KR101871464B1 - 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 개량된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법 - Google Patents

글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 개량된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하여 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물에서, 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시키거나 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc) 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 과발현시킨 새로운 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법에 관한 것이다.

Description

글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 개량된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법 {Improved Microorganism Variants Having Ehtanol Producing Ability Using Glycerol or Crude Glycerol and Method for Producing Ethanol Using the Same}
본 발명은 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하여 에탄올 생성능이 증가된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고, 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물에서, 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시키거나 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc) 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 과발현시킴으로써 보다 향상된 에탄올 생성능을 보이는 새로운 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법에 관한 것이다.
현재, 바이오 디젤 제조 공정의 주된 부산물로서 전체 생산의 약 10%(w/w)에 해당하는 양의 폐글리세롤(crude glycerol)이 발생한다(Johnson and Taconi, 2007). 이러한 폐글리세롤은 기존의 전통적인 글리세롤 시장의 가격에 영향을 미칠 뿐 아니라, 직접 환경에 방출될 수 없기 때문에 처리 비용 등 중요한 환경 문제 요인으로 대두되고 있다(da Silva et al. 2009). 따라서 저가의 폐글리세롤을 이용하여 연료 및 생리 활성 물질을 포함한 산업적으로 가치 있는 물질로 전환하기 위한 방법의 개발이 활발하게 진행 중이다.
글리세롤은 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 클로스트리듐 속(genus Clostridium), 엔테로박터 속(genus Enterobacter), 크렙시엘라 속(genus Klebsiella)을 포함하는 몇몇 박테리아에 의해 발효성 영양원으로 이용되어 프로판디올, 에탄올을 비롯한 다양한 화합물로 전환될 수 있다. 최근 곤잘레스 연구그룹은 전통적으로 글리세롤 비발효성 미생물로 알려져 있던 대장균의 혐기성 발효에 의해 글리세롤로부터 에탄올을 생산했다(Dharmadi et al. 2006; Gonzalez et al. 2008; Murarka et al. 2008). 옥수수 전분질 유래의 포도당으로부터 에탄올을 생산하는 가격과 비교해 글리세롤로부터 생산하는 가격이 40% 정도 낮은 수준이다(Yazdani and Gonzalez, 2007). 따라서 글리세롤로부터 에탄올 및 부산물의 효과적인 발효전환을 위한 미생물 균주의 대사공학 연구가 관심을 받고 있다(Yazdani and Gonzalez 2008; Durnin et al. 2009).
현재까지 보고된 글리세롤로부터 에탄올 발효생산 최고 수율은 크렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca)의 유가식 배양 공정에서 35시간 배양시간에 최대생산량이 19.5 g/L이며 그 시점의 생산성은 시간당 0.56 g/L 수준이다(Yang G et al.2007). 재조합 대장균을 이용한 발효 배양에서 글리세롤로부터 에탄올의 최대 발효생산량은 96시간 배양시 20.7 g/L이었으나, 시간당 생산성은 크렙시아아 옥시토카와 비교해 매우 훨씬 낮은 0.22 g/L이었다(Durnin et al. 2009).
이에, 본 발명자들은 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 이용하여 산업적으로 유용한 에탄올을 고효율로 생산하는 미생물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 감마선 조사에 의해 에탄올 고생성능을 가지게 된 변이 미생물에서 락테이트 디하이드로게네이즈 A 유전자를 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ 유전자를 과발현시킬 경우, 에탄올 생산능이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 감마선 조사에 의해 에탄올 고생성능을 가지게 된 변이 미생물에서 락테이트 디하이드로게네이즈 A 유전자를 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ 유전자를 과발현시켜 에탄올 생성능이 향상된 변이 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 이용한 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물 변이 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물에서, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 도입하여 과발현시킴으로써 에탄올 생성능을 보다 향상시킨 새로운 변이 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물에서, 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 도입하여 과발현시킴으로써 에탄올 생성능을 보다 향상시킨 새로운 변이 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 미생물에 감마선을 조사하여 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이시키는 단계; (b) 상기 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이되어 있는 미생물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 미생물에서 락테이트 하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 결실시키는 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 미생물에 감마선을 조사하여 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이시키는 단계; (b) 상기 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이되어 있는 미생물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 미생물에서 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 미생물에 감마선을 조사하여 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이시키는 단계; (b) 상기 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이되어 있는 미생물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 미생물에서 락테이트 하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이미생물을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 미생물에 감마선을 조사하고 특정 유전자를 결실 또는 과발현시킴으로써 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하여 에탄올을 고효율로 생산하는 변이 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 변이 미생물은 글리세롤 환원 대사경로의 대사산물의 생산이 거의 없을 뿐만 아니라, 바이오디젤 산업의 부산물인 폐글리세롤을 이용하여 고부가가치 산물인 에탄올을 고효율로 생산하여 산업적으로 유용하다.
도 1은 크렙시엘라 뉴모니아의 글리세롤 발효 대사경로를 나타낸 모식도이다.
도 2은 대조군과 본 발명에서 사용된 변이 미생물의 에탄올 생산을 나타낸 것이다((a) K. pneumoniae Cu 균주, (b) K. pneumoniae GEM167 균주).
도 3는 K. pneumoniae GEM167 변이균주의 pH에 따른 에탄올 생산을 나타낸 것이다.
도 4는 K. pneumoniae GEM167 변이균주의 공기주입량에 따른 에탄올 생산을 타낸 것이다.
도 5은 K. pneumoniae GEM167 변이균주의 순수 글리세롤을 이용한 유가식 배양에 의한 에탄올 생산을 나타낸 것이다.
도 6은 K. pneumoniae GEM167 변이균주의 폐글리세롤을 이용한 유가식 배양에 의한 에탄올 생산을 나타낸 것이다.
도 7은 K. pneumoniae GEM167ΔldhA 변이 균주의 제작방법(A) 및 ldhA 변이를 확인한 서던 하이브리다이제이션 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 8은 K. pneumoniae GEM167ΔldhA 변이균주의 유가식 배양에 의한 순수 글리세롤 발효 및 에탄올의 생산결과를 나타낸 것이다.
도 9는 K. pneumoniae GEM167 ΔldhA 변이균주의 유가식 배양에 의한 바이오디젤 폐글리세롤 발효 및 에탄올의 생산결과를 나타낸 것이다.
도 10은 K. pneumoniae GEM167 균주의 개량된 에탄올 생산 경로를 나타낸 것이다.
도 11은 K. pneumoniae GEM167/pBR-pdc-aldhⅡ 균주의 순수 글리세롤 (a) 혹은 폐글리세롤 (b) 유가식 배양과 에탄올 생산결과를 나타낸 것이다.
도 12는 K. pneumoniae GEM167 ΔldhA/pBR-pdc-aldhⅡ 균주의 순수 글리세롤 (a) 혹은 폐글리세롤 (b) 유가식 배양과 에탄올 생산결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 균주에 감마선을 조사하여 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물을 제조하고, 제조된 변이 미생물이 글리세롤 또는 폐글리세롤을 단일 탄소원으로 하여 에탄올을 고효율로 생산할 수 있는지를 확인하였다.
또한, 본 발명에서는 상기 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물에서 추가적으로 락테이트 하이드로게나아제 유전자를 결실시키는 것으로 에탄올 생산능을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
또한 본 발명에서는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물에서 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 과발현 시킴으로써 에탄올 생산능을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 감마선을 1kGy 선량으로 조사하여 미생물에 변이를 유발한 다음, 글리세롤을 단일 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하여 에탄올 생성량이 향상된 변이 미생물을 분리하였다. 변이 미생물의 대사산물 생성량을 비교해 본 결과, 대조군과 비교하여 글리세롤 환원 대사경로의 대사산물은 거의 생성하지 않으면서, 글리세롤 산화 대사경로의 대사산물의 생성량이 크게 증가하였고, 특히 에탄올 생산량이 대조군에 비해 8배 정도 증가함을 확인하였다.
상기의 변이 미생물이 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하여 에탄올이 고효율로 생성되는 것은, 글리세롤 발효성 미생물에 감마선을 조사한 결과, 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)를 코딩하는 유전자에 돌연변이가 발생함으로써 상기 유전자에 의해 코딩되는 효소 활성에 변화를 일으키거나 효소가 관여하는 생합성 경로의 일부 또는 상당부분에 변화가 유발되어 글리세롤이 고효율의 에탄올로 전환되는 것으로 추정할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 감마선을 조사한 변이 미생물의 효소활성을 측정한 결과, 글루코즈를 단일 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양한 경우에는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 크게 증가하지 않은 반면, 글리세롤을 단일 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양한 경우에는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성은 대조군과 비교하여 3배 정도 증가하였고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성은 대조군 보다 감소함을 확인하였다. 이 결과로부터, 변이 미생물의 효소활성의 변화는 글리세롤 발효 대사경로에 변화를 유발하여 글리세롤 산화 대사경로의 산물 생산을 증가시키고 특히 에탄올의 생산량을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
본 발명은 이와 같이 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물에서, 추가로 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시켜 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터의 에탄올 생성능을 더욱 향상시킨 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물을 이용하여, 글리세롤을 탄소원으로 에탄올을 생산하는 경우, 과량의 락테이트가 생성되는 것을 확인하고, 락테이트의 생성을 억제하기 위하여, 상기 변이 미생물에서 락테이트 디하이드로게나아제 A 효소의 활성을 감소시켰다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물 Klebsiella pneumoniae GEM167(기탁번호 KCTC11742BP)에서 락테이트 디하이드로게나아제 A 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시켰으며, 그 결과, 에탄올 생성량이 21.5g/L에서 28.9g/L으로 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일 양상은 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물 Klebsiella pneumoniae GEM167(기탁번호 KCTC11742BP)에서, 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시킨 변이미생물에 관한 것이다.
본 발명은, 다른 관점에서, 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물에서, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 도입하여 과발현시킴으로써 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터의 에탄올 생성능을 보다 향상시킨 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물을 이용하여, 글리세롤을 탄소원으로 알데하이드를 거쳐 에탄올을 생산하는 경로를 강화하기 위하여, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc) 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)의 효소 활성을 증가시켰다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는, 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물 Klebsiella pneumoniae GEM167(기탁번호 KCTC11742BP)에서 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시켰고, 그 결과, 에탄올 생성량이 21.5g/L에서 25g/L로 증가하는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 다른 양상은, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물 Klebsiella pneumoniae GEM167(기탁번호 KCTC11742BP)에서, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 도입하여 과발현시킨 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물에서, 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 도입하여 과발현시킴으로써, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터의 에탄올 생성능을 보다 향상시킨 새로운 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서는 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물을 이용하여, 락테이트의 생성을 억제하기 위하여, 상기 변이 미생물에서 락테이트 디하이드로게나아제 A 효소의 활성을 감소시키고, 글리세롤을 탄소원으로 알데하이드를 거쳐 에탄올을 생산하는 경로를 강화하기 위하여, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc) 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)의 효소 활성을 증가시켰다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는, 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되는 변이가 발생되어 있는 미생물 Klebsiella pneumoniae GEM167(기탁번호 KCTC11742BP)에서 락테이트 디하이드로게나아제 A 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시켰으며, 그 결과, 에탄올 생성량이 21.5g/L에서 31.0g/L로 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양상은, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물 Klebsiella pneumoniae GEM167(기탁번호 KCTC11742BP)에서, 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 도입하여 과발현시킨 변이 미생물에 관한 것이다
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모, 등일 수 있고, 바람직하게는 박테리아일 수 있다. 상기 박테리아는 예를 들면 크렙시엘라 속(genus Klebsiella), 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 클로스트리듐 속(genus Clostridium), 또는 엔테로박터 속(genus Enterobacter)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)이나, 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 사용할 수 있는 미생물이면 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, (a) 미생물에 감마선을 조사하여 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이시키는 단계; (b) 상기 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이되어 있는 미생물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 미생물에서 락테이트 하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 결실시키는 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 미생물에 감마선을 조사하여 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이시키는 단계; (b) 상기 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이되어 있는 미생물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 미생물에서 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 미생물에 감마선을 조사하여 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이시키는 단계; (b) 상기 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되도록 변이되어 있는 미생물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 미생물에서 락테이트 하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 감마선은 변이 미생물의 종류에 따라 적절한 선량으로 조사될 수 있으며, 예를 들면 0.1kGy∼10kGy 선량으로 조사될 수 있다. 바람직하게는 0.5kGy∼5kGy, 더욱 바람직하게는 0.5kGy∼3kGy, 가장 바람직하게는 1kGy 선량으로 조사될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 변이 미생물을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일실시예에서 K. pneumoniae GEM167 및 본 발명의 변이균주들의 에탄올 생산수율을 기존에 보고된 결과들과 비교한 결과, 표 10에서 나타낸 바와 같이, Pdc-AdhII 효소 유전자를 과발현한 K. pneumoniae GEM167 ΔldhA 균주에서 31g/L의 최대 에탄올 생산 수율을 보였으며, 이는 기존의 최대 생산량인 20.7 g/L (재조합 대장균)과 비교해 월등히 우수한 결과이다.
글리세롤로부터 에탄올을 생산하는 산업공정의 경우, 생산 수율이 40∼50 g/L 정도가 되면 경제성이 있는 것으로 전망되고 있다. 본 발명의 변이균주의 생산 수율을 고려할 때, 배양 공정의 최적화가 이루어진다면 상업적 가치가 매우 높은 것으로 판단된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, pH가 변이 미생물의 에탄올 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 배양액의 pH를 각기 달리하면서 변이 미생물을 배양하여 에탄올 생산량을 비교한 결과, pH 6과 pH 7의 중성조건에서 높은 에탄올 생산성을 나타냄을 확인하였고, 또한 공기주입량에 따른 변이 미생물의 에탄올 생산량을 분석한 결과, 0.1vvm, 0.5vvm으로 aereation 해 준 경우에 에탄올 생산량이 높게 나타남을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 변이 미생물의 배양 및 회수과정은 통상적으로 알려진 배양방법을 사용하여 수행될 수 있고, 본 발명의 실시예에서 사용된 특정 배지 및 특정 배양방법 이외에도 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용할 수 있고 다양한 방법을 사용할 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 글리세롤부터 에탄올 생산이 향상된 변이균주의 제조
크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae) Cu 균주를 50 ml 플라스크 배양하여 OD600nm가 0.4~0.6일때 균체를 회수하여 PBS buffer (8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 in 1 L of distilled H2O, pH 7.4)에 현탁하여 감마선을 1kGy 조건에서 조사한 후 사멸율이 약 99%일 때, 현탁한 균체를 적당히 멸균수로 희석하여 LB 배지에 도말하였다. 총 26,000개의 콜로니를 확보한 후 유일 탄소원으로 글리세롤을 포함하는 배지 [0.1 M 포타슘포스페이트 버퍼(pH 7.0) 1 L에 20 g/L 글리세롤을 첨가한 후, 2 g/L (NH4)2SO4, 0.2 g/L MgSO4, 0.002 g/L CaCl22H2O, 1 g/L 효모추출물, 1 ml 철 용액 (5 g/L FeSO47H2O), 4 ml HCl (37%, w/v), 1 ml 미량원소용액 (70 mg/L ZnCl2, 100 mg/L MnCl24H2O, 60 mg/L H3BO3, 200 mg/L CoCl24H2O, 20 mg/L CuCl2H2O, 25 mg/L NiCl26H2O, 35 mg/L Na2MoO42H2O, 4 ml HCl (37%, w/v))]를 사용하여 37℃에서 120 rpm으로 배양하여 균주의 증식 정도를 조사하고, 동시에 배양 상등액의 글리세롤 잔존량과 에탄올을 비롯한 대사산물들의 생성량을 액체크로마토그래피법으로 분석하여 에탄올의 생성량이 향상된 변이균주를 분리하였다. 시험관 배양을 통하여 선별된 변이균주를 5L 발효조를 이용하여 상기의 배지 2L를 사용하여, 배양온도 37℃, 교반속도 200 rpm, 공기주입속도 0.5 vvm으로 배양하여 대조구인 Cu 균주와 비교하였다.
그 결과, 대조구와 비교하여 변이 균주에서는 글리세롤 환원 대사경로의 대사산물인 1,3-프로판디올과 3-하이드록시프로피온산은 거의 생성되지 않고, 글리세롤 산화 대사경로의 대사물질들의 생성량이 대조구에 비해 크게 증가하는 것으로 나타났다. 특히 에탄올의 생산량이 1.1 g/L에서 약 8배 증가한 8.6 g/L로 월등히 높은 에탄올 생산량(고생성능)을 나타내었다(도 2, 표 1).
K. pneumoniae Cu 균주와 GEM 167 변이균주의 대사물질 생성량 (g/L) 비교
Carbon source Strain 1,3-Propanediol 3-Hydroxypropionic acid Ethanol Lactic acid Succinic acid 2,3-
Butandiol		 Acetic acid
Glycerol K. pneumoniae Cu 7.93 1.0 1.1 0.5 0.5 0 3.5
K.
pneumoniae GEM 167		 0.2 0 8.6 1.4 0.7 0.35 1.0
Glucose K.
pneumoniae Cu		 0.15 0 1.9 0.5 0.4 0.25 2.9
K. pneumoniae GEM 167 0.07 0 1.7 0.6 0.4 0.25 2.5
한편, 유일 탄소원으로 글리세롤 대신에 포도당을 포함하는 배지에서 동일한 조건으로 수행한 실험에서는 변이 균주는 대조구와 거의 유사한 대사물질 생성 특성를 보이는 것으로 나타났다. 글리세롤에 특이적으로 에탄올의 생성량이 향상된 상기의 변이 균주를 GEM167로 명명하고, 한국생명공학연구원 유전자은행에 KCTC 11742BP 수탁번호로 기탁하였다.
실시예 2: K. pneumoniae GEM167 변이균주의 효소활성 검증
실시예 1에서 제조한 변이 균주 K. pneumoniae GEM167의 효소활성을 측정하기 위하여, 유일 탄소원으로 글리세롤 혹은 글루코즈를 포함하는 상기 배지에서 동일하게 배양한 균체를 회수한 후, 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.5)로 세척한 후 다시 녹여 sonication법으로 분쇄하였다.
알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ (alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhII)의 효소활성을 측정하기 위한 효소 활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 glycine-KOH buffer (pH 9.0) (50 mM) 및 NAD+ (1 mM)를 첨가하여 제조되었고, 제조된 혼합액에 100 mM ethanol을 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 37℃에서 30분간 반응한 뒤 340 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Postma E. et al, Appl Environ Microbiol., 55: 468-477, 1989).
글리세롤 디히드라타제 (glycerol dehydratase, DhaB)의 효소활성을 측정하기 위한 효소 활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 최종 농도가 20mM이 되도록 glycerol을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응한 뒤, 최종 농도가 10mM이 되도록 vitamin B12를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응한다. 이후 1M citrate buffer(pH 3.6)를 넣고 MBTH 0.1%를 첨가하여, 100℃에서 10분간 반응한뒤 315 nm에서 흡광도를 측정하였다.
글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase, DhaD)의 효소활성을 측정하기 위한 효소 활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 glycine-KOH buffer (pH 9.0) (50 mM) 및 NAD+ (1 mM)를 첨가하여 제조되었고, 제조된 혼합액에 100 mM glycerol을 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 37℃에서 30분간 반응한 뒤 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1,3-프로판디올 옥시더리덕타제 (1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성을 측정하기 위한 효소 활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 glycine-KOH buffer (pH 9.0) (50 mM) 및 NAD+ (1 mM)를 첨가하여 제조되었고, 제조된 혼합액에 100 mM 1,3-propanediol을 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 37℃에서 30분간 반응한 뒤 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 글리세롤 배지에서 배양하였을 때 GEM 167 변이균주의 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ (alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhII) 효소활성이 대조구인 Cu 균주와 비교해 3배 이상 증가한 것으로 나타났다. 반면, 탄소원으로 글루코즈를 포함하는 배지에서 배양한 경우에는 글리세롤 배지와 달리, 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ (alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhII) 효소 활성의 증가량이 크지 않은 것으로 나타났다. 글리세롤 배지에서 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ (alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhII) 효소 활성의 두드러진 증가는 상기의 대사물질 생성량 분석과 일치하는 결과이다. 한편, GEM 167 변이 균주에서 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제 (1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT) 효소활성이 감소하는 것으로 나타났는데, 이는 변이 균주의 1,3-프로판디올 생산량 감소와 일치하는 결과이다.
K. pneumoniae Cu 균주와 GEM 167 변이균주의 효소활성(enzyme units)
Carbon source Strain DhaB DhaT DhaD AdhII
Glycerol K. pneumoniae Cu 0.15 0.31 2.5 0.6
K. pneumoniae GEM 167 0.25 0.21 2.9 1.9
Glucose K. pneumoniae Cu 0.26 0.22 1.08 0.41
K. pneumoniae GEM 167 0.27 0.19 1.22 0.74
효소활성 단위는 unit/g 단백질로 나타내었다.
실시예 3: pH에 따른 변이 균주의 에탄올 생산성 분석
pH가 변이 균주 K. pneumoniae GEM167의 에탄올 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 배양액의 pH를 각각 5, 6, 7 및 8로 조건을 달리하여 배양이 끝날 때까지 유지하면서 변이 균주의 에탄올 생산을 측정하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 중성 조건인 pH 6과 7에서 높은 에탄올 생산성을 나타냈으며, 특히 산성 조건인 pH 5에서는 균체 증식과 에탄올 생산성이 매우 좋지 않은 것으로 나타났다.
실시예 4: Aeration 정도에 따른 변이 균주의 에탄올 생산성 분석
aeration이 변이균주 K. pneumoniae GEM167의 에탄올 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, areation 조건을 각각 0.0 vvm, 0.1 vvm, 0.5 vvm, 1.0 vvm, 2.0 vvm 및 3.0 vvm으로 달리하여 배양하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, aeration을 전혀 하지 않은 0.0 vvm의 경우보다 0.1vvm, 0.5vvm으로 aeration해 준 경우에 에탄올 생산이 높게 나타남을 확인할 수 있었고, 즉, aeration을 적당하게 해주는 것이 에탄올 생성에 유리한 것을 나타내었다.
실시예 5: 변이균주의 글리세롤로부터 에탄올 생산성 분석
상기 실시예 1과 동일한 방법으로, areation를 0.5 vvm, pH를 6.8~7.2로 유지하면서 유가식 방법으로 GEM 167를 발효 배양하였다. 그 결과, 도 5와 표 3에 나타낸 바와 같이 23시간 배양시 에탄올의 최대 생산량 21.5 g/L, 시간당 생산량 0.93 g/L으로 현재까지 알려진 최고 수준의 매우 우수한 에탄올 생산량을 나타내었다.
유가식 방법에 의한 K. pneumoniae GEM 167 변이균주의 발효배양
구분 배양 23시간
1,3-Propanediol 0.45 g/L
3-Hydroxypropionic acid 0 g/L
Acetic acid 0.4 g/L
Lactic acid 11.5 g/L
Succinic acid 1.3 g/L
2,3-Butanediol 2.1 g/L
Ethanol 21.5 g/L
Productivity (Ethanol) 0.93 g/Lh
Molar yield (Ethanol/Glycerol) 0.62 mol/mol
실시예 6: 변이 균주의 폐글리세롤로부터 에탄올 생산성 분석
실시예 1과 동일한 방법으로, areation를 0.5 vvm, pH를 6.8~7.2로 유지하면서 유일 탄소원으로 바이오디젤 산업부산물인 폐글리세롤을 이용하여 GEM 167를 발효 배양하였다. 그 결과, 도 6와 표 4에 나타낸 바와 같이 23시간 배양시 에탄올의 최대 생산량은 19.9 g/L, 시간당 생산량은 0.87 g/L로 순수 글리세롤과 비슷한 에탄올 생산량을 보였다.
폐글리세롤을 이용한 K. pneumoniae GEM 167 변이균주의 발효배양
구분 배양 23시간
1,3-Propanediol 0.6 g/L
3-Hydroxypropionic acid 0 g/L
Acetic acid 0.2 g/L
Lactic acid 10.6 g/L
Succinic acid 0.7 g/L
2,3-Butanediol 1.8 g/L
Ethanol 19.9 g/L
Productivity (Ethanol) 0.87 g/Lh
Molar yield (Ethanol/Glycerol) 0.70 mol/mol
실시예 7: K. pneumoniae GEM167 변이균주의 개량: Lactate-deficient derivative의 제조
(1) K. pneumoniae GEM167ΔldhA 변이균주의 제조
표 3과 표 4에서 나타난 바와 같이, K. pneumoniae GEM167 변이균주의 글리세롤 발효 배양시에 에탄올은 에탄올 21.5 g/L가 생성되고, 락테이트는 11.5 g/L가 생산되어, 에탄올의 주요 경쟁 대사체는 락테이트(lactate)인 것을 확인할 수 있다.
따라서 GEM167 균주에서 락테이트의 생산을 억제한다면 에탄올의 생산량이 증가할 것으로 기대할 수 있으며, 이를 확인하기 위하여 GEM167 변이균주로부터 락테이트 결실 변이균주를 제조하여 글리세롤 발효 및 에탄올 생산 특성을 분석하였다.
락테이트 결핍 GEM167 변이균주 (GEM167 ΔldhA)의 제조 과정을 간략히 설명하면 다음과 같다. GEM167 균주의 염색체 상에서 락테이트 생산을 촉매하는 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A) 유전자 (ldhA)를 제거하기 위하여 ldhA 유전자의 상, 하류 염기서열 0.9 kb를 각각 P1, P2 프라이머 (상류) 혹은 P3, P4 프라이머 (하류)를 이용하여 증폭하여 연결한 다음, 사이에 항생제 apramycin 내성 유전자를 삽입하여 homologous recombination을 DNA 카세트를 제작하였다. 제작된 DNA 카세트 (ldhA 유전자 상류 염기서열-아프라마이신 내성 유전자-ldhA 유전자 하류 염기서열)를 전기충격법으로 K. pneumoniae GEM167 균주에 도입한 후, 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 DNA 카세트가 염색체 DNA에 삽입되어 아프라마이신 내성을 보이는 형질전환체를 분리하였다.
GEM167 ΔldhA 균주 제조에 사용한 primer 서열
구분 염기서열
P1 (ldhA 상류) 5-CAGCCAGACGGGAATAGCTT-3(서열번호 1)
P2 (ldhA 상류) 5-CGCCAATTTTCTGGTGCTTCAGATATCGCCTCAAGGTCGACGTTGTTAA-3(서열번호 2)
P3 (ldhA 하류) 5-TTAACAACGTCGACCTTGAGGCGATATCTGAAGCACCAGAAAATTGGCG-3(서열번호 3)
P4 (ldhA 하류) 5-AGCTCGATGGTTCGGCGATT-3(서열번호 4)
분리된 형질전환체들을 대상으로 DNA 카세트가 ldhA 유전자로 정확하게 삽입되었는지를 확인하기 위하여 서던 하이브리다이제이션(southern hybridization)을 실시하였다. 모균주인 GEM167 균주와 얻어진 형질전환체들의 염색체 DNA를 제한효소 MluI으로 처리한 후 ldhA 유전자의 하류 염기서열을 프로브로 사용하여 하이브리다이제이션을 수행한 결과, 예상한 대로 GEM167 균주에서는 3.2 kb의 DNA 단편이, 형질전환체들에서는 2.3 kb의 DNA 단편이 결합하는 것으로 나타났다(도 7). 한편, 아프라마이신 내성 유전자를 프로브로 사용하였을 때 형질전환체들에서 동일한 DNA 단편이 결합하는 것과 대조적으로 GEM167 균주에서는 결합 DNA 단편이 존재하지 않는 것으로 나타나 얻어진 형질전환체들은 염색체상의 ldhA 유전자가 아프라마이신 내성 유전자에 의해 정확하게 치환되었음을 확인하였다.
(2) 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A) 효소 활성 검증
글리세롤 혹은 글루코즈를 포함하는 실시예 1에서 사용한 배지에서 GEM167 ldhA 균주를 배양하여 락테이트 디하이드로게나아제 A 효소 단백질의 활성을 분석하였다. 회수한 배양 균체를 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5)로 세척하여 재현탁한 후 소니케이션법으로 분쇄하여 효소원으로 이용하였다. LdhA 효소활성을 측정하기 위한 효소 활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 glycine-KOH 버퍼(pH 9.0) (50mM) 및 NAD+ (1mM)를 첨가하여 제조하였고, 제조된 혼합액에 100 mM 락테이트를첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 37℃에서 30분간 반응한 뒤 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 표 6에서 나타난 바와 같이, GEM167ΔldhA 균주에서 락테이트 디하이드로게나아제 A 효소 활성이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
K. pneumoniae GEM167 및 GEM167ΔldhA 변이균주의 락테이트 디하이드로게나아제 A 활성
Strain LdhA activity (U/mg)
GEM167 0.99 ±0.02
GEM167 ΔldhA 0.08 ± 0.01
실시예 8: K. pneumoniae GEM167 ΔldhA 변이균주의 유가식 배양에 의한 에탄올 생산
5L 발효조에서 실시예 1에서 사용한 배지 2L를 사용하여, 배양온도 37℃, 교반속도 200rpm, 공기주입속도 0.5vvm, pH를 6.8~7.2로 유지하면서 K. pneumoniae GEM167 ΔldhA 변이균주를 유가식 방법으로 발효 배양하여 글리세롤 발효 및 에탄올 생산량을 분석하였다.
순수한 글리세롤을 영양원으로 이용하였을 때, 도 8 과 표 7(K. pneumoniae GEM167 ΔldhA 변이균주에 의한 순수 글리세롤 발효 배양)에 나타낸 바와 같이 GEM167 균주와 비교해 GEM167Δ ldhA에서 락테이트의 생성량이 11.5 g/L에서 1.4 g/L로 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 락테이트 생성량의 감소와 비례하여 에탄올의 최대 생산량 28.9 g/L, 시간당 생산량 1.2 g/L으로 크게 증가하였다.
Figure 112011068903620-pat00001
한편, 바이오디젤 산업부산물 폐글리세롤을 영양원으로 이용한 GEM 167 ΔldhA의 유가식 발효배양에서는 도 9에 나타난 바와 같이 순수 글리세롤과 거의 유사한 것으로 관찰되었다.
실시예 9: K. pneumoniae GEM167 변이균주의 개량: Pdc-aldhIⅡ 유전자의 과발현
(1) Zymomonas mobilils Pdc-aldhⅡ 유전자 과발현 벡터의 제작
실시예 8에서 확인한 바와 같이, K. pneumonae GEM167 균주에서 에탄올의 주요 경쟁 대사체인 락테이트의 생성을 촉매하는 LdhA 유전자의 제거에 의해 에탄올의 생성량은 크게 증가하는 것으로 확인되었다. GEM167 균주에서 에탄올의 생성량을 높이기 위한 두 번째 방법으로 Z. mobilis 유래의 에탄올 생산 효소인 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)와 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ) 유전자를 과발현시켜, 에탄올 생성 경로에서 피루베이트에서 아세트알데하이드로 전환되는 단계와 아세트알데하이드에서 에탄올로 전환되는 단계를 촉진시켰다 (도 10).
Pdc-AldhⅡ 효소 유전자 과발현 벡터의 제작과정을 간략히 설명하면 다음과 같다. 1.8kb의 Pdc 유전자와 1.15kb의 AldhII 유전자를 각각 Ppdc-F(5'-TCTAGAatgagttatactgtcggtacctatttagc-3'(서열번호 5); 이탤릭-XbaI 사이트), Ppdc-R (5'-CTCGAG CTGCAGctagaggagcttgttaacaggcttac-3'(서열번호 6); 이탤릭체-XhoI 사이트, 밑줄-PstI 사이트를 나타냄)와 PaldB-F (5'-AGATCTatggcttcttcaactttttatattcc-3'(서열번호 7); 이탤릭-BglII 사이트), PaldB-R (5'-CTCGAG TCTAGAttagaaagcgctcaggaagagtt-3'(서열번호 8); 이탤릭-XhoI사이트, 밑줄-XbaI 사이트를 나타냄) 프라이머를 이용하여 Z. mobilis 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭하였다. 또한 강력한 유전자 발현 프로모터인 lacZ 프로모터 서열 (P lacZ-aldB)를 PlacZ-aldB-F (5'-GAATTCagcgggcagtgagcgcaa-3'(서열번호 9); 이탤릭-EcoRI 사이트)와 PlacZ-aldB-R (5'-CTCAGA AGATCTagctgtttcctgtgtgaaattg-3(서열번호 10), 이탤릭-XhoI 사이트, 밑줄-BglII사이트) 프라이머로 사용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편들을 pGEM TEasy 벡터(Promega, 미국)로 클로닝한 후 염기서열 분석을 수행하여 유전자 증폭이 정확하게 이루어졌음을 확인하였다.
LacZ 프로모터 하류로 AldhⅡ, Pdc 유전자를 차례로 삽입하여 pGEM-P lacZ-aldB, pGEM-P lacZ-aldB-pdc.를 제작하였으며, 이후 P lacZ-aldB-pdc 카세트를 pBR322 벡터로 재삽입하여 pBR-aldB-pdc를 제작하여 전기충격법으로 K. pneumoniae Cu, GEM167, GEM167 ldhA 균주로 각각 도입하였다.
(2) Pdc-aldhⅡ 효소 활성 검증
재조합 균체들의 피루베이트 디카르복실레이즈(Pdc)와 알데하이드 디하이드로게네이즈(AldhⅡ) 효소 활성을 분석하였다. 배양 균체를 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5)로 세척하여 재현탁한 후, 소니케이션법으로 분쇄하여 효소원으로 이용하였다. Pdc 효소활성을 측정하기 위한 효소활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 imidazole hydrochloride 버퍼(pH 6.5) (40mM), MgCl2 (5mM), thiamine pyrophosphate (0.2mM) 및 NADH (0.15mM)을 첨가하고, 알콜 디하이드로게나아제 (Boehringer)가 88U가 되도록 첨가하여 제조하였다. 그 다음, 50 mM 피루베이트를 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 30℃에서 30분간 반응한 뒤 340nm에서 흡광도를 측정하였다. AldhⅡ 효소활성을 측정하기 위한 효소 활성분석 혼합액은 배양 균주 분쇄액에 glycine-KOH 버퍼(pH 9.0) (50mM) 및 NAD+ (1mM)를 첨가하여 제조하였고, 제조된 혼합액에 100mM 에탄올을 첨가하여 반응을 시작하였다. 반응은 30℃에서 30분간 반응한 뒤 340nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, pBR-aldB-pdc 플라스미드가 도입된 재조합 균체들에서 Pdc와 AldhⅡ 효소 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
K. pneumoniae 균주에서의 Pdc 및 AldhⅡ 효소활성
Pdc AldhⅡ
Cu 0.78 ±0.01 0.61 ±0.02
GEM167 1.45 ±0.03 1.92 ±0.02
GEM167 ΔldhA 1.39 ±0.01 1.79 ±0.01
GEM167/pBR-adhB-pdc 2.12 ±0.02 2.67 ±0.03
GEM167 ΔldhA/pBR-adhB-pdc 2.25 ±0.01 2.88 ±0.01
Enzyme activity (U/mg protein)
실시예 10: Pdc-AldhⅡ 과발현 K. pneumoniae 균주의 유가식 배양에 의한 에탄올 생산
5L 발효조에서 실시예 1에 기재된 배지 2L를 사용하여, 배양온도 37℃, 교반속도 200rpm, 공기주입속도 0.5vvm, pH를 6.8~7.2로 유지하면서 Pdc-AldhⅡ 효소 유전자를 과발현한 K. pneumoniae 변이 균주들을 유가식 방법으로 발효 배양하여 글리세롤 발효 및 에탄올 생산량을 분석하였으며, 그 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다. 표 9(Pdc-AldhⅡ 과발현 K. pneumoniae 재조합 균주에 의한 순수 글리세롤 발효 배양)에 보인 바와 같이, Pdc-AldhⅡ 유전자를 과발현시켰을 때, 에탄올의 생산량은 GEM167 균주와 GEM167ΔldhA 균주에서 각각 21.5g/L에서 25g/L로, 28.9g/L에서 31g/L로 증가하는 것으로 나타났다. 발효 배양 과정 중의 pBR-pdc-aldhⅡ 플라스미드의 안정성을 조사해 본 결과, 150 세대 이후에도 약 93%의 세포가 플라스미드를 보유하고 있는 것으로 확인되었다.
Figure 112018014149282-pat00015
실시예 11: K. pneumoniae 변이균주들의 에탄올 생산능 비교
상기 실시예에서 확인된 K. pneumoniae GEM167 및 이의 변이균주들의 에탄올 생산수율을 기존에 보고된 공지균주들의 결과들과 비교하였다.
표 10에서 나타낸 바와 같이, Pdc-AldhⅡ 효소 유전자를 과발현한 K. pneumoniae GEM167 ΔldhA 균주에서 31g/L의 최대 에탄올 생산 수율을 보였으며, 이는 기존의 최대 생산량인 20.7 g/L (재조합 대장균)과 비교해 월등히 우수한 결과이다. 글리세롤로부터 에탄올을 생산하는 산업공정의 경우, 생산 수율이 40~50 g/L 정도가 되면 경제성이 있는 것으로 전망되고 있다. 본 발명의 변이균주의 생산 수율을 고려할 때, 배양 공정의 최적화가 이루어진다면 상업적 가치가 매우 높은 것으로 판단된다.
공지 균주들의 글라이세롤로부터의 에탄올 생산능비교
균주명 배양방법 에탄올 생산 문헌
농도
g/l		 생산능
g/l/h
Enterobacter aerogenes Hu-101 Batch 10 0.83 Ito et al., J Biosci Bioeng, 100, 260, 2005
Escherichia coli EH05 Batch 20.7 0.22 Durnin et al., Biotechnol Bioeng, 103,148, 2009
Klebsiella oxytoca M5al Fed-batch 19.5 0.56 Yang et al., Appl Microbiol Biotechnol, 73, 1017, 2007
Klebsiella pneumoniae M5a1 Fed-batch 18 0.28 Cheng et al., Process Biochem, 42, 740, 2007
K. pneumoniae GEM167 Fed-batch 21.5 0.93 본 발명
K. pneumoniae GEM167/pBR-pdc-aldhⅡ Fed-batch 25.0 0.78 본 발명
K. pneumoniae GEM167 ΔldhA Fed-batch 28.9 0.81 본 발명
K. pneumoniae GEM167 ΔldhA/pBR-pdc-aldhⅡ Fed-batch 31.0 0.89 본 발명
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Institute of Bioscience and Biiotechnology <120> Improved Microorganism Variants Having Ehtanol Producing Ability Using Glycerol or Crude Glycerol and Method for Producing Ethanol Using the Same <130> P11-B152 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cagccagacg ggaatagctt 20 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgccaatttt ctggtgcttc agatatcgcc tcaaggtcga cgttgttaa 49 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttaacaacgt cgaccttgag gcgatatctg aagcaccaga aaattggcg 49 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agctcgatgg ttcggcgatt 20 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctagaatga gttatactgt cggtacctat ttag 34 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcgagctgc agctagagga gcttgttaac aggcttac 38 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agatctatgg cttcttcaac tttttatatt cc 32 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctcgagtcta gattagaaag cgctcaggaa gagtt 35 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gaattcagcg ggcagtgagc gcaa 24 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctcagaagat ctagctgttt cctgtgtgaa attg 34

Claims (25)

  1. 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 변이 미생물인 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) GEM167(기탁번호 KCTC11742BP)에서, 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시킨 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이미생물.
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  9. 알콜 디하이드로지네이즈 Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ, AdhⅡ)의 효소활성이 증가되어 있고 1,3-프로판디올 옥시더리덕타제(1,3-propanediol oxidoreductase, DhaT)의 효소활성이 감소되어 있는 변이 미생물인 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) GEM167(기탁번호 KCTC11742BP)에서, 락테이트 디하이드로게나아제 A(Lactate dehydrogenase A, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase, Pdc)를 코딩하는 유전자 및 알데하이드 디하이드로게나아제 Ⅱ(aldehyde dehydrogenase Ⅱ, AldhⅡ)를 코딩하는 유전자를 과발현시킨 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 변이 미생물.
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  25. 제1항 또는 제9항의 변이 미생물을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
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