CN102933715A - 从甘油生产3-羟基丙酸的新方法 - Google Patents

从甘油生产3-羟基丙酸的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从甘油中生产3-羟基丙酸的新方法，特别是涉及一种通过在含甘油的培养基中培养突变微生物来生产3-羟基丙酸的方法，所述突变微生物是通过扩增在能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物中的编码乙醛脱氢酶的基因而获得。本发明能够使甘油发酵在无需添加辅酶B12甚至在微厌氧或厌氧的条件下进行。因此，本发明对于大量生产3-羟基丙酸的生物学工艺开发来说将非常适用。

Description

从甘油生产3-羟基丙酸的新方法
技术领域
本发明涉及一种从甘油生产3-羟基丙酸的新方法，特别是涉及一种通过在含甘油的培养基中培养突变微生物来生产3-羟基丙酸的方法，所述突变微生物是通过扩增在能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物中的编码乙醛脱氢酶的基因而获得。 
背景技术
与乳酸和琥珀酸一同作为来自生物质平台的化学物质而受到关注的3-羟基丙酸可以用作制备1，3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酰胺、丙二酸或生物聚合物如聚羟基丙酸的原料。然而，生产大量3-羟基丙酸的技术研发十分重要。 
已知的用于生产3-羟基丙酸的化学方法包括：一种在钯催化剂存在的条件下从1，3-丙二醇生产3-羟基丙酸的方法(美国专利No.5,321,156)，一种在钯/铂催化剂存在的条件下从3-羟基丙醛生产3-羟基丙酸的方法(美国专利No.5,831,121)，一种利用离子交换树脂生产3-羟基丙酸的方法(日本专利公报No.2000-159724)以及一种在酸或碱催化剂存在的条件下从环氧化物衍生物生产3-羟基丙酸的方法(韩国专利No.10-0408806)。 
对于生物学方法，威斯康星大学的Suthers等人报道了一种利用重组大肠杆菌(E.coli)菌株从甘油生产3-羟基丙酸的方法，所述重组大肠杆菌过量表达源自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱氢酶基因和源自大肠杆菌或啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙醛脱氢酶基因(美国专利No.6,852,517)。近年来，Rathnasingh等人报道了一种从甘油生产提高产量的3-羟基丙酸的新型重组大肠杆菌菌株(Rathnasingh et al.，Biotechnol.Bineng.104：729-39.2009)。 
然而，利用重组大肠杆菌菌株从甘油生产3-羟基丙酸的方法的缺点在于，需要向培养基提供昂贵的腺苷钴胺辅酶(辅酶B12)以活化甘油脱氢酶。 
因而，本发明的发明者们为了获得无需昂贵的添加剂就能大量生产3-羟基 丙酸的方法而付出了大量的努力，结果发现，当乙醛脱氢酶基因在肺炎克雷伯菌中高表达时，可以高产量地生产3-羟基丙酸，并且不必添加辅酶12，由此获得了本发明。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种无需昂贵的添加剂而高产量地生产3-羟基丙酸的方法。 
为了达到上述目的，本发明提供了一种生产3-羟基丙酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在含甘油的培养基中培养突变微生物，由此产生3-羟基丙酸，所述突变微生物是通过扩增在能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物中的编码乙醛脱氢酶的基因而获得；以及(b)回收所产生的1，3-丙二醇。 
本发明还提供了一种用于生产3-羟基丙酸的方法，所述方法包括以下步骤：在含甘油的培养基中培养突变微生物，由此产生3-羟基丙酸，所述突变微生物是通过将编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因和编码乙醛脱氢酶的基因导入缺失甘油脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和甘油脱水酶激活因子II基因(DhaBA2)的肺炎克雷伯菌突变体(AK菌株)而获得，所述突变微生物能够利用甘油作为碳源生成3-羟基丙酸；以及回收所产生的1，3-丙二醇。 
本发明还提供了一种肺炎克雷伯菌突变体，其是通过扩增在能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物中的编码乙醛脱氢酶的基因而获得。 
附图简要说明 
图1示出通过液相色谱分析肺炎克雷伯菌Cu菌株的代谢产物的结果( 
Figure BDA00001771213600021
3-羟基丙酸； 
Figure BDA00001771213600022
1，3-丙二醇)。 
图2示出肺炎克雷伯菌中生产3-羟基丙酸和1，3-丙二醇的代谢途径。 
图3示出构建重组质粒pVOHK和pVOTHk的方法。 
图4示出构建重组质粒pVOT的方法。 
图5示出构建肺炎克雷伯菌AK突变菌株的方法。 
图6示出通过液相色谱分析来自肺炎克雷伯菌Cu的重组菌株的代谢产物结果( 
Figure BDA00001771213600031
3-羟基丙酸； 
Figure BDA00001771213600032
1，3-丙二醇)。 
图7示出通过液相色谱分析来自肺炎克雷伯菌AK的重组菌株的代谢产物结果( 
Figure BDA00001771213600033
3-羟基丙酸； 
Figure BDA00001771213600034
1，3-丙二醇)。 
图8示出在5L发酵罐中肺炎克雷伯菌AK-VOTHk菌株培养物的结果。 
最佳实施方式 
一方面，本发明致力于一种生产3-羟基丙酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在含甘油的培养基中培养突变微生物，由此产生3-羟基丙酸，所述突变微生物是通过扩增在能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物中的编码乙醛脱氢酶的基因而获得；以及(b)回收所产生的1，3-丙二醇。 
在本发明中，所述能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物为克雷伯菌属的微生物。 
在本发明中，所述能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物优选为克雷伯菌属的微生物，最优选为肺炎克雷伯菌。 
在本发明的一个实施例中，首次发现肺炎克雷伯菌可从甘油生产3-羟基丙酸。为了提高所述肺炎克雷伯菌菌株生产3-羟基丙酸的能力，通过在经基因重组的肺炎克雷伯菌菌株中过表达编码乙醛脱氢酶的基因来构建所述重组菌株，该菌株可以从3-羟基丙醛产生3-羟基丙酸。结果发现，该重组菌株生产3-羟基丙酸的产量比野生型菌株高七倍。 
在本发明中，步骤(a)中的培养基不含辅酶B12。 
在本发明中，能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物是其中甘油氧化途径被阻断的微生物。 
甘油氧化途径被阻断的微生物是肺炎克雷伯菌AK菌株(KCTC11419BP)。 
另一方面，本发明致力于一种生产3-羟基丙酸的方法，所述方法包括以下步骤：在含甘油的培养基中培养突变微生物，所述突变微生物是通过将编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因和编码乙醛脱氢酶的基因导入缺失甘油脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT) 和甘油脱水酶激活因子II基因(DhaBA2)的肺炎克雷伯菌突变体(AK菌株)而获得，所述突变微生物能够利用甘油作为碳源生成3-羟基丙酸，由此产生3-羟基丙酸；以及回收所产生的1，3-丙二醇。 
在又另一方面，本发明致力于一种肺炎克雷伯菌突变体，其是通过扩增在能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物中的编码乙醛脱氢酶的基因而获得。 
在本发明中，所述突变体中的甘油氧化途径被阻断。 
在本发明中，所述突变体为肺炎克雷伯菌AK-VOTHk(KCTC 11569BP)。 
在本发明中，从突变体培养肉汤中回收3-羟基丙酸可以利用常规的分离技术来实施，包括例如，蒸馏、电渗析、蒸发、色谱、溶剂萃取和反应萃取，这些技术可以组合使用来分离高度纯化的物质。 
本文所使用的措词基因“扩增”是指在个体染色体或者质粒中额外地引入基因以便能够备过量表达，措词基因“导入”是指利用重组载体将基因插入个体染色体中或者将基因转化到个体中。 
在本发明中，将基因插入细胞染色体中可以利用本领域已知的常规基因操作方法实施。例如，基因插入可以利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体或者非病毒载体来实施。 
实施例
下文中，将参照实施例来更加详细地说明本发明。显然，对于本领域普通技术人员而言，这些实施例仅仅是说明性的，而不被认为是限制本发明的范围。也即是说，以下步骤将描述为一个说明性的实施例，而并非限制本发明的范围。 
实施例1：从肺炎克雷伯菌菌株中生产3-羟基丙酸 
在50ml含葡萄糖或甘油作为单一碳源的培养基中培养通过从典型的甘油发酵微生物肺炎克雷伯菌中消除质粒而获得的肺炎克雷伯菌Cu菌株(一种消除了肺炎克雷伯菌MGH78578菌株(ATCC700721)中的质粒的菌株)，以120rpm的转速在37℃培养30小时，然后通过色谱分析所产生的3-羟基丙酸。该培养过程中使用的培养基具有以下成分： 
0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，其中补充20g/L甘油或葡萄糖，再补充2g/l(NH4)2SO4、0.2g/l MgSO4、0.002g/l CaCl22H2O、1g/l酵母提取物、1ml铁溶液[5g/l FeSO47H2O、4ml HCl(37％，w/v)]以及1ml痕量元素溶液[70mg/lZnCl2、100mg/l MnCl24H2O、60mg/l H3BO3、200mg/l CoCl24H2O、20mg/lCuCl22H2O、25mg/l NiCl26H2O、35mg/l Na2MoO42H2O、4ml HCl(37％，w/v)]。此外，向所述培养基中添加0.5mM IPTG和10μg/ml抗生素四环素。 
为了从肺炎克雷伯菌中消除质粒，将肺炎克雷伯菌MGH78578在不含抗生素的液体培养基中培养数次，再接种到含四环素或者不含四环素的培养基中。然后，从菌落中选出由于失去质粒DNA而在含四环素的培养基中不生长的菌落，命名为“肺炎克雷伯菌MGH78578Cu”。接着，通过色谱分析所产生的3-羟基丙酸。 
采用Aminex HPX-87H(Bio-Rad，300mm x 78mm)柱结合Agilent 1200系列折射率检测器(RID)来进行色谱。流动相采用0.5mM H2SO4(流动速率：0.8ml/min)，标准品采用市售可得的3-羟基丙酸(Tokyo Chemical Industry Co.，LTD)(图1第一段)。 
结果如图1所示，在含葡萄糖的培养基中培养的肺炎克雷伯菌没有产生3-羟基丙酸，而在含甘油(0.2g/L)的培养基中产生了3-羟基丙酸。此外，在含甘油的培养基中产生了1，3-丙二醇。 
由上述结果可以推导出肺炎克雷伯菌从甘油产生3-羟基丙酸的代谢途径，如图2所示。 
实施例2：适用于从甘油生产3-羟基丙酸的肺炎克雷伯菌重组菌株的产生 
(1)过量表达乙醛脱氢酶基因的质粒的构建 
如图2所示，据信乙醛脱氢酶参与肺炎克雷伯菌从甘油产生3-羟基丙酸。因此，构建了用于在肺炎克雷伯菌中过量表达乙醛脱氢酶的质粒。 
具体而言，采用所述菌株的染色体DNA作为模板与以下引物序列来扩增乙醛脱氢酶(AldHk)基因(GenBank数据库No.ABR76453)，然后将扩增的DNA克隆到pGEM TEasy载体中并测序。接着，如图3所示构建质粒DNA： 
SEQ ID NO：1：5′-TCTAGAATGATGAATTTTCAGCACC-3′(AldHk-F) 
SEQ ID NO：2：5′-GGATCCGTTAACTCAAGACTCCAGGGCAATCC-3′(AldHk-R) 
如图3所示，肺炎克雷伯菌的乙醛脱氢酶AldHk基因被导入lacZ启动子的下游，然后插入含DhaB活化酶基因(dhaT)的质粒中，或者插入含DhaB活化酶基因和1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)的质粒中，从而构建含乙醛脱氢酶基因的质粒pVOHk和含乙醛脱氢酶基因和DhaB活化酶基因的质粒pVOTHk。 
图4示出了用于构建包含DhaB活化酶基因的质粒(pVO)或者包含DhaB活化酶基因和1，3-丙二醇氧化还原酶基因的质粒DNA(pVOT)的方法。所述质粒pVOT被导入肺炎克雷伯菌中并命名为“肺炎克雷伯菌AK-VOT”。该重组菌株保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)的生物资源中心，保藏号为KCTC 11421BP。 
(2)甘油氧化还原途径被阻断的肺炎克雷伯菌重组菌株的构建 
采用质粒DNA消除的肺炎克雷伯菌MGH78578菌株(名为“Cu”)作为亲本菌株，通过同源重组方法用阿普拉霉素抗性基因取代DhaB酶活化基因、DhaT基因、DhaR调控子和dha调控子的DhaD基因(FIG.5)，由此制备甘油氧化和还原途径均缺失的重组菌株(下称“AK”菌株)。 
采用肺炎克雷伯菌MGH78578菌株的染色体DNA作为模板以及以下引物对，通过PCR扩增用于制备同源重组用质粒的DNA片段： 
用于扩增dhaBI基因片段的引物： 
SEQ ID NO：3：5′-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3′(dhaBI XbaI-480bpF) 
SEQ ID NO：4：5′-GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3′(dhaBI BamHI-480bpR) 
用于扩增dhaK基因片段的引物： 
SEQ ID NO：5：5′-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3′(dhaK HindIII-200-700bpF) 
SEQ ID NO：6：5′-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3′(dhaK BglII-200-700bpR) 
用于扩增dhaR基因片段的引物： 
SEQ ID NO：7：5′-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3′(dhaR bglII-200-700bpF) 
SEQ ID NO：8：5′-AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3′(dhaR  HindIII-200-700bpR ) 
用于扩增Apr基因片段的引物： 
SEQ ID NO：9：5′-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3′Apr HpaI F 
SEQ ID NO：10：5′-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3′Apr HindIII-BglIIR 
将扩增的DNA片段克隆到pGEM TEasy载体中并测序。然后，如图5中所示，利用所述载体构建质粒DNA。 
在图5所示的方法中，构建了用于制备AK菌株的质粒DNA，其包括DhaB基因氨基末端(dhaB′)-LacZ启动子(PlacZ)-阿普拉霉素抗性基因-DhaK基因氨基末端(dhaK′)连接。 
用BamHI-BglII处理所述质粒，并将收集的DNA片段通过电穿孔法导入所述肺炎克雷伯菌Cu菌株中。接着，将在补充有阿普拉霉素的培养基中形成菌落的重组菌株从所述Cu菌株细胞中分离出来。结果获得了缺失DhaB酶活化基因、DhaT基因、DhaR调控子和dha调控子的DhaD基因并插入lacZ启动子和阿普拉霉素抗性基因的重组肺炎克雷伯菌AK菌株(KCTC 11419BP)。 
(3)在甘油厌氧代谢途径被阻断的突变菌株中过量表达乙醛脱氢酶基因 
将含有乙醛脱氢酶基因的质粒pVOHk和含有乙醛脱氢酶基因与DhaB活化酶基因的质粒pVOTHk分别通过电穿孔法导入所述肺炎克雷伯菌Cu和AK菌株的每个当中。作为对照，使用含有DhaB活化酶基因的质粒DNA或者含有DhaB活化酶基因和1，3-丙二醇氧化还原酶基因的质粒DNA。在本实施例中构建的重组菌株AK-VOTHk保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的生物资源中心，保藏号为KCTC 11569BP。 
【表1】 
本发明中使用或构建的重组菌株和质粒DNA 
Figure BDA00001771213600071
Figure BDA00001771213600081
将实施例2中制备的重组菌株各在与实施例1相同的培养基条件(碳源：甘油)下以120rpm的转速在37℃培养，并在与实施例1相同的条件下分析培养肉汤中的代谢产物。 
结果表明，培养了20小时的来自所述肺炎克雷伯菌Cu的重组菌株产生了1，3-丙二醇和3-羟基丙酸，同时完全消耗了所添加的甘油，但3-羟基丙酸的产量并没有由于乙醛脱氢酶alkHk基因的高表达而受到实质性的影响(图6和表2)。同时观察到，其中甘油氧化途径被阻断的来自突变体菌株AK的重组菌株中的3-羟基丙酸的产量明显提高(图7)。在所述AK-pVOTHk菌株中的3-羟基丙酸的产量至少比CU菌株中高7倍(表3)。 
【表2】 
来自肺炎克雷伯菌Cu的重组菌株通过烧瓶培养产生的代谢产物含量 
 代谢产物(g/L)   Cu/pVO   Cu/pVOHk   Cu/pVOTHk   Cu/pVOT
 剩余甘油   0   0   0   0
 1，3-丙二醇   7.96   7.80   7.85   7.67
 3-羟基丙酸   0.28   0.16   0.29   0.21
 2，3-丁二醇   1.34   1.19   1.28   1.20
 乙醇   0.14   0.50   0.23   0.43
 乳酸   0.17   0.18   0.17   0.17
 琥珀酸   0.55   0.58   0.56   0.54
 乙酸   1.68   1.77   1.97   1.77
【表3】 
来自肺炎克雷伯菌AK的重组菌株通过烧瓶培养产生的代谢产物含量 
 代谢产物(g/L)   AK/pVO   AK/pVOHk   AK/pVOTHk  AK/pVOT
[0083] 
  剩余甘油   14.85   8.65   0.15   1.48
  1，3-丙二醇   0.51   3.44   9.65   8.43
  3-羟基丙酸   0.25   0.52   2.07   0.57
  2，3-丁二醇   0   0   0   0
  乙醇   0   0   0   0
  乳酸   0.23   0.24   0.25   0.25
  琥珀酸   0.14   0.26   0.25   0.29
  乙酸   0.55   1.37   2.06   2.21
实施例3：通过厌氧培养肺炎克雷伯菌AK-VOTHk菌株从甘油生产3-羟基丙酸 
将肺炎克雷伯菌AK-VOTHk菌株在5L的发酵罐中培养，并检查菌株的生长程度。另外，通过色谱法分析在培养物上清液中残留的甘油量以及代谢产物产量，包括3-羟基丙酸和1，3-丙二醇。 
所述培养过程中使用的培养基具有以下组份： 
20g/l甘油、3.4g/l K2HPO4、1.3g/l KH2PO4、0.2g/l MgSO4、0.002g/lCaCl22H2O、1g/l酵母提取物、1ml铁离子溶液[5g/l FeSO47H2O、4ml HCl(37％，w/v)]以及1ml痕量元素溶液[70mg/l ZnCl2、100mg/l MnCl24H2O、60mg/l H3BO3、200mg/l CoCl24H2O、20mg/l CuCl22H2O、25mg/l NiCl26H2O、35mg/l Na2MoO42H2O、4ml HCl(37％，w/v)]。 
【表4】 
肺炎克雷伯菌AK-VOTHk重组菌株在5L发酵罐中产生的代谢产物含量 
  代谢产物(g/L)   3h   6h   9h   12h   15h   18h   21h   24h   30h   39h   45h
  剩余甘油   19.8   17.2   13.0   9.2   6.4   1.5   0   0   0   0   0
  1，3-丙二醇   0   2.0   3.8   5.8   7.0   9.2   8.9   8.7   8.3   8.1   8.1
  3-羟基丙酸   0   0.5   1.0   1.7   2.4   3.9   4.5   5.5   5.8   5.9   6.0
  2，3-丁二醇   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0
[0091] 
  乙醇   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0
  乳酸   0   0   0   0   0.1   0.2   0.2   0.2   0.2   0.2   0.3
  琥珀酸   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0
  乙酸   0   1.7   1.2   1.9   2.8   3.3   3.5   3.6   3.8   4.2   4.1
  3-HP/甘油(mol/mol)   0   0.18   0.15   0.16   0.18   0.21   0.25   0.30   0.32   0.33   0.33
  3-HP产率(g/Lh)   0.   0.08   0.11   0.14   0.16   0.21   0.21   0.23   0.19   0.15   0.13
所述培养过程在以下条件下实施：5L发酵罐的有效体积：2L，IPTG的最终浓度：0.5mM，四环素的最终浓度：10μg/L，接种浓度：1％，培养温度：37℃，搅拌速率：200rpm以及通气率：0.5vvm。 
结果如图8所示，所述菌株在培养了21小时时完全消耗了甘油，其中3-羟基丙酸的产量、转化率和产率分别为4.5g/L、0.25(mol/mo1)和0.21g/Lh。甚至在所添加的甘油完全被消耗后，3-羟基丙酸的产量还缓慢增加到6.0g/L水平，这种增加似乎有助于所产生的1，3-丙二醇转化为3-羟基丙酸。 
尽管本发明是参照所述具体特征来进行描述的，但对于本领域技术人员来说，显然这些描述仅针对优选的实施方式，而并非限制本发明的范围。因而，本发明的实质范围将通过所附权利要求及其等同方式来限定。 
工业实用性 
本发明能够使甘油发酵在无需添加辅酶B12甚至在微厌氧或厌氧的条件下进行。因此，预计本发明对于大量生产3-羟基丙酸的生物学工艺开发来说将非常适用。 
序列表文件 
作为附件提供。 
国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约  
国际表格
 原始保藏的受理 
根据7.1条签发
To：金哲镐 
韩国生命工学研究院 全北分院
大田市，儒城区，111Gwahangno，305-806
大韩民国
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Figure IDA00001771214600011
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Claims (9)

1.一种生产3-羟基丙酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在含甘油的培养基中培养突变微生物，由此产生3-羟基丙酸，所述突变微生物是通过扩增在能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物中的编码乙醛脱氢酶的基因而获得；以及
(b)回收所产生的1，3-丙二醇。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物为克雷伯菌属的微生物。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的培养基不含辅酶B12。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物是其中甘油氧化途径被阻断的微生物。
5.一种通过培养突变微生物来生产3-羟基丙酸的方法，所述突变微生物是通过将编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因和编码乙醛脱氢酶的基因导入缺失甘油脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和甘油脱水酶激活因子II基因(DhaBA2)的肺炎克雷伯菌突变体(AK菌株)而获得，所述突变微生物能够利用甘油作为碳源生成3-羟基丙酸，
所述方法包括以下步骤：
(a)在含甘油的培养基中培养所述突变微生物，由此产生3-羟基丙酸；以及
(b)回收所产生的1，3-丙二醇。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的所述培养基不含辅酶B12。
7.一种肺炎克雷伯菌突变体，其是通过扩增在能够利用甘油作为碳源生成辅酶B12并生成3-羟基丙酸的微生物中的编码乙醛脱氢酶的基因而获得。
8.如权利要求7所述的肺炎克雷伯菌突变体，其中甘油氧化途径被阻断。
9.如权利要求7所述的肺炎克雷伯菌突变体，其是肺炎克雷伯菌AK-VOTHk菌株(KCTC 11569BP)。
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