KR101090362B1 - 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 새로운 방법 - Google Patents

글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 새로운 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리세롤을 이용하여 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 새로운 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 증폭시킨 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 코엔자임 B12를 추가할 필요가 없으며, microaerobic 혹은 aerobic 조건에서도 글리세롤의 발효가 가능하기 때문에 3-하이드록시프로피온산의 대량 생산을 위한 생물 공정 개발에 매우 적합할 것으로 판단된다.
3-하이드록시프로피온산, 글리세롤, 크렙시엘라 뉴모니아

Description

글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 새로운 방법{Novel Method for Preparing 3-Hydroxypropionic Acid from Glycerol}
본 발명은 글리세롤을 이용하여 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 새로운 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 증폭시킨 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid)은 젖산, 숙신산과 더불어 바이오매스 유래의 3대 플랫폼 화학원료로 주목을 받고 있는 물질로서, 1,3-프로판디올 (1,3-propanediol), 아크릴산 (acrylic acid), 아크릴아미드 (acrylamide), 말론산 (malonic acid), 바이오폴리머 (poly-hydroxypropionic acid)의 제조를 위한 원료로 활용이 가능하지만, 대량생산 기술의 개발이 매우 중요하다.
3-하이드록시프로피온산을 제조하기 위한 화학공정으로는 팔라듐 촉매를 이 용하여 1,3-프로판디올로부터 제조하는 방법(US5321156), 팔라듐, 백금 촉매를 이용하여 3-하이드록시프로피온알데히드로부터 제조하는 방법(US5831121), 이온교환수지를 이용하여 아크릴산으로부터 제조하는 방법(JP2000-159724), 산 혹은 염기 촉매를 이용하여 에폭사이드 유도체로부터 제조하는 방법(KR10-0408806) 등이 보고되어 있다.
생물학적 방법으로는 위스콘신 대학의 Suthers등이 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase)유전자와 대장균 혹은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 알데하이드 디하이드로게나아제(aldehyde dehydrogenase) 유전자를 과발현한 재조합 대장균을 이용하여 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 방법을 보고하였다(US 6852517). 최근에는 Rathnasingh 등이 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산 생산량이 향상된 새로운 재조합 대장균을 보고하였다 (Rathnasingh et al., Biotechnol. Bineng. 104:729-39. 2009).
그러나, 재조합 대장균을 이용하여 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 방법은 글리세롤 디하이드라타제 효소의 재활성화를 위해 필요한 보조효소인 고가의 adenosylcobalamine (코엔자임 B12)를 배양액에 공급해 주어야 하는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 고가의 첨가물을 필요로 하지 않으면서, 높은 생산성을 가지는 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 크렙시엘라 뉴모니아에서 알데히드 디하이드로게나제 유전자를 고발현시킬 경우, 코엔자임 12를 첨가하지 않아도, 높은 생산율로 3-하이드록시프로피온산을 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 고가의 첨가물을 필요로 하지 않으면서 높은 생산성을 가지는 3-하이드록시프로피온산의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 증폭시킨 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계.를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AK 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자 및 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산 생성능을 가지는 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체를 제공한다.
본 발명에 따르면, 코엔자임 B12를 추가할 필요가 없으며, microaerobic 혹은 aerobic 조건에서도 글리세롤의 발효가 가능하기 때문에 3-하이드록시프로피온산의 대량 생산을 위한 생물 공정 개발에 매우 적합할 것으로 판단된다.
일 관점에서, 본 발명은 a) 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 증폭시킨 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 크렙시엘 라(Klebsiella)속 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 크렙시엘라 속 미생물인것이 바람직하고, 크렙시엘라 뉴모니아인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서는, 크렙시엘라 뉴모니아가 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산한다는 것을 최초로 확인하였으며, 크렙시엘라 뉴모니아 균주의 3-하이드록시프로피온산의 생성능을 향상시키기 위하여, 3-하이드록시프로피온 알데하이드에서 3-하이드록시프로피온산을 생성시키는 알데히드 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자를 크렙시엘라 뉴모니아 균주에서 유전자 재조합을 통하여 과발현 시킨 재조합 균주를 제작하고, 상기 재조합 균주를 글리세롤 함유 배지에서 배양한 결과, 야생형 균주에 비하여 7배나 높은 수율로 3-하이드록시프로피온산을 생성시키는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, (a) 단계의 배지는 코엔자임 B12을 함유하지 않는 것을 특징으로 할 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로 하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 글리세롤 산화경로가 차단된 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 글리세롤 산화경로가 차단된 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아 AK 균주(KCTC11419BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AK 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자 및 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산 생성능을 가지는 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또다른 관점에서, 본 발명은 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체는 글리세롤 산화경로가 차단되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체는 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTHk(KCTC 11569BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체의 배양액으로부터의 3-하이드록시프로피온산의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그라피, 용매추출, 반응추출 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 물질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유전자의 "증폭"이란 개체의 염색체 상에 존재하거나, 플라스미드에 존재하는 유전자를 추가로 "도입"하여 과발현될 수 있도록 하는 것이며, 본 발명에서 유전자의 "도입"이란, 개체의 염색체 상에 유전자를 삽입시키거나, 재조합 벡터를 이용하여 유전자를 개체에 형질전환시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 유전자를 세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 크렙시엘라 뉴모니아 ( Klebsiella pneumoniae ) 균주에 의한 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산
전통적인 글리세롤 발효 미생물인 크렙시엘라 뉴모니아에서 플라스미드를 큐어링시킨 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 균주[크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주(ATCC 700721)로부터 플라스미드가 큐어링된 균주]를 글루코즈 혹은 글리세롤을 유일 탄 소원으로 포함하는 배지 50ml를 사용하여, 37℃에서 30시간, 120rpm으로 배양한 다음, 3-하이드록시프로피온산의 생산량을 크로마토그래피로 분석하였다.
사용된 배지의 조성은 다음과 같다:
0.1M 포타슘포스페이트 버퍼(pH 7.0)에 20g/L 글리세롤 혹은 글루코즈를 첨가한 후, 2g/l (NH4)2SO4, 0.2g/l MgSO4, 0.002g/l CaCl22H2O, 1g/l 효모추출물, 1ml 철 용액 [5g/l FeSO47H2O, 4ml HCl(37%,w/v)] 및 1ml 미량원소용액 [70mg/l ZnCl2, 100mg/l MnCl24H2O, 60mg/l H3BO3, 200mg/l CoCl24H2O, 20mg/l CuCl22H2O, 25mg/l NiCl26H2O, 35mg/l Na2MoO42H2O, 4ml HCl(37%,w/v)]을 첨가하였다. IPTG농도는 0.5mM로 하고 항생제는 테트라사이클린 10μg/ml으로 하였다.
크렙시엘라 뉴모니아에서 플라스미드를 큐어링시키는 방법으로는 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578을 항생제를 첨가하지 않은 액상 배지에서 수회 반복 배양한 후, 테트라사이클린이 첨가된 혹은 첨가되지 않은 배지에 접종하여, 플라스미드 DNA가 소실되어, 테트라사이클린이 첨가된 배지에서 증식하지 못하는 콜로니를 선별하여, 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 Cu라 명명한 후, 3-하이드록시프로피온산의 생산량을 확인하였다.
크로마토그래피는 Agilent 1200 (refactive index detector, RID)에 Aminex HPX-87H (Bio-Rad, 300 mm x 78 mm) 컬럼을 사용하였고 이동상은 0.5mM H2SO4 (유속 0.8 ml/min)를 사용하였으며, 표준물질은 시판 3-하이드록시프로피온산(Tokyo Chemical Industry Co., LTD)(도 1의 첫번째 그래프)을 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 글루코즈를 함유한 배지에서의 배양한 크렙시엘라 뉴모니아는 3-하이드록시프로피온산을 생성하지 않은 반면, 글리세롤을 함유한 배지에서는 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 것을 확인할 수 있었다 (0.2 g/L). 또한, 글리세롤 함유 배지에서는 1,3-프로판디올의 생산이 확인되었다.
상기의 결과로부터 도 2에 나타난 바와 같이 크렙시엘라 뉴모니아에서 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산을 위한 대사경로의 유추가 가능하다.
실시예 2. 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산에 적합한 크렙시엘라 뉴모니아( Klebsiella pneumoniae ) 재조합 균주의 개발
(1) 알데히드 디하이드로게나제 유전자 과발현 플라스미드의 제작
도 2에 나타난 바와같이, 크렙시엘라 뉴모니아 균주에서 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산에 관여하는 것으로 판단되는 알데히드 디아히드로게나제를 크렙시엘라 뉴모니아에서 과발현시키기 위한 플라스미드를 제작하였다.
알데히드 디아히드로게나제를 염색체 DNA를 주형으로 하여 하기의 프라이머 서열을 사용하여 알데히드 디하이드로게나제 (AldHk) 유전자 (GenBank database No. ABR76453)를 증폭한 후, pGEM TEasy 벡터로 클로닝하여 염기서열을 확인한 후 플라스미드 DNA를 제조하였다 (도 3).
서열번호 1 : 5'-TCTAGAATGATGAATTTTCAGCACC-3' (AldHk-F)
서열번호 2 : 5'-GGATCCGTTAACTCAAGACTCCAGGGCAATCC-3' (AldHk-R)
도 3에서 나타난 바와 같이, lacZ 프로모터 하류에 크렙시엘라 뉴모니아의 알데히드 디하이드로게나제 AldHk 유전자를 도입한 후, DhaB 재활성화 효소 유전자(dhaT)가 포함된 플라스미드 혹은 DhaB 재활성화 효소 유전자와 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 유전자 (DhaT)가 포함된 플라스미드에 삽입하여, 알데하이드 디하이드로게나아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pVOHk, 알데하이드 디하이드로게나아제 유전자 및 DhaB 재활성화 효소 유전자를 함유하는 플라스미드 pVOTHk를 제작하였다.
도 4는 DhaB 재활성화 효소 유전자가 포함된 플라스미드 (pVO) 혹은 DhaB 재활성화 효소 유전자와 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 유전자 (DhaT)가 플라스미드 DNA (pVOT)를 제작하는 과정을 나타낸 것이며, pVOT는 크렙시엘라 뉴모니아에 재조합하여, Klebsiella pneumoniae AK-VOT(KCTC11421BP)로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁하였다.
(2) 글리세롤 산화 환원경로가 결손된 크렙시엘라 뉴모니아 재조합 균주의 제작
플라스미드 DNA가 큐어링된 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주(Cu로 명명)를 모균주로 하여 상동성재조합 방법으로 dha 레귤론(도 5)의 한 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자, DhaR 조절인자 및 DhaD 유전자를 apramycin 내성 유전자로 치환하여 산화, 환원 경로가 모두 결손된 재조합 균주 AK를 제조하였다.
크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주의 염색체 DNA를 주형으로하여 상동성 재조합(homologous recombination) 용 플라스미드를 제조하기 위한 DNA 단편들을 하기의 프라이머 세트들을 사용하여 PCR로 증폭하였다.
dhaBI 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 3 : 5'-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3'(dhaBI XbaI-480bpF)
서열번호 4 : 5'-GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3'(dhaBI BamHI-480bpR)
dhaK 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 5 : 5'-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3'(dhaK HindIII-200-700 bpF)
서열번호 6 : 5'-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3'(dhaK BglII-200-700bpR)
dhaR 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 7 : 5'-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3'(dhaR bglII-200-700bpF)
서열번호 8 : 5'-AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3'(dhaR HindIII-200-700bpR)
Apr 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 9 : 5'-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3' Apr HpaI F
서열번호 10 : 5'-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3' Apr HindIII-BglIIR
증폭된 DNA 단편을 pGEM TEasy 벡터를 이용하여 클로닝하여 염기서열을 확인 한 후, 도 5에 나타낸 바와 같이 플라스미드 DNA를 제작하였다.
도 5에 나타낸 방법으로, AK 균주를 제조하기 위한 DhaB 유전자의 아미노 말단(dhaB')-LacZ promoter(PlacZ)-Apramycin 내성 유전자-DhaK 유전자의 아미노말단(dhaK')이 연결된 플라스미드 DNA를 제작하였다.
상기 플라스미드를 BamHI-BglII로 처리하여 회수한 DNA 단편을 전기충격법으로 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 균주에 도입한 후 apramycin이 첨가된 배지에서 콜로니를 형성하는 재조합 균주들을 분리하였다. 그 결과, dha 레귤론의 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자, DhaR 조절인자 및 DhaD 유전자가 제거되고 lacZ 프로모터와 apramycin 내성 유전자가 삽입된 재조합 균주 크렙시엘라 뉴모니아 AK 균주(KCTC11419BP)를 수득하였다.
(3) 글리세롤 혐기대사 산화경로가 차단된 변이주에서 알데히드 디하이드로게나제 유전자의 과발현
알데하이드 디하이드로게나아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pVOHk, 알데하이드 디하이드로게나아제 유전자 및 DhaB 재활성화 효소 유전자를 함유하는 플라스미드 pVOTHk 및 대조구로 DhaB 재활성화효소 유전자 혹은 DhaB 재활성화 효소 유전자와 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 효소 유전자를 포함하는 플라스미들 DNA를 전기 충격법으로 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 균주와 AK 균주로 도입하였다. 본 실시예에서 제작한 재조합 균주인 균주인 AK-VOTHk는 한국생명공학연구원 내 유전자 원센터에 기탁하였다 (KCTC 11569BP).
본 발명에서 이용되거나 제작한 재조합 균주와 플라스미드 DNA
Strains
E. coli DH5a Cloning Host
K. pneumoniae Cu TetR contained Plasmid DNA curing K. pneumoniae MGH 78578
K. pneumoniae AK (orfY-dhaT-orfW-orfX-dhaR-dhaD)::PLacZ-AprR
Plasmids
pV pBR322
pVO pBR322-PLacZorfW-orfX
pVOT pBR322-PLacZorfW-orfX-PLacZdhaT
pVOHk pBR322-PLacZorfW-orfX-PLacZaldHk
pVOTHk pBR322-PLacZorfW-orfX-PLacZaldHk-PLacZdhaT
실시예 2에서 제조된 재조합 균주들을 실시예 1과 같은 배지조건(탄소원은 글리세롤)으로 37℃, 120 rpm으로 배양하면서 배양액 중의 대사산물을 실시예 1과 같은 조건으로 분석하였다.
그 결과, 20시간 배양한 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 유래의 재조합균주들은 첨가해 준 글리세롤을 모두 소모하면서 1,3-프로판디올과 3-하이드록시프로피온산을 생산하였으나, 알데히드 디하이드로게나제 alkHk 유전자의 고발현에 의해 그 생산량은 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(도 6 및 표 2). 한편, 글리세롤 발효대사 산화경로가 차단된 변이주 AK 유래의 재조합 균주에서 3-하이드록시프로피온산 생산량은 현저히 증가하는 것으로 확인되었다(도 7). AK-pVOTHk 균주에서 3-하이드록시프로피온산의 생산량은 Cu 균주에 비해 7배 이상 증가하였다.(표 3).
Klebsiella pneumoniae Cu 유래 재조합 균주의 플라스크 배양을 통하여 생성된 대사물질의 함량
대사물질 (g/L) Cu/pVO Cu/pVOHk Cu/pVOTHk Cu/pVOT
잔존 글리세롤 0 0 0 0
1,3-프로판디올 7.96 7.80 7.85 7.67
3-하이드록시프로피온산 0.28 0.16 0.29 0.21
2,3-부탄디올 1.34 1.19 1.28 1.20
에탄올 0.14 0.50 0.23 0.43
젖산 0.17 0.18 0.17 0.17
숙신산 0.55 0.58 0.56 0.54
아세트산 1.68 1.77 1.97 1.77
Klebsiella pneumoniae AK 유래 재조합 균주의 플라스크 배양을 통하여 생성된 대사물질의 함량
대사물질 (g/L) AK/pVO AK/pVOHk AK/pVOTHk AK/pVOT
잔존 글리세롤 14.85 8.65 0.15 1.48
1,3-프로판디올 0.51 3.44 9.65 8.43
3-하이드록시프로피온산 0.25 0.52 2.07 0.57
2,3-부탄디올 0 0 0 0
에탄올 0 0 0 0
젖산 0.23 0.24 0.25 0.25
숙신산 0.14 0.26 0.25 0.29
아세트산 0.55 1.37 2.06 2.21
실시예 3. 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTHk 균주의 호기 배양을 통한 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산
5L 발효조를 이용하여 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTHk 균주의 증식 정도를 조사하고, 동시에 배양 상등액의 글리세롤의 잔존량과 3-하이드록시프로피온산, 1,3-프로판디올을 비롯한 대사산물들의 생성량을 크로마토그래피법으로 분석하였다.
배지조성은 다음과 같다:
20 g/l 글리세롤, 3.4g/l K2HPO4, 1.3g/l KH2PO4, 0.2g/l MgSO4, 0.002g/l CaCl22H2O, 1g/l 효모추출물, 1ml 철용액 [5g/l FeSO47H2O, 4ml HCl(37%,w/v)] 및 1ml 미량원소용액 [70mg/l ZnCl2, 100mg/l MnCl24H2O, 60mg/l H3BO3, 200mg/l CoCl24H2O, 20mg/l CuCl22H2O, 25mg/l NiCl26H2O, 35mg/l Na2MoO42H2O, 4ml HCl(37%,w/v)].
Klebsiella pneumoniae AK-VOTHk 재조합 균주의 5-L 발효조 배양을 통하여 생성된 대사물질의 함량
대사물질 (g/L) 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 30h 39h 45h
잔존 글리세롤 19.8 17.2 13.0 9.2 6.4 1.5 0 0 0 0 0
1,3-프로판디올 0 2.0 3.8 5.8 7.0 9.2 8.9 8.7 8.3 8.1 8.1
3-하이드록시프로피온산 0 0.5 1.0 1.7 2.4 3.9 4.5 5.5 5.8 5.9 6.0
2,3-부탄디올 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
에탄올 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
젖산 0 0 0 0 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3
숙신산 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
아세트산 0 1.7 1.2 1.9 2.8 3.3 3.5 3.6 3.8 4.2 4.1
3-HP/글리세롤 (mol/mol) 0 0.18 0.15 0.16 0.18 0.21 0.25 0.30 0.32 0.33 0.33
3-HP 생산성 (g/Lh) 0. 0.08 0.11 0.14 0.16 0.21 0.21 0.23 0.19 0.15 0.13
5L 발효조에 유효용적을 2L로하고, 최종농도가 IPTG 0.5 mM, 테트라사이클린 10μg/L으로 하였으며, 접종량 1%, 배양온도 37ㅀC, 교반속도 200 rpm, 공기 주입속도는 0.5 vvm으로 하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 배양 21 시간째에 글리세롤을 전부 소모하였으며 이때 3-하이드록시프로피온산의 생산량, 전환율 및 생산성은 각각 4.5 g/L, 0.25 (mol/mol), 0.21 g/Lh이었다. 첨가해준 글리세롤이 완전히 소모된 이후에도 3-하이드록시프로피온산의 생산량은 서서히 증가하여 최대 6.0 g/L수준에 달하였는데, 이는 생성된 1,3-프로판디올로부터 전환에 기인하는 것으로 보인다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 균주 대사산물의 액체크로마토그래피 분석결과를 나타낸 것이다(▽:3-하이드록시프로피온산; ▼:1, 3-프로판디올).
도 2는 크렙시엘라 뉴모니아의 3-하이드록시프로피온산 및 1, 3-프로판디올 생산 대사경로를 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 플라스미드 pVOHK 및 pVOTHk의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 플라스미드 pVOT의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 5는 크렙시엘라 뉴모니아 AK 변이균주의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 6은 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 유래 재조합 균주 대사산물의 액체크로마토그래피 분석결과를 나타낸 것이다(▽:3-하이드록시프로피온산; ▼:1, 3-프로판디올).
도 7은 크렙시엘라 뉴모니아 AK 유래 재조합 균주 대사산물의 액체크로마토그래피 분석결과를 나타낸 것이다(▽:3-하이드록시프로피온산; ▼:1, 3-프로판디올).
도 8은 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTHk 균주의 5L-발효조 배양결과를 나타낸 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechology <120> Novel Method for Preparing 3-Hydroxypropionic Acid from Glycerol <130> P09-B200 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tctagaatga tgaattttca gcacc 25 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggatccgtta actcaagact ccagggcaat cc 32 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tctagaatga aaagatcaaa acgattt 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggatccgtca gcggcaatct gcac 24 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aagcttcatg ctctccggcg cctgtc 26 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agatctattt ggtccagcga gctgaagc 28 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agatctcctg ggatttcgcg acggca 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aagctttcga caatcggttt taaggtg 27 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gttaacctga cgccgttgga tacacc 26 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agatctaaaa gcttatgagc tcagccaatc ga 32

Claims (9)

  1. 다음 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산의 제조방법:
    (a) 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자, 전사 활성인자 유전자 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자가 결실되어 글리세롤 산화경로가 차단되어 있고, 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 증폭된 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 크렙시엘라(Klebsiella)속인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (a) 단계의 배지에 코엔자임 B12을 첨가하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 다음 단계를 포함하는, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자 및 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산 생성능을 가지는 변이 미생물을 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법:
    (a) 글리세롤 함유 배지에서 상기 변이 미생물을 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, (a) 단계의 배지에 코엔자임 B12을 첨가하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 코엔자임 B12 생성능을 가지고, 글리세롤을 탄소원으로하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자, 전사 활성인자 유전자 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자가 결실되어 글리세롤 산화경로가 차단되어 있고, 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있는 변이 미생물.
  8. 삭제
  9. 크렙시엘라 뉴모니아 AK-VOTHk(KCTC 11569BP).
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