KR101473532B1

KR101473532B1 - 부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올 생산 방법

Info

Publication number: KR101473532B1
Application number: KR1020120131850A
Authority: KR
Inventors: 이상현; 엄문호
Original assignee: 지에스칼텍스 주식회사
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2014-12-16
Also published as: BR112015011492B1; US20150376655A1; US9957529B2; BR112015011492A2; MY170881A; CA2892129C; CA2892129A1; KR20140064469A; WO2014081084A1

Abstract

본 발명은 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로가 억제되고, 아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진된, 부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 재조합 미생물을 이용하여 부탄올을 생산하는 방법에 대한 것이다.

Description

부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올 생산 방법{RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED BUTANOL PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING BUTANOL USING THE SAME}

본 발명은 부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올 생산 방법에 대한 것이다.

부탄올은, 화장품, 향수, 호르몬, 위생제, 산업용 코팅제, 페인트첨가제, 섬유, 플라스틱 모노머, 의료용품, 비타민, 항생제, 농약 등 활용범위가 매우 넓은 중간체 화합물로 그 효용성이 매우 크다(Durre, Biotechnol J, 2:1525-1534, 2007).

기존의 부탄올 제조방법은 클로스트리디움 균주로 당을 발효하여 부탄올, 아세톤 및 에탄올을 생산하는 방법(Weizmann, U.S. Pat. No 1,315,585)이 80년대까지 이용되었으나 이후로는 석유로부터 얻어진 프로필렌으로부터 부탄올을 합성하는 옥소법(oxo process)이 널리 이용되어 왔다. 그러나 석유 기반의 부탄올 제조법은 고온 고압을 사용하여 공정이 복잡하며 다량의 유해성 폐기물과 이산화탄소를 배출하는 문제점(Tsuchida et al., Ind. Eng. Chem.Res., 45:8634, 2006)으로 최근에는 다시 재생 가능한 자원으로부터 미생물의 발효를 통해 친환경적으로 부탄올을 생산하기 위한 요구가 증가하고 있다.

그러나 미생물을 이용하여 산업적으로 유용한 수준으로 부탄올을 생산하기 위하여는 부탄올의 선택성, 수율 및 생산성, 즉 단위시간 당 부탄올의 생산량 모두가 우수하여야 한다. 그러나 바이오 부탄올 생산을 위한 야생형 및 재조합 미생물들 중 이들 조건들을 모두 만족하는 미생물은 아직 발견되지 않았다.

구체적으로, 야생형 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) ATCC824 균주 경우 아세톤, 에탄올 및 부탄올을 발효를 통해 약 3:1:6의 질량비로 생산하는 것으로 알려져 있으며, 소량의 아세트산과 부틸산을 생산한다. 이때 야생형 균주의 수율은 약 25%이고, 최종 농도는 약 10g/L 정도이다. 클로스트리디움 아세토부틸리쿰과 같이 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물은, 일반적으로 도 1과 같은 경로로 아세톤, 부탄올 및 에탄올을 합성하는 것으로 알려져 있다. 최근 대사공학 기술의 발달로 좀더 효율적으로 부탄올을 생산하고자 하는 노력이 지속되고 있으며 특히 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 경우 최근 genome 서열이 알려지면서 대사경로 조작과 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다.

예컨대, 부탄올 생성관련 유전자(adc, ctfAB 및 adhE1(알코올/알데히드 탈수소 효소) 및 adhE2(알코올/알데히드 탈수소 효소))가 존재하는 거대 플라스미드가 결실된 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 M5 균주에 adhE1과 ctfAB 유전자를 동시에 과발현한 결과가 보고되었는데, 이 보고에 따르면 부탄올 선택도가 질량비로 0.78로 향상되었으나 균주의 생장이 저해되고 아세트산 생산이 증가하면서 생산성과 수율이 크게 저하되는 한계가 있었다(Lee, et al.,Biotechnology Journal, 4:1432-1440, 2009; Lee, et al., WO 2009/082148)

아세틸코에이(Acetyl-CoA)를 아세테이트로 전환하는 pta유전자를 결실시킨 경우 및 pta 및 부티릴코에이(Butyryl-CoA)를 부티레이트로 전환하는 buk 유전자 모두를 결실시키고 aad(알코올/알데히드 탈수소 효소)를 과발현한 경우 모두 부탄올 농도, 선택도 및 수율이 증가한 결과가 보고되었으나, 양자 모두 여전히 생산성 및 균주의 안정성 측면에서 한계가 있었다(LEE et al., WO 2011/037415). 또한 pta와 buk을 결실시킨 변이주에 추가로 코에이 트란스퍼라제(CoAT)를 코드하는 CtfB 유전자를 결실시킨 경우에도 생산성이 여전히 낮았다(LEE et al., WO 2011/037415).

그 밖에도, 무작위 돌연변이로 유발된 돌연변이주 Clostridium beijerinckii BA101 균주를 이용하여 탄소원으로 말토덱스트린을 사용하여 발효한 결과, 18.6 g/ℓ의 부탄올이 생산된다는 것을 보고한 예도 있다(Ezeji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 63:653, 2004). 하지만, 상기 재조합 균주들을 이용하더라도 모두 최종 산물인 부탄올의 생산성이 낮아 산업적 이용이 불가능하다.

또한 코에이트랜스퍼라아제를 코딩하는 ctfAB 또는 아세토아세트산 탈 탄산효소인 adc를 결실시킴으로써 아세톤의 농도를 감소시키고 부탄올의 선택도를 증가시킨 보고가 있지만 이들은 부탄올의 최종 농도가 10g/L 미만이고 균주의 안정성에 문제가 있다(Jiang et al., Metab. Eng., 11(4-5):284-291, 2009).

또한 adc(아세토아세트산 탈탄산효소) 및 ctfAB(코에이 트란스퍼라제) 유전자를 야생형 클로스트리디움 아세토부틸리쿰에서 과발현한 경우 야생형에 비해 아세톤, 에탄올 및 부탄올 생산성이 각각 95%, 90% 37% 증가한 것이 보고되었으나, 부탄올 선택도 및 수율이 낮은 문제가 있다(Mermelstein et al., Biotechnol. Bioeng., 42:1053, 1993).

이에 본 발명자들은 부탄올의 선택도, 수율 및 생산성이 모두 우수한 미생물에 대하여 연구하던 중, 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 포스포트랜스아세틸라제 및 부티레이트 키나아제의 활성이 억제되고 코에이트랜스퍼라제 및 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 활성이 증가되며, 티올라제(thiolase) 또는 hbd-crt-bcd 오페론의 활성이 증가된 재조합 미생물이 부탄올 선택도 및 수율이 높으면서도, 에탄올 선택도가 낮아 산업적 규모로 지속적인 바이오 부탄올을 생산할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 부탄올 선택도 및 수율이 높으면서도, 에탄올 선택도가 낮아 산업적 규모로 지속적으로 바이오 부탄올을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,

아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로가 억제되고,

아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진된,

부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은,

본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및

상기 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 미생물은 ABE(아세톤, 에탄올 및 부탄올) 수율 및 부탄올 생산성, 부탄올 선택도가 높으면서도, 에탄올 선택도는 낮은 특징이 있다. 그러므로 본 발명의 재조합 미생물은 산업적인 규모로 지속적으로 바이오부탄올을 생산할 수 있다.

도 1은 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 아세톤, 부탄올 및 에탄올의 합성 경로를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 재조합 미생물의 일 실시예를 나타낸다.
도 3은 pGS1-MCS 벡터이다.
도 4는 pGS1-atoB 벡터이다.
도 5는 서열번호 4의 염기서열이다.
도 6은 pGS1-HCB 벡터이다.
도 7은 pGS1-AdhE1 벡터이다.
도 8은 pGS1-E1AB 벡터이다.
도 9는 pGS1-E1AB-atoB 벡터이다.
도 10은 pGS1-E1AB-HCB 벡터이다.

본 발명은 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,

아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로가 억제되고,

아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진된,

부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및

상기 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물

본 발명의 재조합 미생물은,

아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로가 억제되고,

아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진된,

부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물이다.

상기 재조합 미생물은, 그 외 경로가 억제 촉진 또는 억제될 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 미생물은 아세틸 코에이를 아세토아세틸 코에이로 전환하는 경로, 아세토아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로, 아세테이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로 및 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로 중 하나 이상이 촉진될 수 있다. 또한 상기 재조합 미생물은, 부티릴 코에이를 부티레이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 도 2에 개시된 바와 같이,

아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로 및 부티릴 코에이를 부티레이트로 전환하는 경로가 억제되고,

아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로, 아세테이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로 및 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로가 촉진된, 재조합 미생물이다.

이 때, 본 발명의 재조합 미생물의 한 구현예는,

포스포트랜스아세틸라제 및 부티레이트 키나아제의 활성이 억제되고

코에이트랜스퍼라제 및 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 활성이 증가되며,

티올라제 또는 hbd-crt-bcd 오페론의 활성이 증가된 재조합 미생물일 수 있다.

아세틸 코에이 생합성 경로

본 발명의 아세틸 코에이(Acetyl-CoA) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 아세틸 코에이 생합성 경로는 피루베이트(pyruvate)로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로 또는 아세테이트로(acetate)부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로 등이 될 수 있다. 아세테이트로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로는 코에이트랜스퍼라제(CoA-transferase)에 의하여 조절될 수 있다.

부티릴 코에이 생합성 경로

본 발명의 부티릴 코에이 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 부티릴 코에이가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 부티릴 코에이 생합성 경로는 아세틸 코에이(Acetyl CoA)로부터 부티릴 코에이(Butyryl CoA)를 합성하는 경로, 아세토아세틸 코에이(Acetoacetyl CoA)로부터 부티릴 코에이가 합성되는 경로 또는 부티레이트(butyrate)로부터 부티릴 코에이가 합성되는 경로 등이 될 수 있다. 부티레이트로부터 부티릴 코에이가 합성되는 경로는 코에이트랜스퍼라제에 의하여 조절될 수 있다.

아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물

본 발명의 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물은 전술한 상기 생합성 경로들을 갖는 미생물이면 되고 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 미생물은 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 야생형으로 갖고 있는 미생물 또는 유전자 재조합에 의하여 갖게 되는 재조합 미생물일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 미생물은 클로스트리디움이나 이에 제한되는 것은 아니다.

아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로의 억제

생합성된 아세틸 코에이는 아세틸 포스페이트 (Acetyl phosphate)를 거쳐 아세테이트로 전환될 수 있다. 상기 경로는 아세틸 코에이의 아세틸-포스페이트 로의 전환 단계 또는 아세틸-포스페이트 의 아세테이트로의 전환 단계를 조절함으로써 억제될 수 있다. 상기 단계들은 각 단계를 조절하는 효소의 발현 조절 또는 효소 활성의 억제와 같은 공지의 방법을 이용하여 억제될 수 있다.

예컨대, 포스포트랜스아세틸라제는 아세틸 코에이의 아세틸-포스페이트로의 전환을 조절하는데, 상기 포스포트랜스아세틸라제가 억제됨으로써 아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 포스포트랜스아세틸라제의 억제는 포스포트랜스아세틸라제의 발현 억제, 포스포트랜스아세틸라제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 포스포트랜스아세틸라제를 코드하는 유전자인 pta를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 포스포트랜스아세틸라제를 억제할 수 있다.

또, 아세테이트 키나아제(Acetate kinase, ack)는 아세틸 포스페이트의 아세테이트로의 전환을 조절하는데, 상기 아세테이트 키나아제가 억제됨으로써 아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 아세테이트 키나아제의 억제는 아세테이트 키나아제의 발현 억제, 아세테이트 키나아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 아세테이트 키나아제를 코드하는 유전자인 ack를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 아세테이트 키나아제를 억제할 수 있다.

부티릴 코에이를 부티레이트로 전환하는 경로의 억제

생합성된 부티릴 코에이는 부티릴-포스페이트(Butyryl-phosphate)를 거쳐 부티레이트로 전환될 수 있다. 상기 경로는 부티릴 코에이의 부티릴-포스페이트로의 전환 단계 또는 부티릴-포스페이트의 부티레이트로의 전환 단계를 억제함으로써 억제될 수 있다. 상기 단계들은 각 단계를 조절하는 효소의 발현 조절 또는 효소 활성의 억제와 같은 공지의 방법을 이용하여 억제될 수 있다.

예컨대, 부티레이트 키나아제(butyrate kinase)는 부티릴 포스페이트의 부티레이트로의 전환을 조절하는데, 상기 부티레이트 키나아제가 억제됨으로써 부티릴 코에이를 부티레이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 부티레이트 키나아제의 억제는 부티레이트 키나아제의 발현 억제, 부티레이트 키나아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 부티레이트 키나아제를 코드하는 유전자인 buk를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등 당업자는 적절한 방법을 선택하여 부티레이트 키나아제를 억제할 수 있다.

또한, 포스포트랜스부틸라제는 부티릴 코에이의 부티릴-포스페이트로의 전환을 조절하는데, 상기 포스포트랜스부틸라제가 억제됨으로써 부티릴 코에이를 부티레이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 포스포트랜스부틸라제의 억제는 포스포트랜스부틸라제의 발현 억제, 포스포트랜스부틸라제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 포스포트랜스아세틸라제를 코드하는 유전자인 ptb를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 포스포트랜스아세틸라제를 억제할 수 있다.

부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로의 촉진

코에이트랜스퍼라제(CoA Transferase)는 부티레이트의 부티릴 코에이로의 전환을 조절한다. 상기 코에이트랜스퍼라제의 활성을 증가시킴으로써 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진될 수 있다. 상기 코에이트랜스퍼라제의 활성 증가는 코에이트랜스퍼라제의 발현 증가, 코에이트랜스퍼라제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 코에이트랜스퍼라제를 코드하는 유전자인 cftA 또는 ctfB(이하, "ctfAB"라 한다)의 도입, 증폭, 재배열, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등 당업자는 적절한 방법을 선택하여 코에이트랜스퍼라제의 활성을 증가시킬 수 있다.

아세테이트를 아세틸코에이로 전환하는 경로의 촉진

코에이트랜스퍼라제는 아세테이트의 아세틸 코에이로의 전환을 조절한다. 상기 코에이트랜스퍼라제의 활성을 증가시킴으로써 아세테이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로가 촉진될 수 있다. 상기 코에이트랜스퍼라제의 활성 증가는 코에이트랜스퍼라제의 발현 증가, 코에이트랜스퍼라제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 코에이트랜스퍼라제를 코드하는 유전자인 ctfAB의 도입, 증폭, 재배열, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등 당업자는 적절한 방법을 선택하여 코에이트랜스퍼라제의 활성을 증가시킬 수 있다.

코에이트랜스퍼라제는 아세토아세틸 코에이를 아세토아세테이트로 전환하는 경로 역시 조절한다. 그러므로 코에이트랜스퍼라제의 활성이 증가될 경우 아세토아세틸 코에이가 아세토아세테이트를 거쳐 아세톤으로 전환되는 경로 역시 영향을 받을 수 있다. 그러나 본 발명의 재조합 미생물은 코에이트랜스퍼라제의 활성을 증가시키더라도, 아세틸 코에이의 부티릴 코에이로의 전환 경로 등 다른 경로들 및 이와 관련된 효소들이 적절히 조절되는바, 결과적으로 부탄올 생산 균주로서의 성능을 유의하게 저해할 정도로 아세톤 생성능이 증가하지는 않는다.

부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로의 촉진

생합성된 부티릴 코에이는 부탄알(butanal)을 거쳐 부탄올로 전환될 수 있다. 상기 경로는 부티릴 코에이의 부탄알로의 전환 단계 또는 부탄알의 부탄올로의 전환 단계를 촉진함으로써 촉진될 수 있다. 각 단계는 효소 활성의 증가와 같은 공지의 방법을 이용하여 촉진될 수 있다.

예컨대, 알데히드/알코올 디하이드로게나제는 부티릴 코에이의 부탄알로의 전환 및 부탄알의 부탄올로의 전환을 조절하는데, 상기 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 활성이 증가됨으로써 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로가 촉진될 수 있다. 상기 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 활성 증가는 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 발현 증가, 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 알데히드/알코올 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 adhE의 도입, 증폭, 재배열, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등 당업자는 적절한 방법을 선택하여 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 활성을 증가시킬 수 있다.

알데히드/알코올 디하이드로게나제는 아세틸 코에이를 에탄올로 전환하는 경로 역시 조절한다. 그러므로 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 활성이 증가될 경우 아세틸 코에이가 아세토알데하이드를 거쳐 에탄올로 전환되는 경로 역시 영향을 받을 수 있다. 그러나 본 발명의 재조합 미생물은 알데히드/알코올 디하이드로게나제의 활성을 증가시키더라도, 아세틸 코에이의 부티릴 코에이로의 전환 경로 등 다른 경로들 및 이와 관련된 효소들이 적절히 조절되는바, 결과적으로 에탄올 생성능 및 에탄올 선택도가 감소하게 된다.

아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로의 촉진

생합성된 아세틸 코에이는 아세토아세틸 코에이(Acetoacetyl CoA)를 거쳐 부티릴 코에이로 전환될 수 있다. 상기 경로는 아세틸 코에이의 아세토아세틸 코에이로의 전환 단계 또는 아세토아세틸 코에이의 부티릴 코에이로의 전환 단계를 촉진함으로써 촉진될 수 있다. 상기 단계들은 각 단계를 조절하는 효소의 발현 증가 또는 효소 활성의 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다.

아세틸 코에이를 아세토아세틸 코에이로 전환하는 경로의 촉진

티올라제(thiolase)는 아세틸 코에이의 아세토아세틸 코에이로의 전환을 조절한다. 상기 티올라제의 활성을 증가시킴으로써 아세틸 코에이의 아세토아세틸 코에이로 전환하는 경로가 촉진될 수 있다. 상기 티올라제의 활성 증가는 티올라제의 발현 증가, 티올라제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 티올라제를 코드하는 유전자인 atoB의 도입, 증폭, 재배열, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등 당업자는 적절한 방법을 선택하여 티올라제의 활성을 증가시킬 수 있다.

아세토아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로의 촉진

hbd-crt-bcd 오페론은 아세토아세틸 코에이의 부티릴 코에이로의 전환을 조절한다. 상기 hbd-crt-bcd 오페론의 활성을 증가시킴으로써 아세토아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진될 수 있다. 상기 hbd-crt-bcd 오페론의 활성 증가는 hbd-crt-bcd 오페론의 유전자의 발현 증가, hbd-crt-bcd 오페론의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, hbd-crt-bcd 오페론의 유전자의 도입, 증폭, 재배열, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등 당업자는 적절한 방법을 선택하여 hbd-crt-bcd 오페론의 활성을 증가시킬 수 있다.

부탄올 생성능의 증강

부탄올 생성능의 증강이란 부탄올 선택도(생산된 ABE 중 부탄올의 비율), 부탄올 생산성(단위 시간 당 생성되는 부탄올의 양) 및 수율(생산에 소모된 탄소원의 양에 대한 생산된 ABE의 양)이 모두 우수해지는 것을 의미한다. 바람직하게는 부탄올 생성능의 증강이란, 회분식 배양을 기준으로 부탄올 선택도가 70 % 이상 되거나 부탄올 생산성이 1.0 g/L/h 이상 되거나 수율이 28 % 이상이 되는 것을 의미한다.

에탄올 생성능의 감소

산업적 규모로 지속적, 연속적으로 바이오 부탄올을 생산하기 위하여는 배양 액 내 에탄올 농도가 일정 수준 이하여야 한다. 에탄올의 농도가 높을 경우 미생물에 독성이 야기되어, 지속적인 배양이 어렵고, 배양 공정의 효율이 낮아지게 된다. 본 발명의 재조합 미생물은 부탄올 생성능은 증강하나 에탄올 생성능은 감소된다.

상기 에탄올 생성능의 감소는 에탄올 선택도, 즉 생산된 ABE 중 에탄올의 비율이 감소되는 것을 의미한다. 바람직하게는 상기 에탄올 생성능의 감소란, 회분식 배양 또는 유가식 배양을 기준으로 에탄올 선택도가 15% 이하인 것을 의미한다. 또는 상기 에탄올 생성능의 감소란, 연속 배양을 기준으로 에탄올 선택도가 20% 이하인 것을 의미한다.

부탄올의 생산 방법

본 발명의 부탄올 생산 방법은 본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및 상기 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 배양은 미생물을 이용한 알코올의 생산 공정에서 일반적으로 사용되는 방법이면 되고 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 배양 방법은 액체 배양 또는 고체 배양일 수 있고, 회분식 배양, 연속 배양 또는 유가식 배양일 수도 있으나 특별히 제한되지는 않으며 당업자는 적절한 배양 방법을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다.

상기 부탄올의 회수 방법 역시 바이오 알코올의 회수에 일반적으로 사용되는 방법이면 되고 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 부탄올의 회수 단계는 분리막 또는 증류 등을 이용하여 수행할 수 있다. 또한 상기 미생물의 배양 및 부탄올의 회수는 동시에 수행될 수도 있고, 순차로 수행될 수도 있다. 예컨대, 부탄올을 회수하면서 미생물을 계속하여 배양할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

재료 및 방법

유전자 결실 균주 Clostridium acetobutylicum PJC4BK △buk::MLS^r ^*는 1996년 Microbiology(EM Green et al., 142, pp 2079) 저널에 보고된 균주를 확보한 것이며, Clostridium acetobutylicum ATCC824 △pta 및 Clostridium acetobutylicum ATCC824 △pta △buk는 WO2011/037415에 기재된 방법으로 제작하였다.

한편, 재조합 C. 아세토부틸리쿰 균주의 바이오 부탄올 생성능의 평가 시, 알코올 선택도(생산되는 혼합용매(ABE:아세톤, 부탄올, 에탄올) 중 특정 알코올의 비율), 부탄올 생산성 및 수율은 하기와 같이 계산하였다.

-부탄올 선택도(%): 부탄올 생산량(g)/ABE 생산량(g) × 100

-에탄올 선택도(%): 에탄올 생산량(g)/ABE 생산량(g) × 100

-부탄올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 부탄올 양

(이 때, 회분식 및 유가식 방법에서 부탄올 생산성은 exponential phase 기준임, 연속배양에서는 전체 phase에서 생산된 누적 ABE량을 기준으로 계산함)

-수율(%): ABE 생산량(g)/탄소원(g) × 100

-ABE 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 ABE의 양

<실험예 1> 재조합 플라스미드의 제작

pGS1 - atoB 의 제작

먼저 E.coli W3110균주를 LB 고체배지에 도말 후 24시간 호기 배양하고 도말된 고체배지에서 콜로니 하나를 액체배지 3ml에 18시간 배양한 후, 배양액을 원심 분리하여 세포를 수득하고, 10ml Tris 버퍼를 이용하여 세척한 후, Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega사,USA)을 이용하여 균주의 염색체를 분리하였다.

상기 분리된 염색체를 프라이머 atoB-UP-PstI (서열번호 2) 및 atoB-DN-XhoI(서열번호 3)을 사용하여 상기 분리된 염색체를 주형으로 하여 atoB 유전자(서열번호 1)를 증폭하였다(표 1). PCR반응 혼합물 100 μl는 dNTP 250 μM, primer를 각각 20 pmol, 1.5mM MgCl₂, 10buffer 10μl, DNA 주형 100 ng, pfu 폴리머라제 1 units을 첨가하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분 동안 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 중합과정을 25회 반복하였다.

증폭된 유전자는 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 PstI, XhoI 제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-MCS 벡터(도 3)에 라이게이션 하여 pGS1-atoB를 제작하였다(도 4).

pGS1 - HCB 의 제작

먼저 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 균주를 RCM 고체배지에 도말 후 48시간 혐기 배양하고 도말된 고체배지에서 콜로니 하나를 RCM 액체배지 3ml에 18시간 배양한 후, 배양액을 원심 분리하여 세포를 수득하고, 10ml Tris 버퍼를 이용하여 세척한 후, Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega사, USA)을 이용하여 균주의 염색체를 분리하였다.

HCB-UP-PstI (서열번호 5) 및 HCB-DN-XhoI 프라이머 (서열번호 6)를 이용하여 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주의 hbd-crt-bcd 오페론을 코드하는 유전자(서열번호 4, 도 5)를 증폭하였다(표 2).

PCR 반응 혼합물 100 μl는 dNTP 250μM, 프라이머를 각각 20pmol, 1.5mM MgCl2, 10buffer 10μl, DNA 주형100ng, pfu 폴리머라제 5 units을 첨가하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분 동안 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 4분 동안 중합과정을 30회 반복하였다.

증폭된 유전자를 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 PstI, XhoI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 pGS1-MCS벡터에 라이게이션 하여 pGS1-HCB(도 6)를 완성하였다.

pGS1 - E1AB 의 제작

클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824균주를 RCM 고체배지에 도말 후 24시간 혐기 배양하고 도말된 고체배지에서 콜로니 하나를 액체배지 3ml에 18시간 배양한 후, 배양액을 원심 분리하여 세포를 수득하고, 10ml Tris 버퍼를 이용하여 세척한 후, Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega사,USA)을 이용하여 균주의 염색체를 분리하였다.

상기 분리된 염색체를 프라이머 AdhE1-UP-PstI (서열번호 8) 및 AdhE1-DN-XhoI(서열번호 9)을 사용하여 상기 분리된 염색체를 주형으로 하여 adhE1 유전자(서열번호 7)를 증폭하였다(표 3). PCR 반응 혼합물 100μl는 dNTP 250μM, 프라이머를 각각 20pmol, 1.5mM MgCl2, 10buffer 10μl, DNA 주형100ng, pfu 폴리머라제 1 units을 첨가하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분동안 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 2분 동안 중합과정을 30회 반복하였다. 증폭된 유전자는 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 PstI, XhoI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-MCS 벡터에 라이게이션 하여 pGS1- AdhE1(도 7)을 제작하였다.

앞서 제작한 재조합 플라스미드들을 이용하여 pGS1-E1AB를 제작하였다. 먼저 프라이머 CtfAB-UP-XhoI(서열번호 11) 와 E1AB-DN-SalI(서열번호 12)을 사용하여 상기 분리한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 염색체를 주형으로 하여 ctfAB 유전자(서열번호 10)를 증폭하였다(표 4).

증폭된 유전자는 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 XhoI, SalI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-AdhE1 벡터에 라이게이션 하여 pGS1-E1AB를 제작하였다(도 8).

pGS1 - E1AB - atoB 의 제작

전술한 바와 같이 제작한 재조합 플라스미드 pGS1-atoB 및 재조합 플라스미드 pGS1-E1AB를 이용하여 pGS1-E1AB-atoB를 제작하였다.

먼저, 프라이머 pThl-UP-SalI (서열번호 13) 및 pGS-R4 (서열번호 14)을 사용하여 상기 제작한 pGS1-atoB를 주형으로 하여 atoB유전자(서열번호 1) 및 플라스미드의 프로모터와 터미네이터 영역을 증폭하였다(표 5). PCR 반응 혼합물 100μl는 dNTP 250μM, 프라이머를 각각 20pmol, 1.5mM MgCl2, 10buffer 10μl, DNA 주형100ng, pfu 폴리머라제 1 units을 첨가하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분동안 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 중합과정을 25회 반복하였다.

증폭된 유전자는 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 SalI, XmaI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-E1AB 벡터에 라이게이션 하여 pGS1-E1AB-atoB(도 9)를 제작하였다.

pGS1 - E1AB - HCB 의 제작

앞서 제작한 재조합 플라스미드 pGS1-HCB 및 재조합 플라스미드 pGS1-E1AB를 이용하여 pGS1-E1AB-HCB를 제작하였다.

프라이머 pThl-UP-SalI (서열번호 13) 및 pGS-R4 (서열번호 14)을 사용하여 상기 제작한 pGS1-HCB를 주형으로 hbd-crt-bcd 오페론을 코드하는 유전자 (서열번호 4), 프로모터 및 터미네이터 영역을 증폭하였다. PCR 반응 혼합물 100 μl는 dNTP 250μM, 프라이머를 각각 20pmol, 1.5mM MgCl₂, 10buffer 10μl, DNA 주형100ng, pfu 폴리머라제 5 units을 첨가하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분동안 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 4분 동안 중합과정을 30회 반복하였다.

증폭된 유전자는 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 SalI, XmaI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-E1AB 벡터에 라이게이션 하여 pGS1-E1AB-HCB(도 10)를 제작하였다.

<실험예 2> 재조합 미생물의 제작

하기 표 6의 유전자 결실 균주들에 상기 실험예 1에서 제작한 재조합 플라스미드들을 도입하여 형질전환된 재조합 미생물을 제작하였다.

유전자가 결실된 클로스트리디움 균주 각각을 CGM(Clostridium Growth Media) 액체배지(0.75 g/L K₂HPO₄, 0.75 g/L KH₂PO₄, 0.7 g/L, MgSO₄·7H₂O, 0.017 g/L MnSO₄·5H₂O, 0.01 g/L, FeSO₄·7H₂O, 2 g/L (NH₄)2SO₄, 1 g/L NaCl, 2 g/L asparagine, 0.004 g/L p-aminobenzoic acid, 5 g/L, yeast extract, 4.08 g/L CH₃COONa·3H₂O, 및 80 g/L glucose) 60ml에서 OD₆₀₀=0.5가 될 때까지 혐기 조건에서 배양한 후 배양액을 얼음에서 10분 동안 방치 후 7000g로 10분 동안 4 ℃ 에서 배양액을 원심 분리하였다. 세포 펠렛(pellet)을 일렉트로포레이션 (electroporation) 완충용액으로 3회 씻은 다음 같은 완충용액 2ml에 현탁하여 형질전환용 세포를 제작한다. 이렇게 제작된 형질전환용 세포 500ul에 0.5~2.0ug 의 플라스미드들을 첨가하여 Bio-Rad사의 Gene pulser II를 이용하여 일렉트로포레이션(4mm cuvette, 2.5kV, ∞Ω, 25uF)을 수행하고 항생제가 첨가된 배지에서 혐기 배양한 후 형질전환 균주를 제작하였다(표 7).

형질 전환을 위해 사용한 플라스미드들은 모두 일렉트로포레이션 전에 pAN1 벡터로 형질 전환된 대장균 TOP10 균주에서 메틸화되어 클로스트리디움 균주의 restriction system에 작용을 받지 않게 제작된 것들이다.

MLS^r, macrolide lincosamide streptogramin B 저항성

<실험예 3> 회분식 배양에 의한 바이오 부탄올의 생산

회분식 배양을 통하여, 재조합 미생물들에 따른 부탄올 생성능을 시험하였다. 실험예 2에서 제작한 재조합 클로스트리디움 균주들(#1 내지 18)을 CGM 고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 혐기 배양하였다. 배양된 콜로니 각각 1개를 CCM 40ml이 포함된 50ml 일회용 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37 ℃에서 정치하며 OD600=1이 될 때까지 혐기 배양하였다. 배양된 종균을 다시 400ml 6% glucose를 포함하는 CGM 액체배지에 접종하고 37℃에서 정치하며 OD600=1가 될 때까지 혐기 배양하여 8% glucose가 첨가된 CGM 액체배지 1.6L가 포함된 발효조에 접종하여 배양을 시작하였다. pH는 수산화암모늄(NH4OH)를 이용하여 혐기 배양 중 5.0을 유지하였고 질소를 20ml/min 속도로 주입하면서 혐기조건을 유지하였다. Glucose배양 시작 후 3시간 마다 생성되는 부탄올 및 혼합용매의 농도를 분석하였다. 부탄올 및 혼합용매의 분석은 가스 크로마토그래피(Agilent, USA)를 이용하였으며 분석 조건은 하기 표 8과 같다. 당과 유기산의 농도는 배양액을 원심 분리한 후, 상등액을 수득하고, HPLC, 당분석기를 이용해 확인하였다. HPLC 조건은 이동상으로 0.01N 황산을 함유한 물을 이용하였으며 유속은 0.6ml/min이었다. 칼럼은 Aminex87H 및 Aminex87P(Bio-Rad, USA)을 이용하였으며, 생성되는 당과 유기산은 RI(Reflective Index) detector를 이용하여 분석하였다.

이 때, 대조군으로는 야생형인 C. 아세토부틸리쿰 ATCC824를 사용하였다(C1).

그 결과, 1~3번 균주들을 비교해 보면, buk 유전자가 결실된 PJC4BK 균주에서 HCB 오페론과 atoB 유전자가 과발현되면 에탄올 선택도가 17%에서 7%로 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 에탄올은 미생물에 독성을 야기하기 때문에 낮은 농도로 유지하는 것이 연속발효를 통해 부탄올을 생산할 때 매우 중요하다. 그러나 2번 및 3번 균주의 경우 에탄올 선택도가 감소하지만 부탄올 생산성과 수율이 여전히 낮다는 단점이 있다.

한편, 1번 균주와 4번 균주를 비교해 보면 PJC4BK 균주에 adhE1유전자와 ctfAB유전자를 동시에 과발현하면 부탄올 생산성이 향상되는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 4번 균주에 atoB유전자 혹은 HCB operon을 과발현하여 균주의 부탄올 생산성을 증가시키고 에탄올 선택도는 낮게 유지하고자 하였다. 그 결과 균주 2와 3을 각각 5와 6과 비교해 보면, 부탄올 생산성이 각각 41%, 17%증가하는 것을 확인하였다. 그러나 5와 6번 균주의 경우 다시 에탄올 선택도가 7%에서 각각 16%, 13%로 다소 증가하였다.

반면, pta유전자가 결실된 균주들(7~12)경우는 전체적으로 수율이 낮고 특히 에탄올 선택도가 낮았는데, 이로 보아, pta 유전자 결실이 에탄올 선택도를 감소시키는 것으로 판단되었다. 따라서 본 발명자들은 5번 및 6번 균주에 추가적으로 pta유전자가 결실될 경우 에탄올 선택도가 낮아지면서 부탄올 생산성이 높은 상태로 유지할 수 있을 것으로 기대하고, 17번 및 18번 균주의 성능을 확인하였다. 한편, 17번 균주의 경우 5번 균주와 비교해 볼 때 에탄올 선택도가 1/2로 감소하고 부탄올 생산성, 선택도 및 ABE 수율이 각각 7%, 21% 및 15% 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 18번 균주의 경우 6번 균주와 비교해 볼 때 에탄올 선택도는 7% 감소했으나 부탄올 선택도 역시 약 4% 감소했으며 부탄올 생산성 및 수율은 각각 11%, 10% 향상되었다.

이를 종합하여 볼 때, 유기산 생산 관련 유전자인 pta 및 buk 유전자가 결실된 균주에 adhE 및 ctfAB 유전자를 동시에 과발현하면 부탄올 생산성과 수율이 증가하는 경향을 확인할 수 있으며, 이에 추가적으로 atoB 유전자 또는 HCB 오페론을 과발현하면 에탄올 선택도가 감소하면서 부탄올 선택도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(표 9).

*생산성은 exponential phase 기준

<실험예 4> 유가식 배양방법을 이용한 바이오 부탄올의 생산

상기 실험예 3에서 부탄올 선택도, 부탄올 생산성 및 수율 모두가 우수하고, 에탄올 선택도가 낮다고 판단된 6번, 16 내지 18번 재조합 균주에 대하여 부탄올을 선택적으로 흡착할 수 있는 흡착제를 배양기에 첨가하고 유가식 배양을 수행하였다.

먼저, 실험예 2에서 제작한 상기 6, 16, 17 및 18 번 재조합 클로스트리드움 균주들을 CGM 고체배지에 도말하여 37 ℃에서 밤새 혐기 배양하였다. 배양된 콜로니들을 각각 1개씩 CCM 40ml이 포함된 50ml 일회용 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37℃에서 정치하며 OD600=1이 될 때까지 혐기 배양하였다. 배양된 종균을 다시 400ml 6% 글루코스를 포함하는 CGM 액체배지에 접종하고 37℃에서 정치하며 OD600=1가 될 때까지 혐기 배양하여 8% 글루코스와 부탄올을 선택적으로 흡착하는 흡착제 200g을 첨가된 CGM 액체배지 1.6L가 포함된 발효조에 접종하여 배양을 시작하였다. pH는 수산화암모늄(NH4OH)를 이용하여 혐기 배양 중 5.0을 유지하였고 질소를 20ml/min 속도로 주입하면서 혐기조건을 유지하였다. 글루코스 배양 시작 후 3시간 마다 생성되는 부탄올 및 혼합용매의 농도를 분석하였다. 배양액 내 글루코스 농도는 10g/L이상을 유지하기 위해 700g/L Glucose용액을 feeding 용액으로 이용하였다.

연속배양을 통해 부탄올을 고수율, 고생산성 및 고선택도로 생산하기 위해서는 배양 시간 동안 에탄올이 균주에 독성을 야기하지 않도록 에탄올 농도를 낮게 유지하는 것이 매우 중요하다. 유가식 배양 결과를 볼 때, 17번 균주와 18번 균주의 경우 에탄올 선택도가 매우 낮게 유지되면서 부탄올 생산 균주로서의 성능은 높게 유지되는 것으로 확인되었는바, 이들이 장기 연속 배양에 적합할 것으로 예상되었다(표 10).

<실험예 5> 연속배양방법을 이용한 바이오 부탄올의 생산

실험예 4의 결과를 바탕으로 16, 17 및 18번 재조합 균주에 대하여 연속배양 공정을 통해 부탄올 생산 균주로서의 성능을 최종 확인해 보고자 하였다. 먼저 연속 공정을 위한 배양기를 특허출원 제 10-2012-0038770 호를 바탕으로 제작하였다. 먼저 3L의 부피를 가지는 칼럼에 위 아래로 흡착제가 용출돼 유실되는 것을 방지하고자 약 150um 정도의 필터를 장착한 후에 교반기를 장착하고 흡착제 200g을 충진하여 칼럼 2 개를 완성하고 이를 배양기에 실리콘 튜브를 이용하여 연결하고 펌프를 장착하여 배양액이 각 칼럼 간을 순환하도록 장착하였다. 칼럼의 inlet과 outlet은 4-way밸브를 장착하여 배양 과정에서 칼럼내의 흡착제가 부탄올 및 혼합용매로 포화될 때 용출용 용매를 흘려 실시간으로 탈착할 수 있도록 하였다. 첫 번째 칼럼을 탈착시킬 경우, 이때 배양액을 두 번째 칼럼으로 순환시켜, 배양액의 흐름이 연속적으로 이루어질 수 있도록 하였다. 배양액의 순환 방향은 칼럼의 위쪽에서 아래로 순환하였으나 그 방향은 문제가 되지 않는다. 제작한 배양기로 부탄올 및 혼합용매 생산성능을 가지는 16(대조군), 17, 및 18번 균주를 배양하였다. 먼저 3.2L의 CGM 액체배지가 포함된 반응기에 밤새 CGM액체배지에서 혐기 배양한 800ml 종균을 접종하면서 배양을 시작하였다. 본 실험예에서는 일반 배치 발효로 종균을 배양하였다. 배양 시작 후 부탄올 농도가 약 7~8g/L가 되면 배양액을 펌프를 통해 유속을 50ml/min 속도로 칼럼을 통과시키며 배양액을 순환시켰다. 칼럼으로 배양액이 통과하면서 흡착제가 배양액에 현탁되어 묽은 슬러리상을 형성하면서 배양액의 흐름이 cell flock에 의해 막히지 않고 칼럼을 통과하였으며 칼럼 통과직전과 통과직후의 배양액 배양액 시료를 채취하여 부탄올 농도가 8g/L 이하게 되게 유지하였다.

그 결과, 수율, 선택도 및 생산성 모두 HCB오페론 또는 thioase를 코드하는 atoB 유전자가 증폭되는 경우 우수한 것을 확인할 수 있으며 특히 공정안전성(배양시간)측면에서 크게 개선되는 것을 확인할 수 있다. 그러나 HCB 오페론 또는 티올라제가 증폭되지 않은 재조합 균주 16번의 경우 배양시간이 길어질수록 에탄올이 고농도로 축적되면서 균주의 성능이 급격히 저하되어 부탄올 및 혼합용매의 생산성이 크게 저하되는 현상을 보여 88시간 이상 배양이 불가능하였다.

한편, 세 균주의 부탄올 및 총 용매 누적 생산량을 비교해 보면 HCB 오페론 또는 티올라제가 증폭되지 않은 16번 균주의 경우 에탄올 선택도가 27%로 높아 균주 독성으로 인해 용매의 생산성 및 부탄올 선택도가 현저히 저하된 것을 확인할 수 있었다. 반면 각각 HCB 오페론 및 atoB 유전자를 과발현한 17번 균주 및 18번 균주의 경우 배양 100시간 이상 용매의 생산성이 일정하게 유지되면서 안정적으로 부탄올 및 용매를 생산하는 것을 확인할 수 있었다(표 11). 이는 연속배양 동안 공정 안정성이 개선되어 주기적으로 재배양하는 과정을 줄일 수 있어 utility 및 operation cost를 크게 개선할 수 있음을 의미한다.

<110> GS caltex <120> RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED BUTANOL PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING BUTANOL USING THE SAME <130> GSP120701 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1185 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 1 atgaaaaatt gtgtcatcgt cagtgcggta cgtactgcta tcggtagttt taacggttca 60 ctcgcttcca ccagcgccat cgacctgggg gcgacagtaa ttaaagccgc cattgaacgt 120 gcaaaaatcg attcacaaca cgttgatgaa gtgattatgg gtaacgtgtt acaagccggg 180 ctggggcaaa atccggcgcg tcaggcactg ttaaaaagcg ggctggcaga aacggtgtgc 240 ggattcacgg tcaataaagt atgtggttcg ggtcttaaaa gtgtggcgct tgccgcccag 300 gccattcagg caggtcaggc gcagagcatt gtggcggggg gtatggaaaa tatgagttta 360 gccccctact tactcgatgc aaaagcacgc tctggttatc gtcttggaga cggacaggtt 420 tatgacgtaa tcctgcgcga tggcctgatg tgcgccaccc atggttatca tatggggatt 480 accgccgaaa acgtggctaa agagtacgga attacccgtg aaatgcagga tgaactggcg 540 ctacattcac agcgtaaagc ggcagccgca attgagtccg gtgcttttac agccgaaatc 600 gtcccggtaa atgttgtcac tcgaaagaaa accttcgtct tcagtcaaga cgaattcccg 660 aaagcgaatt caacggctga agcgttaggt gcattgcgcc cggccttcga taaagcagga 720 acagtcaccg ctgggaacgc gtctggtatt aacgacggtg ctgccgctct ggtgattatg 780 gaagaatctg cggcgctggc agcaggcctt acccccctgg ctcgcattaa aagttatgcc 840 agcggtggcg tgccccccgc attgatgggt atggggccag tacctgccac gcaaaaagcg 900 ttacaactgg cggggctgca actggcggat attgatctca ttgaggctaa tgaagcattt 960 gctgcacagt tccttgccgt tgggaaaaac ctgggctttg attctgagaa agtgaatgtc 1020 aacggcgggg ccatcgcgct cgggcatcct atcggtgcca gtggtgctcg tattctggtc 1080 acactattac atgccatgca ggcacgcgat aaaacgctgg ggctggcaac actgtgcatt 1140 ggcggcggtc agggaattgc gatggtgatt gaacggttga attaa 1185 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atactgcaga tgaaaaattg tgtcatcgtc agtgcgg 37 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atactcgagt taattcaacc gttcaatcac catc 34 <210> 4 <211> 4759 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 4 atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac 60 agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata 120 ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa 180 tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga 240 aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta 300 atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat 360 ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca 420 cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag 480 cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat 540 aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg 600 agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt 660 gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag 720 gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat 780 agataggagg taagtttata tggattttaa tttaacaaga gaacaagaat tagtaagaca 840 gatggttaga gaatttgctg aaaatgaagt taaacctata gcagcagaaa ttgatgaaac 900 agaaagattt ccaatggaaa atgtaaagaa aatgggtcag tatggtatga tgggaattcc 960 attttcaaaa gagtatggtg gcgcaggtgg agatgtatta tcttatataa tcgccgttga 1020 ggaattatca aaggtttgcg gtactacagg agttattctt tcagcacata catcactttg 1080 tgcttcatta ataaatgaac atggtacaga agaacaaaaa caaaaatatt tagtaccttt 1140 agctaaaggt gaaaaaatag gtgcttatgg attgactgag ccaaatgcag gaacagattc 1200 tggagcacaa caaacagtag ctgtacttga aggagatcat tatgtaatta atggttcaaa 1260 aatattcata actaatggag gagttgcaga tacttttgtt atatttgcaa tgactgacag 1320 aactaaagga acaaaaggta tatcagcatt tataatagaa aaaggcttca aaggtttctc 1380 tattggtaaa gttgaacaaa agcttggaat aagagcttca tcaacaactg aacttgtatt 1440 tgaagatatg atagtaccag tagaaaacat gattggtaaa gaaggaaaag gcttccctat 1500 agcaatgaaa actcttgatg gaggaagaat tggtatagca gctcaagctt taggtatagc 1560 tgaaggtgct ttcaacgaag caagagctta catgaaggag agaaaacaat ttggaagaag 1620 ccttgacaaa ttccaaggtc ttgcatggat gatggcagat atggatgtag ctatagaatc 1680 agctagatat ttagtatata aagcagcata tcttaaacaa gcaggacttc catacacagt 1740 tgatgctgca agagctaagc ttcatgctgc aaatgtagca atggatgtaa caactaaggc 1800 agtacaatta tttggtggat acggatatac aaaagattat ccagttgaaa gaatgatgag 1860 agatgctaag ataactgaaa tatatgaagg aacttcagaa gttcagaaat tagttatttc 1920 aggaaaaatt tttagataat ttaaggaggt taagaggatg aatatagttg tttgtttaaa 1980 acaagttcca gatacagcgg aagttagaat agatccagtt aagggaacac ttataagaga 2040 aggagttcca tcaataataa atccagatga taaaaacgca cttgaggaag ctttagtatt 2100 aaaagataat tatggtgcac atgtaacagt tataagtatg ggacctccac aagctaaaaa 2160 tgctttagta gaagctttgg ctatgggtgc tgatgaagct gtacttttaa cagatagagc 2220 atttggagga gcagatacac ttgcgacttc acatacaatt gcagcaggaa ttaagaagct 2280 aaaatatgat atagtttttg ctggaaggca ggctatagat ggagatacag ctcaggttgg 2340 accagaaata gctgagcatc ttggaatacc tcaagtaact tatgttgaga aagttgaagt 2400 tgatggagat actttaaaga ttagaaaagc ttgggaagat ggatatgaag ttgttgaagt 2460 taagacacca gttcttttaa cagcaattaa agaattaaat gttccaagat atatgagtgt 2520 agaaaaaata ttcggagcat ttgataaaga agtaaaaatg tggactgccg atgatataga 2580 tgtagataag gctaatttag gtcttaaagg ttcaccaact aaagttaaga agtcatcaac 2640 taaagaagtt aaaggacagg gagaagttat tgataagcct gttaaggaag cagctgatat 2700 gttgtctcaa aattaaaaga agaacacata tttaagttag gagggatttt tcaatgaata 2760 aagcagatta caagggcgta tgggtgtttg ctgaacaaag agacggagaa ttacaaaagg 2820 tatcattgga attattaggt aaaggtaagg aaatggctga gaaattaggc gttgaattaa 2880 cagctgtttt acttggacat aatactgaaa aaatgtcaaa ggatttatta tctcatggag 2940 cagataaggt tttagcagca gataatgaac ttttagcaca tttttcaaca gatggatatg 3000 ctaaagttat atgtgattta gttaatgaaa gaaagccaga aatattattc ataggagcta 3060 ctttcatagg aagagattta ggaccaagaa tagcagcaag actttctact ggtttaactg 3120 ctgattgtac atcacttgac atagatgtag aaaatagaga tttattggct acaagaccag 3180 cgtttggtgg aaatttgata gctacaatag tttgttcaga ccacagacca caaatggcta 3240 cagtaagacc tggtgtgttt tttgaaaaat tacctgttaa tgatgcaaat gtttctgatg 3300 ataaaataga aaaagttgca attaaattaa cagcatcaga cataagaaca aaagtttcaa 3360 aagttgttaa gcttgctaaa gatattgcag atatcggaga agctaaggta ttagttgctg 3420 gtggtagagg agttggaagc aaagaaaact ttgaaaaact tgaagagtta gcaagtttac 3480 ttggtggaac aatagccgct tcaagagcag caatagaaaa agaatgggtt gataaggacc 3540 ttcaagtagg tcaaactggt aaaactgtaa gaccaactct ttatattgca tgtggtatat 3600 caggagctat ccagcattta gcaggtatgc aagattcaga ttacataatt gctataaata 3660 aagatgtaga agccccaata atgaaggtag cagatttggc tatagttggt gatgtaaata 3720 aagttgtacc agaattaata gctcaagtta aagctgctaa taattaagat aaataaaaag 3780 aattatttaa agcttattat gccaaaatac ttatatagta ttttggtgta aatgcattga 3840 tagtttcttt aaatttaggg aggtctgttt aatgcattga tagttcttta aatttaggga 3900 ggtctgttta atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc 3960 tcaggcattt gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt 4020 tgatagagga ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat 4080 agaagaagct actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat 4140 ggcagctgat tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca 4200 gatttttgct gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc 4260 atcactttca ataacagaag tggcatcagc aactaaaact aatgataagg ttataggtat 4320 gcatttcttt aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac 4380 atcacaagaa acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt 4440 agaagtagca gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga 4500 agcagttggt atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa 4560 acttggagct aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat 4620 atgtcttgct ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca 4680 tacattactt aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt 4740 ctacgattat tcaaaataa 4759 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atactgcaga tggaactaaa caatgtcatc cttgaaaagg aagg 44 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atactcgagt tattttgaat aatcgtagaa accttttcct g 41 <210> 7 <211> 2589 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 7 atgaaagtca caacagtaaa ggaattagat gaaaaactca aggtaattaa agaagctcaa 60 aaaaaattct cttgttactc gcaagaaatg gttgatgaaa tctttagaaa tgcagcaatg 120 gcagcaatcg acgcaaggat agagctagca aaagcagctg ttttggaaac cggtatgggc 180 ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat 240 aaggatgaaa aaacctgcgg tataattgaa cgaaatgaac cctacggaat tacaaaaata 300 gcagaaccta taggagttgt agctgctata atccctgtaa caaaccccac atcaacaaca 360 atatttaaat ccttaatatc ccttaaaact agaaatggaa ttttcttttc gcctcaccca 420 agggcaaaaa aatccacaat actagcagct aaaacaatac ttgatgcagc cgttaagagt 480 ggtgccccgg aaaatataat aggttggata gatgaacctt caattgaact aactcaatat 540 ttaatgcaaa aagcagatat aacccttgca actggtggtc cctcactagt taaatctgct 600 tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt ggtccgggta acaccccagt aataattgat 660 gaatctgctc atataaaaat ggcagtaagt tcaattatat tatccaaaac ctatgataat 720 ggtgttatat gtgcttctga acaatctgta atagtcttaa aatccatata taacaaggta 780 aaagatgagt tccaagaaag aggagcttat ataataaaga aaaacgaatt ggataaagtc 840 cgtgaagtga tttttaaaga tggatccgta aaccctaaaa tagtcggaca gtcagcttat 900 actatagcag ctatggctgg cataaaagta cctaaaacca caagaatatt aataggagaa 960 gttacctcct taggtgaaga agaacctttt gcccacgaaa aactatctcc tgttttggct 1020 atgtatgagg ctgacaattt tgatgatgct ttaaaaaaag cagtaactct aataaactta 1080 ggaggcctcg gccatacctc aggaatatat gcagatgaaa taaaagcacg agataaaata 1140 gatagattta gtagtgccat gaaaaccgta agaacctttg taaatatccc aacctcacaa 1200 ggtgcaagtg gagatctata taattttaga ataccacctt ctttcacgct tggctgcgga 1260 ttttggggag gaaattctgt ttccgagaat gttggtccaa aacatctttt gaatattaaa 1320 accgtagctg aaaggagaga aaacatgctt tggtttagag ttccacataa agtatatttt 1380 aagttcggtt gtcttcaatt tgctttaaaa gatttaaaag atctaaagaa aaaaagagcc 1440 tttatagtta ctgatagtga cccctataat ttaaactatg ttgattcaat aataaaaata 1500 cttgagcacc tagatattga ttttaaagta tttaataagg ttggaagaga agctgatctt 1560 aaaaccataa aaaaagcaac tgaagaaatg tcctccttta tgccagacac tataatagct 1620 ttaggtggta cccctgaaat gagctctgca aagctaatgt gggtactata tgaacatcca 1680 gaagtaaaat ttgaagatct tgcaataaaa tttatggaca taagaaagag aatatatact 1740 ttcccaaaac tcggtaaaaa ggctatgtta gttgcaatta caacttctgc tggttccggt 1800 tctgaggtta ctccttttgc tttagtaact gacaataaca ctggaaataa gtacatgtta 1860 gcagattatg aaatgacacc aaatatggca attgtagatg cagaacttat gatgaaaatg 1920 ccaaagggat taaccgctta ttcaggtata gatgcactag taaatagtat agaagcatac 1980 acatccgtat atgcttcaga atacacaaac ggactagcac tagaggcaat acgattaata 2040 tttaaatatt tgcctgaggc ttacaaaaac ggaagaacca atgaaaaagc aagagagaaa 2100 atggctcacg cttcaactat ggcaggtatg gcatccgcta atgcatttct aggtctatgt 2160 cattccatgg caataaaatt aagttcagaa cacaatattc ctagtggcat tgccaatgca 2220 ttactaatag aagaagtaat aaaatttaac gcagttgata atcctgtaaa acaagcccct 2280 tgcccacaat ataagtatcc aaacaccata tttagatatg ctcgaattgc agattatata 2340 aagcttggag gaaatactga tgaggaaaag gtagatctct taattaacaa aatacatgaa 2400 ctaaaaaaag ctttaaatat accaacttca ataaaggatg caggtgtttt ggaggaaaac 2460 ttctattcct cccttgatag aatatctgaa cttgcactag atgatcaatg cacaggcgct 2520 aatcctagat ttcctcttac aagtgagata aaagaaatgt atataaattg ttttaaaaaa 2580 caaccttaa 2589 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cacctgcaga tgaaagtcac aacagtaaag gaattagat 39 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cacctcgagt taaggttgtt ttttaaaaca atttatatac a 41 <210> 10 <211> 1537 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 10 accttcatat ttcaactact ttttataatt ttaataaaga atttaaaagg agggattaaa 60 atgaactcta aaataattag atttgaaaat ttaaggtcat tctttaaaga tgggatgaca 120 attatgattg gaggtttttt aaactgtggc actccaacca aattaattga ttttttagtt 180 aatttaaata taaagaattt aacgattata agtaatgata catgttatcc taatacaggt 240 attggtaagt taatatcaaa taatcaagta aaaaagctta ttgcttcata tataggcagc 300 aacccagata ctggcaaaaa actttttaat aatgaacttg aagtagagct ctctccccaa 360 ggaactctag tggaaagaat acgtgcaggc ggatctggct taggtggtgt actaactaaa 420 acaggtttag gaactttgat tgaaaaagga aagaaaaaaa tatctataaa tggaacggaa 480 tatttgttag agctacctct tacagccgat gtagcattaa ttaaaggtag tattgtagat 540 gaggccggaa acaccttcta taaaggtact actaaaaact ttaatcccta tatggcaatg 600 gcagctaaaa ccgtaatagt tgaagctgaa aatttagtta gctgtgaaaa actagaaaag 660 gaaaaagcaa tgacccccgg agttcttata aattatatag taaaggagcc tgcataaaat 720 gattaatgat aaaaacctag cgaaagaaat aatagccaaa agagttgcaa gagaattaaa 780 aaatggtcaa cttgtaaact taggtgtagg tcttcctacc atggttgcag attatatacc 840 aaaaaatttc aaaattactt tccaatcaga aaacggaata gttggaatgg gcgctagtcc 900 taaaataaat gaggcagata aagatgtagt aaatgcagga ggagactata caacagtact 960 tcctgacggc acatttttcg atagctcagt ttcgttttca ctaatccgtg gtggtcacgt 1020 agatgttact gttttagggg ctctccaggt agatgaaaag ggtaatatag ccaattggat 1080 tgttcctgga aaaatgctct ctggtatggg tggagctatg gatttagtaa atggagctaa 1140 gaaagtaata attgcaatga gacatacaaa taaaggtcaa cctaaaattt taaaaaaatg 1200 tacacttccc ctcacggcaa agtctcaagc aaatctaatt gtaacagaac ttggagtaat 1260 tgaggttatt aatgatggtt tacttctcac tgaaattaat aaaaacacaa ccattgatga 1320 aataaggtct ttaactgctg cagatttact catatccaat gaacttagac ccatggctgt 1380 ttagaaagaa atactatgaa acaatattaa aaaaataaga gttaccattt aaggtaactc 1440 ttatttttat tacttaagat aatcatatat aacttcagct ctaggcaata ttatatctgc 1500 aagaatgtga gagctagaaa caatctcttt tactggc 1537 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cacctcgaga ccttcatatt tcaactactt tttat 35 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tacgcgtcga cgccagtaaa agagattgtt tctagc 36 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atagtcgaca tgaagtttct tatgcacaag tattttttat tacattaa 48 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 taagttgggt aacgccaggg 20

Claims

아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로가 억제되고,
아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진되며,
상기 아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로는 아세틸 코에이가 포스포트랜스아세틸라제 또는 아세테이트 키나아제에 의하여 아세테이트로 전환되는 경로이고,
상기 아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로는 아세틸 코에이가 티올라제 또는 hbd-crt-bcd 오페론에 의하여 부티릴 코에이로 전환되는 경로인,
에탄올 생성능은 감소되고 부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물.
삭제
제 1항에 있어서,
포스포트랜스아세틸라제가 억제됨으로써 아세틸 코에이를 아세테이트로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
아세틸 코에이를 아세토아세틸 코에이로 전환하는 경로 또는 아세토아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진되며,
상기 아세틸 코에이를 아세토아세틸 코에이로 전환하는 경로는 아세틸 코에이가 티올라제에 의하여 아세토아세틸 코에이로 전환되는 경로이고,
상기 아세토아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로는 상기 아세토아세틸 코에이가 hbd-crt-bcd 오페론에 의하여 부티릴 코에이로 전환되는 경로인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
티올라제 또는 hbd-crt-bcd 오페론의 활성이 증가함으로써, 아세틸 코에이를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
부티릴 코에이를 부티레이트로 전환하는 경로가 억제되며,
상기 부티릴 코에이를 부티레이트로 전환하는 경로는 부티릴 코에이가 부티레이트 키나아제 또는 포스포트랜스부틸라제에 의하여 부티레이트로 전환되는 경로인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 6항에 있어서,
부티레이트 키나아제를 억제함으로써 부티릴 코에이를 부티레이트로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
아세테이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로 또는 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진되며,
상기 아세테이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로는 아세테이트가 코에이트랜스퍼라제에 의하여 아세틸 코에이로 전환되는 경로이고,
상기 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로는 부티레이트가 코에이트랜스퍼라제에 의하여 부티릴 코에이로 전환되는 경로인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 8항에 있어서,
코에이트랜스퍼라제의 활성이 증가됨으로써 아세테이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로 또는 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로가 촉진되며,
상기 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로는 부티릴 코에이가 알데히드/알코올 디하이드로게나제에 의하여 부탄올로 전환되는 경로인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 10항에 있어서,
알데히드/알코올 디하이드로게나제의 활성이 증가됨으로써 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
포스포트랜스아세틸라제를 코드하는 유전자인 pta가 결실 또는 억제되고,
티올라제를 코드하는 유전자인 atoB 및 hbd-crt-bcd 오페론 중 적어도 하나가 도입되거나 발현이 증진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
회분식 배양을 기준으로, 에탄올 선택도는 15% 이하이고, 부탄올 선택도는 70% 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
유가식 배양을 기준으로 에탄올 선택도가 15% 이하인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
연속 배양을 기준으로 에탄올 선택도가 20% 이하인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항 및 제 3항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및
상기 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법.