KR101577503B1

KR101577503B1 - １，３－프로판디올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 １，３－프로판디올의 생산 방법

Info

Publication number: KR101577503B1
Application number: KR1020130156803A
Authority: KR
Inventors: 양택호; 라트나싱
Original assignee: 지에스칼텍스 주식회사
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2015-12-14
Also published as: CN105829523A; KR20150069977A; US9932609B2; CN105829523B; WO2015093832A1; US20160319308A1

Abstract

본 발명은 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 재조합 미생물을 이용하여, 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에 대한 것이다.

Description

１，３－프로판디올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 １，３－프로판디올의 생산 방법 {RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED 1,3-PROPANEDIOL PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING 1,3-PROPANEDIOL USING THE SAME}

본 발명은 1,3-프로판디올 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법에 대한 것이다.

세 개의 탄소와 두 개의 하이드록시기(-OH)를 가지는 알코올의 하나(CH₂OHCH₂CH₂OH)인 1,3-프로판디올은 폴리에스테르나 폴리우레탄 등 고분자의 단량체로 사용 가능하며, 또한, 화장품 및 개인 위생용품 등의 성질개선 용도로의 첨가제로 사용 가능하다. 특히 1,3-프로판디올과 테레프탈릭산 (terephthalic acid)의 중합 반응에 의해 생성되는 직선성의 방향족 폴리에스터인 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (PTT, polytrimethylene terephthalate)는 semi-crystal 분자 구조 상에서 발생하는 킨크(kink)라 불리는 독특한 꼬임이 고분자 사슬 상에 존재하여 반방 탄성 및 형태 안정성이 우수하며, 이러한 구조적 특성으로 인해 섬유, 포장 및 필름, 부직포 구조물, 엔지니어링 플라스틱 등 폭넓고 다양한 분야에 적용이 가능하다.

1,3-프로판디올은 화학적 합성과 생물학적 합성으로 생산할 수 있다. 화학적 생산 방법으로는 에틸렌옥사이드(ethylene oxide)나 아크롤레인(acrolein)을 원료로 하여 수소첨가반응에 의해 제조하는 방법이 있으나, 비용이 많이 들고 환경 오염물질을 함유한 폐유출물을 발생시킨는 문제점이 있다.

생물학적 방법으로는 옥수수 유래의 당을 원료로 사용한 재조합 대장균 발효에 의한 생산과 글리세롤 등을 원료로 1,3-프로판디올 생성 균주 (1,3-propanediol natural producer) 발효에 의한 생산이 있다. 옥수수와 같은 바이오매스 유래의 당을 탄소 기질로 하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단독 미생물 (재조합 대장균)은 미국 듀폰 (DuPont)社에 의해 개발되어 현재 상업 생산에 사용되고 있다 (WO 2001/12833). 한편, 글리세롤을 원료로 1,3-프로판디올을 생산하는 균주들에 대해서는 1세기 전부터 알려져 있는데, 예를 들어, 클렙시엘라 (Klebsiella), 엔테로박터 (Enterobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 시트로박터 (Citrobacter), 락토바실러스 (Lactobacillus) 군 등이 있다. 이러한 균주들은 글리세롤의 환원적 대사 경로를 통해 1,3-프로판디올을 생산하고, 산화적 대사경로를 통해 성장에 필요한 탄소원, 에너지원 및 1,3-프로판디올 생산에 필요한 조효소 (NAHD)를 공급 받는다.

대표적 1,3-프로판디올 생산 균주인 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)는 그람 음성 (G(-)) 세균으로, 1,3-프로판디올 뿐 아니라 2,3-부탄디올 생산 능력 역시 뛰어나다. 이러한 특성은 글리세롤을 원료로 1,3-프로판디올 생산에 제약점이 되는데, 2,3-부탄디올이 1,3-프로판디올과 유사한 비점을 가지고 있어 정제 과정을 어렵게 만들고 최종 정제 수율을 낮추는 문제를 발생시킨다. 이를 해결하기 위해 유전자 재조합 기술을 적용하여 글리세롤 대사 경로 중 부산물을 생성하는 산화 대사 경로를 차단하고, 1,3-프로판디올을 생성하는 환원 대사 경로만을 갖는 변이체를 제작하여 2,3-부탄디올을 비롯한 산화 대사 부산물들은 생성하지 않도록 시도하였으나, 1,3-프로판디올 생산성이 떨어져 상용화에 적용하기 힘든 경우도 있었다 (대한민국 특허출원 제 10-2008-0122166호).

이에, 본 발명자들은 1,3-프로판디올 생산 시 2,3-부탄디올을 포함한 산화 대사 부산물의 생성이 적은 재조합 미생물을 연구하던 중 특정 유전자들이 결실된 재조합 미생물의 경우, 1,3-프로판디올의 생산 수율, 생산성 저하 없이 부산물이 저감 생산되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 1,3-프로판디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,

피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은,

본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 미생물은 글리세롤 대상 경로에서 주요 부산물인 락테이트, 2,3-부탄디올, 포름산 생성이 억제됨으로써, 정제 과정을 어렵게 하는 2,3-부탄디올 생성이 없고, 높은 선택도 및 수율로 1,3-프로판디올을 생산할 수 있다.

도 1은 1,3-프로판디올 생산 균주인 클렙시엘라 뉴모니아의 글리세롤 대사 경로를 나타낸다.
도 2는 클렙시엘라 뉴모니아 내에 존재하는 2,3-부탄디올 합성 관련 유전자 오페론을 도식한 것이다.
도 3 내지 6은 재조합 클렙시엘라 균주들을 회분식 발효하여 2,3-부탄디올을 생산한 결과를 나타낸다(2,3-BDO: 2,3-부탄디올, 1,3-PDO:, 1,3-프로판디올) (도 3: Kp △ ldhA △ pflB, 도 4: Kp △ ldhA △ pflB △ budA, 도 5: Kp △ ldhA △ pflB △budC, 도 6: Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC).

본 발명은,

피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

상기 재조합 미생물을 배양하는 단계;및

상기 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 생산 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물

본 발명의 미생물은 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는다. 본 발명의 아세틸 코에이(Acetyl-CoA) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 아세틸 코에이 생합성 경로는 피루베이트(pyruvate)로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로 등이 될 수 있다. 본 발명의 피루베이트 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 피루베이트가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 피루베이트 생합성 경로는 PEP로부터 피루베이트가 합성되는 경로 등이 될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 미생물은 글리세롤 등의 탄소원으로부터 피루베이트 및 아세틸 코에이를 생합성하는 경로를 갖는다.

본 발명의 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물은 전술한 상기 생합성 경로들을 갖는 미생물이면 되고 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 미생물은 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 야생형으로 갖고 있는 미생물 또는 유전자 재조합에 의하여 갖게 되는 재조합 미생물일 수 있다. 바람직하게는 상기 미생물은 1,3-프로판디올의 생성능을 갖는 미생물이다. 상기 미생물은 클렙시엘라 (Klebsiella) 속, 엔테로벡터 (Enterobacter) 속, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 클렙시엘라 속이고, 더욱 바람직하게는 클렙시엘라 뉴모니아이다.

1,3- 프로판디올 생산용 재조합 미생물

본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 1,3-프로판디올의 생산성, 수율이 높으며, 상기 재조합 미생물은 발효 시 야생형 미생물에 비하여 발효액 내 1,3-프로판디올의 농도가 높은 특징이 있다. 또한 본 발명의 재조합 미생물은 락테이트, 포름산, 2,3-부탄디올, 숙신산 등과 같은 산화 부산물들의 생성이 억제되며, 특히 목표 산물인 1,3-프로판디올과 유사한 비점을 가지고 있어 정제 과정을 어렵게 만들고 최종 정제 수율을 낮추는 2,3-부탄디올의 생성이 억제된 것이다. 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 포름산, 2,3-부탄디올, 숙신산의 생성능이 없다. 상기, 포름산, 2,3-부탄디올, 숙신산의 “생성능이 없다”는 것은 이들을 실질적으로 생산하지 않는다는 것을 의미하며, 이는 포름산, 2,3-부탄디올, 숙신산을 제거하는 별도의 공정이 필요하지 않다는 것을 의미한다.

바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제된 것이며, 더욱 바람직하게는, 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되거나 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로 및 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 억제된 것이며, 더더욱 바람직하게는 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로 및 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 모두 억제된 것이다.

바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 회분식 배양을 기준으로 1,3-프로판디올의 수율이 0.40 g/g 이상이며, 생산성이 1.5 g/L/hr 이상이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 하기 식 1에 의하여 계산할 때, 발효 산물 내 1,3-프로판디올의 비율이 80 중량% 이상이며, 더욱 바람직하게는 85 중량% 이상이고, 더더욱 바람직하게는 88 중량% 이상이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 발효 산물 내 락테이트의 비율이 5 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 2 중량% 미만이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 발효 산물 내 포름산의 비율이 1 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 미만이고, 더더욱 바람직하게는 0.1 중량% 미만이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 발효 산물 내 2,3-부탄디올의 비율이 1 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 미만이고, 더더욱 바람직하게는 0.1 중량% 미만이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 발효 산물 내 숙신산의 비율이 1 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 미만이고, 더더욱 바람직하게는 0.1 중량% 미만이다.

<식 1>

발효 산물 내 특정 산물의 비율 = {발효 산물 내 특정 산물의 농도/(발효 산물 내 1,3-프로판디올, 락테이트, 포름산, 2,3-부탄디올, 에탄올, 초산 및 숙신산의 농도의 총 합)} X 100

피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로의 억제

피루베이트로부터 2,3-부탄디올을 생산하는 미생물은 도 1에서와 같이 알파-아세토락테이트 합성 효소 (α-acetolactate synthase), 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제 (α-acetolactate decarboxylase), 아세토인 리덕타아제 (acetoin reductase)와 같은 일련의 전환 효소군을 가지고 있다. 하기 경로 1에서처럼 알파-아세토락테이트 합성 효소는 피루베이트를 알파-아세토락테이트로, 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제는 알파-아세토락테이트를 아세토인으로, 아세토인 리덕타아제는 아세토인을 2,3-부탄디올로의 전환을 촉매한다.

<경로 1>

피루베이트 → 알파-아세토락테이트 (α-acetolactate) → 아세토인 (acetoin) → 2,3-부탄디올

이들 2,3-부탄디올 합성에 관련된 효소들의 전사는 전사 활성화 인자에 의해 조절 받으며, 2,3-부탄디올 합성 효소들 및 전사 활성화 인자를 코딩하는 유전자들은 미생물 내 유전체 상에서 도 2와 같이 군을 이루어 존재하며 이를 2,3-부탄디올 오페론이라 한다. 상기 2,3-부탄디올 오페론 상에 존재하는 효소들의 억제는 각 유전자들의 발현 억제, 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 2,3-부탄디올 오페론 상의 효소들을 코드하는 유전자인 budR(레귤레이터(regulator)를 코드함), budA(ALDC, 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제(α-acetolactate decarboxylase)를 코드함), budB(ALS, 알파-아세토락테이트 합성효소(α-acetolactate synthetase)를 코드함), budC(AR, 아세토인 리덕타아제(acetoin reductase)를 코드함) 중 하나 혹은 그 이상을 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 2,3-부탄디올 합성 효소를 억제할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제, 알파-아세토락테이트 합성효소 및 아세토인 리덕타아제 중 하나 이상이 억제됨으로써 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제되며, 더욱 바람직하게는 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제, 알파-아세토락테이트 합성효소 및 아세토인 리덕타아제가 억제되고, 더더욱 바람직하게는 이들을 코드하고 발현을 조절하는 유전자인 budR , budA , budB 및 budC의 발현이 억제된다.

피루베이트를 아세틸 코에이와 포름산으로 전환하는 경로의 억제

피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase)는 통성 혐기 조건에서 피루베이트를 아세틸 코에이와 포름산으로의 전환을 촉매한다 (경로 2).

<경로 2>

피루베이트 → 아세틸 코에이 + 포름산

상기 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제함으로써 피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로 및 포름산으로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제의 억제는 피루베이트-포르메이트 리아제의 발현 억제, 피루베이트-포르메이트 리아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제할 수 있다.

피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로의 억제

락테이트 탈수소화효소 (lactate dehydrogenase)는 피루베이트의 락테이트로의 전환을 조절한다. 상기 락테이트 탈수소화효소를 억제함으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 락테이트 탈수소화효소의 억제는 락테이트 탈수소화효소의 발현 억제, 락테이트 탈수소화 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 락테이트 탈수소화효소를 코드하는 유전자인 ldhA를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 락테이트 탈수소화효소를 억제할 수 있다. 상기 경로가 억제된 본 발명의 재조합 미생물은 발효 산물 내 락테이트의 비율이 12 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 8 중량% 미만이고, 더더욱 바람직하게는 5 중량% 미만이다.

1,3- 프로판디올의 생산 방법

본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및 상기 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 생산 방법에 대한 것이다.

상기 배양은 호기 조건에서 수행되며, 바람직하게는 미세호기적 조건 (microaerobic condition)에서 수행된다. 예컨대, 상기 배양은 배양 시 산소, 즉 공기를 공급하면서 수행되며, 구체적인 예로서, 이는 교반을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<재료 및 방법>

-1,3-프로판디올 농도(g/L): 단위 부피당 생산되는 1,3-프로판의 양

-1,3-프로판 수율(g/g): 1,3-프로판디올 생산량(g)/탄소원(g)

-1,3-프로판디올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 1,3-프로판디올의 양

<실험예 1> 재조합 미생물의 제조

클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA ( Kp △ ldhA ) 균주

락테이트 탈수소화효소 (ldhA)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA (Kp △ ldhA) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 락테이트 탈수소화효소를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 ldhA(서열번호 1)의 상동 부위 1(서열번호 2)을 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2(서열번호 5)를 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 8)을 완성하였다(표 1).

표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.

상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 클렙시엘라 뉴모니아 야생형에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.

클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB ( Kp △ ldhA △ pflB ) 균주

피루베이트-포르메이트 리아제(pflB)가 추가로 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB ( Kp △ ldhA △ pflB) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 피루베이트-포르메이트 리아제를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 pflB (서열번호 9)의 상동 부위 1(서열번호 10)을 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2(서열번호 13)를 서열번호 14 및 15의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 16)을 완성하였다(표 2).

상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA ( Kp △ ldhA ) 균주에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.

클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budA ( Kp △ ldhA △ pflB △budA) 균주

2,3-부탄디올 합성 경로 상에서 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환시키는 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제 (α-acetolactate decarboxylase, budA)가 추가로 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budA ( Kp △ldhA △ pflB △ budA) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 budA (서열번호 17)의 상동 부위 1 (서열번호 18)을 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2 (서열번호 21)를 서열번호 22 및 23의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 24)을 완성하였다(표 3).

상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)와 피루베이트-포르메이트 리아제(pflB)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB (Kp △ ldhA △ pflB) 균주에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작을 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.

클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budC ( Kp △ ldhA △ pflB △budC ) 균주

2,3-부탄디올 합성 경로 상에서 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환시키는 아세토인 리덕타아제 (acetoin reductase, budC)가 추가로 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budC (Kp △ ldhA △ pflB △ budC) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 아세토인 리덕타아제를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 budC (서열번호 25)의 상동 부위 1 (서열번호 26)을 서열번호 27 및 28의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2 (서열번호 29)를 서열번호 30 및 31의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 32)을 완성하였다(표 4).

클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budRABC ( Kp △ ldhA △ pflB △budRABC ) 균주

2,3-부탄디올 오페론을 구성하는 유전자들 (budRABC), 즉, 전사 활성화 인자 (budR), 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제 (budA), 알파-아세토락테이트 합성 효소 (budB), 아세토인 리덕타아제 (budC)가 추가로 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budRABC (Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 2,3-부탄디올 오페론을 클로닝하기 위해 표적 유전자인 budRABC (서열번호 33)의 상동 부위 1 (서열번호 34)을 서열번호 35 및 36의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2 (서열번호 37)를 서열번호 38 및 39의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 40)을 완성하였다(표 5).

상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)와 피루베이트-포르메이트 리아제(pflB)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB (Kp △ ldhA △ pflB) 균주에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.

상기 본 발명을 위해 제작한 재조합 클렙시엘라 뉴모니아의 genotype은 하기 표 6과 같다.

<실험예 2> 1,3-프로판디올의 생산

상기 실험예 1에서 제작한 재조합 균주들을 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하였다. 이 때, 비교예로는 야생형 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 (Kp wt)를 사용하였다.

각 재조합 균주들을 250 ml의 복합배지에 접종하여 37 ℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 발효시켰다. 이 때, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 200 rpm), 46 g/L 글리세롤(500mM glycerol), pH 7.0, 배양 온도 37℃로 하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 암모니아 (NH₃)를 사용하였다. 상기 재조합 클렙시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 1,3-프로판디올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

그 결과, ldhA이 결실된 재조합 균주(Kp △ ldhA)는 야생형 클렙시엘라 뉴모니아 (Kp wt)의 최대 부산물이었던 락테이트가 획기적으로 감소하였다. 그러나, 그 외 부산물들인 포름산, 2,3-부탄디올, 에탄올, 초산, 숙신산 모두가 증가하여 최종 1,3-프로판디올 생산 농도 및 생산 수율이 오히려 감소하였다. 또한, ldhA와 pflB 이 동시에 결실된 재조합 균주 (Kp △ ldhA △ pflB)의 경우 상기 야생형 클렙시엘라 뉴모니아 균주인 Kp wt 또는 ldhA가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 균주인 Kp △ ldhA와 비교할 때, 2,3-부탄디올을 제외한 모든 부산물들이 대폭 감소하였고, 최종 1,3-프로판디올 생산 농도 및 생산 수율이 증가하였다. 그러나, 2,3-부탄디올의 농도 증가는 상당하였다.

2,3-부탄디올 합성에 관여하는 효소군 중 일부를 제거한 재조합 균주들 즉, Kp △ ldhA △ pflB △ budA 나 Kp △ ldhA △ pflB △ budC 와 비교할 때, 전체 2,3-부탄디올 오페론을 결실시킨 재조합 균주인 Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC의 경우에서 가장 높은 1,3-프로판디올 농도와 가장 낮은 부산물 생산을 얻을 수 있었고, 생산 수율 및 생산성 측면에서도 가장 우수한 결과를 얻을 수 있었다. 한편, 2,3-부탄디올 축적을 감소시키기 위한 유전자 결실에서 budA를 결실시킨 경우(Kp △ ldhA △pflB △ budA)와 budRABC를 결실시킨 경우(Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC)는 효과가 있었으나 budC를 결실시킨 경우(Kp △ ldhA △ pflB △ budC)는 효과가 없었으며, budA가 결실된 재조합 균주 (Kp △ ldhA △ pflB △ budA)의 경우 발효 성능이 좋지 않아 발효 종료 시점인 24 시간 후에도 잔류 글리세롤이 관찰되었다. 그러나, budRABC가 결실된 재조합 균주 (Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC)의 경우, 모균주(Kp △l d hA △ pflB)와 유사한 발효 패턴을 보이면서 2,3-부탄디올을 생산하지 않았다(표 7 및 8, 도 3 내지 6).

<110> GS CALTEX <120> RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED 1,3-PROPANEDIOL PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING 1,3-PROPANEDIOL USING THE SAME <130> GSP120902 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 1 atgaaaatcg cggtttatag tacgaagcag tacgataaaa agtacctgca gcacgttaat 60 gatgcatacg gctttgaact ggaattcttc gatttcctgc tgacagcgaa gactgccaaa 120 accgccaacg gttgcgaagc ggtatgtatc ttcgtcaatg acgacggcag ccgcccggtg 180 ctggaagagc tgaaggccca cggggtgaaa tatatcgccc tgcgctgcgc cgggtttaac 240 aacgtcgacc ttgaggcggc aaaggagctt ggcctgcgcg tcgtgcgcgt tccagcttac 300 tctccggaag cggtcgctga gcatgcgatc ggtatgatga tgtcgctcaa ccgccgcatc 360 caccgcgctt accagcgtac ccgcgatgcc aatttctccc tcgaaggcct caccggcttc 420 accatgtacg gcaaaaccgc cggggtgatc ggcaccggga aaattggcgt agcgatgttg 480 cggatcctca aaggcttcgg catgcgcctg ctggcgttcg acccgtaccc aagcgccgcc 540 gcgctggagc tgggggtgga atatgttgac ctcgccacgc tgtacaagga atcggacgtg 600 atctccctgc actgtccgct gaccgacgaa aactaccacc tgctcaatcg cgaagctttc 660 gatcagatga aagacggggt gatggtgatc aacaccagcc gcggcgccct gatcgactct 720 caggcggcca tcgacgccct gaagcaccag aaaattggcg cgctggggct ggacgtttat 780 gagaacgaac gcgatctgtt ctttgaagac aaatccaacg acgtgatcca ggacgatgtc 840 ttccgccgcc tctccgcctg ccataacgtg ctgtttaccg gccaccaggc gttcctcacc 900 gccgaggcgc tgatcagcat ttcggagacc actctgggta acctgcagca ggtcgccaac 960 ggcgaaacct gtccgaacgc catcgtc 987 <210> 2 <211> 1200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 2 caagcgtgcg cggtgaaccg ggagagggat cgctggccgg cagtttgctc aggcaggcgc 60 tgttgatctc cagctggcca atatgcagcc gccagcggct gggacgcgag agacgggcat 120 cggtcacccg ggcgatttca cagtcgccca ccagataacg cagatcgggg atcagcaggg 180 ccgaccgcgt caggcgcggg ctctcctgca aagagatacg cgtgcccacg ggcagccaga 240 tgcccgccag cgtcggcacc cagtgggtta gcgtcaacag cagggttagc ggcaataaca 300 ccagaactaa caccagcgcg atggcggctt tatatttacc cttcatgggc agttaatatc 360 ctgattcaac ataagtaaaa gccgaaaggc gtccattgtg acacgttcga ccagtgagtg 420 aaagtttacg gcctgttaaa gcatagttgc cagccggact cgcggcgcga cgttcggcca 480 ttatcattta actgttgttt aagtcgcccc tgccacactc cagccagacg ggaatagctt 540 gcgggagagg cggtgtcgtt aattatctcg ctcatagaga gcgcacagga ccactatcca 600 tgggtattgc tgattgtttt tctgcttacc ttcactaaat cctgcgcatt ggtctcgctg 660 gcaatccccg gcacctccgg cctgctgctg ctggggacat tcgcttccgc cagcctcgga 720 catttcctgt taatgtggtc cagcgccagc ctcggcgcca tcggcggatt ctggctatcg 780 tggcggctgg gcattcgcta ccgtcatcgc ctcacccatc tacgctggct gaccgccgag 840 cgtctggccc gcagccgcct cttctttcag cgctatggcc cgtgggctat ctttttcagc 900 cgctttctct ctcccctgag ggctacgctg cccttcgtta gcggcgccag cagtctgccg 960 ctgtggtcgt ttcagctggc taacgtcagc tccggtctgc tgtggccgct tctgctgctc 1020 gcccccggcg ctttcagcct cagtttgtgg tgaaaaaact ttgtctttca aagagattcc 1080 gcaagtccgc gatatgctct agaattagga ttagcaccct ctcattaaac tattttttaa 1140 taattgtacg attattttaa atatgctacc gtgacggtat aatcactgga gaaaagtctt 1200 1200 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 3 tagaggatcc caagcgtgcg cggtgaaccg 30 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 4 gaggagcaca aaagggaaag gcgaagactt ttctccagtg attatac 47 <210> 5 <211> 1199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 5 cgcctttccc ttttgtgctc ctctcccggg gggagcacat tcagataatc cccacagatc 60 cctgctgcga taccgttaca ctggcttggt tttattagtt atatgattgt tttggagtga 120 aaatgaacaa atttgcggcg cttctggcgg caggtatgct gctgtccggc tgtgtctata 180 atagtaaggt gtccaccggt gcggaacagc tgcagcatca tcgtttcgtg ctgaccagcg 240 tcaacggcca ggcggtcaac gccagcgacc ggccgctgga gctgagcttc ggtgagaaga 300 tggctattac cggcaagatg tatgtatccg gcaatatgtg caacggcttt agcggggaag 360 gtaaagtgtc ggacggcgag ctgaaggtca aatcgctggc gatgacccgg atgctgtgcc 420 acgacgccca gctcaatacc ctggatgcga cgatcgacaa gatgctgcgc gagggtgcgc 480 aggtcgatct gacggaaaac cagttgacgc tggcgaccgc cgaccagacg ctggtctata 540 agctcgccga cctgatgcac tagccggcgt tgaggtgccg ctgacgctgc cccgcgacgg 600 ggccgctgtt agtagccgca gctgccaccc gccagcgcct gctcgctgca gcgtttgccg 660 ttcggcagcg cgcacatgcc aatcgccgaa ccatcgagct gacgagccac cgataacgag 720 ccgcctatca tggcgcagtt ggcctgaccg gcgtcgctca tcgccgcccg cattcccggc 780 gtgacgtgcg ccgccgtggc ctgctgaacg ggttcactac tgcacgcgga cagcaacagc 840 gccgcacatc ctactaacat cgcagctcgc attctctctc ccctcggaaa cgtcttaaaa 900 aagcaaaccc cagaataata ggcagcgtgg cgggcggcgt cgagagggga agtacgtatt 960 tatgcgcctc attaacattt tctagcaaat tttcgcctaa agcttgatct gcctcggcca 1020 tgtcgcccgg cgcaggtggt tcatctcccg gcaggcagcc attttctccg cgaaccacgc 1080 aaaatattga tctggtcacg ggtacccggc gcattgagga cacaaatgca aaaatggcgg 1140 ggtcagcggt ttgctaaact accccttata taattacagg gcgcgtcgcg gtttcacgc 1199 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 6 gtataatcac tggagaaaag tcttcgcctt tcccttttgt gctcctc 47 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 7 atcgcggccg cgcgtgaaac cgcgacgcgc c 31 <210> 8 <211> 2399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 8 caagcgtgcg cggtgaaccg ggagagggat cgctggccgg cagtttgctc aggcaggcgc 60 tgttgatctc cagctggcca atatgcagcc gccagcggct gggacgcgag agacgggcat 120 cggtcacccg ggcgatttca cagtcgccca ccagataacg cagatcgggg atcagcaggg 180 ccgaccgcgt caggcgcggg ctctcctgca aagagatacg cgtgcccacg ggcagccaga 240 tgcccgccag cgtcggcacc cagtgggtta gcgtcaacag cagggttagc ggcaataaca 300 ccagaactaa caccagcgcg atggcggctt tatatttacc cttcatgggc agttaatatc 360 ctgattcaac ataagtaaaa gccgaaaggc gtccattgtg acacgttcga ccagtgagtg 420 aaagtttacg gcctgttaaa gcatagttgc cagccggact cgcggcgcga cgttcggcca 480 ttatcattta actgttgttt aagtcgcccc tgccacactc cagccagacg ggaatagctt 540 gcgggagagg cggtgtcgtt aattatctcg ctcatagaga gcgcacagga ccactatcca 600 tgggtattgc tgattgtttt tctgcttacc ttcactaaat cctgcgcatt ggtctcgctg 660 gcaatccccg gcacctccgg cctgctgctg ctggggacat tcgcttccgc cagcctcgga 720 catttcctgt taatgtggtc cagcgccagc ctcggcgcca tcggcggatt ctggctatcg 780 tggcggctgg gcattcgcta ccgtcatcgc ctcacccatc tacgctggct gaccgccgag 840 cgtctggccc gcagccgcct cttctttcag cgctatggcc cgtgggctat ctttttcagc 900 cgctttctct ctcccctgag ggctacgctg cccttcgtta gcggcgccag cagtctgccg 960 ctgtggtcgt ttcagctggc taacgtcagc tccggtctgc tgtggccgct tctgctgctc 1020 gcccccggcg ctttcagcct cagtttgtgg tgaaaaaact ttgtctttca aagagattcc 1080 gcaagtccgc gatatgctct agaattagga ttagcaccct ctcattaaac tattttttaa 1140 taattgtacg attattttaa atatgctacc gtgacggtat aatcactgga gaaaagtctt 1200 cgcctttccc ttttgtgctc ctctcccggg gggagcacat tcagataatc cccacagatc 1260 cctgctgcga taccgttaca ctggcttggt tttattagtt atatgattgt tttggagtga 1320 aaatgaacaa atttgcggcg cttctggcgg caggtatgct gctgtccggc tgtgtctata 1380 atagtaaggt gtccaccggt gcggaacagc tgcagcatca tcgtttcgtg ctgaccagcg 1440 tcaacggcca ggcggtcaac gccagcgacc ggccgctgga gctgagcttc ggtgagaaga 1500 tggctattac cggcaagatg tatgtatccg gcaatatgtg caacggcttt agcggggaag 1560 gtaaagtgtc ggacggcgag ctgaaggtca aatcgctggc gatgacccgg atgctgtgcc 1620 acgacgccca gctcaatacc ctggatgcga cgatcgacaa gatgctgcgc gagggtgcgc 1680 aggtcgatct gacggaaaac cagttgacgc tggcgaccgc cgaccagacg ctggtctata 1740 agctcgccga cctgatgcac tagccggcgt tgaggtgccg ctgacgctgc cccgcgacgg 1800 ggccgctgtt agtagccgca gctgccaccc gccagcgcct gctcgctgca gcgtttgccg 1860 ttcggcagcg cgcacatgcc aatcgccgaa ccatcgagct gacgagccac cgataacgag 1920 ccgcctatca tggcgcagtt ggcctgaccg gcgtcgctca tcgccgcccg cattcccggc 1980 gtgacgtgcg ccgccgtggc ctgctgaacg ggttcactac tgcacgcgga cagcaacagc 2040 gccgcacatc ctactaacat cgcagctcgc attctctctc ccctcggaaa cgtcttaaaa 2100 aagcaaaccc cagaataata ggcagcgtgg cgggcggcgt cgagagggga agtacgtatt 2160 tatgcgcctc attaacattt tctagcaaat tttcgcctaa agcttgatct gcctcggcca 2220 tgtcgcccgg cgcaggtggt tcatctcccg gcaggcagcc attttctccg cgaaccacgc 2280 aaaatattga tctggtcacg ggtacccggc gcattgagga cacaaatgca aaaatggcgg 2340 ggtcagcggt ttgctaaact accccttata taattacagg gcgcgtcgcg gtttcacgc 2399 <210> 9 <211> 2280 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 9 atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttgcgaa aggtgactgg 60 cagaatgaag tcaacgtccg tgactttatt cagaaaaact acaccccata tgaaggcgac 120 gaatccttcc tggctggcgc gactgaagcg accaccaagc tgtgggacac cgtaatggaa 180 ggtgtaaaac aggaaaaccg cactcacgcg cctgttgatt ttgacactgc cctggcttcc 240 accatcacct ctcacgacgc gggctatatc gagaaaggtc tggaaaaaat cgttggtctg 300 cagaccgaag cgccgctgaa acgtgcgatc atcccgttcg gtggtatcaa aatggttgaa 360 ggttcctgca aagcgtataa tcgcgagctg gacccgatgc tgaaaaaaat cttcacagag 420 taccgtaaaa ctcacaacca gggcgttttc gacgtctata ccccggacat tctgcgctgc 480 cgtaaatccg gcgtgctgac gggtctgccg gatgcttacg gtcgtggtcg tatcatcggt 540 gactaccgtc gcgttgcgct gtacggtatc gacttcctga tgaaagacaa attcgcccag 600 ttcaactctc tgcaagcgaa actggaaagc ggcgaagacc tggaagcgac catccgtctg 660 cgtgaagaaa tcgctgaaca acaccgcgca ctgggccaga tcaaagagat ggccgctaaa 720 tatggctatg acatctccgg tccggcgacc accgctcagg aagcgattca gtggacctac 780 ttcggttacc tggctgccgt gaaatctcag aacggcgcgg caatgtcctt cggtcgtacc 840 tccagcttcc tggatatcta catcgagcgt gacctgcagg cgggtaaaat caccgagcaa 900 gacgcgcagg aaatggttga ccacctggtc atgaaactgc gtatggttcg cttcctgcgt 960 accccggaat atgatgaact gttctccggc gacccgattt gggcaacgga atccatcggc 1020 ggtatgggcg ttgacggccg tactctggtg accaaaaaca gcttccgctt cctgaacacc 1080 ctgtacacca tggggccgtc tccggagccg aacattacta tcctgtggtc tgaaaaactg 1140 ccgctgagct tcaagaaatt cgccgctaaa gtgtccatcg atacctcttc tctgcagtat 1200 gagaacgatg acctgatgcg tccggacttc aacaacgacg actacgctat cgcatgctgc 1260 gtaagcccga tggttgttgg taagcaaatg cagttcttcg gcgctcgcgc taacctcgcg 1320 aaaaccatgc tgtacgctat caacggcggc gtggatgaaa aactgaaaat gcaggttggt 1380 ccgaaatctg aaccgatcaa aggcgacgtc ctgaacttcg acgaagtaat ggatcgcatg 1440 gatcacttca tggactggct ggctaaacag tacgtcaccg cgctgaacat catccactac 1500 atgcacgaca agtacagcta cgaagcctct ctgatggcgc tgcacgaccg tgacgttatc 1560 cgcaccatgg cgtgtggtat cgctggtctg tccgttgctg ctgactccct gtctgctatc 1620 aaatatgcga aagttaaacc gattcgtgac gaagacggtc tggctatcga cttcgaaatc 1680 gaaggcgaat acccgcagtt tggtaacaac gaccctcgcg tcgatgacat ggccgttgac 1740 ctggttgaac gtttcatgaa gaaaattcag aaactgcaca cctaccgcaa cgctatcccg 1800 actcagtctg ttctgaccat cacctctaac gtggtgtacg gtaagaaaac cggtaatacc 1860 ccagacggtc gtcgcgctgg cgcgccgttc ggtccaggtg ctaacccgat gcacggccgt 1920 gaccagaaag gcgcagtagc ctctctgacc tccgtcgcta aactgccgtt tgcttacgcg 1980 aaagatggta tctcttatac cttctctatc gtgccgaacg cgctgggtaa agacgacgaa 2040 gttcgtaaga ccaacctggc gggtctgatg gatggttact tccatcacga agcgtccatc 2100 gaaggtggtc agcacctgaa cgtgaacgtc atgaaccgcg aaatgctgct cgacgcgatg 2160 gaaaacccgg aaaaatatcc gcagctgacc atccgtgtat ctggctacgc cgtacgtttt 2220 aactccctga ccaaagaaca gcagcaggat gttattaccc gtaccttcac tcagaccatg 2280 2280 <210> 10 <211> 529 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 10 gtttgtgctg ctgatgtggt tatcaggcga atatatgact gccaacggcg gctgggggct 60 aaacgttctg cagaccgccg accacaaaat gcaccatact tttgtggagg ccgtgagcct 120 gggtatcctc gctaacctga tggtttgtct cgccgtatgg atgagctatt ccggtcgtag 180 cctgatggat aaagcgatga 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ccttcggcgg cgtcgatatc gtgatcaata acgccggcat 180 ccagcacgtg gccccggtgg agcagttccc ggtggacaaa tggaacgata ttctcgccat 240 caatctctcc agcgtcttcc acaccacccg cctggcgctg ccgggtatgc gccagcgcaa 300 ctgggggcgc atcatcaaca ttgcctcagt gcatggcctg gtggcgtcga aagagaaatc 360 ggcctacgtc gccgccaagc acgcggtggt cgggctgacc aaaaccgtgg ccctggaaac 420 cgcgcgcagc ggtatcacct gcaacgccat ctgccctggc tgggtgctaa ccccgctggt 480 gcagcagcag atcgacaaac gcatcgccga gggggtcgac ccggagcagg ccagcgccca 540 gctgctggcg gaaaaacagc cctccgggga gtttgtcacc ccgcagcagc tgggcgaaat 600 ggcgctgttt ctgtgcagcg atgccgccgc ccaggtgcgc ggcgccgcat ggaacatgga 660 tggcggctgg gtggcgcagt aagccgctgg cgccgcgaag a 701 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 35 tagaggatcc ccagctggtg ctcaatggct tcg 33 <210> 36 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 36 caagccatgt cagagctttt ttttatcttc gcggcgccag cggc 44 <210> 37 <211> 701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 37 taaaaaaaag ctctgacatg gcttgcccct gctttcgcgc aggggctttt tttggtttgg 60 gtgtaagtgt aagcatcccg gagaaacgaa gcatcgatat ttgagggctt ctggcgttct 120 cacttacgct tcgacacgac gtgggcaatc tgactgggat gaaggtctga tttgagcgag 180 gagcggaagt tcgggaacgg gatagctctg acctgccacc aggattagat acaaccgtca 240 gttagtaagg tcggtttgtt taccttcaca ttttccattt cgccaccgtg ctgcaaactc 300 tgatggcgtc tgataattca gtgctgaatg tggacgacac tcgttataat cctgccgcca 360 gtcattaatg attttccttg cgtgaacgat atcgctgaac cagtgctcat tcaggcattc 420 atcgcgaaat cgtccgttaa agctctcaat aaatccgttc tgcgttggct tgcccggctg 480 gattaagcgc aactcaacac catgctcaaa ggcccattga tccagtgcac ggcaagtgaa 540 ctccggcccc tggtcagttc ttatcgtcgc cggatagcct cgaaacagtg caatgctgtc 600 cagaatacgc gagacctgaa cgcctgaaat cccaaaggca acagtgaccg tcaggcattc 660 ctttgtgaaa tcatcgacgc aggtaagaca cttgatcctg c 701 <210> 38 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 38 gccgctggcg ccgcgaagat aaaaaaaagc tctgacatgg cttg 44 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 39 gatcgcggcc gcgcaggatc aagtgtctta cctgcg 36 <210> 40 <211> 1402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 40 ccagctggtg ctcaatggct tcggcgacag cagccacgcc cgggctgaag tcgccgcgct 60 gggcaagatc cccggctatc acgacgccga cctgcgcgac gtcgggcaga tcgaggcgat 120 gatgcgctat gccgaaagca ccttcggcgg cgtcgatatc gtgatcaata acgccggcat 180 ccagcacgtg gccccggtgg agcagttccc ggtggacaaa tggaacgata ttctcgccat 240 caatctctcc agcgtcttcc acaccacccg cctggcgctg ccgggtatgc gccagcgcaa 300 ctgggggcgc atcatcaaca ttgcctcagt gcatggcctg gtggcgtcga aagagaaatc 360 ggcctacgtc gccgccaagc acgcggtggt cgggctgacc aaaaccgtgg ccctggaaac 420 cgcgcgcagc ggtatcacct gcaacgccat ctgccctggc tgggtgctaa ccccgctggt 480 gcagcagcag atcgacaaac gcatcgccga gggggtcgac ccggagcagg ccagcgccca 540 gctgctggcg gaaaaacagc cctccgggga gtttgtcacc ccgcagcagc tgggcgaaat 600 ggcgctgttt ctgtgcagcg atgccgccgc ccaggtgcgc ggcgccgcat ggaacatgga 660 tggcggctgg gtggcgcagt aagccgctgg cgccgcgaag ataaaaaaaa gctctgacat 720 ggcttgcccc tgctttcgcg caggggcttt ttttggtttg ggtgtaagtg taagcatccc 780 ggagaaacga agcatcgata tttgagggct tctggcgttc tcacttacgc ttcgacacga 840 cgtgggcaat ctgactggga tgaaggtctg atttgagcga ggagcggaag ttcgggaacg 900 ggatagctct gacctgccac caggattaga tacaaccgtc agttagtaag gtcggtttgt 960 ttaccttcac attttccatt tcgccaccgt gctgcaaact ctgatggcgt ctgataattc 1020 agtgctgaat gtggacgaca ctcgttataa tcctgccgcc agtcattaat gattttcctt 1080 gcgtgaacga tatcgctgaa ccagtgctca ttcaggcatt catcgcgaaa tcgtccgtta 1140 aagctctcaa taaatccgtt ctgcgttggc ttgcccggct ggattaagcg caactcaaca 1200 ccatgctcaa aggcccattg atccagtgca cggcaagtga actccggccc ctggtcagtt 1260 cttatcgtcg ccggatagcc tcgaaacagt gcaatgctgt ccagaatacg cgagacctga 1320 acgcctgaaa tcccaaaggc aacagtgacc gtcaggcatt cctttgtgaa atcatcgacg 1380 caggtaagac acttgatcct gc 1402

Claims

피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로 및 아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 억제되고,
2,3-부탄디올의 생성이 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
알파-아세토락테이트 디카르복실라아제가 억제됨으로써 아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
알파-아세토락테이트 디카르복실라아제, 알파-아세토락테이트 합성효소 및 아세토인 리덕타아제가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
서열번호 33의 염기 서열을 갖는 유전자가 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
포름산 생성이 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
피루베이트를 아세토락테이트로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3 부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
숙신산 생성이 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
피루베이트를 아세토락테이트로 전환하는 경로 및 아세토인을 2,3 부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
락테이트 탈수소화효소가 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 추가로 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
피루베이트 포르메이트 리아제가 추가로 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
알파-아세토락테이트 합성효소 또는 아세토인 리덕타아제가 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
알파-아세토락테이트 합성효소 및 아세토인 리덕타아제가 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및
상기 배양물로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는,
1,3-프로판디올의 생산 방법.