工程醋酸菌，该醋酸菌在乙醇脱氢酶启动子的作用下重组表达辅酶PQQ生物合成蛋白。

3.如权利要求1或2所述的过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，其特征在于，所述基因工程醋酸菌重组表达辅酶PQQ生物合成蛋白PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE，其氨基酸序列分别如序列3、序列4、序列5、序列6、序列7所示。

4.如权利要求2所述的过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌，其特征在于，所述电激转化法包括如下步骤：

①挑取一株醋酸菌接种于YPG培养基中，30℃、220转/分钟预培养12-24小时，至OD₅₅₀≥0.6，制备种子液；取1mL预培养的种子液接入装有50-100mL YPG培养基的三角瓶中，30℃、220转/分钟培养10-24小时，至OD₆₀₀到0.5-0.6；

②将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却15-30分钟，4℃下5000转/分钟离心3-10分钟，弃上清；

③加80mL预冷至0℃的质量比10％甘油溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃条件下5000转/分钟离心3-10分钟，弃上清；

④重复步骤③两次后，加3-5mL预冷的10％甘油溶液，摇匀，置于冰浴中，分装至小离心管中，每管100μL，加入构建好的重组质粒5-10μL，将该混合液加入到预冷的电脉冲杯内冰浴1-5分钟；

⑤打开电脉冲仪，1.0-2.5kV电压电激后，迅速加入1mL预冷的无菌YPG培养基，混匀后转入试管中，30℃缓慢振荡培养2-6小时后，涂布到加有适当氨苄青霉素的选择平板上，30℃倒置24-60小时，获得含有重组质粒pBBR-Padh-pqq的基因工程醋酸菌。

5.权利要求1或2所述的过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌在发酵生产醋酸中的应用，其特征在于，所述发酵以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料。

6.权利要求1或2所述的过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌在发酵生产苹果醋中的应用，其特征在于，所述发酵以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料。

7.利用权利要求1或2所述的过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌发酵生产醋酸的方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制备：培养基中乙醇浓度为30-200g/L，还含有碳源、氮源、磷酸盐、硫酸盐及金属离子钠、钾、镁、钙、锌、铁、锰、铜、钴、硼和钼，每种金属离子的含量在0.001mg/L-500mg/L；

(2)种子培养：利用250-1000mL的摇瓶，装有培养基30-100mL，接入含有权利要求1或2所述的过量表达辅酶PQQ合成蛋白的基因工程醋酸菌进行摇瓶培养，摇床转速为100-300转/分钟，温度为27-30℃，培养时间为20-30小时，制备种子液；

(3)醋酸发酵：发酵罐接种量为5％-20％体积比，温度为27-35℃，发酵过程中向发酵罐中通入空气，每分钟通气量为1：0.05-0.25v/v，发酵方式为分批发酵、补料分批发酵或分割发酵。

8.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有来源于巴氏醋杆菌的乙醇脱氢酶启动子和辅酶PQQ合成蛋白基因簇pqqABCDE；所述重组载体的骨架是质粒pBBR1MCS-4。