CN1191369C - 一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种简单、高产、低成本发酵生产腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)的方法。将外源SAM合成酶2基因置于组成型GAP启动子调控下，整合至甲醇酵母得到高产SAM的基因工程菌。在外加一定量的甲硫氨酸的简单发酵培养基中，该基因工程菌来发酵生产SAM，结果显示，在较短的发酵周期内，得到较高的SAM产量。本发明还提供了一个新的菌株，该菌株的保藏号为CGMCC No.0746，分类命名为Pichia pastoris。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程、代谢工程和发酵工程的相关技术，具体地说，本发明涉及利用生物技术构建甲醇酵母基因工程菌，利用该基因工程菌增强腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)合成的代谢流来高产SAM。
背景技术
腺苷甲硫氨酸是生物体中重要的中间代谢物质，参与众多生物反应。SAM是作为生物体代谢的主要甲基供体，直接参与了肌酸、肾上腺素、松果素和胆碱等重要生理活性物质的合成，还参与了核糖、蛋白质的甲基化修饰，也是诸如谷胱甘肽、半胱氨酸、牛磺酸和辅酶A等含硫化合物的活性前体，对维护人体健康至关重要。SAM从八十年代成为临床处方药，德国、意大利和西班牙有多家药厂生产，用于治疗肝脏紊乱、关节炎和抑郁症等。1999年，美国FDA已批准SAMe作为保健品上市，迅速在美国成为最畅销的营养品之一(杨静等，药学进展，2001，25(3)：164～167)。我国人口众多，其中有相当比例的肝功能紊乱、关节炎患者，另外，随着生活节奏的加快和工作压力的增加，抑郁症患者明显增多，SAM在保健上功效及副作用小等优点，具有巨大的市场前景，并且市场需求量将会不断增加。
SAM可以从微生物发酵提取，化学合成或酶促合成得到。化学法合成有产率低、消旋性等明显缺点，而很少被实际应用(Matos J R et al.Biotechnol Appl Biochem，1987，9：39～52)。酶法合成尽管反应产物纯度高，但成本太高，一般只用于合成同位素标记的SAM(Reed B R et al.1986，EP0189322)。一些微生物可以通过细胞代谢，体内积累SAM。尤其是酵母Saccharomyces属的一些菌株，在培养基中存在一定量甲硫氨酸，便能够在细胞内转化和积累较高浓度的SAM(Shiozaki S et al.Agric Biol Chem，1984，48(9)：2293～2300)。因此，通过微生物的发酵、酶学转化、提取纯化SAM，是目前SAM的主要工业生产途径。
SAM的生产一直以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的发酵为主(Shiozaki S，Yamada H et al.，US4562149，1985；Shiozaki S，Yamada H et al.Arig Biol Chem，1989，53：3269～3274)。早期，SAM生产菌都是通过大规模地筛选野生菌分离得到的，Shiozaki通过筛选300多株菌株，分离到一株Saccharomyces sake K-6菌(Shiozaki S et al.，Agric BiolChem，1984，48(9)：2293～2300)，在10ml培养基小量发酵时可以产出1.55g/L的SAM；进一步优化培养条件，该菌在10L发酵罐中培养7天后的SAM产量高达10.8g/L(Shiozaki S et al.Journal of Biotechnology，1986，4：345～354)。这是目前从各种专利和期刊上所查到的最高产量。尽管酿酒酵母细胞内SAM含量很高，但由于酿酒酵母细胞不能以极高的密度生长，使得单位发酵体积中菌体产出较低，而且，为了在野生酿酒酵母中发酵得到高的SAM产量，必须延长发酵周期，一方面会降低发酵质量，另一方面大大增加发酵成本。
近年来在生物工程领域迅速发展起来的甲醇酵母Pichia pastoris最早是用于生产单细胞蛋白的，相比较于传统的酿酒酵母，Pichia pastoris具有：(1)在基本盐培养基中能高密度生长，并实现高的生物累积量。大规模发酵可达到极高的细胞密度(＞130g/L的细胞干重)和生物转化率(12g干细胞/L·h)。(2)具有强力而又严紧调控的启动子，能精确控制外源基因的表达。(3)表达菌株比较稳定，表达质粒不易丢失。这些特性，尤其是高密度生长使得它具备以极低的成本生产细胞内中间代谢产物。然而野生型甲醇酵母细胞内的SAM含量极低。基因工程技术的发展和代谢途径研究的进展，使得有目的地改造细胞成为可能。
在生物体的硫代谢网络中，SAM的生物合成是由底物L-Met和ATP经SAM合成酶[EC 2.5.1.6]催化合成。S.cerevisiae细胞中有两种SAM合成酶的同功酶即SAM合成酶1和SAM合成酶2，两者的氨基酸序列的一致性高达92％。SAM合成酶1负责合成细胞内的大部分SAM，但SAM合成酶1表现出较强的产物抑制现象，在过量Met存在下，它的转录受到抑制；而SAM合成酶2则表现出不同的调控方式，它的转录不受Met的抑制，在细胞生长到稳定期前，基因编码的SAM合成酶2量随生长而增加(ThomasD et al.Mol Gen Genet，1991，226：224～232)。我们相信构建重组表达S.cerevisiae来源的SAM合成酶2的甲醇酵母Pichia pastoris基因工程菌，有利于发酵生产SAM。
在关于Pichia pastoris现有的报道中，在表达外源蛋白质时，醇氧化酶1(AOX1)启动子是使用最多，表达效率较高的一个，许多蛋白质得到了成功表达(Joan L C，James M C.FEMS Microbiology Reviews，2000，24：45～66)。
根据上述技术思路，中国科学院上海生物化学研究所袁中一、李东阳和吉鑫松提供了一种生产腺苷甲硫氨酸的方法，该方法已经申请了中国专利，专利申请号为01132379.5，申请日为2001年11月30日。该发明利用甲醇酵母为宿主菌，通过克隆已知的酿酒酵母的SAM合成酶2基因，将此酶基因装配入甲醇酵母的表达载体，并置于AOX1启动子调控下，此质粒经过线性化后，转化入甲醇酵母细胞，得到了转化子。该方法利用得到的重组菌先经在甘油中生长，再经甲醇诱导表达生产SAM。
但AOX1表达系统由于甲醇对细胞的毒性和甘油对甲醇诱导的抑制等原因，在发酵罐中必须先经1-2天的甘油生长期(见该申请的实施例6)，随后限量补加甘油使细胞生长到合适的密度，最后才添加甲醇开始诱导表达，整个周期长达7-12天，这种诱导表达的方法，一方面条件较难控制，容易染菌；另一方面发酵后期发酵质量比较差，而且生产成本相应比较高。发酵8天SAM产量达到1.72g/l。
而甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子尽管最近才被报道，但由于其发酵条件比较简单，无需诱导，可以组成型表达外源蛋白使得发酵周期比较短等优点，越来越受到关注，对于大规模工业化生产，尤为有利(Hans RWaterham et al.Gene，1997，186：37～44)。而且GAP调控下的外源基因的表达，只需用甘油等廉价碳源作唯一碳源，大大降低生产成本。
本发明是对中国科学院上海生物化学研究所01132379.5专利申请的改进，首次将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae来源的SAM合成酶2基因置于GAP启动子调控下，整合重组于甲醇酵母Pichia pastoris，用此组成型表达的基因工程菌发酵生产SAM。以期提供一种既高产又条件简单、成本低而适合工业化应用的发酵生产SAM的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、周期短、高产、低成本发酵生产腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)的方法。
本发明根据GeneBank中的S.cerevisiae来源的SAM合成酶2基因(登录M23368)，设计两条专一引物，PCR扩增得到此酶基因。将克隆得到的来源于酿酒酵母的SAM合成酶2基因装配入甲醇酵母的表达载体pGAPZαA中，得到表达质粒pGAPZαA-SAM2，使得SAM合成酶2基因置于启动子GAP的控制下。
以上得到的表达质粒经过线性化后，通过原生质体或电转化的方法转化入甲醇酵母Pichia pastoris宿主细胞GS115。该表达质粒中的启动子序列或3’末端序列通过与Pichia pastoris染色体DNA同源重组，使得外源的SAM合成酶2基因整合入酵母染色体中，并在重组细胞内稳定地得到表达。这种整合于染色体的重组表达方式比单独复制的质粒表达形式的稳定性强，Ohi的实验表明此类重组菌即使经过83代的连续传代后，染色体组型和蛋白表达量都没有明显的变化(H Ohi.yeast，1998，14：895～903)。
由于整合入酵母中的表达质粒含有Zeocin抗性基因，使得重组甲醇酵母细胞能在含有一定Zeocin浓度的抗性平板上生长。我们就很方便的利用抗性筛选到阳性克隆细胞。
为筛选出高表达的本发明工程菌，将不同菌株在含有适量甲硫氨酸的发酵培养基中培养，细胞可以利用培养基中的甲硫氨酸做底物在SAM合成酶2的催化下，在细胞内合成并累积SAM。根据表达量高低筛选得到一株高产菌株。该菌株已于2002年6月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.0746，分类命名为Pichiapastoris。
对此高产工程菌发酵条件进行优化，结果显示，碳源、pH和溶氧对SAM的累积影响较大。以甘油作为碳源，外加一定量甲硫氨酸，并在发酵过程中补加一定量的甘油，发酵4天SAM产量达到2.2g/L，相比较于空载对照菌产量提高了100多倍。
利用本发明的方法发酵生产SAM，产量高于国内外相关专利和文献的报道。并且此方法发酵条件简单、高产、成本低，适合于工业化生产。
本发明的效果：
本发明一方面克服了现有的生产SAM的方法中，酿酒酵母细胞内SAM含量很高但单位发酵体积中菌体产出SAM很低的缺点。利用甲醇酵母具有的能在基本盐培养基中高密度生长，并实现高的生物累积量，大规模发酵可得到极高的细胞密度和生物转化率的特点，将来源于酿酒酵母的SAM合成酶2基因置于启动子GAP的调控下，在甲醇酵母细胞内重组表达，使细胞内合成并累积大量的SAM。
另一方面，GAP调控下的外源SAM合成酶2基因在P.pastoris中是组成型表达，不需要诱导，而且，只用廉价的甘油作为碳源，表达条件非常简单，发酵周期很短，产量稳定，这将大大降低生产成本。我们得到的重组菌，在优化了发酵条件后，发酵4天SAM产量就达到2.2g/L。体积产率达到0.55g/L/d。产量和产率高于国内外相关专利和文献的报道。申请号为01132379.5专利申请，发酵8天，SAM产量为1.72g/L，体积产率为0.22g/L/d。因此，利用本发明的方法发酵生产SAM，产量更高、成本更低，更加适合于工业化生产。
附图说明
图1为重组表达质粒的示意图。
图2为重组菌的SAM生产曲线。
具体实施方式
实验材料和方法：
1.菌株和试剂
P.pastoris宿主菌GS115(his4)、酵母表达质粒pGAPZαA均为Invitrogen公司产品。克隆质粒pUCm-T载体为本室保存(用作T载体)。E.coli菌株TG1用以进行克隆步骤。
所用的T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和限制性内切酶均购自Takara公司。胶回收试剂盒购自上海正谷生物公司。其它所有试剂均为国产或进口分析纯试剂。
2.培养基
YPDS/Zeocin(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂，1mol/L山梨醇，100mg/L Zeocin)，YPD(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)，发酵培养基A(10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，0.05mol/L磷酸钾缓冲液pH 6.0，13.4g/L YNB，4×10-4g/L生物素，30g/L甘油)，发酵培养基B(10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，0.05mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，13.4g/L YNB，4×10-4g/L生物素，30g/L甘油，0.05mol/L L-甲硫氨酸)
3、常规分子生物学操作
S.cerevisiae基因组DNA的抽提，基因克隆按奥斯伯等的方法(奥斯伯等.1995，精编分子生物学实验指南，第三版)进行。
本发明可以通过下述实施例进一步阐明：
实施例1 甲醇酵母重组表达SAM合成酶2质粒pGAPZαA-SAM2的构建
1、引物设计及PCR反应
根据GeneBank中的S.cerevisiae来源的SAM合成酶2基因(登录号M23368)，设计两条专一引物：
5’primer TAT
TTCGAAACC
ATGGCCAAGAGCAAAACT
3’primer GCGGCCGC
GAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA
在设计基因5’端引物包含了核糖体结合位点，同时引入了一个NspV酶切位点。基因3’端引物包含了终止密码子TAG附近的序列，并引入了一个EcoRI酶切位点。
抽提S.cerevisiae基因组染色体总DNA(奥斯伯等.1995，精编分子生物学实验指南，第三版)，以S.cerevisiae染色体DNA为模板，加入一定量的引物、Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，进行PCR扩增，PCR反应条件如表1：
表1
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 起始变性 | 94℃ | 5min | 1 |
| 变性 | 94℃ | 30sec | 5 |
| 退火 | 42℃ | 30sec | |
| 延伸 | 72℃ | 3min | |
| 变性 | 94℃ | 30sec | 30 |
| 退火 | 55℃ | 1min | |
| 延伸 | 72℃ | 3min | |
| 最后延伸 | 72℃ | 10min | 1 |
2、PCR产物的克隆
PCR产物经1％琼脂糖电泳后，采用上海正谷生物公司DNA胶回收试剂盒回收1200bp大小的PCR扩增片段。为方便以后的操作，将回收的PCR产物亚克隆至pUCm-T载体。得到的质粒pUCm-SAM2，用NspV和EcoRI双酶将SAM2基因切出后，装配入甲醇酵母质粒pGAPZαA，得到表达质粒pGAPZαA-SAM2。
将获得的表达质粒pGAPZαA-SAM2(见附图1)经NspV和EcoRI双酶切与PCR扩增均能得到1200bp左右的片段，与理论SAM2基因一致。测序后表明其与GeneBank中发表的SAM2基因序列完全相同。
实施例2 表达外源SAM合成酶2的重组细胞的构建
1、电转化甲醇酵母细胞的制备
接种GS115于50ml YPD培养基，28～30℃培养至OD600为1.3～1.5，0～4℃，4000rpm离心10min，菌体沉淀分别用50ml冷冻无菌水、25ml冷冻无菌水和2ml 1M的冷冻山梨醇各洗一次，每次洗后均0～4℃，4000rpm离心10min并收集菌体，最后将离心的菌体细胞用100μl 1M冰冻的山梨醇重悬，即获得电击感受态细胞。
2、重组表达质粒pGAPZαA-SAM2电转化感受态酵母细胞
将构建好的重组表达质粒pGAPZαA-SAM2约10μg用AvrII酶切线性化，乙醇沉淀回收线性DNA并溶解于10μl无菌水中，同时将空载体pGAPZαA质粒用相同的酶切线性化并回收作为对照。将上述线性化DNA分别与80μl GS115电转化细胞混合，采用Bio-Rad电转化仪GenePulser电击转化，电转化条件为：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω。立即向电转化杯中加1ml 1M冰浴预冷的山梨醇，并将电转化产物分别转移到一无菌微量离心管中，28～30℃保温1h，加入0.5mlYPD培养基，28～30℃保温1.5h，6000rpm离心5min，用80μl上清重悬细胞，涂布于YPDS/Zeocin平板。28～30℃培养直到出现单菌落。
3、抗性菌株的复筛
从生长出菌落的YPDS/Zeocin平板上，用无菌牙签依次点接到新鲜的YPDS/Zeocin平板上，28～30℃培养直至出现单菌落。
实施例3 小量快速抽提细胞内SAM
已知细胞浓度的发酵液离心收集，加入等体积的20％高氯酸于4℃抽提一小时以上，12000rpm离心5分钟后，将上清用0.2μm的滤膜过滤，从中取20μl，上样HPLC定量SAM。
实施例4 SAM的高效液相色谱(HPLC)法定量
SAM分子中的硫原子带有正电荷，这个特性使得它可以用离子交换柱来分析检测。强阳离子型离子交换柱Hypercil 10 SCX(4.6×250mm)，流动相为：0.5M甲酸(pH4.0)，流速2.0ml/min，检测254nm的光密度。采用外标法，即根据不同浓度的SAM标准品的峰面积所做的标准曲线来定量。
实施例5 SAM合成酶活力的测定
在10mL发酵培养基A(10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，0.05mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，13.4g/L YNB，4×10-4g/L生物素，30g/L甘油)中28～30℃培养5天后，离心收集菌体(4000rpm×10min，4℃)，并用裂解缓冲液——50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，5％甘油(V/V)，5mM的巯基乙醇和1mM的EDTA(加入1mM的苯甲醚和1mM的PMSF作为蛋白酶抑制剂)，清洗一次。加入菌体一倍体积的酸洗玻璃珠和4倍体积的裂解缓冲液，用超声波(在最大输出，50％的工作周期)于0～4℃处理10分钟，裂解细胞。玻璃珠和细胞残片经0～4℃，10000rpm，离心15分钟除去。粗抽提液经0～4℃，12000rpm，离心30分钟后，保留上清。
设定1ml的反应混合物，其中含有20mM的L-甲硫氨酸，20mM的ATP，8mM的还原型谷胱甘肽，20mM的MgCl2，100mM的KCl，150mM的pH7.4的Tris-HCl和适量的细胞裂解液，在37℃温育60分钟。不加入L-甲硫氨酸的反应作为空白对照。反应结束后，加入1ml的20％高氯酸溶液终止，离心除去沉淀。所得上清通过HPLC分析SAM的含量。
经过5天的培养，测定重组菌的酶活力可达0.41克SAM/小时/升细胞裂解液，相比较于宿主菌GS115的小于0.01克SAM/小时/升细胞裂解液，活力至少提高了40多倍(表2)。可见，正是由于外源SAM合成酶2基因的表达，提高了重组菌SAM合成酶活力。
表2重组菌和野生菌细胞内SAM产量和SAM合成酶2活力的比较
野生菌 重组菌
SAM产量(克/升) ＜0.001 0.041
SAM合成酶活力(克SAM/小时/升细胞裂解液) ＜0.01 0.41
实施例6 重组菌发酵生产SAM
将筛选出的Pichia pastoris转化子接种3ml YPD试管，28～30℃300r/min培养过夜，以1％接种量接入含10mL发酵培养基B的50mL离心管中。28～30℃300r/min培养。从第48小时开始每24h补加甘油到0.1％，连续培养6天。SAM在重组菌内比较快地累积，96h即可达到2.2g/L，随后稍有下降，相比较于空载对照菌最高仅有的0.019g/L，产量提高了100多倍(见图2)。
Claims (4)
1.一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法，重组表达外源腺苷甲硫氨酸合成酶2的载体转化后获得表达质粒，表达质粒经过线性化以后转化入甲醇酵母Pichia pastoris宿主细胞GS115，利用表达质粒的Zeocin抗性筛选阳性克隆，然后在含有甲硫氨酸的发酵培养基中培养，可生成腺苷甲硫氨酸，其特征在于，该外源的腺苷甲硫氨酸合成酶2基因置于甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的调控下。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pGAPZαA，得到表达质粒pGAPZαA-SAM2。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在发酵培养基中，以甘油作碳源。
4.一种新的代谢工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组DNA上整合了甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控下的酿酒酵母来源的SAM合成酶2基因，其种属为Pichia pastoris，保藏号为CGMCC No.0746。
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Owner name: SHANGHAI INST. OF LIFE SCIENCE, CAS Free format text: FORMER OWNER: INSTITUTE OF BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Effective date: 20090619 |
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Effective date of registration: 20090619 Address after: No. 320, Yueyang Road, Shanghai Patentee after: Shanghai Institute of life Sciences, Chinese Academy of Sciences Address before: No. 320, Yueyang Road, Shanghai Patentee before: Inst. of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Research Academy of Life Scienc |
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Granted publication date: 20050302 Termination date: 20160614 |
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