KR20170024466A

KR20170024466A - 효소복합체의 제조 및 이를 이용한 목적물질의 생산 방법

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Publication number: KR20170024466A
Application number: KR1020150119784A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 김하성; 성원재; 염수진; 이대희; 정흥채; 한귀환
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-08-25
Filing date: 2015-08-25
Publication date: 2017-03-07
Also published as: WO2017034304A1

Abstract

본 발명은 목적 물질 생합성에 관여하는 합성 효소의 효소 복합체 및 이를 이용한 목적 물질의 생산 방법에 관한 것으로서, 섬유소결합도메인 및 목적 물질 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들을 포함하고, 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들이 각각 섬유소결합도메인과 연결되는 효소 복합체를 제공하며, 이러한 효소 복합체는 목적 물질의 전구체로부터 목적 물질로 전환되는 일련의 과정에 작용하는 효소들의 물리적인 간격을 좁힘으로써 중간 생성물이 즉각적으로 다음 반응에 참여할 수 있도록 유도할 수 있고, 그로 인해 전체적인 목적 물질의 생성의 속도나 수율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

효소복합체의 제조 및 이를 이용한 목적물질의 생산 방법{Making of Enzyme Complex and Producing Method of Target Substance Using the Same}

본 발명은 효소 복합체의 제조 및 이를 이용한 목적 물질의 생산 방법에 관한 것이다.

세균을 사용한 발효법으로 부탄올 등의 목적 물질을 제조하기 위해서는 고활성 야생형 세균(야생주)을 자연으로부터 직접 분리하여 사용하는 방법, 알려진 미생물에 물질제조에 필요한 목적 유전자를 도입한 변이주를 사용하는 방법, 고활성 야생주에 변이주의 성질까지 도입한 미생물을 사용하는 방법 등이 있다.

구체적으로, 대사 조절 변이주를 제조하는 방법으로는, 즉 새로운 물질대사 경로를 만들거나 물질대사 과정에 포함된 경로를 조작/변화시켜서 목적 물질의 생산 효율을 높이는 다양한 기술들이 이용되고 있다. 이러한 기술은 특정/목적 산물의 합성과 관련된 하나 이상의 목적 단백질(또는 효소)의 발현 또는 활성이 촉진되거나 억제될 것이 전제된다. 예를 들면, 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 대해서, 특허문헌 1에는 아세틸-CoA를 아세테이트로 전환하는 경로에 관여하는 단백질(또는 효소)의 발현 또는 활성이 억제되고, 아세틸-CoA를 부티릴-CoA로 전환하는 경로에 관여하는 단백질(또는 효소)의 발현 또는 활성이 촉진된 미생물이 개시되어 있다.

또는 위와 같은 노력의 일환으로, 부탄올 합성에 관여하는 효소인 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, HBD), 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase, CRT), 트랜스-에노일-CoA 환원효소(trans-enoyl-CoA reductase, TER), 알데히드/알코올 탈수소효소(aldehyde and alcohol dehydrogenase, AdhE2) 등과 같은 효소를 미생물에 도입하여 부탄올의 생산 효율을 향상시키고자 하는 시도도 있었다(특허문헌 2).

이와 같이, 미생물을 이용하여 부탄올을 생산하는 경우에는 부탄올 합성 경로 중 NADH가 NAD⁺로 환원되는 반응을 통해 미생물 내에 부탄올 합성 경로의 중간 생성물들이 축적될 수는 있으나, 세포 내부에서는 부탄올 합성 경로에 관여하는 효소들 외에도 다양한 전환효소들이 존재하고 있기 때문에, 실제로는 부탄올 합성 경로의 중간 생성물인 3-히드록시부티릴-CoA, 크로토닐-CoA, 부티릴-CoA, 부티릴알데히드의 축적이 방해받게 된다. 예를 들면, 부티릴-CoA의 경우, 알데히드/알코올 탈수소효소에 의해 부티릴알데히드로 전환되어야 하지만, 포스포트랜스 부티릴라제(phosphotrans butyrylase)에 의해 부티릴-P로 전환될 수도 있는 것이다.

또한, 목적 물질로서 숙신산을 미생물을 이용하여 생산하는 경우에도 TCA 회로의 산화적 인산화 반응을 통해 미생물 내에 C4 화합물들이 축적될 수는 있으나, 세포 내부에서는 TCA 회로에 관여하는 효소들 외에도 다양한 C4 전환효소들이 존재하고 있기 때문에, 실제로는 말산, 푸마르산, 숙신산의 축적이 방해받게 된다. 예를 들면, 옥살아세트산(oxaloacetate, OAA)의 경우, 말산 탈수소효소에 의하여 말산으로 전환되어야 하지만, 동시에 아미노전이효소(aminotransferase)에 의해 아스파르트산(aspartate)으로 전환되기도 하고, 말산으로부터 푸마르산을 생합성하는 반응도 탈수소 반응의 역반응으로 진행하기 어려운 것으로 판단되고 있다.

이에, 본 발명자들은 목적 물질의 합성 효율을 높이기 위해 목적 물질의 생합성 관련 효소들이 존재하는 물리적 간격을 좁혀 중간 생성물이 즉각적으로 반응에 참여함으로써 다른 기타 효소들에 의해 축적이 방해되는 문제를 해소할 수 있는 시스템에 대하여 연구하였고, 대장균 내에서 불용성 단백질 구조체를 형성하는 것으로 알려져 있는 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)을 이용하여 세포 내에서 목적 물질의 합성 관련 효소들을 고정 및 집적함으로써 고효율/고수율로 목적 물질을 생산할 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국 공개특허 2014-0064469 일본 특허출원 2009-113632

본 발명의 목적은 생물 공정으로 목적 물질을 생산함에, 목적 물질의 생산 효율을 향상시킬 수 있는 목적 물질의 합성을 위한 효소들의 복합체, 및 이를 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD); 류신 지퍼; 및 전구체로부터 목적 물질의 생합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들;을 포함하고, 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 각각은 상기 류신 지퍼를 통해 상기 섬유소결합도메인에 연결되며, 상기 각각의 효소들이 연결된 섬유소결합도메인들은 서로 응집되어 복합체화되는 것을 특징으로 하는 목적 물질 생합성을 위한 효소 복합체를 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 섬유소결합도메인과 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터와 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 각각이 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질과 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터; 또는 섬유소결합도메인과 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터와 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 각각이 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질과 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터;가 숙주세포에 도입된 목적 물질의 합성을 위한 형질전환체를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체로부터 상기 재조합 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체의 인 비보(in vivo) 제조 방법, 및 상기 형질전환체로부터 목적 물질의 합성에 관여하는 효소와 류신 지퍼의 CZ 단백질 또는 NZ 단백질이 융합된 융합 단백질과 섬유소결합도메인과 류신 지퍼의 NZ 단백질 또는 CZ 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현 및 정제하는 단계 및 상기 발현/정제된 재조합 단백질을 시험관 내에서 결합 및 응집시키는 단계를 포함하는 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체의 인 비트로(in vitro) 제조 방법을 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체를 시험관 내에서 목적 물질의 전구체와 반응시키는 단계를 포함하는, 효소 복합체를 이용한 인 비트로(in vitro) 상에서의 목적 물질의 생산 방법을 제공한다.

아울러, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 목적 물질의 전구체의 존재 하에서 배양시키는 단계를 포함하는, 효소 복합체를 이용한 인 비보(in vivo) 상에서의 목적 물질의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 효소 복합체는 목적 물질의 합성 효소들을 섬유소결합도메인으로 고정하여 세포 내에서 목적 물질의 전구체(예, 포도당)로부터 목적 물질로 전환되는 일련의 과정에 작용하는 효소의 물리적인 간격을 좁힘으로써, 중간 생성물이 즉각적으로 다음 반응에 참여할 수 있도록 유도할 수 있고, 그로 인해 전체적인 목적 물질의 생성 속도나 수율을 향상시킬 수 있다. 또한 세포 내에서 각 효소들이 고정된 상태로 존재할 수 있도록 함으로써, 각 효소의 안정성 또한 확보할 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 효소 복합체의 개략도이다.
도 2는 섬유소결합도메인과 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들이 류신 지퍼를 통해 연결된 구조를 도시한 도면이다.
도 3은 n-부탄올 합성 경로를 나타낸다.
도 4는 1,4-부탄디올 합성 경로를 나타낸다.
도 5는 이소프렌 합성 경로를 나타낸다.
도 6a는 류신 지퍼의 일부를 이루는 NZ 단백질과 섬유소결합도메인이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝되어 있는 재조합 벡터(pET21a-NZ::CBD)의 맵을 나타낸다.
도 6b는 류신 지퍼의 일부를 이루는 CZ 단백질과 섬유소결합도메인이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝되어 있는 재조합 벡터(pET21a-CZ::CBD)의 맵을 나타낸다.
도 7a는 대조군으로서, 부탄올 합성에 관여하는 효소인 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, HBD), 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase, CRT), 트랜스-에노일-CoA 환원효소(trans-enoyl-CoA reductase, TER) 및 알데히드/알코올 탈수소효소(aldehyde and alcohol dehydrogenase, AdhE2)가 각각 발현되도록 제작된 재조합 벡터(pACBB-HCTA)의 맵을 나타낸다.
도 7b는 도 7a의 재조합 벡터 pACBB-HCTA를 제작하는 과정을 나타낸다.
도 8a는 실험군으로서, 부탄올 합성에 관여하는 효소인 HBD, CRT, TER, AdhE2 각각에 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터(pACBB-CZ::HCTA)를 나타낸다.
도 8b는 도 8a의 재조합 벡터 pACBB-CZ::HCTA를 제작하는 과정을 나타낸다.
도 9는 ①대조군인 pET21a-NZ::CBD와 pACBB-HCTA의 조합과 ②실험군인 pET21a-NZ::CBD와 pACBB-CZ::HCTA의 조합을, 각각 대장균 MG1655에 도입하여 발현시키고 정제하였을 때, 섬유소결합도메인과 부탄올 합성에 관여하는 효소들의 발현 정도를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 10a는 부탄올 생합성에 관여하는 각각의 개별 효소들이, ①유리된 상태로 존재하는 형질전환체(대조군) 및 ②본 발명에 따른 효소 복합체를 형성한 형질전환체(실험군)로부터 용해성 분획과 불용성 분획을 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이고, 도 10b는 대조군과 실험군에서 유래한 각 용해성 분획과 불용성 분획에서 각 효소들의 활성 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 인 비트로(in vitro)에서, 부탄올 생합성에 관여하는 각각의 개별 효소들이, ①유리된 상태로 존재하는 경우의 부탄올 생성 정도 및 ②본 발명에 따른 효소 복합체를 형성한 경우의 부탄올 생산 정도를 나타낸 그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 부탄올 생합성에 관여하는 각각의 개별 효소들이, 형질전환체 내에서 ①유리된 상태로 존재하는 경우(대조군)와 ②본 발명에 따른 효소 복합체를 형성하여 존재하는 경우(실험군)에, 호기 조건의 인 비보(in vivo)에서 부탄올 생성 효율을 확인한 결과이다(도 12a: 대조군, 도 12b: 실험군).
도 13a 및 도 13b는 부탄올 생합성에 관여하는 각각의 개별 효소들이, 형질전환체 내에서 ①유리된 상태로 존재하는 경우(대조군)와 ②본 발명에 따른 효소 복합체를 형성하여 존재하는 경우(실험군)에, 혐기 조건의 인 비보(in vivo)에서 부탄올 생성 효율을 확인한 결과이다(도 13a: 대조군, 도 13b: 실험군).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 목적 물질 합성을 위한 효소 복합체

본 발명의 일 측면은 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체를 제공한다.

도 1은 상기와 같은 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체의 구조를 도시한 개략도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 효소 복합체는 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 및 섬유소결합도메인을 포함한다.

상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소는 전구체로부터 목적 물질이 생성되는 일련의 대사 과정에 참여하는 모든 효소를 의미하며, 그 중에서 선택된 둘 이상의 효소이다.

상기 목적 물질은 생체 내의 2개 이상의 효소가 관여하는 일련의 대사 과정에 의해 생성될 수 있는 모든 생합성 물질일 수 있고, 예를 들어 부탄올, 1,4-부탄디올, 이소프렌, 숙신산, ε-카프로락탐 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 목적 물질이 부탄올인 경우, 상기 목적 물질인 부탄올의 합성에 관여하는 효소는 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, HBD), 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase, CRT), 트랜스-에노일-CoA 환원효소(trans-enoyl-CoA reductase, TER) 및 알데히드/알코올 탈수소효소(aldehyde and alcohol dehydrogenase, AdhE2)로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 다른 2 종류 이상일 수 있다. 또한, 상기 부탄올 합성에 관여하는 효소들은 Clostridium acetobutylicum 또는Treponema denticola 유래의 효소들일 수 있으나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소 및 알데히드/알코올 탈수소효소는 C. acetobutylicum로부터 유래한 것이고, 트랜스-에노일-CoA 환원효소는 T. denticola로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 특히, 상기 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 트랜스-에노일-CoA 환원효소는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 알데히드/알코올 탈수소효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

상기 목적 물질이 1,4-부탄디올인 경우, 상기 목적 물질인 1,4-부탄디올의 합성에 관여하는 효소는 숙시닐-CoA 합성효소(Succinyl-CoA synthetase, sucCD), CoA-의존성 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase, sucD), 4-히드록시부티레이트 탈수소효소(4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-HBD), 4-히드록시부티릴-CoA 전이효소(4-hydroxybutyryl-CoA transferase, 4-HBT) 및 알데히드/알코올 탈수소효소(Aldehyde/Alcohol dehydrogenase, AdhE2)로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 다른 2 종류 이상일 수 있다. 상기 숙시닐-CoA 합성효소는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CoA-의존성 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 4-히드록시부티레이트 탈수소효소는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 4-히드록시부티릴-CoA 전이효소는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 알데히드/알코올 탈수소효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

상기 목적 물질이 이소프렌인 경우, 상기 목적 물질인 이소프렌의 합성에 관여하는 효소는 히드록시메틸글루타릴 CoA 생성효소(hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mvaS), 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, mvaA), 메발로네이트 인산화효소(mevalonate kinase, mvaK1), 아세틸-CoA 아세틸 전이효소/HMG-CoA 환원효소(acetyl-CoA acetyltransferase/HMG-CoA reductase, mvaE), 포스포메발로네이트 인산화효소(phosphomevalonate kinase, mvaK2), 디포스포메발로네이트 탈탄산효소(diphosphomevalonate decarboxylase, mvaD), 이소펜틸-디포스페이트 델타 이성질화효소(isopentenyl-diphosphate delta isomerase, idi) 및 이소프렌 생성효소(isoprene synthase, IspS)로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 다른 2 종류 이상일 수 있다. 상기 히드록시메틸글루타릴 CoA 생성효소는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 메발로네이트 인산화효소는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아세틸-CoA 아세틸전이효소/HMG-CoA 환원효소는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 포스포메발로네이트 인산화효소는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 디포스포메발로네이트 탈탄산효소는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이소펜틸-디포스페이트 델타 이성질화효소는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

상기 목적 물질이 숙신산인 경우, 상기 목적 물질인 숙신산의 합성에 관여하는 효소는 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소(phosphoenolpyruvate carboxykinase, pckA), 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, mdh), 푸마라아제(fumarase, fum) 및 숙신산 유비퀴논 산화환원효소(succinate ubiquinone oxidoreductase, sdhABCD)로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 다른 2 종류 이상일 수 있다.

상기 목적 물질이 ε-카프로락탐인 경우, 상기 목적 물질인 ε-카프로락탐 합성에 관여하는 효소는 CoA 의존성 알데히드 탈수소효소(CoA-dependent aldehyde dehydrogenase), 아미노기전이효소(transaminase) 및 아미드 가수분해효소(amide hydrolase)로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 다른 2 종류 이상일 수 있다.

상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들은 각 효소들의 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4; 서열번호 11 내지 14; 및 서열번호 19 내지 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 부탄올 합성에 관여하는 효소인 상기 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소는 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되며, 상기 트랜스-에노일-CoA 환원효소는 서열번호 8의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 알데히드/알코올 탈수소효소는 서열번호 9의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

1,4-부탄디올 합성에 관여하는 효소인 상기 숙시닐-CoA 합성효소는 서열번호 15의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 CoA-의존성 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소는 서열번호 16의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되며, 상기 4-히드록시부티레이트 탈수소효소는 서열번호 17의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 4-히드록시부티릴-CoA 전이효소는 서열번호 18의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되며, 상기 알데히드/알코올 탈수소효소는 서열번호 9의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.

이소프렌 합성에 관여하는 효소인 상기 히드록시메틸글루타릴 CoA 생성효소는 서열번호 25의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 메발로네이트 인산화효소는 서열번호 26의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되며, 상기 아세틸-CoA 아세틸전이효소/HMG-CoA 환원효소는 서열번호 27의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 포스포메발로네이트 인산화효소는 서열번호 28의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되며, 상기 디포스포메발로네이트 탈탄산효소는 서열번호 29의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 이소펜틸-디포스페이트 델타 이성질화효소는 서열번호 30의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.

본 발명의 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들 및 이들의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 대한 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 서열번호 6 내지 서열번호 9; 서열번호 15 내지 서열번호 18; 및 서열번호 25 내지 서열번호 30의 염기 서열을 포함하는 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)은 인 비보(in vivo)의 환경에서 발현되면 그 발현된 단백질이 자발적으로 응집되어 봉입체(inclusion body)를 형성하는 특성 및 섬유소에 결합하는 특성을 가지는 도메인이다. 상기 섬유소결합도메인은 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)에서 유래한 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이라면 제한없이 이용될 수 있다. 또한, 상기 섬유소결합도메인은 서열번호 10의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화될 수 있으나 이에 한정되지 않고, 서열번호 10의 염기 서열과 실질적으로 동일한 염기 서열이라면 제한없이 이용될 수 있다.

상기 섬유소결합도메인의 일 말단에는 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들이 각각 연결된다. 상기 섬유소결합도메인과 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소는 제3의 매개체를 통해 연결될 수 있다. 상기 섬유소결합도메인과 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들의 연결이 제3의 매개체를 통해 이루어지는 경우, 상기 제3의 매개체는 류신 지퍼일 수 있다. 류신 지퍼는 CZ 단백질과 NZ 단백질로 이루어지는 이종 이량체(heterodimer)인데, 상기 CZ 단백질과 NZ 단백질은 각 단백질에 존재하는 글루탐산(glutamic acid)과 라이신(lysine)의 정전기적 상호작용에 의해서 결합될 수 있다. 상기 류신 지퍼를 통한 연결은 ⅰ) 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들에 융합된 CZ 단백질과 상기 섬유소결합도메인에 융합된 NZ 단백질이 상호 결합됨으로써 이루어지거나(도 2 참고), 또는 상기 CZ 단백질과 NZ 단백질이 융합된 대상이 바뀐 상태, 즉 ⅱ) 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들에 융합된 NZ 단백질과 상기 섬유소결합도메인에 융합된 CZ 단백질이 상호 결합됨으로써 이루어질 수 있다.

상기 CZ 단백질은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 32의 염기 서열로 암호화되며, 상기 NZ 단백질은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 34의 염기 서열로 암호화되나, 이에 한정하지 아니한다.

또한, 상기 섬유소결합도메인, CZ 단백질, NZ 단백질은 각 도메인의 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 단백질의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 5, 서열번호 31 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 본 발명의 상기 섬유소결합도메인, 상기 류신 지퍼를 이루는 단백질들 및 이들의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 대한 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 서열번호 10, 서열번호 32 및 서열번호 34의 염기 서열을 포함하는 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다.

상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들이 결합된 섬유소결합도메인은 자발적으로 서로 응집되는 특성이 있으므로 상기 섬유소결합도메인에 결합된 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들을 서로 응집시켜 고정시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들이 결합되지 않은 섬유소결합도메인의 타 말단이 서로 응집하여 봉입체를 형성하게 되고, 이렇게 형성된 봉입체의 표면에는 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들이 높은 밀도로 집적되어 존재할 수 있게 된다.

또한, 상기 섬유소결합도메인은 섬유소가 존재하는 경우에는 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들을 상기 섬유소에 결합 및 고정시키는 역할을 한다. 상기 섬유소결합도메인의 일 말단에는 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들이, 그리고 상기 섬유소결합도메인의 타 말단에는 섬유소가 각각 결합됨으로써, 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들이 섬유소 상에 결합 및 고정될 수 있는 것이며, 상기 섬유소결합도메인의 타 말단은 도메인 자체가 가지고 있는 섬유소 결합 특성에 의해 상기 섬유소에 결합될 수 있다.

상기와 같이 섬유소결합도메인의 타 말단이 섬유소에 결합되어 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들을 결합 및 고정시키는 경우, 상기 섬유소는 본 발명의 효소 복합체의 지지체가 되는 것으로서, 생물체 내에 존재하는 모든 종류의 섬유소일 수 있다. 따라서 상기 섬유소는 동물 또는 식물에서 유래된 것일 수 있고, 특히 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그노셀룰로오스 등 일 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 효소 복합체에서는 목적 물질의 합성에 순차적으로 관여하는 효소들이 상기 섬유소결합도메인에 의해 형성되는 봉입체 또는 섬유소결합도메인이 결합되는 섬유소 상에 조밀하게 모여 있기 때문에, 어느 한 효소에 의해 생성된 중간 생성물이 다음 효소와 즉각적으로 반응을 일으킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 효소 복합체를 다양한 목적 물질들 중 대표적으로 부탄올의 생합성에 적용하였고, 부탄올 생합성에 관여하는 효소들 중 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소, 트랜스-에노일-CoA 환원효소 및 알데히드/알코올 탈수소효소를 류신 지퍼를 통해 섬유소결합도메인과 연결하여 효소 복합체를 제조하였고, SDS-PAGE를 통해 상기와 같은 효소들이 섬유소결합도메인에 연결되어 불용성의 상태로 발현됨을 확인되었다. 따라서, 상기 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 섬유소결합도메인에 의해 형성된 봉입체에 밀집되어 있기 때문에 상기 효소 복합체 상에서 포도당으로부터 대사된 아세토아세틸-CoA가 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소에 의하여 3-히드록시부티릴-CoA로 전환된 후, 중간 생성물인 상기 3-히드록시부티릴-CoA가 그 다음 효소인 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소와 바로 반응을 일으킬 수 있게 되고, 나아가 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소에 의해 생성된 크로토닐-CoA 역시 그 다음 효소인 트랜스-에노일-CoA 환원효소와 바로 반응을 일으킬 수 있게 된다. 트랜스-에노일-CoA 환원효소에 의해 생성된 부티릴-CoA는 역시 그 다음 단계의 효소인 알데히드/알코올 탈수소효소와 바로 반응을 일으킬 수 있다(도 3 참고). 따라서 상기와 같은 본 발명의 효소 복합체는 상기 부탄올 합성에 관여하는 효소들 세포질 내에 각각이 유리된 상태로 존재하는 경우에 비해 생성된 중간체들이 지체없이 다음 단계의 효소 반응에 참여하게 되므로, 더욱 빠른 속도로 부탄올이 생성될 수 있고, 그 결과 부탄올의 수율이 더욱 향상될 수 있다. 본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 상기와 같은 효과를 확인하였다(도 11 내지 14b 참고). 상기와 같은 실시예의 결과들에 의할 때, 본 발명의 효소 복합체는 비단 부탄올 뿐만 아니라, 복수 개의 효소가 작용하는 대사 과정에 의해 생합성되는 다른 종류의 목적 물질에도 충분히 적용될 수 있음을 알 수 있다.

2. 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체

본 발명의 다른 측면은 섬유소결합도메인과 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터와 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 각각이 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질과 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터; 또는 섬유소결합도메인과 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터와 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 각각이 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질과 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터;가 숙주세포에 도입된 목적 물질의 합성을 위한 형질전환체를 제공한다.

상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소, 류신 지퍼 및 섬유소결합도메인에 관해서는 상기 "1. 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 재조합 벡터 및 형질전환체에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.

상기 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미하는데, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적당한 숙주세포로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 특히, 본 발명에서는 플라스미드 벡터가 이용될 수 있는데, 상기 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 선택 마커 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소의 유전자와 섬유소결합도메인의 유전자는 상기와 같은 제한효소 절단부위에 클로닝될 수 있고, 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소의 유전자와 섬유소결합도메인의 유전자는 각각 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질 또는 NZ 단백질의 유전자 중 어느 하나와 서로 융합되어 발현될 수 있는 상태로 클로닝된다.

상기와 같이 서로 융합되어 발현될 수 있는 상태로 클로닝되는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 유전자와 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질의 유전자에 의해 발현되는 융합 단백질(각 효소별로 융합 단백질 설계); 및 섬유소결합도메인의 유전자와 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질의 유전자에 의해 발현되는 융합 단백질을 설계하고 상기 융합 단백질들의 유전자 컨스트럭트를 먼저 제조한 후 이를 벡터에 삽입할 수도 있고, 각 유전자 컨스트럭트를 별도로 순차적으로 벡터에 삽입하여 백터 내에서 두 유전자가 서로 융합되도록 할 수도 있다. 또는, 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 유전자와 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질의 유전자에 의해 발현되는 융합 단백질(각 효소별로 융합 단백질 설계); 및 섬유소결합도메인의 유전자와 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질의 유전자에 의해 발현되는 융합 단백질을 설계하고 상기 융합 단백질들의 유전자 컨스트럭트를 먼저 제조한 후 이를 벡터에 삽입할 수도 있고, 각 유전자 컨스트럭트를 별도로 순차적으로 벡터에 삽입하여 백터 내에서 두 유전자가 서로 융합되도록 할 수도 있다. 본 발명의 구체적인 실시예(실시예 1)에서는, 섬유소결합도메인과 NZ 단백질의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 pET21a 벡터에 삽입하여 재조합 벡터 pET21a-NZ::CBD를 제조하였고(도 6a 참고), 부탄올 합성에 관여하는 개별 효소들과 CZ 단백질이 융합된 단백질(즉, CZ:HBD 융합 단백질, CZ:CRT 융합 단백질, CZ::TER 융합 단백질 및 CZ::AdhE2 융합 단백질)들을 암호화하는 유전자를 pACBB 벡터에 삽입하여 재조합 벡터 pACBB-CZ::HCTA를 제조하였다(도 8a 및 8b 참고).

또한, 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들이 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질과 개별로 융합된 단백질들을 암호화하는 유전자 컨스트럭트들;과 섬유소결합도메인 및 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질의 융합단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트는 각각의 컨스트럭트가 서로 다른 벡터에 따로따로 삽입되어 있을 수도 있고, 2 이상의 유전자 컨스트럭트가 하나의 벡터에 함께 삽입되어 있을 수도 있다. 또는, 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들이 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질과 개별로 융합된 단백질들을 암호화하는 유전자 컨스트럭트들;과 섬유소결합도메인 및 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질의 융합 단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트는 각각의 컨스트럭트가 서로 다른 벡터에 따로따로 삽입되어 있을 수도 있고, 2 이상의 유전자 컨스트럭트가 하나의 벡터에 함께 삽입되어 있을 수도 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 NZ 단백질과 섬유소결합도메인이 융합된 NZ::CBD 융합 단백질의 유전자 컨스트럭트가 삽입된 벡터를 제조하고, NZ 단백질과 부탄올 합성에 관여하는 개별 효소들이 융합된 융합 단백질(CZ:HBD 융합 단백질, CZ:CRT 융합 단백질, CZ::TER 융합 단백질 및 CZ::AdhE2 융합 단백질)을 발현하는 각 유전자 컨스트럭트들이 모두 하나의 벡터에 삽입된 벡터를 제조하였다(실시예 1 참고).

상기 재조합 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 본 기술 분야에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 활성형 단백질 입자를 효과적으로 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 재조합 발현 벡터를 아세틸-CoA로의 대사회로가 조절된 대장균 MG1655 균주(Δfed ΔldhA ΔadhE Δpta)를 숙주세포로 이용하였다(실시예 2 참고).

본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

3. 효소 복합체의 제조 방법

본 발명의 다른 측면은 상기 "2. 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 " 항목에서 설명한 재조합 벡터 및 형질전환체를 이용하여, 상기 "1. 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체 "에서 설명한 효소 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체는 상기 "2. 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 " 항목에서 설명된 바와 같이 제조된 형질전환체에서, 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 및 섬유소결합도메인이 각각 발현된 이후 서로 연결됨으로써 인 비보(in vivo) 상에서 제조될 수 있다. 형질전환체 내에서 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들과 섬유소결합도메인이 각각 발현된 이후 서로 연결되면, 이렇게 연결된 단백질 중 섬유소결합도메인의 타 말단이 자발적으로 응집하여 봉입체를 형성함으로써 봉입체 표면에 목적 물질의 합성에 관여하는 2 이상의 효소들이 집적되거나, 또는 상기 연결된 단백질 중 섬유소결합도메인의 타 말단이 형질전환체 내에 존재하는 섬유소에 결합됨으로써 섬유소의 표면에 목적 물질의 합성에 관여하는 2 이상의 효소들이 집적될 수 있다. 이러한 과정을 통해 형질전환체 내에서 연결된 단백질이 섬유소결합도메인을 통해 응집됨으로써 형질전환체 내에서 자연스럽게 효소 복합체가 생성될 수 있다. 상기와 같이 형질전환체 내의 인 비보(in vivo) 환경에서 효소 복합체가 생성된 경우, 상기와 같은 형질전환체의 인 비보(in vivo) 환경을 그대로 목적 물질의 생성에 이용하거나, 또는 상기 형질전환체로부터 효소 복합체를 분리해 낸 다음, 분리된 효소 복합체를 이용하여 인 비트로(in vitro) 환경에서 목적 물질의 생성에 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체는 상기 "2. 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 " 항목에서 설명된 바와 같이 제조된 형질전환체에서 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들과 섬유소결합도메인이 연결된 단백질을 발현 및 분리ㅇ정제해 내거나, 이들을 각각 발현 및 분리ㅇ정제해 낸 다음 연결시키고, 이들 연결된 단백질을 시험관 내에서 섬유소결합도메인의 자발적 응집을 유도하거나 또는 섬유소에 결합시키는 과정을 통해 인 비트로(in vitro) 상에서도 제조될 수 있다. 상기와 같이 제조된 효소 복합체는 인 비트로(in vitro) 환경에서 목적 물질의 생성에 이용할 수 있다.

4. 효소 복합체를 이용한 목적 물질의 제조 방법

본 발명의 또 다른 측면은 상기 "1. 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체 "에서 설명한 효소 복합체를 이용하여, 인 비보(in vivo) 환경 또는 인 비트로(in vitro) 환경에서 목적 물질을 생산하는 방법을 제공한다.

먼저, 인 비보(in vivo) 환경에서는 상기 "2. 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 " 항목에서 설명한 형질전환체를 목적 물질의 전구체의 존재 하에서 배양함으로써, 목적 물질을 합성할 수 있다. 상기 "3. 효소 복합체의 제조 방법 "항목에서 설명한 바와 같이, 상기 형질전환체에서는 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들과 섬유소결합도메인이 각각 별도로 발현된 후 서로 연결된 다음, 상기 섬유소결합도메인의 타 말단이 자발적으로 응집하여 봉입체를 형성하거나, 또는 상기 섬유소결합도메인의 타 말단이 상기 형질전환체 내에 존재하는 섬유소에 결합됨으로써, 자연스럽게 효소 복합체가 형성되는 바, 상기 형질전환체를 목적 물질의 전구체와 함께 배양함으로써 목적 물질을 생산할 수 있다.

상기 목적 물질의 전구체는 목적 물질의 합성 경로의 모든 중간 생성물이 해당될 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 목적 물질이 부탄올일 경우에 상기 전구체는 포도당, 피루브산, 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, 3-히드록시부티릴-CoA, 크로토닐-CoA, 부티릴-CoA 및 부티릴알데히드로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 또한 상기 목적 물질이 1,4-부탄디올일 경우에, 전구체는 숙신산, 숙시닐 CoA, 숙시닐 세미알데히드, 4-히드록시부티레이트, 4-히드록시부티릴 CoA 및 4-히드록시부티르알데히드로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 이소프렌일 경우에, 전구체는 포도당, 피루브산, 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, HMG-CoA, 메발로네이트, 포스포메발로네이트 및 디포스포메발로네이트로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 숙신산일 경우에, 전구체는 포도당, 포스포에놀피루베이트, 옥살로아세테이트, 말레이트 및 푸마레이트로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 ε-카프로락탐일 경우에, 전구체는 포도당, 피루브산, 숙신산 세미알데히드, 아디프산 세미알데히드 및 6-아미노카프론산으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙주세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.

또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

상기와 같은 형질전환체의 배양은 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 25℃ 내지 55℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 20℃ 미만 또는 60℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 목적 물질의 합성에 관여하는 효소들의 효소 복합체가 형성됨에도 불구하고 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 목적 물질의 생성량 또는 충분해지지 못하는 문제가 발생하게 된다.

상기 형질전환체는 호기성 조건 또는 혐기성 조건에서 배양될 수 있다. 호기성 조건은 배양 과정에서 배양 용기의 뚜껑을 열고 배양할 수 있다. 혐기성 조건은, 예를 들면 이산화탄소 또는 질소를 약 0.1 내지 0.4 vvm, 약 0.2 내지 0.3 vvm 또는 약 0.25 vvm의 유속으로 공급하여 조성될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면 20℃ 내지 60℃ 또는 35℃ 내지 55℃일 수 있다. 배양기간은 목적 물질이 원하는 만큼 얻어질 때까지 지속될 수 있다.

상기 호기성 조건에서 배양시 배양 시간은 1시간 내지 40시간일 수 있고, 바람직하게는 2시간 내지 35시간일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3시간 내지 30시간일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 혐기성 조건에서 배양시 배양 시간은 20시간 내지 200시간일 수 있고, 바람직하게는 30시간 내지 190시간일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 40시간 내지 180시간일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기 배양시간이 하한값 미만일 경우에는 전구체로부터 목적 물질을 합성하기에는 미생물총량이 충분히 증가하지 않으므로 목적 물질이 적게 생산되며, 상기 배양시간이 상한값을 초과할 경우에는 미생물의 증식이 증가함에 따라 노폐물과 대사산물이 축적되어 pH 변화 등에 의해 목적 물질의 생산이 감소하게 된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 부탄올 생합성에 관여하는 개별 효소들 각각의 유전자들이 발현되어 유리된 상태로 존재하도록 제조된 대장균을 대조군으로 하고, 부탄올 생합성에 관여하는 효소들의 유전자와 섬유소결합도메인 유전자가 각각 따로 발현된 후 류신 지퍼에 의해 서로 연결됨으로써 효소 복합체를 형성하도록 제조된 대장균을 실험군으로 하여, 두 군의 대장균을 각각 37℃의 호기 조건(24시간 배양) 또는 혐기 조건(168 시간 배양)에서 배양하였을 때, 효소 복합체가 형성되는 실험군에서 부탄올 생성량이 현저히 향상됨을 확인하였다(도 12a 내지 도 13b 참고).

또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 4.3 내지 pH 9.5에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 9.0에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 8.0에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질 전환체의 배양 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환체가 생장하기 어렵기 때문에 부탄올 합성 효소들과 섬유소결합도메인이 발현되고 연결되는 것이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 이들 발현된 단백질이 연결되어 효소 복합체가 형성된다고 하더라도 목적 물질의 합성이 효율적으로 이루어지지 않는 문제점이 있다.

본 발명에 따른 방법은 목적 물질을 고효율로 생산하는 것을 목적으로 하나, 목적 물질 제조 공정에서 생산되는 중간 산물들, 예를 들어, 목적 물질이 부탄올인 경우에는 3-히드록시부티릴-CoA, 크로토닐-CoA, 부티릴-CoA, 부티릴알데히드의 고효율 생산에도 사용할 수도 있다. 또한, 상기 목적 물질이 1,4-부탄디올일 경우에는 본 발명에 따른 방법을 적용하여 숙시닐 CoA, 숙시닐 세미알데히드, 4-히드록시부티레이트, 4-히드록시부티릴 CoA 및 4-히드록시부티르알데히드와 같은 중간 산물의 고효율 생산에도 사용할 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 이소프렌일 경우에 본 발명에 따른 방법을 적용하여 HMG-CoA, 메발로네이트, 포스포메발로네이트, 디포스포메발로네이트와 같은 중간 산물의 고효율 생산에도 사용할 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 숙신산일 경우에 는 본 발명에 따른 방법을 적용하여 옥살로아세테이트, 말레이트, 푸마레이트와 같은 중간 산물의 고효율 생산에도 사용할 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 ε-카프로락탐일 경우에는 본 발명에 따른 방법을 적용하여 아디프산 세미알데히드, 6-아미노카프론산와 같은 중간 산물의 고효율 생산에도 사용할 수 있다.

일 예로, 부티릴알데히드를 고효율로 생산하기 위해서는, 상기와 같은 형질전환체의 배양 시간을 조절하여 부탄올이 생성되기 전에 부티릴알데히드를 회수함으로써 달성할 수 있다. 부탄올 외에 다른 목적 물질에 대해서도, 목적 물질 제조 공정에서 생산되는 중간 산물들을 얻기 위해서 배양 시간을 조절하여 중간 산물을 회수할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 류신 지퍼를 통해 섬유소결합도메인에 연결되어 효소 복합체를 형성할 수 있도록 제조된 대장균을 포도당이 함유된 배지에서 배양하는 경우, 부탄올 합성에 관여하는 개별 효소들이 유리된 상태로 존재하는 대장균에 비해, 부탄올 생성 효율이 향상됨을 확인하였다(도 12a 내지 도 13b 참고).

다음으로, 인 비트로(in vitro) 환경에서는 상기 "1. 목적 물질의 합성을 위한 효소 복합체 " 항목에서 설명한 효소 복합체를 목적 물질의 전구체와 함께 시험관 내에서 반응시킴으로써, 목적 물질을 합성할 수 있다.

상기 목적 물질의 전구체는 목적 물질의 합성 경로의 모든 중간 생성물이 이에 해당될 수 있으며, 보다 구체적으로, 목적 물질이 부탄올인 경우에는 포도당, 피루브산, 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, 3-히드록시부티릴-CoA, 크로토닐-CoA, 부티릴-CoA, 부티릴알데히드로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 또한 상기 목적 물질이 1,4-부탄디올일 경우에는 전구체는 숙신산, 숙시닐 CoA, 숙시닐 세미알데히드, 4-히드록시부티레이트, 4-히드록시부티릴 CoA 및 4-히드록시부티르알데히드로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 이소프렌일 경우에 전구체는 포도당, 피루브산, 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, HMG-CoA, 메발로네이트, 포스포메발로네이트 및 디포스포메발로네이트로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 숙신산일 경우에 전구체는 포도당, 포스포에놀피루베이트, 옥살로아세테이트, 말레이트 및 푸마레이트로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 또한, 상기 목적 물질이 ε-카프로락탐일 경우에 전구체는 포도당, 피루브산, 숙신산 세미알데히드, 아디프산 세미알데히드 및 6-아미노카프론산으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

상기와 같은 효소 복합체와 목적 물질의 전구체의 반응은 30℃ 내지 60℃, 바람직하게는 40℃ 내지 57℃, 보다 바람직하게는 45℃ 내지 55℃에서 수행될 수 있고, pH 4.3 내지 pH 9.5에서, 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 9.0에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 8.0에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.

그리고 상기와 같은 인 비트로(in vitro) 환경에서의 목적 물질의 생성 방법 또한 목적 물질을 고효율로 생산하는 것을 목적으로 하나, 상기 효소 복합체를 구성하는 효소의 종류를 조절함으로써, 예를 들면 목적 물질이 부탄올일 경우 3-히드록시부티릴-CoA, 크로토닐-CoA, 부티릴-CoA, 부티릴알데히드 등과 같은 부탄올 제조 공정에서 생산되는 중간 산물들을 고효율로 생성하는데 이용될 수도 있다. 구체적으로, 3-히드록시부티릴-CoA를 출발 물질로 하여 부티릴알데히드를 고효율로 생산하고자 하는 경우, 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소와 트랜스-에노일-CoA 환원효소만으로 상기 효소 복합체를 구성하고, 이를 3-히드록시부티릴-CoA와 함께 반응시킴으로써 달성할 수 있다. 또한, 목적 물질이 1,4-부탄디올일 경우 숙시닐 CoA, 숙시닐 세미알데히드, 4-히드록시부티레이트, 4-히드록시부티릴 CoA 및 4-히드록시부티르알데히드 등과 같은 1,4-부탄디올 제조 공정에서 생산되는 중간 산물들을 고효율로 생성하는데 이용될 수 있다. 구체적으로, 숙신산을 출발 물질로 하여 4-히드록시부티릴 CoA를 고효율로 생산하고자 하는 경우, 숙시닐-CoA 합성효소, CoA-의존성 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소, 4-히드록시부티레이트 탈수소효소, 4-히드록시부티릴-CoA 전이효소만으로 상기 효소 복합체를 구성하고, 이를 숙신산과 함께 반응시킴으로써 달성할 수 있다.

또한, 목적 물질이 이소프렌일 경우 HMG-CoA, 메발로네이트, 포스포메발로네이트 및 디포스포메발로네이트 등과 같은 이소프렌 제조공정에서 생산되는 중간 산물들을 고효율로 생성하는데 이용될 수 있다. 구체적으로, 아세토아세틸-CoA를 출발 물질로 하여 포스포메발로네이트를 고효율로 생산하고자 하는 경우, 히드록시메틸글루타릴 CoA 생성효소, 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소, 메발로네이트 인산화효소만으로 상기 효소 복합체를 구성하고, 이를 아세토아세틸-CoA와 함께 반응시킴으로써 달성할 수 있다.

부탄올, 1,4-부탄디올 및 이소프렌 외에 다른 목적 물질에 대해서도, 목적 물질 제조 공정에서 생산되는 중간 산물들을 얻기 위해서 배양 시간을 조절하여 중간 산물을 회수할 수 있다.

상기와 같이 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro) 환경에서 생성된 목적 물질은 본 기술 분야에서 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 회수될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 이들의 조합에 의하여 이루어질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 및 실험예]

부탄올 합성 대사회로에 관여하는 효소들을 발현하는 벡터의 제조

부탄올 합성을 위한 효소 복합체의 형성을 위하여, 부탄올 합성에 관여하는 효소로 Clostridium acetobutylicum 유래의 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, HBD), 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase, CRT) 및 알데히드/알코올 탈수소효소(aldehyde and alcohol dehydrogenase, AdhE2)와, Treponema denticola 유래의 트랜스-에노일-CoA 환원효소(trans-enoyl-CoA reductase, TER)를 이용하였고, 이들 효소를 응집시키기 위한 구성으로 섬유소결합도메인(CBD)을 이용하였다.

그리고 상기 부탄올 합성에 관여하는 효소들과 상기 섬유소결합도메인을 연결하기 위하여 두 가닥의 이종 단백질[CZ 단백질, NZ 단백질]로 이루어진 역평행 류신 지퍼(leucine zipper)를 이용하였다.

하기에 구체적인 실험 방법을 기재한다. 클로닝 시에 사용된 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.

프라이머 명칭	서열(5'~3') 및 *제한효소 부위*	서열번호
NZ_F	ata catatg gccctcaaaaaagaattgcag	35
NZ_GS_R	cccggccggaccactgctgctaccgctgccgctaccctgcgcca	36
GS_CBD_F	agcagtggtccggccgggtgccaggtgctgtggggcgtcaacc	37
CBD_R	ata ctcgag ttagccgaccgtgcagggcgtg	38
CZ_F	ata catatg gagcagctgaaaaagaagtt	39
CZ_GS_R	cccggccggaccactgctgctaccgctgccgctaccctgcgcga	40
Hbd_F	cagac ggatcc atgaaaaaggtatgtgtt	41
Hbd_R	ggctt ctcgag ttattttgaataatcgtagaa	42
Crt_F	caaca ggatcc atggaactaaacaatgtc	43
Crt_R	accca ctcgag ctatctatttttgaagcct	44
Ter_FN	cctca ggatcc atgatcgtcaagcca	45
Ter_RN	acccc ctcgag ttaaatacgatcgaaacg	46
AdhE2_F	cagac ggatcc atgaaagttacaaatcaa	47
AdhE2_R	cctca ggatcc ttaaaatgattttatat	48
NZ_F	agcaa ggatcc atggccctcaaaaaa	49
CZ_F	agcaa ggatcc atggcaagcgagca	50
GS_Hbd_F	agcggcagcggtagcaaaaaggtatgtgttataggt	51
GS_Hbd_R	aacacatacctttttgctaccgctgccgct	52
GS_Crt_F	agcggcagcggtagcgaactaaacaatgtcatcc	53
GS_Crt_R	gacattgtttagttcgctaccgctgccgct	54
GS_Ter_F	agcggcagcggtagcatcgtcaagccaatg	55
GS_Ter_R	cattggcttgacgatgctaccgctgccgct	56
GS_AdhE2_F	agcggcagcggtagcaaagttacaaatcaaaaagaa	57
GS_AdhE2_R	ttgatttgtaactttgctaccgctgccgct	58

1-1. 섬유소 결합 도메인과 NZ의 융합 단백질을 암호화하는 벡터의 제조(pET21a-NZ::CBD)

pET21a-NZ::CBD 제작을 위해 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)로부터 게놈 DNA를 추출하여 CBD 염기서열을 확보하는데 사용하였고, 역평행 류신지퍼(NZ 단백질, CZ 단백질)는 NCBI의 서열정보를 바탕으로 NZ::eGFP(서열번호 59의 아미노산 서열, 서열번호 60의 염기 서열)와 CZ::eGFP 유전자(서열번호 61의 아미노산 서열, 서열번호 62의 염기 서열)를 합성하여 이용하였다.

NZ::CBD를 클로닝하기 위하여 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 GS_CBD_F(서열번호: 37) 및 CBD_R(서열번호: 38)을 이용하여 하기 표 2의 (1)조건으로 PCR을 수행하여 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 섬유소결합도메인(CBD)의 유전자를 증폭하였다. NZ 서열을 얻기 위해 pACBB-NZ::eGFP를 주형으로 하고, 프라이머 NZ_F(서열번호: 35)와 NZ_GS_R(서열번호: 36)를 이용하여 하기 표 2의 (2)조건을 이용하여 PCR하였다.

CBD 및 NZ 서열을 융합하기 위하여 상기에서 확보된 PCR 결과물을 주형으로 overlap PCR을 수행하였다. 구체적으로, PCR하여 얻어진 CBD 서열과 NZ 서열을 몰 비가 1:1이 되도록 혼합한 후, 프라이머를 넣지 않고 하기 표 2의 (3)조건을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액에 프라이머 NZ_F(서열번호: 35)와 CBD_R(서열번호: 38)를 첨가하여 하기 표 2의 (4)조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR을 2회 수행한 산물에 NdeI, XhoI를 처리하였다. 처리된 용액과 미리 준비해 둔 NdeI, XhoI가 처리된 pET21a을 각각 겔 추출한 후, T4 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 라이게이션된 것만 선별하여 사용하였다. 완성된 pET21a-NZ::CBD를 도 6a에 나타낸다.

	(1)	(2)	(3)	(4)
1. 초기 변성	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분
2. 변성	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초
3. 어닐링	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초
4. 연장	72℃, 30분	72℃, 30분	72℃, 1분	72℃, 1분
2 내지 4 과정 반복 횟수	30	30	5	30
5. 최종 연장	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분

1-2. 섬유소 결합 도메인과 CZ의 융합 단백질을 암호화하는 벡터의 제조(pET21a-CZ::CBD)

CZ::CBD를 클로닝하기 위하여 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 게놈 DNA를 주형하고, 프라이머 GS_CBD_F(서열번호: 37) 및 CBD_R(서열번호: 38)을 이용하여 하기 표 3의 (1)조건으로 PCR을 수행하여 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 섬유소결합도메인(CBD)의 유전자를 증폭하였다. CZ 서열을 얻기 위해 pACBB-CZ::eGFP를 주형으로 하고, 프라이머 CZ_F(서열번호: 39)와 CZ_GS_R(서열번호: 40)를 이용하여 하기 표 3의 (2)조건을 이용하여 PCR하였다.

CBD 및 CZ 서열을 융합하기 위하여 상기에서 확보된 PCR 결과물을 주형으로 overlap PCR을 수행하였다. 구체적으로, PCR하여 얻어진 CBD 서열과 CZ 서열을 몰 비가 1:1이 되도록 혼합한 후, 프라이머를 넣지 않고 하기 표 3의 (3)조건을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액에 프라이머 CZ_F(서열번호: 39)와 CBD_R(서열번호: 38)를 첨가하여 하기 표 3의 (4)조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR을 2회 수행한 산물에 NdeI, XhoI를 처리하였다. 처리된 용액과 미리 준비해 둔 NdeI, XhoI가 처리된 pET21a을 각각 겔 추출한 후, T4 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 라이게이션된 것만 선별하여 사용하였다. 완성된 pET21a-CZ::CBD를 도 6b에 나타낸다.

1-3. 부탄올 생합성 관련 효소들이 클로닝된 벡터{pACBB-HCTA(대조군)}의 제조

1-3-1. hbd, crt, ter 및 adhE2의 제작

클로스트리디움 아세토뷰티리쿰 DSM 1731(Clostridium acetobutylicum DSM 1731, Accession no. CP002660)의 NCBI의 서열정보를 바탕으로 HBD의 유전자(hbd), CRT의 유전자(crt)를 합성하여 사용하였으며, 클로스트리디움 아세토뷰티리쿰 DSM 1731 (Clostridium acetobutylicum DSM 1731, Accession no. CP002661)의 NCBI의 서열정보를 바탕으로 유전자 코돈을 최적화하여 ADHE2의 유전자(adhE2)를 합성하였다. 트리포네마 덴티콜라(Treponema denticola ATCC 35405, Accession no. AE017226)의 NCBI의 서열정보를 바탕으로 유전자 코돈을 최적화하여 TER의 유전자(ter)를 합성하였다.

1-3-2. pACBB-hbd, pACBB-crt, pACBB-ter 및 pACBB-adhE2의 제작

상기 실시예 1-3-1에서 합성한 hbd, crt, ter, adhE2를 주형으로 하여 각각 Hbd_F와 Hbd_R의 프라이머 쌍(서열번호: 41, 42), Crt_F와 Crt_R의 프라이머 쌍(서열번호: 43, 44), ter_F와 ter_R의 프라이머 쌍(서열번호: 45, 46) 및 adhE2_F와 adhE2_R의 프라이머 쌍(서열번호: 47, 48)으로 각각 PCR을 수행하여 hbd, crt, ter 및 adhE2 유전자를 각각 증폭하였다. 상기와 같이 증폭된 각각의 PCR 산물에 BamHI, XhoI를 처리한 다음, 상기 제한효소가 처리된 PCT 산물을 T4 리가아제를 이용하여 제한효소 BamHI, XhoI가 처리된 pACBB-eGFP에 삽입함으로써, 재조합 벡터 pACBB-hbd, pACBB-crt, pACBB-ter 및 pACBB-adhE2를 각각 제조하였다. 상기 PCR은 각 유전자에 따라 하기 표 4의 조건으로 수행하였다.

유전자 명	hbd	crt	ter	adhE2
1. 초기 변성	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분
2. 변성	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초
3. 어닐링	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초
4. 연장	72℃, 1분	72℃, 1분	72℃, 1.5분	72℃, 2.5분
2 내지 4 과정 반복 횟수	30	30	30	30
5. 최종 연장	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분

1-3-3. pACBB-hbd-crt-ter-adhE2의 제작

pACBB-hbd에 EcoRI, SpeI 처리하고, pACBB-crt에 EcoRI, xbaI 처리하였으며, 각 처리물을 겔 추출한 후 T4 리가아제를 이용하여 라이게이션 후 pACBB-hbd-crt를 선별하였다. 제조된 pACBB-hbd-crt에 EcoRI, SpeI 처리하고, pACBB-ter에 EcoRI, xbaI 처리하였으며, 각 처리물을 겔 추출한 후 T4 리가아제를 이용하여 라이게이션 후 pACBB-hbd-crt-ter를 선별하였다. 제조된 pACBB-hbd-crt-ter에 EcoRI, SpeI 처리하고, pACBB-adhE2에 EcoRI, xbaI 처리하였으며, 각 처리물을 겔 추출한 후 T4 리가아제를 이용하여 라이게이션 후 선별하였다. 완성된 pACBB-hbd-crt-ter-adhE2 벡터(이하 'pACBB-HCTA'라고 합니다)를 도 7a 및 7b에 나타낸다.

1-4. 부탄올 생합성 관련 효소들과 CZ 단백질의 융합 단백질들이 클로닝된 벡터{pACBB-CZ::HCTA(실험군)}의 제조

1-4-1. pACBB-CZ::hbd의 제작

CZ::hbd의 클로닝에 사용하기 위해 pACBB-CZ::eGFP에 BamHI(NEB), XhoI(NEB)를 처리하여 준비해두었다. hbd 서열을 얻기 위해 합성한 실시예 1-3-2에서 제작한 pACBB-hbd 플라스미드를 주형으로 하고 GS_Hbd_F(서열번호: 51)와 Hbd_R(서열번호: 42)을 이용하여 하기 표 5의 (1) 조건을 이용하여 PCR하였다. CZ서열을 얻기 위해 pACBB-CZ::GFP gene를 주형으로 하고, CZ_F(서열번호: 50)와 GS_Hbd_R(서열번호: 52)를 이용하여 하기 표 5의 (2) 조건을 이용하여 PCR하였다. hbd 및 CZ 서열을 융합하기 위하여 상기에서 확보된 PCR 결과물을 주형으로 overlap PCR을 수행하였다. 구체적으로, PCR하여 얻어진 hbd 서열과 CZ 서열을 몰 비가 1:1이 되도록 혼합한 후, 프라이머를 넣지 않고 하기 표 5의 (3)조건을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR반응액에 프라이머 CZ_F(서열번호: 50)와 Hbd_R(서열번호: 42)를 첨가하여 하기 표5의 (4)조건으로 PCR을 수행하였다. PCR을 2회 수행한 산물에 BamHI, XhoI를 처리하였다. 처리된 용액과 미리 준비해 둔 BamHI, XhoI가 처리된 pACBB을 각각 겔 추출한 후, T4 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 라이게이션된 것만 선별하여 pACBB-CZ::hbd로 명명하였으며, 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 류신 지퍼를 이루는 단백질과 연결되어 발현되는 재조합 벡터의 제조에 사용하였다.

	(1)	(2)	(3)	(4)
1. 초기 변성	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분
2. 변성	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초
3. 어닐링	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초
4. 연장	72℃, 1분	72℃, 30초	72℃, 1분	72℃, 1분
2 내지 4 과정 반복 횟수	30	30	5	30
5. 최종 연장	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분

1-4-2. pACBB-CZ::crt의 제작

CZ::crt의 클로닝에 사용하기 위해 pACBB-CZ::eGFP에 BamHI(NEB), XhoI(NEB)를 처리하여 준비해두었다. crt 서열을 얻기 위해 합성한 실시예 1-3-2에서 제작한 pACBB-crt 플라스미드를 주형으로 하고 GS_Crt_F(서열번호: 53)와 Crt_R(서열번호: 44)을 이용하여 하기 표 6의 (1) 조건을 이용하여 PCR하였다. CZ 서열을 얻기 위해 pACBB-CZ::GFP gene를 주형으로 하고, CZ_F(서열번호: 50)와 GS_Crt_R(서열번호: 54)를 이용하여 하기 표 6의 (2) 조건을 이용하여 PCR하였다.

crt 및 CZ 서열을 융합하기 위하여 상기에서 확보된 PCR 결과물을 주형으로 overlap PCR을 수행하였다. 구체적으로, PCR하여 얻어진 crt 서열 과 CZ 서열을 몰 비가 1:1이 되도록 혼합한 후, 프라이머를 넣지 않고 하기 표 6의 (3)조건을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액에 프라이머 CZ_F(서열번호: 50)와 Crt_R(서열번호: 44)을 첨가하여 하기 표 6의 (4)조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR을 2회 수행한 산물에 BamHI, XhoI를 처리하였다. 처리된 용액과 미리 준비해 둔 BamHI, XhoI가 처리된 pACBB을 각각 겔 추출한 후, T4 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 라이게이션된 것만 선별하여 pACBB-CZ::crt로 명명하였으며, 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 류신 지퍼를 이루는 단백질과 연결되어 발현되는 재조합 벡터의 제조에 사용하였다.

1-4-3. pACBB-CZ::ter의 제작

CZ::ter의 클로닝에 사용하기 위해 pACBB-CZ::eGFP에 BamHI(NEB), XhoI(NEB)를 처리하여 준비해두었다. ter 서열을 얻기 위해 합성한 실시예 1-3-2에서 제작한 pACBB-ter 플라스미드를 주형으로 하고 GS_Ter_F(서열번호: 55)와 Ter_R(서열번호: 46)을 이용하여 하기 표 7의 (1) 조건을 이용하여 PCR하였다. CZ 서열을 얻기 위해 pACBB-CZ::GFP gene를 주형으로 하고, CZ_F(서열번호: 50)와 GS_Ter_R(서열번호: 56)를 이용하여 하기 표 7의 (2) 조건을 이용하여 PCR하였다.

ter 및 CZ 서열을 융합하기 위하여 상기에서 확보된 PCR 결과물을 주형으로 overlap PCR을 수행하였다. 구체적으로, PCR하여 얻어진 ter 서열 과 CZ 서열을 몰 비가 1:1이 되도록 혼합한 후, 프라이머를 넣지 않고 하기 표 7의 (3)조건을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액에 프라이머 CZ_F(서열번호: 50)와 Ter_R(서열번호: 46)를 첨가하여 하기 표 7의 (4)조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR을 2회 수행한 산물에 BamHI, XhoI를 처리하였다. 처리된 용액과 미리 준비해 둔 BamHI, XhoI가 처리된 pACBB을 각각 겔 추출한 후, T4 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 라이게이션된 것만 선별하여 pACBB-CZ::ter로 명명하였으며, 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 류신 지퍼를 이루는 단백질과 연결되어 발현되는 재조합 벡터의 제조에 사용하였다.

	(1)	(2)	(3)	(4)
1. 초기 변성	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분
2. 변성	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초
3. 어닐링	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초
4. 연장	72℃, 1.5분	72℃, 30초	72℃, 1.5분	72℃, 1.5분
2 내지 4 과정 반복 횟수	30	30	5	30
5. 최종 연장	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분

1-4-4. pACBB-CZ::adhE2의 제작

CZ::adhE2의 클로닝에 사용하기 위해 pACBB-CZ::eGFP에 BamHI(NEB), XhoI(NEB)를 처리하여 준비해두었다. adhE2 서열을 얻기 위해 합성한 실시예 1-3-2에서 제작한 pACBB-adhE2 플라스미드를 주형으로 하고 GS_AdhE2_F(서열번호: 57)와 AdhE2_R(서열번호: 48)을 이용하여 하기 표 8의 (1) 조건을 이용하여 PCR하였다. CZ서열을 얻기 위해 pACBB-CZ::GFP gene를 주형으로 하고, CZ_F(서열번호: 50)와 GS_AdhE2_R(서열번호: 58)를 이용하여 하기 표 8의 (2) 조건을 이용하여 PCR하였다.

adhE2 및 CZ 서열을 융합하기 위하여 상기에서 확보된 PCR 결과물을 주형으로 overlap PCR을 수행하였다. 구체적으로, PCR하여 얻어진 adhE2 서열 과 CZ 서열을 몰 비가 1:1이 되도록 혼합한 후, 프라이머를 넣지 않고 하기 표 8의 (3)조건을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액에 프라이머 CZ_F(서열번호: 50)와 AdhE2_R(서열번호: 48)를 첨가하여 하기 표 8의 (4)조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR을 2회 수행한 산물에 BamHI, XhoI를 처리하였다. 처리된 용액과 미리 준비해 둔 BamHI, XhoI가 처리된 pACBB을 각각 겔 추출한 후, T4 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 라이게이션된 것만 선별하여 pACBB-CZ::adhE2로 명명하였으며, 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 류신 지퍼를 이루는 단백질과 연결되어 발현되는 재조합 벡터의 제조에 사용하였다.

	(1)	(2)	(3)	(4)
1. 초기 변성	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분	95℃, 3분
2. 변성	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초	95℃, 30초
3. 어닐링	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초	55℃, 30초
4. 연장	72℃, 2.5분	72℃, 30초	72℃, 2.5분	72℃, 2.5분
2 내지 4 과정 반복 횟수	30	30	5	30
5. 최종 연장	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분	72℃, 5분

1-4-5. pACBB-CZ::hbd-CZ::crt-CZ::ter-CZ::adhE2의 제작

pACBB-CZ::hbd에 EcoRI, SpeI 처리하고, pACBB-CZ::crt에 EcoRI, xbaI 처리하였으며, 각 처리물을 겔 추출한 후 T4 리가아제를 이용하여 라이게이션 후 pACBB-CZ::hbd-CZ::crt를 선별하였다. 제조된 pACBB-CZ::hbd-CZ::crt에 EcoRI, SpeI 처리하고, pACBB-CZ::ter에 EcoRI, XbaI 처리하였으며, 각 처리물을 겔 추출한 후 T4 리가아제를 이용하여 라이게이션 후 pACBB-CZ::hbd-CZ::crt-CZ::ter를 선별하였다. 제조된 pACBB-CZ::hbd-CZ::crt-CZ::ter에 EcoRI, SpeI 처리하고, pACBB-CZ::adhE2에 EcoRI, xbaI 처리하였으며, 각 처리물을 겔 추출한 후 T4 리가아제를 이용하여 라이게이션 후 선별하였다. 완성된 pACBB-CZ::hbd-CZ::crt-CZ::ter-CZ::adhE2 벡터(이하 'pACBB-HCTA'라고 합니다)를 도 8a 및 8b에 나타낸다.

pET21a-NZ::CBD, pACBB-HCTA(대조군), pACBB-CZ::HCTA(실험군)의 발현 및 정제

상기 실시예 1-1에서 제작된 pET21a-NZ::CBD와 상기 실시예 1-4-5에서 제조된 pACBB-CZ::HCTA를, 아세틸-CoA로의 대사회로가 조절된 대장균 MG1655 균주(Δfed ΔldhA ΔadhE Δpta)로 형질전환시켜, CZ 단백질과 NZ 단백질의 결합에 의해 부탄올 생합성에 관여하는 효소들이 섬유소결합도메인에 결합되고 상기 섬유소결합도메인이 서로 응집됨으로써 효소 복합체가 형성되는 실험군을 제조하였다. 그리고 상기 실시예 1-1에서 제작된 pET21a-NZ::CBD와 상기 실시예 1-3-3에서 제작된 pACBB-HCTA도 MG1655 균주(Δfed ΔldhA ΔadhE Δpta)로 형질전환시켜, CZ단백질과 NZ 단백질의 결합이 불가능하여 효소 복합체를 형성할 수 없고 개별 효소들이 유리된 상태로 존재하게 되는 대조군을 제조하였다. 상기 실험군 및 대조군의 형질전환체를 각각 50㎍/㎖의 엠피실린, 클로람페니콜 34mg/㎖이 포함된 LB 배지에 접종하여 37℃, 200rpm에서 16시간 동안 전배양한 후, 본 배양 배지인 1% 글루코오스가 함유된 LB 배지에 1%(v/v)로 접종하였다. 37℃, 200rpm에서 본 배양 후 흡광도(OD600)가 0.4일 때 0.1mM IPTG를 첨가한 후 24시간 동안 호기적 조건에서 배양하여 섬유소결합도메인 CBD와 부탄올의 생합성에 관여하는 효소인 HBD, CRT, TER, ADHE2의 발현을 유도하였다.

상기와 같이 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 6,000ㅧg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, pH 7.4 10mM PBS 완충용액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄)으로 두 번 세척한 다음, 단백질분해효소 저해제인 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 0.1mM을 첨가하여, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다.

상기 세포 파쇄물은 다시 13000ㅧg로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 상기 세포 상등액에서 발현된 단백질들을 가용성 분획 및 펠렛에서 발현된 불용성 분획으로 분리하고, SDS-PAGE를 통해 단백질들(CRT, HBD, TER, AdhE2, NZ::CBD와 CZ::CRT 결합 단백질, NZ::CBD와 CZ::HBD 결합 단백질, NZ::CBD와 CZ::TER 결합 단백질, NZ::CBD와 CZ::AdhE2 결합 단백질)을 확인하였다.

그 결과, 실험군과 대조군 모두에서 섬유소결합도메인(16kda)은 불용성 단백질층에서 모두 확인되었다. 또한 부탄올 생합성 효소의 경우, 대조군의 불용성 단백질의 SDS-PAGE에서는 HBD(30kda), CRT(28kda), TER(44kda) 및 AdhE2(94kda) 확인되지 않았으나, 실험군의 불용성 단백질의 SDS-PAGE에서는 CZ::HBD(32kda), CZ::CRT(30kda), CZ::TER(46kda) 및 CZ::AdhE2(96kda)가 모두 확인되었다(도 9).

상기와 같은 결과로부터, 실험군의 경우 세포 내에서 섬유소결합도메인과 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 서로 결합되고, 섬유소결합도메인이 서로 응집되거나 섬유소에 결합되어 효소 복합체를 형성하였음을 알 수 있다.

류신 지퍼에 의해 연결된 효소 복합체의 효소 활성 측정

본 발명에 따른 효소 복합체는 목적 물질의 생합성에 관여하는 효소들이 각각 섬유소결합도메인에 류신 지퍼를 통해 연결된다. 이에, 본 발명자들은 상기 효소들이 류신 지퍼를 통해 섬유소결합도메인에 연결되는지, 또는 효소와 섬유소결합도메인이 류신 지퍼를 통해 연결되어도 효소 활성을 나타내는지 확인하였다. 섬유소결합도메인은 대장균 내에서 불용성 단백질 구조체를 형성하므로, 세포 용해물을 용해성(soluble) 분획 및 불용성(insoluble) 분획으로 각각 분획한 후 불용성 분획물의 효소 활성을 확인함으로써 본 발명에 따른 효소 복합체의 활성을 확인할 수 있다(도 10a).

상기 실시예 2의 대조군 및 실험군 형질전환체를 세포 배양 후에 배양된 세포를 용해하고, 각각의 용해물을 용해성, 불용성 분획으로 구획화하여 각 분획에 포함되어 있는 효소 또는 효소 복합체의 활성을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2의 대조군 및 실험군 형질전환체를 LB 배지에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리를 통해 대장균을 확보하였다. 배양된 대조군과 실험군 대장균을 각각 세포벽을 파쇄한 후 용해성 및 불용성으로 구획화하여 대조군(유리된 상태로 존재하는 효소들)과 실험군(효소들이 류신 지퍼를 통해 섬유소결합도메인과 연결된 효소 복합체)의 효소 활성을 확인하였다.

3-1. HBD 및 CZ::HBD의 효소 활성 측정

HBD의 효소활성을 측정하기 위해서 아세토아세틸-CoA(Acetoacetyl-CoA) 0.1mM, NADH 0.1mM이 포함된 MOPS 완충용액(pH 7.2)을 효소 반응액으로 준비하였다. 상기에서 획득한 대조군의 용해성(soluble) 분획 25㎕ 및 불용성(insoluble) 분획 25㎕를 각각의 효소 반응액에 첨가하고 10분 간격으로 분광광도계 340nm에서 흡수 스펙트럼을 90분 동안 측정하여 NADH 감소량을 측정하여 HBD의 효소 활성을 측정하여 용해성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획의 상대 효소 활성을 비교하였다. 그 결과 용해성 분획과 불용성 분획의 효소 활성은 각각 0.403 umol/mg/min, 0.124 umol/mg/min였으며, 이들의 상대 효소 활성은 용해성 분획에서 76.4%, 불용성 분획에서 23.6%로 나타났다.

CZ::HBD의 효소활성을 측정하기 위해서 아세토아세틸-CoA 0.1mM, NADH 0.1mM이 포함된 MOPS 완충용액(pH 7.2)을 효소 반응액으로 준비하였다. 상기에서 획득한 실험군의 용해성(soluble) 분획 25㎕ 및 불용성(insoluble) 분획 25㎕를 각각의 효소 반응액에 첨가하고 10분 간격으로 분광광도계 340nm에서 흡수 스펙트럼을 90분 동안 측정하여 NADH 감소량을 측정하여 CZ::HBD의 효소 활성을 측정하여 용해성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획의 상대 효소 활성을 비교하였다. 그 결과 융해성 분획과 불용성 분획의 효소 활성은 각각 0.093 umol/mg/min, 0.326 umol/mg/min였으며, 이들의 상대효소활성은 용해성 분획에서 22.2%, 불용성 분획에서 77.8%로 나타났다.

결과적으로 대조군의 경우 용해성 분획에서 HBD의 효소 활성이 불용성 분획보다 높게 측정되었고, 실험군(효소 복합체)의 경우는 불용성 분획에서 각 효소의 활성이 용해성 분획보다 높게 측정되었다(도 10b).

3-2. CRT 및 CZ::CRT의 효소 활성 측정

CRT의 효소활성을 측정하기 위해서 3-히드록시부티릴-CoA(3-Hydroxybutyryl-CoA) 0.1mM, NADH 0.1mM이 포함된 MOPS 완충용액(pH 7.2)을 효소 반응액으로 준비하였다. 상기에서 획득한 대조군의 용해성(soluble) 분획 25㎕ 및 불용성(insoluble) 분획 25㎕를 각각의 효소 반응액에 첨가하고 10분 간격으로 분광광도계 340nm에서 흡수 스펙트럼을 90분 동안 측정하여 NADH 감소량을 측정하여 CRT의 효소 활성을 측정하여 용해성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획의 상대효소 활성을 비교하였다. 그 결과 용해성 분획과 불용성 분획의 효소 활성은 각각 0.311 umol/mg/min, 0.140 umol/mg/min였으며, 이들의 상대효소활성은 용해성 분획에서 68.9%, 불용성 분획에서 31.1%로 나타났다.

CZ::CRT의 효소활성을 측정하기 위해서 3-히드록시부티릴-CoA 0.1mM, NADH 0.1mM이 포함된 MOPS 완충용액(pH 7.2)을 효소 반응액으로 준비하였다. 상기에서 획득한 실험군의 용해성(soluble) 분획 25㎕ 및 불용성(insoluble) 분획 25㎕를 각각의 효소 반응액에 첨가하고 10분 간격으로 분광광도계 340nm에서 흡수 스펙트럼을 90분 동안 측정하여 NADH 감소량을 측정하여 CZ::CRT의 효소 활성을 측정하여 용해성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획의 상대효소 활성을 비교하였다. 그 결과 융해성 분획과 불용성 분획의 효소 활성은 각각 0.088 umol/mg/min, 0.405 umol/mg/min였으며, 이들의 상대효소활성은 용해성 분획에서 17.9%, 불용성 분획에서 82.1%로 나타났다.

결과적으로 대조군의 경우 용해성 분획에서 CRT의 효소 활성이 불용성 분획보다 높게 측정되었고, 실험군(효소 복합체)의 경우는 불용성 분획에서 각 효소의 활성이 용해성 분획보다 높게 측정되었다(도 10b).

3-3. TER 및 CZ::TER의 효소 활성 측정

TER의 효소활성을 측정하기 위해서 크로토닐-CoA(Crotonyl-CoA) 0.1mM, NADH 0.1mM이 포함된 MOPS 완충용액(pH 7.2)을 효소 반응액으로 준비하였다. 상기에서 획득한 대조군의 용해성(soluble) 분획 25㎕ 및 불용성(insoluble) 분획 25㎕를 각각의 효소 반응액에 첨가하고 10분 간격으로 분광광도계 340nm에서 흡수 스펙트럼을 90분 동안 측정하여 NADH 감소량을 측정하여 TER의 효소 활성을 측정하여 용해성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획의 상대효소 활성을 비교하였다. 그 결과 융해성 분획과 불용성 분획의 효소 활성은 각각 0.192 umol/mg/min, 0.212 umol/mg/min였으며, 이들의 상대효소활성은 융해성 분획에서 47.5%, 불용성 분획에서 52.5%로 나타났다.

CZ::TER의 효소활성을 측정하기 위해서 크로토닐-CoA 0.1mM, NADH 0.1mM이 포함된 MOPS 완충용액(pH 7.2)을 효소 반응액으로 준비하였다. 상기에서 획득한 실험군의 용해성(soluble) 분획 25㎕ 및 불용성(insoluble) 분획 25㎕를 각각의 효소 반응액에 첨가하고 10분 간격으로 분광광도계 340nm에서 흡수 스펙트럼을 90분 동안 측정하여 NADH 감소량을 측정하여 CZ::TER의 효소 활성을 측정하여 용해성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획의 상대효소 활성을 비교하였다. 그 결과 융해성 분획과 불용성 분획의 효소 활성은 각각 0.089 umol/mg/min, 0.500 umol/mg/min 였으며, 이들의 상대효소활성은 융해성 분획에서 15.1%, 불용성 분획에서 84.9%로 나타났다.

결과적으로 대조군의 경우 용해성 분획에서 TER의 효소 활성이 불용성 분획보다 높게 측정되었고, 실험군(효소 복합체)의 경우는 불용성 분획에서 각 효소의 활성이 용해성 분획보다 높게 측정되었다(도 10b).

3-4. AdhE2 및 CZ::AdhE2의 효소 활성 측정

AdhE2의 효소활성을 측정하기 위해서 부티릴-CoA(Butyryl-CoA) 0.1mM, NADH 0.1mM, DTT 1mM이 포함된 MOPS 완충용액(pH 7.2)을 효소 반응액으로 준비하였다. 상기에서 획득한 대조군의 용해성(soluble) 분획 25㎕ 및 불용성(insoluble) 분획 25㎕를 각각의 효소 반응액에 첨가하고 10분 간격으로 분광광도계 340nm에서 흡수 스펙트럼을 90분 동안 측정하여 NADH 감소량을 측정하여 AdhE2의 효소 활성을 측정하여 용해성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획의 상대효소 활성을 비교하였다. 그 결과 융해성 분획과 불용성 분획의 효소 활성은 각각 0.077 umol/mg/min, 0.026 umol/mg/min였으며, 이들의 상대효소활성은 융해성 분획에서 74.7%, 불용성 분획에서 25.3%로 나타났다.

CZ::AdhE2의 효소활성을 측정하기 위해서 부티릴-CoA 0.1mM, NADH 0.1mM, DTT 1mM이 포함된 MOPS 완충용액(pH 7.2)을 효소 반응액으로 준비하였다. 상기에서 획득한 실험군의 용해성(soluble) 분획 25㎕ 및 불용성(insoluble) 분획 25㎕를 각각의 효소 반응액에 첨가하고 10분 간격으로 분광광도계 340nm에서 흡수 스펙트럼을 90분 동안 측정하여 NADH 감소량을 측정하여 CZ::AdhE2의 효소 활성을 측정하여 용해성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획의 상대효소 활성을 비교하였다. 그 결과 융해성 분획과 불용성 분획의 효소 활성은 각각 0.077 umol/mg/min, 0.036 umol/mg/min 였으며, 이들의 상대효소활성은 융해성 분획에서 67.7%, 불용성 분획에서 32.3%로 나타났다.

결과적으로 대조군의 경우 용해성 분획에서 ADHE2의 효소 활성이 불용성 분획보다 높게 측정되었고, 실험군(효소 복합체)의 경우는 불용성 분획에서 각 효소의 활성이 용해성 분획보다 높게 측정되었다(도 10b).

3-5. 실시예 3-1. 내지 3-4. 부분 - 정리

종합하면,대조군의 경우 용해성 분획에서 HBD, CRT, TER, ADHE2의 효소 활성이 불용성 분획보다 높게 측정되었고, 실험군(효소 복합체)의 경우는 불용성 분획에서 각 효소의 활성이 용해성 분획보다 높게 측정되었다(도 10b). 또한, 네 종류의 효소 중에서, HBD, CRT, TER는 유리된 상태의 효소들에 비해서, 실험군의 불용성 분획에서, 즉 본 발명에 따른 효소 복합체의 경우에 효소 활성이 높았고, ADHE2는 유리된 상태의 효소와 실험군의 불용성 분획이 유사한 정도의 효소 활성을 나타내었다.

이와 같은 결과로부터, 실험군의 불용성 분획에서 각 효소의 활성이 높게 측정되는 것을 통하여 해당 효소들이 류신 지퍼에 의해서 섬유소결합도메인과 결합되어 원심분리시 섬유소결합도메인과 함께 침전되며, 부탄올 생합성에 관여하는 효소와 섬유소결합도메인을 류신 지퍼로 연결하여도 부탄올 생합성에 관여하는 효소의 활성이 유지되는 것을 알 수 있다. 아울러, 부탄올 합성에 관여하는 효소와 섬유소결합도메인을 류신 지퍼로 연결하여도 연결되는 효소에 따라 효소 활성 정도가 다르며, 특히 HBD, CRT, TER의 경우에는 유리된 효소 상태일 때보다, 효소 복합체 형태일 때 효소 활성이 증가한 것을 알 수 있었다.

부탄올 합성 관련효소와 섬유소결합도메인의 융합에 따른 부탄올 생성 효율 확인

4-1. 인 비트로( in vitro )에서 부탄올 합성

상기 실시예 2의 형질전환된 대조군 및 실험군 대장균으로부터, 각 효소 또는 효소 복합체를 분리한 후, 시험관 내에서 부탄올 합성에 미치는 영향을 확인하였다. 상기 실시예 3의 대조군의 용해성 분획으로부터 유리상태의 효소를 준비하였고, 실험군의 불용성분획으로부터 복합체를 형성한 효소를 준비하였다.

시험관 내 부탄올 전환반응을 위해 pH 7.4의 MOPS 완충용액에 아세토아세틸-CoA 20mM, NADH 50mM, DDT 1mM가 포함된 전환반응액을 준비하였다. 반응액 150㎕에 상기에서 준비한 대조군의 유리상태의 효소 50㎕와 실험군의 효소복합체 50㎕를 각각 반응액에 첨가하여 총량을 200㎕로 하여 30℃에서 24시간 동안 반응하였다. 매 3시간, 혹은 6시간 간격으로 반응액으로부터 50㎕의 시료를 취하여 12000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 취하여 0.21㎛ 필터에 거른 후 불용성 단백질 및 불순물을 제거한 시료를 부탄올 분석에 이용하였다.

부탄올의 측정은 애질런트 사의 기체 크로마토그래피 7890B 모델과 불꽃 이온 검출기(FID)를 이용하였고, 분석용 컬럼 애질런트 사의 DB-WAX capillary 컬럼 (30 m, 0.32mm i.d., 0.50um 필름 두께)을 사용하였다. 상기에서 준비한 시료를 splitless 모드로 (15 ml/min at 0.75 min) 1㎕ 주입하였다. 기체 크로마토그래피 오븐 온도는 초기 60℃에서 4분 정체 시킨 후 분당 15℃씩 120℃ 까지 올렸다. 그 후 분당 50℃씩 230℃까지 올렸다. 운반기체는 헬륨을 사용하며 기체 주입부 (inlet) 압력은 9.3 psi를 유지하였다. 기체크로마토그래피의 기체 주입부 (inlet) 온도는 250℃, 검출기는 300℃로 유지하였다.

그 결과, 시험관 내에서 부탄올 합성시 효소 복합체의 경우 23.68ㅁ4.80 mg/L의 부탄올이 생성되었고, 부탄올 합성에 관여하는 효소가 유리된 상태로 존재하는 경우 6.28ㅁ2.88 mg/L 의 부탄올이 생성되었다. 상기의 결과에 의해서 시험관내 부탄올 전환 시험 결과 효소복합체를 형성한 경우 부탄올 합성에 관여하는 효소가 유리된 상태로 존재할 때에 비하여 약 4배 부탄올 합성 효율이 우수한 것을 알 수 있었다(도 11).

4-2. 인 비보( in vivo )에서 부탄올 합성 효율 평가 - 호기성 조건

상기 실시예 2의 형질전환된 대조군 및 실험군 대장균을 이용하여, 효소 복합체의 형성이 호기성 조건에서의 부탄올 합성에 미치는 영향을 확인하였다.

형질전환체는 50㎍/㎖의 엠피실린, 클로람페니콜 34mg/㎖이 포함된 LB 배지에 접종하여, 37℃, 200rpm에서 16시간 동안 전배양한 후, 본 배양 배지인 2% 글루코오스가 함유된 LB 배지에 1%(v/v)로 접종하였다. 37℃, 200rpm에서 0.5vvm의 속도로 공기를 주입하여 배양하였다. 본 배양 후 흡광값(OD600)이 0.4일 때 0.1mM IPTG를 첨가한 후 24시간 동안 호기적 조건에서 배양하여 부탄올 합성 효소인 HBD, CRT, TER, ADHE2의 발현을 유도하였다. 본 배지로 접종 후 3시간 간격으로 총 3번 시료를 채취하였고, 채취 시 전체 배양액량의 1/10을 취하여 흡광도(OD₆₀₀) 및 부탄올 분석에 사용하였다. 부탄올 분석 시료는 12,000rpm에서 5분 동안 원심분리 후, 상층액만 취해 0.21㎛ 필터에 거른 후 기체 크로마토그래피를 통해 분석하였으며 분석 조건은 시험관 시험에서와 동일한 조건으로 수행하였다.

그 결과, 본 배양 24시간 경과 후 실험군에서는 309.0ㅁ6.9mg/L, 대조군에서는 230.5ㅁ8.2mg/L의 부탄올이 각각 생산되었고, 효소 복합체 실험군이 효소가 유리된 상태로 존재하는 대조군보다 약 1.3배 높은 부탄올 생산량을 나타내었다(도 12a, 12b).

이와 같은 결과로부터, 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 섬유소결합도메인에 의해 서로 응집됨으로써 효소들 간의 물리적 간격이 좁아져 중간 생성물의 전환 속도의 향상 및 생산 수율이 증가되는 것을 알 수 있다.

4-3. 인 비보( in vivo )에서 부탄올 합성 효율 평가 - 혐기성 조건

상기 실시예 2의 형질전환된 대조군 및 실험군 대장균을 이용하여, 효소 복합체의 형성이 혐기성 조건에서의 부탄올 합성에 미치는 영향을 확인하였다.

형질전환체는 50㎍/㎖의 엠피실린, 클로람페니콜 34mg/㎖이 포함된 LB 배지에 접종하여, 37℃, 200rpm에서 16시간 동안 전배양한 후, 본 배양 배지인 2% 글루코오스가 함유된 LB 배지에 1%(v/v)로 접종하였다. 37℃, 200rpm에서 본 배양 후 흡광값(OD600)이 0.4일 때 0.1mM IPTG를 첨가한 후 12시간 동안 0.5vvm의 공기를 주입하여 주입하여 호기적 조건에서 배양하여 부탄올 합성 효소인 HBD, CRT, TER, ADHE2의 발현을 유도하였다. 호기적 조건에서 12시간 배양한 후 공기주입을 정지하여 미량호기성(microaerobic) 조건을 형성하고 37℃, 50rpm에서 배양 168 시간 동안 배양하였다. 본 배지로 접종 후 3시간 간격으로 총 3번 시료를 채취하였고, 채취 시 전체 배양액량의 1/10을 취하여 흡광도(OD₆₀₀) 및 부탄올 분석에 사용하였다. 부탄올 분석 시료는 12,000rpm에서 5분 동안 원심분리 후, 상층액만 취해 0.21㎛ 필터에 거른 후 기체 크로마토그래피를 통해 분석하였으며 분석 조건은 시험관 시험에서와 동일한 조건으로 수행하였다.

그 결과, 본 배양 168시간 경과 후 대조군에서는 1.281ㅁ0.046 g/L, 실험군에서는 1.981ㅁ0.099 g/L의 부탄올이 각각 생산되었고, 효소 복합체 실험군이 효소가 유리된 상태로 존재하는 대조군보다 약 1.5배 높은 부탄올 생산량을 나타내었다(도 13a, 13b).

상기 실시예 4-2 및 실시예 4-3의 결과로부터, 부탄올 합성에 관여하는 효소들이 섬유소결합도메인을 통해 서로 응집되어 효소 복합체를 형성하는 경우, 호기 배양 및 혐기 배양 모두에서 약 30% 이상으로 부탄올 생성 효율이 현저히 높아지는 것을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Korea Research Institute Bioscience and Biotechnology <120> Making of Enzyme Complex and Producing Method of Target Substance Using the Same <130> 2015-DPA-1041 <160> 62 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 1 Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile 1 5 10 15 Ala Gln Ala Phe Ala Ala Lys Gly Phe Glu Val Val Leu Arg Asp Ile 20 25 30 Lys Asp Glu Phe Val Asp Arg Gly Leu Asp Phe Ile Asn Lys Asn Leu 35 40 45 Ser Lys Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Glu Glu Ala Thr Lys Val Glu 50 55 60 Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gly Thr Val Asp Leu Asn Met Ala Ala Asp 65 70 75 80 Cys Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Val Glu Arg Met Asp Ile Lys Lys 85 90 95 Gln Ile Phe Ala Asp Leu Asp Asn Ile Cys Lys Pro Glu Thr Ile Leu 100 105 110 Ala Ser Asn Thr Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Val Ala Ser Ala Thr 115 120 125 Lys Arg Pro Asp Lys Val Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro Ala Pro 130 135 140 Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu 145 150 155 160 Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr Ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro 165 170 175 Val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile 180 185 190 Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala Ser 195 200 205 Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met 210 215 220 Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala 225 230 235 240 Ile Met Asp Val Leu Tyr Ser Glu Thr Gly Asp Ser Lys Tyr Arg Pro 245 250 255 His Thr Leu Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Gly Trp Leu Gly Arg Lys 260 265 270 Ser Gly Lys Gly Phe Tyr Asp Tyr Ser Lys 275 280 <210> 2 <211> 261 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 2 Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val 1 5 10 15 Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr 20 25 30 Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu 35 40 45 Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala 50 55 60 Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg 65 70 75 80 Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu 85 90 95 Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala 115 120 125 Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly 130 135 140 Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln 145 150 155 160 Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile 165 170 175 Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala 180 185 190 Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys 195 200 205 Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr 210 215 220 Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu 225 230 235 240 Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu 245 250 255 Gly Phe Lys Asn Arg 260 <210> 3 <211> 397 <212> PRT <213> Treponema denticola <400> 3 Met Ile Val Lys Pro Met Val Arg Asn Asn Ile Cys Leu Asn Ala His 1 5 10 15 Pro Gln Gly Cys Lys Lys Gly Val Glu Asp Gln Ile Glu Tyr Thr Lys 20 25 30 Lys Arg Ile Thr Ala Glu Val Lys Ala Gly Ala Lys Ala Pro Lys Asn 35 40 45 Val Leu Val Leu Gly Cys Ser Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Ser Arg Ile 50 55 60 Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Gly Val Ser Phe Glu 65 70 75 80 Lys Ala Gly Ser Glu Thr Lys Tyr Gly Thr Pro Gly Trp Tyr Asn Asn 85 90 95 Leu Ala Phe Asp Glu Ala Ala Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Ser Val Thr 100 105 110 Ile Asp Gly Asp Ala Phe Ser Asp Glu Ile Lys Ala Gln Val Ile Glu 115 120 125 Glu Ala Lys Lys Lys Gly Ile Lys Phe Asp Leu Ile Val Tyr Ser Leu 130 135 140 Ala Ser Pro Val Arg Thr Asp Pro Asp Thr Gly Ile Met His Lys Ser 145 150 155 160 Val Leu Lys Pro Phe Gly Lys Thr Phe Thr Gly Lys Thr Val Asp Pro 165 170 175 Phe Thr Gly Glu Leu Lys Glu Ile Ser Ala Glu Pro Ala Asn Asp Glu 180 185 190 Glu Ala Ala Ala Thr Val Lys Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Glu Arg 195 200 205 Trp Ile Lys Gln Leu Ser Lys Glu Gly Leu Leu Glu Glu Gly Cys Ile 210 215 220 Thr Leu Ala Tyr Ser Tyr Ile Gly Pro Glu Ala Thr Gln Ala Leu Tyr 225 230 235 240 Arg Lys Gly Thr Ile Gly Lys Ala Lys Glu His Leu Glu Ala Thr Ala 245 250 255 His Arg Leu Asn Lys Glu Asn Pro Ser Ile Arg Ala Phe Val Ser Val 260 265 270 Asn Lys Gly Leu Val Thr Arg Ala Ser Ala Val Ile Pro Val Ile Pro 275 280 285 Leu Tyr Leu Ala Ser Leu Phe Lys Val Met Lys Glu Lys Gly Asn His 290 295 300 Glu Gly Cys Ile Glu Gln Ile Thr Arg Leu Tyr Ala Glu Arg Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Lys Asp Gly Thr Ile Pro Val Asp Glu Glu Asn Arg Ile Arg Ile 325 330 335 Asp Asp Trp Glu Leu Glu Glu Asp Val Gln Lys Ala Val Ser Ala Leu 340 345 350 Met Glu Lys Val Thr Gly Glu Asn Ala Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ala 355 360 365 Gly Tyr Arg His Asp Phe Leu Ala Ser Asn Gly Phe Asp Val Glu Gly 370 375 380 Ile Asn Tyr Glu Ala Glu Val Glu Arg Phe Asp Arg Ile 385 390 395 <210> 4 <211> 860 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 4 Met Lys Val Thr Asn Gln Lys Glu Leu Lys Gln Lys Leu Asn Glu Leu 1 5 10 15 Arg Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Gln Glu Gln Val Asp 20 25 30 Lys Ile Phe Lys Gln Cys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Glu Arg Ile Asn 35 40 45 Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp 50 55 60 Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly 85 90 95 Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro 100 105 110 Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu 115 120 125 Lys Thr Arg Asn Ala Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys 130 135 140 Ser Thr Ile Ala Ala Ala Lys Leu Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu 165 170 175 Leu Ser Gln Asp Leu Met Ser Glu Ala Asp Ile Ile Leu Ala Thr Gly 180 185 190 Gly Pro Ser Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile 195 200 205 Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp 210 215 220 Ile Asp Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn 225 230 235 240 Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile 245 250 255 Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu 260 265 270 Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly 275 280 285 Ala Ile Asn Ala Asp Ile Val Gly Lys Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Lys 290 295 300 Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu 305 310 315 320 Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser 325 330 335 Pro Val Leu Ala Met Tyr Lys Val Lys Asp Phe Asp Glu Ala Leu Lys 340 345 350 Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser 355 360 365 Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly 370 375 380 Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln 385 390 395 400 Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr 405 410 415 Leu Gly Cys Gly Thr Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Gln Asn Val Glu 420 425 430 Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Ser Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn 435 440 445 Met Leu Trp Phe Lys Val Pro Gln Lys Ile Tyr Phe Lys Tyr Gly Cys 450 455 460 Leu Arg Phe Ala Leu Lys Glu Leu Lys Asp Met Asn Lys Lys Arg Ala 465 470 475 480 Phe Ile Val Thr Asp Lys Asp Leu Phe Lys Leu Gly Tyr Val Asn Lys 485 490 495 Ile Thr Lys Val Leu Asp Glu Ile Asp Ile Lys Tyr Ser Ile Phe Thr 500 505 510 Asp Ile Lys Ser Asp Pro Thr Ile Asp Ser Val Lys Lys Gly Ala Lys 515 520 525 Glu Met Leu Asn Phe Glu Pro Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gly Gly Gly 530 535 540 Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Val Met His Leu Leu Tyr Glu Tyr Pro 545 550 555 560 Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Ala Ile Asn Phe Met Asp Ile Arg Lys 565 570 575 Arg Ile Cys Asn Phe Pro Lys Leu Gly Thr Lys Ala Ile Ser Val Ala 580 585 590 Ile Pro Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Ala Thr Pro Phe Ala Val 595 600 605 Ile Thr Asn Asp Glu Thr Gly Met Lys Tyr Pro Leu Thr Ser Tyr Glu 610 615 620 Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met 625 630 635 640 Pro Arg Lys Leu Thr Ala Ala Thr Gly Ile Asp Ala Leu Val His Ala 645 650 655 Ile Glu Ala Tyr Val Ser Val Met Ala Thr Asp Tyr Thr Asp Glu Leu 660 665 670 Ala Leu Arg Ala Ile Lys Met Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr 675 680 685 Lys Asn Gly Thr Asn Asp Ile Glu Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala 690 695 700 Ser Asn Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly Val Cys 705 710 715 720 His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ala Met His His Val Pro His Gly 725 730 735 Ile Ala Cys Ala Val Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Tyr Asn Ala Thr 740 745 750 Asp Cys Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Pro Gln Tyr Lys Ser Pro Asn 755 760 765 Ala Lys Arg Lys Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu Asn Leu Lys Gly 770 775 780 Thr Ser Asp Thr Glu Lys Val Thr Ala Leu Ile Glu Ala Ile Ser Lys 785 790 795 800 Leu Lys Ile Asp Leu Ser Ile Pro Gln Asn Ile Ser Ala Ala Gly Ile 805 810 815 Asn Lys Lys Asp Phe Tyr Asn Thr Leu Asp Lys Met Ser Glu Leu Ala 820 825 830 Phe Asp Asp Gln Cys Thr Thr Ala Asn Pro Arg Tyr Pro Leu Ile Ser 835 840 845 Glu Leu Lys Asp Ile Tyr Ile Lys Ser Phe Leu Glu 850 855 860 <210> 5 <211> 110 <212> PRT <213> Cellulomonas fimi <400> 5 Met Ser Gly Pro Ala Gly Ser Cys Gln Val Leu Trp Gly Val Asn Gln 1 5 10 15 Trp Asn Thr Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Val Lys Asn Thr Ser Ser 20 25 30 Ala Pro Val Asp Gly Trp Thr Leu Thr Phe Ser Phe Pro Ser Gly Gln 35 40 45 Gln Val Thr Gln Ala Trp Ser Ser Thr Val Thr Gln Ser Gly Ser Ala 50 55 60 Val Thr Val Arg Asn Ala Pro Trp Asn Gly Ser Ile Pro Ala Gly Gly 65 70 75 80 Thr Ala Gln Phe Gly Phe Asn Gly Ser His Thr Gly Thr Asn Ala Ala 85 90 95 Pro Thr Ala Phe Ser Leu Asn Gly Thr Pro Cys Thr Val Gly 100 105 110 <210> 6 <211> 849 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 6 atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc tcaggcattt 60 gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt tgatagagga 120 ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct 180 actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat 240 tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca gatttttgct 300 gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc atcactttca 360 ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga cctgataagg ttataggtat gcatttcttt 420 aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac atcacaagaa 480 acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca 540 gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga agcagttggt 600 atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa acttggagct 660 aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat atgtcttgct 720 ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca tacattactt 780 aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat 840 tcaaaataa 849 <210> 7 <211> 786 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 7 atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac 60 agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata 120 ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa 180 tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa 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ggcggtgagc tccataatcc tgtcaaagac ttatgacaat 720 ggcgtaatat gcgcgtcgga gcagtcgata ttagttatga acagcatcta cgaaaaagtc 780 aaagaggagt tcgtcaaacg cgggagctat atactgaatc agaatgagat cgctaagatt 840 aaggaaacca tgttcaagaa tggggctatt aatgctgaca tagtcggtaa gtccgcttat 900 ataattgcga agatggcagg catcgaagtt ccgcaaacca caaagatcct tatcggtgaa 960 gtacagtctg ttgaaaagtc ggagctgttc tcacacgaaa aactctcccc tgtgcttgcc 1020 atgtataaag tcaaggattt tgacgaagca ttgaaaaaag cccagcgcct gatcgaatta 1080 ggtggaagtg gacacacgtc atctctctat atagattcac agaacaacaa ggataaagtg 1140 aaagagtttg gcctagcgat gaaaacaagc cgcacgttta ttaatatgcc ttcttcccaa 1200 ggggcaagcg gggatctcta caactttgcg atagcaccat catttactct aggctgcggc 1260 acctggggcg gaaactctgt ctcgcaaaat gttgaaccta aacacctgct gaatatcaag 1320 agtgtggctg aacgtaggga aaatatgctg tggttcaaag tgccacagaa aatctatttt 1380 aagtatggat gtctgcggtt tgcattaaaa gaactgaaag atatgaataa gaagcgggcg 1440 tttatagtaa cggataaaga cctgtttaag ctgggatatg tgaataaaat cacgaaggta 1500 ctagacgaga tagatattaa gtacagtatt 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tatgtcccaa 360 gcacctaaat tacaacgatt taattacgaa acagaaagct atgatgcgcc tttttctagt 420 atgatgtacg atgggttaac ggatgccttt agtggtcaag caatgggctt aactgctgaa 480 aatgtggccg aaaagtatca tgtaactaga gaagagcaag atcaattttc tgtacattca 540 caattaaaag cagctcaagc acaagcagaa gggatattcg ctgacgaaat agccccatta 600 gaagtatcag gaacgcttgt ggagaaagat gaagggattc gccctaattc gagcgttgag 660 aagctaggaa cgcttaaaac agtttttaaa gaagacggta ctgtaacagc agggaatgca 720 tcaaccatta atgatggggc ttctgctttg attattgctt cacaagaata tgccgaagca 780 cacggtcttc cttatttagc tattattcga gacagtgtgg aagtcggtat tgatccagcc 840 tatatgggaa tttcgccgat taaagccatt caaaaactgt tagcgcgcaa tcaacttact 900 acggaagaaa ttgatctgta tgaaatcaac gaagcatttg cagcaacttc aatcgtggtc 960 caaagagaac tggctttacc agaggaaaag gtcaacattt atggtggcgg tatttcatta 1020 ggtcatgcga ttggtgccac aggtgctcgt ttattaacga gtttaagtta tcaattaaat 1080 caaaaagaaa agaaatatgg agtggcttct ttatgtatcg gcggtggctt aggactcgct 1140 atgctactag agagacctca gcaaaaaaaa aacagccgat tttatcaaat gagtcctgag 1200 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actagttgga cgctggatgg cgaacaacta attggtgaaa tttcagttcc gcttgcgtta 2100 gccacggttg gcggtgccac aaaagtctta cctaaatctc aagcagctgc tgatttgtta 2160 gcagtgacgg atgcaaaaga actaagtcga gtagtagcgg ctgttggttt ggcacaaaat 2220 ttagcggcgt tacgggcctt agtctctgaa ggaattcaaa aaggacacat ggctctacaa 2280 gcacgttctt tagcgatgac ggtcggagct actggtaaag aagttgaggc agtcgctcaa 2340 caattaaaac gtcaaaaaac gatgaaccaa gaccgagcct tggctatttt aaatgattta 2400 agaaaacaat aa 2412 <210> 28 <211> 1011 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mvaK2 <400> 28 atgattgctg ttaaaacttg cggaaaactc tattgggcag gtgaatatgc tattttagag 60 ccagggcagt tagctttgat aaaggatatt cccatctata tgagggctga gattgctttt 120 tctgacagct accgtatcta ttcagatatg tttgatttcg cagtggactt aaggcccaat 180 cctgactaca gcttgattca agaaacgatt gctttgatgg gagacttcct cgctgttcgc 240 ggtcagaatt taagaccttt ttccctaaaa atctgtggca aaatggaacg agaagggaaa 300 aagtttggtc taggttctag tggcagcgtc gttgtcttgg ttgtcaaggc tttactggct 360 ctctataatc tttcggttga tcagaatctc ttgttcaagc tgactagcgc tgtcttgctc 420 aagcgaggag acaatggttc catgggcgac cttgcctgta ttgtggcaga ggatttggtt 480 ctttaccagt catttgatcg ccagaaggcg gctgcttggt tagaagaaga aaacttggcg 540 acagttctgg agcgtgattg gggatttttt atctcacaag tgaaaccaac tttagaatgt 600 gatttcttag tgggatggac caaggaagtg gctgtatcga gtcacatggt ccagcaaatc 660 aagcaaaata tcaatcaaaa ttttttaagt tcctcaaaag aaacggtggt ttctttggtc 720 gaagccttgg agcaggggaa agccgaaaaa gttatcgagc aagtagaagt agccagcaag 780 cttttagaag gcttgagtac agatatttac acgcctttgc ttagacagtt gaaagaagcc 840 agtcaagatt tgcaggccgt tgccaagagt agtggtgctg gtggtggtga ctgtggcatc 900 gccctgagtt ttgatgcgca atcttctcga aacactttaa aaaatcgttg ggccgatctg 960 gggattgagc tcttatatca agaaaggata ggacatgacg acaaatcgta a 1011 <210> 29 <211> 954 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mvaD <400> 29 atggatagag agcctgtaac agtacgttcc tacgcaaata ttgctattat caaatattgg 60 ggaaagaaaa aagaaaaaga gatggtgcct gctactagca gtatttctct aactttggaa 120 aatatgtata cagagacgac cttgtcgcct ttaccagcca atgtaacagc tgacgaattt 180 tacatcaatg gtcagctaca aaatgaggtc gagcatgcca agatgagtaa gattattgac 240 cgttatcgtc cagctggtga gggctttgtc cgtatcgata ctcaaaacaa tatgcctacg 300 gcagcgggcc tgtcctcaag ttctagtggt ttgtccgccc tggtcaaggc ttgtaatgct 360 tatttcaagc ttggattgga tagaagtcag ttggcacagg aagccaaatt tgcctcaggc 420 tcttcttctc ggagttttta tggaccacta ggagcctggg ataaggatag tggagaaatt 480 taccctgtag agacagactt gaaactagct atgattatgt tggtgctaga ggacaagaaa 540 aaaccaatct ctagccgtga cgggatgaaa ctttgtgtgg aaacctcgac gacttttgac 600 gactgggttc gtcagtctga gaaggactat caggatatgc tgatttatct caaggaaaat 660 gattttgcca agattggaga attaacggag aaaaatgctc tggctatgca tgctacgaca 720 aagactgcta gtccagcctt ttcttatctg acggatgcct cttatgaggc tatggccttt 780 gttcgccagc ttcgtgagaa aggagaggcc tgctacttta ccatggatgc tggtcccaat 840 gttaaggtct tctgtcagga gaaagacttg gagcatttgt cagaaatttt cggtcagcgt 900 tatcgcttga ttgtgtcaaa aacaaaggat ttgagtcaag atgattgctg ttaa 954 <210> 30 <211> 549 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> idi <400> 30 atgcaaacgg aacacgtcat tttattgaat gcacagggag ttcccacggg tacgctggaa 60 aagtatgccg cacacacggc agacacccgc ttacatctcg cgttctccag ttggctgttt 120 aatgccaaag gacaattatt agttacccgc cgcgcactga gcaaaaaagc atggcctggc 180 gtgtggacta actcggtttg tgggcaccca caactgggag aaagcaacga agacgcagtg 240 atccgccgtt gccgttatga gcttggcgtg gaaattacgc ctcctgaatc tatctatcct 300 gactttcgct accgcgccac cgatccgagt ggcattgtgg aaaatgaagt gtgtccggta 360 tttgccgcac gcaccactag tgcgttacag atcaatgatg atgaagtgat ggattatcaa 420 tggtgtgatt tagcagatgt attacacggt attgatgcca cgccgtgggc gttcagtccg 480 tggatggtga tgcaggcgac aaatcgcgaa gccagaaaac gattatctgc atttacccag 540 cttaaataa 549 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CZ sequence(prey) <400> 31 Glu Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 32 <211> 90 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CZ sequence(prey) <400> 32 gagcagctga aaaagaagtt acaagccctg gagaaaaaac ttgctcagct ggaatggaaa 60 aaccaagcat tggaaaaaga actcgcgcag 90 <210> 33 <211> 29 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> NZ sequence(bate) <400> 33 Ala Leu Lys Lys Glu Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln Leu 1 5 10 15 Lys Trp Glu Leu Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 <210> 34 <211> 87 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> NZ sequence(bate) <400> 34 gccctcaaaa aagaattgca ggcaaacaaa aaagaacttg cgcagctgaa gtgggagtta 60 caagctctga aaaaggaact ggcgcag 87 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NZ_F <400> 35 atacatatgg ccctcaaaaa agaattgcag 30 <210> 36 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NZ_GS_R <400> 36 cccggccgga ccactgctgc taccgctgcc gctaccctgc gcca 44 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS_CBD_F <400> 37 agcagtggtc cggccgggtg ccaggtgctg tggggcgtca acc 43 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD_R <400> 38 atactcgagt tagccgaccg tgcagggcgt g 31 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CZ_F <400> 39 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<220> <223> GS_Ter_R <400> 56 cattggcttg acgatgctac cgctgccgct 30 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS_AdhE2_F <400> 57 agcggcagcg gtagcaaagt tacaaatcaa aaagaa 36 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS_AdhE2_R <400> 58 ttgatttgta actttgctac cgctgccgct 30 <210> 59 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NZ::eGFP sequence <400> 59 Met Ala Leu Lys Lys Glu Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Lys Trp Glu Leu Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu 35 40 45 Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val 50 55 60 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr 65 70 75 80 Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro 85 90 95 Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys 100 105 110 Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser 115 120 125 Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp 130 135 140 Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr 145 150 155 160 Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly 165 170 175 Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val 180 185 190 Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys 195 200 205 Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr 210 215 220 Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn 225 230 235 240 His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys 245 250 255 Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr 260 265 270 Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 275 280 <210> 60 <211> 843 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NZ::eGFP sequence <400> 60 atggccctca aaaaagaatt gcaggcaaac aaaaaagaac ttgcgcagct gaagtgggag 60 ttacaagctc tgaaaaagga actggcgcag ggtagcggca gcggtagcag cagtggtccg 120 gccggggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 180 gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 240 tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 300 accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 360 aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 420 ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 480 ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 540 cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 600 aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 660 gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 720 cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 780 gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 840 taa 843 <210> 61 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CZ::eGFP sequence <400> 61 Met Glu Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln Gly 20 25 30 Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val 35 40 45 Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe 50 55 60 Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr 85 90 95 Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro 100 105 110 Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly 115 120 125 Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys 130 135 140 Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile 145 150 155 160 Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His 165 170 175 Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp 180 185 190 Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile 195 200 205 Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro 210 215 220 Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr 225 230 235 240 Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val 245 250 255 Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu 260 265 270 Leu Tyr Lys 275 <210> 62 <211> 828 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CZ::eGFP sequence <400> 62 atggagcagc tgaaaaagaa gttacaagcc ctggagaaaa aacttgctca gctggaatgg 60 aaaaaccaag cattggaaaa agaactcgcg cagggtagcg gcagcggtag cgtgagcaag 120 ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 180 ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 240 ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 300 ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 360 ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 420 ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 480 gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 540 aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 600 aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 660 cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 720 cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 780 gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaa 828

Claims

섬유소결합도메인;
류신 지퍼; 및
전구체로부터 목적 물질의 생합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들;을 포함하고,
상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 각각은 상기 류신 지퍼를 통해 상기 섬유소결합도메인에 연결되며,
상기 각각의 효소들이 연결된 섬유소결합도메인들은 서로 응집되어 복합체화되는 것을 특징으로 하는 목적 물질 생합성을 위한 효소 복합체.
청구항 1에 있어서,
상기 류신 지퍼를 통한 연결은 ⅰ) 상기 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들에 융합된 NZ 단백질과 상기 섬유소결합도메인에 융합된 CZ 단백질이 상호 결합됨으로써 이루어지거나, 또는 ⅱ) 상기 부탄올 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들에 융합된 CZ 단백질과 상기 섬유소결합도메인에 융합된 NZ 단백질이 상호 결합됨으로써 이루어지는 효소 복합체.
청구항 1에 있어서,
상기 목적 물질은 부탄올, 1,4-부탄디올 및 이소프렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 효소 복합체.
청구항 3에 있어서,
부탄올 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, HBD), 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase, CRT), 트랜스-에노일-CoA 환원효소(trans-enoyl-CoA reductase, TER) 및 알데히드/알코올 탈수소효소(aldehyde and alcohol dehydrogenase, AdhE2)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소 복합체.
청구항 3에 있어서,
1,4-부탄디올 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 숙시닐-CoA 합성효소(Succinyl-CoA synthetase, sucCD), CoA-의존성 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase, sucD), 4-히드록시부티레이트 탈수소효소(4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-HBD), 4-히드록시부티릴-CoA 전이효소(4-hydroxybutyryl-CoA transferase, 4-HBT) 및 알데히드/알코올 탈수소효소(Aldehyde/Alcohol dehydrogenase, AdhE2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 복합체.
청구항 3에 있어서,
이소프렌 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 히드록시메틸글루타릴 CoA 생성효소(hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mvaS), 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, mvaA), 메발로네이트 인산화효소(mevalonate kinase, mvaK1), 아세틸-CoA 아세틸전이효소/HMG-CoA 환원효소(acetyl-CoA acetyltransferase/HMG-CoA reductase, mvaE), 포스포메발로네이트 인산화효소(phosphomevalonate kinase, mvaK2), 디포스포메발로네이트 탈탄산효소(diphosphomevalonate decarboxylase, mvaD), 이소펜틸-디포스페이트 델타 이성질화효소(isopentenyl-diphosphate delta isomerase, idi) 및 이소프렌 생성효소(isoprene synthase, IspS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 복합체.
청구항 1에 있어서,
상기 섬유소결합도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 복합체.
청구항 1에 있어서,
상기 섬유소결합도메인의 응집은 상기 섬유소결합도메인이 섬유소에 결합됨으로써 이루어지는 효소 복합체.
섬유소결합도메인과 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터와 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 각각이 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질과 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터; 또는 섬유소결합도메인과 류신 지퍼를 이루는 CZ 단백질이 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터와 목적 물질의 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들 각각이 류신 지퍼를 이루는 NZ 단백질과 서로 연결되어 발현되도록 클로닝된 재조합 벡터;가 숙주세포에 도입된 목적 물질의 합성을 위한 형질전환체.
청구항 9에 있어서,
상기 목적 물질은 부탄올, 1,4-부탄디올 및 이소프렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 형질전환체.
청구항 10에 있어서,
부탄올 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, HBD), 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase, CRT), 트랜스-에노일-CoA 환원효소(trans-enoyl-CoA reductase, TER) 및 알데히드/알코올 탈수소효소(aldehyde and alcohol dehydrogenase, AdhE2)로 구성된 군으로부터 선택되는 형질전환체.
청구항 10에 있어서,
1,4-부탄디올 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 숙시닐-CoA 합성효소(Succinyl-CoA synthetase, sucCD), CoA-의존성 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase, sucD), 4-히드록시부티레이트 탈수소효소(4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-HBD), 4-히드록시부티릴-CoA 전이효소(4-hydroxybutyryl-CoA transferase, 4-HBT) 및 알데히드/알코올 탈수소효소(Aldehyde/Alcohol dehydrogenase, AdhE2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질전환체.
청구항 10에 있어서,
이소프렌 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 히드록시메틸글루타릴 CoA 생성효소(hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mvaS), 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, mvaA), 메발로네이트 인산화효소(mevalonate kinase, mvaK1), 아세틸-CoA 아세틸전이효소/HMG-CoA 환원효소(acetyl-CoA acetyltransferase/HMG-CoA reductase, mvaE), 포스포메발로네이트 인산화효소(phosphomevalonate kinase, mvaK2), 디포스포메발로네이트 탈탄산효소(diphosphomevalonate decarboxylase, mvaD), 이소펜틸-디포스페이트 델타 이성질화효소(isopentenyl-diphosphate delta isomerase, idi) 및 이소프렌 생성효소(isoprene synthase, IspS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질전환체.
청구항 9에 있어서,
상기 섬유소결합도메인은 서열번호 10의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
청구항 9에 있어서,
상기 숙주세포는 세균, 효모 및 곰팡이로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
청구항 15에 있어서,
상기 숙주세포는 아세틸-CoA로의 대사회로가 조절된 대장균 MG1655 균주(Δfed ΔldhA ΔadhE Δpta)인 형질전환체.
청구항 9의 형질전환체를 목적 물질의 전구체의 존재 하에서 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 물질의 생산 방법.