CN104946576A

CN104946576A - 大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用

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Publication number: CN104946576A
Application number: CN201510205724.4A
Authority: CN
Inventors: 杨茂华; 邢建民; 刘谊兰; 白冰
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2015-04-27
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2035-04-27
Also published as: CN104946576B

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用。本发明所提供的基因工程菌是按照包括以下步骤的方法构建的：在出发大肠杆菌中降低或抑制硫脂酶活性，失活乙酸合成途径，构建得到大肠杆菌基因工程菌YP01。本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌菌株YP01，在好氧条件下，利用无机盐培养基发酵48小时，可将95g/L葡萄糖转化生成69g/L丙酮酸，适合工业化生产。

Description

大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用。

背景技术

丙酮酸(Pyruvic acid)，浅黄色至黄色透明液体，是生物体基本代谢中间产物之一，广泛应用于食品添加剂、农药、医药等领域。可作为前体，酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、D-/L-丙氨酸和L-二羟基苯丙氨酸等，同时在减肥、增强耐力、降低胆固醇等人类健康领域有应用潜力。目前，丙酮酸的合成主要采用化学法，由酒石酸和焦硫酸钾反应获得。由于原料转化率低、反应条件苛刻，总成本较高。与之相比，发酵法生产丙酮酸具有原料成本低、来源广、产物纯度高、反应条件温和等诸多优势，更具有市场竞争力。

发酵法生产丙酮酸的研究开始于二十世纪90年代，日本、美国等发达国家在菌株选育、工程菌株构建等方面积累了大量的经验，尤其日本，已经实现了产业化，处于世界领先水平。我国的相关研究主要由江南大学和中国科学院微生物研究所所属的两个课题组开展，也取得了不错的进展。

发酵菌株的选育和构建一直是丙酮酸产业化的关键。在微生物代谢体系中，丙酮酸是糖酵解途径的终产物，处于糖类、脂类、蛋白质三种主要物质代谢的中心位置，具有重要的枢纽性作用，存在多条丙酮酸降解途径，无论厌氧和好氧条件下，丙酮酸都难以大量积累。在好氧条件下，丙酮酸会在丙酮酸脱氢酶系的作用下降解为乙酰辅酶A和CO₂，乙酰辅酶A进入TCA循环、乙酸合成途径和脂肪酸合成途径等，最终产物主要为菌体、CO₂和乙酸等；而在厌氧环境下，丙酮酸会在乳酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶的作用下，产生乳酸、甲酸和乙酰辅酶A，乙酰辅酶A会进入乙酸合成途径，最终实现混合酸发酵。

阻断和减弱丙酮酸的降解途径是实现丙酮酸积累的主要思路。目前发酵菌株研究最多的是光滑球拟酵母(Torulopsis glabuata)和大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌。日本的Yonehara等筛选出一株多种维生素营养缺陷型光滑球拟酵母T.glabuata IFO 005，经过诱变后，丙酮酸得率可达到0.52-0.54g/g[JP,patent2000078996]。采用分批补料方式培养63小时，丙酮酸浓度达到67.8g/L[J.Ferment. Bioeng.,1996,82(5):475-479]。刘立民等在高浓度NaCl溶液中驯化得到一株高盐耐受菌株T.glabuata RS23，培养82小时，丙酮酸浓度可达到94.3g/L，葡萄糖转化率达到0.635g/g[Biotech.Bioeng.,2007,97(4):825-832]。与采用筛选、驯化手段改造酵母相比，产丙酮酸大肠杆菌构建主要采用基因工程技术，通过使丙酮酸降解途径失活来实现。Ingram等以E.coli W3110为出发菌株，通过敲除ldhA、poxB、ackA、pflB、adhE、frdBC、sucAB、atpFH基因，在阻断乙酸合成，减弱TCA代谢流的同时，增强糖酵解途径的代谢强度，实现菌体生物量和CO₂产生量降低，积累丙酮酸达到66g/L，转化率和生产强度分别达到0.75g/g、1.2g/Lh[PNAS,2004,101(8),2235-2240]。Eiteman等采用类似的思路，通过敲除aceEF、pfl、poxB、pps、ldhA、atpFH、arcA基因，批次补料培养44h，丙酮酸浓度达到90g/L，转化率和生产强度分别达到0.68g/g、2.1g/Lh[Appl.Environ.Microbiol.,2008,74(21),6649-6655]。

虽然目前丙酮酸生产菌株的筛选和构建已经取得了很大的进展，但仍存在不足。如，维生素营养缺陷型光滑球拟酵母普遍存在糖酸转化率不高的问题。而大肠杆菌工程菌由于敲除了丙酮酸脱氢酶亚基或乙酸途径的编码基因，使其不能直接利用简单培养基，需要添加维生素或是乙酸等，增加了发酵过程的控制难度及发酵成本。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)基因工程菌YP01，该菌保藏日期为2015年4月7日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，其保藏号为CGMCC No.10691。

本发明的另一个目的在于，提供一种上述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

在出发大肠杆菌中抑制酯酰辅酶A硫酯酶III(fadM)、酯酰辅酶A硫酯酶II(tesB)的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌Ⅰ。

进一步地，所述方法还包括以下步骤：

所述重组大肠杆菌Ⅰ中抑制乙酸激酶(ackA)、乙酰磷酸化酶(pta)的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌Ⅱ。

更进一步地，所述方法还包括以下步骤：

所述重组大肠杆菌Ⅱ中抑制丙酮酸氧化酶(poxB)的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌III，即大肠杆菌基因工程菌YP01。保存时间:2015年4月7日，保存单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：10691。

所述抑制硫酯酶的活性是使所述酯酰辅酶A硫酯酶III编码基因的功能丧失；所述使所述酯酰辅酶A硫酯酶III编码基因的功能丧失的方法包括以下步骤：向所述出发大肠杆菌中导入序列表中SEQ ID NO：1所示DNA，得到重组大肠杆菌α；所述序列表中SEQ ID NO：1所示DNA与所述出发大肠杆菌中的酯酰辅酶A硫酯酶III编码基因发生同源重组；

所述抑制硫酯酶的活性还包括使所述酯酰辅酶A硫酯酶II编码基因的功能丧失；所述使所述酯酰辅酶A硫酯酶II编码基因的功能丧失的方法包括以下步骤：向所述重组大肠杆菌α中导入序列表中SEQ ID NO：2所示DNA，得到重组大肠杆菌Ⅰ；所述序列表中SEQ ID NO：2所示DNA与所述出发大肠杆菌中的酯酰辅酶A硫酯酶II编码基因发生同源重组；

所述抑制乙酸激酶和乙酰磷酸化酶的活性是使所述乙酸激酶和乙酰磷酸化酶编码基因的功能丧失；所述使所述乙酸激酶和乙酰磷酸化酶编码基因的功能丧失的方法包括以下步骤：向所述重组大肠杆菌Ⅰ中导入序列表中SEQ ID NO：3所示DNA，得到重组大肠杆菌Ⅱ；所述序列表中SEQ ID NO：3所示DNA与所述出发大肠杆菌中的乙酸激酶和乙酰磷酸化酶编码基因发生同源重组；

所述抑制丙酮酸氧化酶的活性是使所述丙酮酸氧化酶编码基因的功能丧失；所述使所述丙酮酸氧化酶编码基因的功能丧失的方法包括以下步骤：向所述重组大肠杆菌Ⅱ中导入序列表中SEQ ID NO：4所示DNA，得到重组大肠杆菌III；所述序列表中SEQ ID NO：4所示DNA与所述出发大肠杆菌中的丙酮酸氧化酶编码基因发生同源重组；

所述硫酯酶编码基因为酯酰辅酶A硫酯酶III编码基因和(或)酯酰辅酶A硫酯酶II编码基因。

所述出发大肠杆菌为大肠杆菌K-12MG1655。

由上述方法构建得到的重组大肠杆菌也属于本发明的保护范围。

所述大肠杆菌基因工程菌YP01在生产丙酮酸中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一个目的是提供一种生产丙酮酸的方法。

本发明提供的生产丙酮酸的方法，包括以下步骤：发酵所述大肠杆菌重组基因工程菌YP01或所述重组大肠杆菌，在发酵过程中通入空气或含氧气气体，消耗葡萄糖或碳源，生产得到丙酮酸，其中，

所述发酵温度为25℃-40℃；

所述发酵体系的pH值为6.0-8.0；

所述发酵时间为16小时-96小时；

所述发酵体系的DO值为10-40％；

所述发酵接种量的体积百分比为0.01％-10％；

所述发酵培养基中的碳源可以是下述的一种或几种：葡萄糖、木糖、淀粉；

所述发酵培养基中的氮源可以是下述的一种或几种：酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、氨水、铵盐、尿素。

本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌菌株YP01，在好氧条件下，利用无机盐培养基发酵48小时，可将95g/L葡萄糖转化生成69g/L丙酮酸。

本发明以野生型大肠杆菌为出发菌株，通过改造脂肪酸合成-降解途径，积累乙酰辅酶A，间接抑制丙酮酸的消耗，同时强化糖酵解途径，弱化TCA循环，实现对整体代谢网络的调控，达到积累丙酮酸的目的。本发明中构建的大肠杆菌基因工程菌可在无机盐合成培养基中正常生长，无需添加维生素和乙酸盐等。

附图说明

图1为大肠杆菌合成丙酮酸代谢途径改造示意图；

图2为大肠杆菌基因工程菌构建方法中基因敲除操作步骤示意图；

图3为大肠杆菌基因工程菌YP01不同发酵时间的OD600值、丙酮酸浓度和葡萄糖浓度。

具体实施方式

下述实施例中所有的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中得到。

实施例1、如图1所示，大肠杆菌基因工程菌Ⅰ的构建

大肠杆菌基因工程菌Ⅰ的构建需要两个步骤。

(1)敲除大肠杆菌K-12MG1655的酯酰辅酶A硫酯酶III基因(fadM)

如图2所示，基因敲除采用两步同源重组的方法。

第一步，采用热激转化法将pKD46质粒转入出发菌株大肠杆菌K-12MG1655中，得到重组大肠杆菌A。具体操作为：吸取1μL pKD46质粒加入感受态细胞中混合均匀，静止5min后置于42℃水浴锅热激90s，冰水浴3min。随后加入800μL无抗生素的LB培养基，在30℃，140rpm孵育1h，涂布于Amp抗性平板，30℃静止培养16h至单菌落长出。

第二步，NCBI数据库中查到fadM基因的NDA序列，以此为依据设计引物fadM-F/fadM-R，其中fadM-F中包括fadM上游50bp、fadM下游50bp及cat-sacB的上游25bp，fadM-R包括fadM下游50bp及cat-sacB的下游25bp，以质粒p EASY-cat-sacB为模版进行PCR扩增。引物序列为：

fadM-F(SEQ ID NO：5)：

CGTAATCTGGCGGTATTAACCCTGTAATTAATTTGCATAGTGGCAATTTTACGTTTTGTGGTGCCGGATGCTCAAGCCGCATCCGGCGACACCCGGAATAGTGACGGAAGATCACTTCGCAG

fadM-R(SEQ ID NO：6)：

TATTCCGGGTGTCGCCGGATGCGGCTTGAGCATCCGGCACCACAAAACGTATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC

扩增体系为：

PCR程序为：98℃预变性2min，(98℃热变性10s，55℃退火20s，72℃延伸2min)35cycles，72℃5min。得到含有fadM-F/fadM-R和cat-sacB序列的DNA片段，记作DNA片段Ⅰ，序列表中SEQ ID NO：1。

第三步，DNA片段Ⅰ用于第一轮重组。将DNA片段Ⅰ电转至重组大肠杆菌A。电转条件为：首先准备重组大肠杆菌A的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段Ⅰ，冰上放置2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电击杯，电击参数为2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为重组大肠杆菌B。

第四步，重组大肠杆菌B的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为：将重组大肠杆菌B活化于LB液体培养基，过夜培养；取1mL培养物接种于10mL含有蔗糖的LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取400个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌α(重组大肠杆菌α)。

(2)敲除大肠杆菌基因工程菌α的酯酰辅酶A硫酯酶II基因(tesB)

如图2所示，基因敲除采用两步同源重组的方法。

第一步，NCBI数据库中查到tesB基因的NDA序列，以此为依据设计引物tesB-F/tesB-R，其中tesB-F中包括tesB上游50bp、tesB下游50bp及cat-sacB的上游25bp，tesB-R包括tesB下游50bp及cat-sacB的下游25bp，以质粒p EASY-cat-sacB为模版进行PCR扩增。引物序列为：

tesB-F(SEQ ID NO：7)：

ATCACGCATTTCTGCCTGTAATTAGCCCGTAATTCAGACCATTGCACCCAAAAAATAGCCGGAGGTGAAAACCGTCCGGCTGTTTTTTGCAGTGCTTGTTGTGACGGAAGATCACTTCGCAG

tesB-R(SEQ ID NO：8)：

AACAAGCACTGCAAAAAACAGCCGGACGGTTTTCACCTCCGGCTATTTTTATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC

扩增体系和PCR程序同实例1(1)，得到含有tesB-F/tesB-R和cat-sacB序列的DNA片段，记作DNA片段Ⅱ，序列表中SEQ ID NO：2。

第二步，DNA片段Ⅱ用于第一轮重组。将DNA片段Ⅱ电转至重组大肠杆菌α。电转条件为：首先准备重组大肠杆菌α的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段Ⅱ，冰上放置2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电击杯，电击参数为2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为重组大肠杆菌C。

第三步，重组大肠杆菌C的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为：将重组大肠杆菌C活化于LB液体培养基，过夜培养；取1mL培养物接种于10mL含有蔗糖的LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取400个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌Ⅰ。

实施例2、如图1所示，大肠杆菌基因工程菌Ⅱ的构建

敲除大肠杆菌基因工程菌Ⅰ的乙酰磷酸化酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)，构建大肠杆菌基因工程菌Ⅱ。

如图2所示，基因敲除采用两步同源重组的方法。

第一步，NCBI数据库中查到ackA和pta基因的NDA序列，以此为依据设计引物ackA-pta-F/ackA-pta-R，其中ackA-pta-F中包括ackA上游50bp及cat-sacB的上游25bp，ackA-pta-R包括ackA上游50bp、pta下游50bp及cat-sacB的下游25bp，以质粒p EASY-cat-sacB为模版进行PCR扩增。引物序列为：

ackA-pta-F(SEQ ID NO：9)：

CTATGGCTCCCTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCGTGACGGAAGATCACTTCGCAGA

ackA-pta-R(SEQ ID NO：10)：

TTATTTCCGGTTCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAGGAAGTACCTATAATTGATACGTGGCTAAAAAAACGTCAGGGAGCCATAGATCAA AGGGAAAACTGTCCATATGC

扩增体系和PCR程序同实例1，得到含有ackA-pta-F/ackA-pta-R和cat-sacB序列的DNA片段，记作DNA片段III，序列表中SEQ ID NO：3。

第二步，DNA片段III用于第一轮重组。将DNA片段III电转至重组大肠杆菌Ⅰ。电转条件为：首先准备重组大肠杆菌Ⅰ的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段III，冰上放置2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电击杯，电击参数为2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为重组大肠杆菌D。

第三步，重组大肠杆菌D的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为：将重组大肠杆菌D活化于LB液体培养基，过夜培养；取1mL培养物接种于10mL含有蔗糖的LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取400个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌Ⅱ。

实施例3、如图1所示，大肠杆菌基因工程菌III的构建

敲除大肠杆菌基因工程菌Ⅱ的丙酮酸氧化酶(poxB)，构建大肠杆菌基因工程菌III。

如图2所示，基因敲除采用两步同源重组的方法。

第一步，NCBI数据库中查到poxB基因的NDA序列，以此为依据设计引物poxB-F/poxB-R，其中poxB-F中包括poxB上游50bp、poxB下游50bp及cat-sacB的上游25bp，poxB-R包括poxB下游50bp及cat-sacB的下游25bp，以质粒p EASY-cat-sacB为模版进行PCR扩增。引物序列为：

poxB-F(SEQ ID NO：11)：

TATGCCCGATGATATTCCTTTCATCGGGCTATTTAACCGTTAGTGCCTCCAAAGGGTGGCATTTCCCGTCATAATAAGGACATGCCATGATTGATTTACGGTGACGGAAGATCACTTCGCAG

poxB-R(SEQ ID NO：12)：

CGTAAATCAATCATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTATC AAAGGGAAAACTGTCCATATGC

扩增体系和PCR程序同实例1，得到含有poxB-F/poxB-R和cat-sacB序列的DNA片段，记作DNA片段Ⅳ，序列表中SEQ ID NO：4。

第二步，DNA片段Ⅳ用于第一轮重组。将DNA片段Ⅳ电转至重组大肠杆菌Ⅱ。电转条件为：首先准备重组大肠杆菌Ⅱ的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段Ⅳ，冰上放置2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电击杯，电击参数为2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为重组大肠杆菌E。

第三步，重组大肠杆菌E的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为：将重组大肠杆菌E活化于LB液体培养基，过夜培养；取1mL培养物接种于10mL含有蔗糖的LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取400个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌III。

实施例4、用大肠杆菌基因工程菌YP01生产丙酮酸

种子培养基和发酵培养基含以下成分(除葡萄糖外)：

大量元素(mmol/L)：(NH₄)₂HPO₄19.92，NH₄H₂PO₄7.56，KCl 2.00，MgSO₄·7H₂O1.50；

微量元素(μmol/l):FeCl₃·6H2O 8.88，CoCl₂·6H₂O 1.26，CuCl₂·2H₂O 0.88，ZnCl₂2.20，Na₂MoO₄·2H₂O 1.24，H₃BO₃1.21，MnCl₂·4H₂O 2.50；

以大肠杆菌基因工程菌株YP01生产丙酮酸，包括以下步骤：

(1)种子培养：在250ml三角瓶中种子培养基100ml，含葡萄糖1％，115℃灭菌30min。冷却后将菌株YP01按照1％(v/v)的接种量接种于种子培养基，在pH＝7.0、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到种子液。

(2)发酵培养：5L发酵罐发酵培养基体积为2L，121℃灭菌20min，添加已高温灭菌的葡萄糖母液，使发酵罐中葡萄糖浓度为5％。将步骤1中种子按照5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，在pH＝7.0、37℃和400rpm的条件下培养24小时，添加葡萄糖母液，使发酵罐中葡萄糖总浓度达到10％，培养48小时后得到发酵液。

分析方法：使用安捷伦(1200型)高效液相色谱对发酵液中的成分进行定量分析，发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱分析。结果如图3所示。

由图3可以看出：大肠杆菌基因工程菌株YP01发酵48小时后，丙酮酸浓度达到69g/L，产率达到0.73g/g，丁二酸生产强度为1.44g/L·h。

Claims

1.一种大肠埃希氏菌基因工程菌YP01，其保藏号为CGMCC No.10691。

2.权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌YP01的构建方法，所述方法包括以下步骤：

采用同源重组技术，敲除大肠杆菌K-12MG1655中的酯酰辅酶A硫酯酶III基因、酯酰辅酶A硫酯酶Ⅱ基因，命名为重组大肠杆菌Ⅰ。

3.根据权利要求2所述大肠杆菌基因工程菌YP01的构建方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

采用同源重组技术，敲除重组大肠杆菌Ⅰ中的乙酸激酶基因和乙酰磷酸化酶基因，命名为重组大肠杆菌Ⅱ。

4.根据权利要求3所述大肠杆菌基因工程菌YP01的构建方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

采用同源重组技术，敲除重组大肠杆菌Ⅱ中的丙酮酸氧化酶，命名为重组大肠杆菌III，即大肠杆菌基因工程菌YP01。

5.权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌YP01在生产丙酮酸中的应用。

6.一种生产丙酮酸的方法，发酵权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌YP01，得到丙酮酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在发酵过程中通入空气或含氧气气体，消耗葡萄糖或碳源，生产丙酮酸，其中：

发酵温度为25℃-40℃；

发酵体系的pH值为6.0-8.0；

发酵时间为16小时-96小时；

发酵接种量的体积百分比为0.01％-10％；

发酵培养基中的碳源是葡萄糖、木糖和淀粉中的一种或几种；

发酵培养基中的氮源是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、氨水、铵盐和尿素中的一种或几种。