KR101519627B1

KR101519627B1 - 생체 내 단백질 간 상호작용의 분석 방법

Info

Publication number: KR101519627B1
Application number: KR1020120063804A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 최수림; 감종식; 송재준; 이상준
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2015-05-12
Also published as: KR20130023057A

Abstract

본 발명은 세포 내 단백질 간 상호작용을 분석하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 세포를 제공하고, 상기 융합 단백질을 발현시켜 세포 내에서 봉입체 (inclusion body)를 형성시킨 다음, 형광 단백질의 형광 신호를 측정하여 세포 내 단백질 간 상호작용을 분석하는 방법, 상기 구조물들을 포함하는 세포를 이용하여 목적 단백질과 결합하는 표적 단백질을 분리하는 방법, 상기 세포, 및 상기 구조물을 포함하는 단백질 간 상호작용 분석용 키트에 관한 것이다.

Description

생체 내 단백질 간 상호작용의 분석 방법{Method for Detecting Protein-Protein Interactions in Cells}

생명체의 많은 기능들은 분자간 상호작용 네트워크에 의해 조절된다. 따라서, 세포 내 단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interactions, PPI)의 이해는 현대 생물학 연구에서 중요한 이슈이다. PPI는 면역침강법 (immunoprecipitation) 및 TAP (tandem affinity purification)와 같은 in vitro 실험 방법에 의해 주로 확인되어 왔다. 그러나, in vitro 접근법으로는 다이나믹한 in vivo 단백질 간 상호작용을 정확히 분석하기에는 한계가 있다. 또는 Y2H (yeast two-hybrid) 분석이 in vivo 조건에서 높은 민감성으로 PPI를 검출하는 방법으로 사용되어 왔으나, 반드시 효모에서 수행되어야 하며, 핵 전위를 필요로 하고, 직접 접촉을 관찰하는 것이 아니고 2차 유발되는 전사활성과 효과를 측정하는 간접적인 분석방법이므로, 결과적으로 거짓 양성이 발생되는 단점이 있다.

상기와 같은 단점을 극복하기 위하여, FRET (fluorescence resonance energy transfer), 형광 상보 (fluorescence complementation) 방법 및 형광 동시 집적 (fluorescence co-localization) 방법 등과 같은 형광 기술을 바탕으로 한 수많은 새로운 방법이 개발되어 왔다. 이 중 FRET 방법은 공여 (donor) 단백질 및 수용체 (acceptor) 단백질이 2-8 nm 거리 내에 있을 때 형광 스펙트럼이 변화하는 것을 검출하는 방법으로, 두 개의 서로 다른 파장영역의 형광물질이 인접하였을 경우 하나의 형광을 일으키는 에너지 (donor)가 다른 형광물질에 전달되는 공명이 일어나 다른형광 (acceptor)이 일어나는 현상을 이용한 것이다. 형광 상보 (fluorescence complementation) 방법은 살아있는 세포 내에서 단백질간의 결합을 확인할 수 있는 방법으로서, 그 원리는 형광 단백질을 N-절편과 C-절편으로 나눈 후 각각에 결합 단백질을 붙여서 세포 내에 발현시킨 후, 두 단백질이 결합하면 형광 단백질의 N-, C-절편이 결합하게 되어 완전한 형광 단백질이 만들어지고, 이에 따라, 비로소 세포가 형광을 나타내게 되는 것을 이용한 것으로, GFP 절편의 상보 작용에 의한 형광 회복을 바탕으로 한 방법이다. 비록 상기 두 방법은 고속 대량 분석기구인 유세포분석기를 이용하여 분석하는 경우 동물 세포에서 일어나는 상호작용을 효과적으로 분석할 수 있었으나, 이를 박테리아 세포에 적용하는 것은 쉽지가 않다. 예를 들어, FRET 방법은 진핵세포와 비교하여 상당히 작은 크기의 박테리아 세포에서 작은 신호를 민감하게 정량하기에는 검출 수준이 매우 낮았다. 형광 상보 방법은 큰 세포에 따라 단백질 발현이 균일하지 않을 수 있고 박테리아 내 다른 요소들에 영향을 받아서 거짓 양성을 발생하는 경우가 많았다.

형광 동시 집적 방법은 진핵 세포의 특별한 세포 소기관에 집적되어 사용되지만, 박테리아 시스템은 세포 소기관 구조가 없어서, 박테리아 시스템에는 적용할 수 없다. 그러나, 최근에 목적 (bait) 단백질이 융합된 세포 분열 유도 단백질 및 형광 표적 (prey) 단백질이 동시 발현되어 형광 PPI 복합체가 E. coli 세포 내의 양쪽 말단 염색체 부위로 재배열하는 연구 결과가 보고된 바 있다 (Edwards, A. N., et al., 2009. An in vivo imaging-based assay for detecting protein interactions over a wide range of binding affinities. Anal. Biochem. 395:166-77.).

이에 본 발명자들은 살아있는 세포에서 생체 물질 간 상호작용을 분석할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 셀룰로모나스 피미 (Cellulomonas fimi) 유래의 패밀리 II CBD (cellulose-binding domain)가 E. coli 내에서 자가-응집을 하여 봉입체 (inclusion bodies, IB)를 형성하는 것을 확인하고, CBD-유도 IB는 상호작용 단백질들이 동시-발현될 때, 입자 내의 특정 상호작용 단백질을 포획하는 경향이 있는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 상기 봉입체를 박테리아 세포뿐만 아니라 진핵 세포 내의 인공 세포 소기관 구조로 사용하여 새로운 형광 동시 집적 방법을 개발하고자 하였다. 이에 본 발명자들은 역평행 류신 지퍼 (leucine zipper)를 상호작용 단백질의 모델로 사용하여 FCIB (fluorescence colocalization on inclusion bodies)를 형광 현미경 및 고속 대량 분석기인 유세포분석기로 관찰하여 낮은 결합 친화도를 갖는 상호작용 단백질의 결합을 분석 및 분리할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 융합 단백질을 발현시켜 세포 내에서 봉입체 (inclusion body)를 형성시키는 단계; 및 (iii) 목적 단백질과 표적 단백질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광 신호로 측정하는 단계를 포함하는, 세포 내 단백질 간 상호작용을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 융합 단백질을 발현시켜 세포 내에서 봉입체 (inclusion body)를 형성시키는 단계; 및 (iii) 목적 단백질에 결합된 표적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 목적 단백질과 상호 작용하는 표적 단백질을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 구조물이 도입된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 구조물을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 융합 단백질을 발현시켜 세포 내에서 봉입체 (inclusion body)를 형성시키는 단계; 및 (iii) 목적 단백질과 표적 단백질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광 신호로 측정하는 단계를 포함하는, 세포 내 단백질 간 상호작용을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법은 기존의 세포 내 단백질 간 상호작용을 검출하는 방법으로 사용된 FRET (fluorescence resonance energy transfer), 형광 상보 (fluorescence complementation) 방법 및 형광 동시 집적 (fluorescence co-localization) 방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 CBD 단백질 태그가 세포 내에서 봉입체를 형성하여 형광 단백질이 봉입체에 응집하는 현상을 통해 간편하게 상호작용을 검출할 수 있는 방법이다. 특히, 기존의 봉입체의 경우에는 활성이 없어서, 활성이 있는 단백질간의 상호작용 검출에는 한계가 있었으나, 본 발명의 CBD 단백질은 소수성 잔기가 외부로 다수 노출되어 있어, 결합하는 단백질의 정상적인 폴딩 (folding) 상태에서 봉입체를 형성하여 실제 활성을 갖고 있는 단백질 간의 생체 내에서 일어나는 단백질간 상호 작용을 검출할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 이러한 장점에 의해서 단백질의 발현 수준에 영향이 없으므로, 과발현 상태에서 상호작용의 신호 (signal)가 줄어드는 단점이 없어서 과발현에 의한 노이즈 제거에도 장점을 갖고 있다.

본 발명에서 용어, "목적 (bait) 단백질"이란 이와 상호작용하는 단백질을 알고자 하는 단백질로서, 봉입체에 제시되어 상호작용하는 표적 (prey) 단백질과 결합하여 세포 내 인공 소기관으로 작용하는 봉입체 주위로 형광이 집중될 수 있도록 하는 단백질을 의미한다. 본 발명에서 용어, "표적 (prey) 단백질"이란 목적 단백질과 상호작용할 수 있는 단백질을 의미한다. 목적 단백질 및 표적 단백질은 이에 제한되지는 않으나, 다양한 치료용 단백질, 신호전달 단백질 등 각각 상호작용의 대상이 되는 물질을 의미할 수 있다. 상기 목적 단백질 및 표적 단백질은 천연형 단백질뿐만 아니라, 기능을 담당하는 도메인, 폴리펩타이드 일부일 수 있다. 상호작용의 검출 또는 스크리닝을 위해 목적 단백질은 실험자가 알고 있는 물질을 의미하며, 표적 단백질은 미지의 물질을 지칭하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게 상기 목적 단백질 및 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다양한 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 라이브러리로부터 유래된 것일 수 있다. 이는 전체 게놈성 DNA 및 cDNA 라이브러리와 같은 생물체 전체 게놈에서부터 얻을 수 있다. 또한, 상기 목적 단백질 및 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공제 라이브러리 (subtracted 라이브러리) 또는 맞춤 라이브러리 (sized 라이브러리)와 같은 전체 게놈 서브셋에서부터 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어, "제1 형광 단백질" 및 "제2 형광 단백질"은 당업자가 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 물질을 의미하며, 이의 예로는 GFP (Green Fluorescent Protein), EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), mGFP (modified green fluorescent protein), RFP (Red Fluorescent Protein), mRFP (Monomeric Red Fluorescent Protein), ERFP (Enhanced Red Fluorescent Protein), DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), BFP (Blue Fluorescent Protein), EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein), CGFP (Cyan Green Fluorescent Protein), ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), AzG (Azami Green), HcR (HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP (Blue Fluorescent Protein)로 이루어지는 군에서 선택된 형광 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 제1 형광 단백질 및 제2 형광 단백질은 동일한 형광 단백질을 이용할 수도 있으나, 바람직하게는 구별의 편의를 위해서 제1 형광 단백질 및 제2 형광 단백질은 서로 다른 형광을 나타내는 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 목적 단백질에는 제1 형광 단백질로 GFP 단백질을, 표적 단백질에는 제2 형광 단백질로 RFP 단백질을 사용하여 각기 다른 색깔을 나타내는 단백질로 나타내어 목적 단백질 및 표적 단백질의 동시 발현 시에 손쉽게 상호작용 여부를 판단하였다.

(i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 세포를 제공하는 단계에 있어서, 상기 제1 구조물 및 제2 구조물은 별개의 벡터 또는 하나의 벡터 내에 존재할 수 있다.

별개의 벡터 내에 존재할 경우, 목적 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 제1 형광 단백질 및 CBD 융합 단백질의 N-말단에 목적 단백질이 융합된 단백질을 발현할 수 있는 벡터이며, 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 제2 형광 단백질의 N-말단에 표적 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터일 수 있다.

하나의 벡터 내에 존재할 경우, 목적 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물이 IRES (internal ribosome entry site) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 벡터일 수도 있다. 바람직하게 IRES 뉴클레오티드 서열은 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 목적 단백질로 류신 지퍼2 (LZ2)를 제1 형광 단백질로 GFP를 사용하고, 표적 단백질로 류신 지퍼1 (LZ1)을 제2 형광 단백질로 RFP를 사용한 pCBD(LZ1-LZ2) 벡터를 사용하여 "LZ1-RFP" 융합 단백질 및 "LZ2-GFP-CBD" 융합 단백질을 세포 내에서 동시 발현시켜서 LZ1 및 LZ2의 상호작용을 관찰하였다 (도 4 및 5). 이와 같은 벡터의 구조는 도 2에 개략적으로 나타냈다. 동물세포에서의 발현은 도 8에 나타낸 셔틀벡터에 의해서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면 다양한 결합력을 가지는 루신지퍼를 이용하여 목적 단백질과 표적 단백질 간 상호작용을 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다 (실시예 13 및 14).

또한, 상기 제1 구조물 또는 제2 구조물은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 그 예로, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절할 수 있는 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절할 수 있는 서열은 서로 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은, 하나의 폴리뉴클레오티드 단편이 다른 폴리뉴클레오티드 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 폴리뉴클레오티드 단편의 영향을 받지만, 이들 폴리뉴클레오티드 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 폴리뉴클레오티드 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 또한, 본 발명에서 "작동가능하게 연결된"은 형광 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 목적 또는 표적 단백질 및/또는 CBD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 형광 단백질의 발현 또는 기능이 가능하도록 연결된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다.

본 발명에서 제1 구조물 및 제2 구조물을 포함하는 세포를 제공하는 단계란 하나의 벡터 또는 별개의 벡터를 적합한 세포에 도입하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서 용어, "도입"이란 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질전환은 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염 (infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "CBD (cellolose-binding domain) 단백질"은 봉입체 (inclusion body) 형성을 촉진시킬 수 있는 단백질로서, 융합 태그로 사용되어 봉입체 형성을 촉진할 수 있다. 상기 CBD 단백질은 목적 단백질 또는 형광 단백질의 C-말단에 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 CBD 단백질은 봉입체 형성을 유도할 수 있는 단백질은 제한 없이 포함될 수 있으며, 그 예로 셀룰로모나스 피미 (Cellulomonas fimi) 유래의 패밀리 II CBD일 수 있으며, 그 예로 서열번호 28로 정의되는 아미노산 서열의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 CBD 단백질은 셀룰로모나스 피미 엑소글루카나제(exoglucanase) 유전자 (GenBank: M15824.1)의 CBD 부분으로서, 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로 정의되는 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 셀룰로모나스 피미 (Cellulomonas fimi) 유래의 패밀리 II CBD가 E. coli 내에서 자가-응집을 하여 봉입체 (inclusion bodies, IB)를 형성하는 것을 확인하였다 (실시예 8).

이와 같은 봉입체는 세포 내 인공적인 세포 소기관으로 작용하여, 봉입체에 융합된 단백질이 봉입체에 집중될 수 있도록 한다.

상기 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법은 (iv) 봉입체에 형광이 응집되면 목적 단백질 및 표적 단백질이 상호작용하는 것을 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 목적 단백질 및 표적 단백질이 상호작용하지 않으면 목적 단백질에 결합된 제1 형광 단백질만이 CBD에 의해 유도된 봉입체에 존재하고, 표적 단백질과 융합된 제2 형광 단백질은 세포질에 분산되어 존재하나, 목적 단백질 및 표적 단백질이 상호작용하면 목적 단백질이 표적 단백질과 결합하여 표적 단백질이 CBD에 의해 유도된 봉입체로 끌려와서 제1 형광 및 제2 형광이 봉입체에 응집하게 된다. 이에, 세포 내의 봉입체에 위치한 형광 신호는 목적 단백질과 표적 단백질의 상호작용을 나타낼 수 있다. 이러한 본 발명의 작용 원리는 도 4C에 나타냈다.

또한, 상기 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법은 목적 단백질 및 표적 단백질 간의 상호작용을 정량적으로 분석할 수 있다. 구체적으로, 목적 단백질 및 표적 단백질 간의 상호작용이 증가될수록 표적 단백질에 연결된 제2 형광 단백질의 형광 정도가 감소하며, 목적 단백질에 연결된 제1 형광 단백질의 형광 정도가 증가하게 된다. 이에, 표적 단백질에 연결된 제2 형광 단백질의 형광 정도를 목적 단백질에 연결된 제1 형광 단백질의 형광 정도로 나눈 형광비를 통하여 상호작용을 정량적으로 측정 및 분석할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 다양한 결합력을 지닌 LZ1을 이용하여 형광 수준을 측정한 결과 RFP와 GFP의 형광비(FL2/FL1 ratio)가 결합력에 의존적임을 확인하였다 (도 12 내지 13).

이와 같은 형광 검출은 형광을 분석할 수 있는 기기를 이용하여 확인할 수 있으며, 바람직하게는 형광 현미경 또는 유세포분석기로 수행할 수 있다.

본 발명자들은 살아있는 세포 내에서의 목적 단백질과 표적 단백질의 상호작용이 본 발명의 방법에 의해 수행될 수 있는지 확인하기 위하여, 일 실시예에서 형광 단백질의 C-말단 태그로 사용된 CBD가 봉입체를 형성하므로, CBD가 융합되지 않은 GFP 단백질은 세포질에 분산되어 존재하는 반면, CBD가 융합된 GFP 단백질은 봉입체에 높은 형광 집중을 형성하는 것을 확인하여 (도 3A 내지 C), GFP의 기능에는 영향이 없이 형광 현미경 및 유세포분석기로 분산된 형광 단백질과 봉입체에 위치하는 형광 단백질을 완전히 구분할 수 있는 것을 확인하였다. 아울러, 상호작용하는 것으로 알려진 역평행 류신 지퍼 단백질인 LZ2 및 LZ1 각각을 목적 단백질과 표적 단백질로 선정하여 "LZ1-RFP" 및 "LZ2-GFP-CBD" 융합 단백질을 박테리아 세포 내에서 동시 발현시킨 단백질-단백질 상호작용이 있는 군에서는 (PPI⁺) 형광 현미경으로 관찰한 결과 녹색 및 빨간색 형광이 세포 내의 봉입체 위치에 동시 위치하는 반면 (도 4B 내지 4C), LZ1의 상호작용 단백질인 LZ2를 봉입체를 유도하는 "GFP-CBD" 융합 단백질에 결합시키지 않고 "LZ1-RFP" 및 "GFP-CBD"만 박테리아 세포 내에서 동시 발현시킨 단백질-단백질 상호작용이 없는 군에서는 (PPI^-) 빨간색 형광이 세포질 내 분산되는 것을 확인하여 (도 4B 내지 4C), 본 발명의 방법이 살아있는 세포 내의 단백질-단백질 상호작용 유무를 빠르게 확인할 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 유세포분석기를 이용한 분석 결과도 히스토그램이 명확히 구분되는 것을 확인하였으며 (도 5A 내지 C), 고속 대량 유세포분석기로 PPI⁺ 세포와 PPI^- 세포를 선택적으로 분류할 수 있음을 확인하였다 (도 6). 또한, 동물 세포에서도 CBD에 의하여 봉입체가 형성되는 것을 확인하여 (도 8B), 본 발명의 분석 방법이 박테리아 세포뿐만 아니라, 동물 세포의 PPI를 검출할 수 있는 방법임을 뒷받침하였다. 아울러, 다양한 결합력을 지니는 LZ1을 이용하여 본 발명의 검출 방법이 단백질 간의 상호작용을 정량적으로 분석할 수 있는 기술임을 확인하였다 (도 10, 12 및 13). 이와 같은 결과는 본 발명의 살아있는 세포의 단백질 간 상호작용 검출 방법이 신속하고 간단하게 이루어질 수 있으며, 상호작용을 정량적으로 분석할 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 융합 단백질을 발현시켜 세포 내에서 봉입체 (inclusion body)를 형성시키는 단계; 및 (iii) 목적 단백질에 결합된 표적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 목적 단백질과 상호 작용하는 표적 단백질을 분리하는 방법을 제공한다.

표적 단백질, 목적 단백질, 제1 형광 단백질, 제2 형광 단백질, CBD, 제1 구조물 및 제2 구조물은 상기에서 설명한 바와 같다.

표적 단백질의 분리는 다양한 방법으로 수행될 수 있으나, 바람직하게는 유세포분석기를 이용할 수 있다. 유세포분석기는 적합한 조건에 따라 세포를 분류할 수 있으며, 목적 단백질에 표적 단백질이 결합된 경우를 조건으로 선정하면, 상기 세포만을 따로 분류할 수 있다.

본 발명의 표적 단백질을 분리하는 방법은 살아있는 세포 내에서 목적 단백질과 상호작용 하고 있는 표적 단백질을 분리할 수 있는 이점을 지닌다.

본 발명자들은 일 실시예에서 단백질-단백질 상호작용이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우에 형광의 강도 차이를 이용하여 고속 대량 유세포분석기로 세포를 분류할 수 있는 것을 확인하고, 분류된 세포를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과, LZ2-GFP-CBD에 상응하는 밴드만이 확인되는 것을 확인하여 (도 6), 유세포분석기로 선택적으로 상호작용 단백질을 분류할 수 있음을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 (b) 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 세포를 제공한다.

상기 제1 구조물 및 제2 구조물은 별개의 벡터 또는 하나의 벡터 내에 존재할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 (b) 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 키트를 제공한다.

바람직하게 상기 키트는 상기 제1 구조물 및 제2 구조물이 포함된 벡터를 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 벡터가 도입된 세포를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 제1 구조물 및 제2 구조물을 포함하는 세포 이외에 형광 단백질 검출에 사용되는 당업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법들에서 이용될 수 있는 실험과정, 시약 및 반응 조건은 종래 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 것들을 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명의 방법을 이용하면 살아있는 세포 내에서 생체 물질 간의 상호작용을 손쉽게 고속으로 분석할 수 있으며, 형광 현미경 및 유세포분석기를 이용하여 대량의 라이브러리에서 목적 상호작용 단백질을 초고속으로 탐색 및 분리할 수 있는 고속 탐색 기술을 제공할 수 있다. 아울러, 분리된 목적 상호작용 단백질을 이용하여 결합을 방해하는 의약품 등의 생산에 이용될 수 있다.

도 1은 overlap PCR로 류신 지퍼를 융합한 CBD (LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD)의 유전자적 구조의 개략도이다.
도 2는 pCBD(LZ1-LZ2) 및 pCBD(LZ1)의 유전자 지도의 대표 개략도이다.
도 3은 GFP 및 CBD의 융합에 의한 형광 봉입체의 형성을 나타낸 도이다. (A)는 세포질 내의 분산된 GFP를 위한 pGFP, 및 세포 내의 GFP 집중 생성을 위한 pGFP-CBD의 구조도이고; (B)는 천연 GFP 및 GFP-CBD의 현미경 관찰결과이며; (C)는 GFP 및 GFP-CBD 단백질을 포함하는 세포의 유세포분석기 분석 결과를 나타낸다. 옅은 녹색 및 짙은 녹색 시그널은 각각 분산된 GFP 및 집중된 GFP-CBD 단백질을 포함하는 두 종류의 세포의 다른 형광 분포를 나타낸다.
도 4는 FCIB (fluorescence colocalization on inclusion bodies)를 이용한 류신 지퍼 (LZ1 및 LZ2) 간의 단백질-단백질 상호작용 (PPI)의 현미경 분석 결과를 나타낸 도이다. (A)는 목적 및 표적 단백질의 발현 6시간 후의 PPI⁺ (왼쪽; 무색) 또는 PPI^- (오른쪽; 빨간색)를 포함하는 양쪽 세포의 배양액의 육안관찰 결과이고; (B)는 PPI⁺ (LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD 단백질) 또는 PPI^- (LZ1-RFP 및 GFP-CBD 단백질)를 포함하는 세포의 현미경 관찰결과이며; (C)는 PPI 간의 관계 계략도 및 형광 봉입체의 동시 위치를 나타낸 것이다. RFP 및 GFP는 PPI⁺의 경우 봉입체 내에 동시 위치하고, PPI^-의 경우 GFP 집중을 형성하는 대신에 RFP 단백질이 분산된다.
도 5는 FCIB에서 LZ1 및 LZ2 류신 지퍼 간 PPI의 유세포분석기 분석 결과를 나타낸 도이다. (A)는 FL1 및 FL2 plot에서 PPI⁺ (파란색 점) 또는 PPI^- (검정색 점)을 포함하는 세포의 형광 분석이고; (B)는 FL2 (RFP) 히스토그램에서 PPI⁺ (짙은 빨간색) 또는 PPI^- (옅은 빨간색) 세포 간의 비교이며; (C)는 FL1 (GFP) 히스토그램에서 PPI⁺ (짙은 녹색) 또는 PPI^- (옅은 녹색)간의 비교를 나타낸다.
도 6은 FACS (fluorescence activated cell sorter)로 분류한 PPI⁺ 세포의 SDS-PAGE (A) 및 웨스턴 블롯팅 (B) 분석 결과를 나타낸다. 1 레인은 PPI⁺ 세포; 2 레인은 PPI^- 세포; 3 레인은 PPI⁺ 및 PPI^- 세포의 혼합; 4 레인은 FACS에 의해 분류된 PPI⁺ 세포를 나타낸다.
도 7은 LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD 단백질 입자 모두를 발현하는 PPI⁺ 세포의 투과전자현미경 사진이고 (왼쪽), 분리된 CBD-IB의 주사 전자현미경 사진이며 (오른쪽), 전자 현미경의 배율은 20,000 배이다.
도 8은 동물세포 (HeLa)에서 CBD의 융합에 의한 GFP의 봉입체 형성을 확인한 결과이다. (A)는 GFP-CBD유전자를 대장균-동물세포 셔틀벡터 (pCMV)에 클로닝한 벡터그림이며; (B)는 동물세포에서 발현된 GFP-CBD의 봉입체를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 9는 다양한 루신지퍼의 결합력을 지니는 돌연변이 균주들의 mLZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD의 세포내 발현량을 조사한 SDS-PAGE 결과이다.
도 10은 돌연변이 균주들의 mLZ1와 LZ2간의 결합력에 따라 RFP 단백질의 GFP 봉입체로의 집적 현상을 형광현미경으로 관찰한 도이다. (A)는 결합력에 따라 세포내 집적현상이 발생하고 있음을 보여주는 도이고, (B)는 결합력에 따른 봉입체에서의 GFP와 RFP의 형광변화를 보여주는 도이다.
도 11은 GFP 형광 봉입체를 sonication을 통해 부분 파쇄을 수행했을 때에 sonication 시간에 따라 형광이 증가되는 것을 관찰한 도이다. GFP의 형광은 510nm에서 emission된다.
도 12는 돌연변이 균주들의 mLZ1와 LZ2간의 결합력을 유세포분석기로 분석한 도이다. (A)는 FL1과 FL2 plot에서 결합력에 따른 각 균주들의 형광분포를 분석한 도이고, (B)는 FL2 혹은 FL1 히스토그램에서 RFP 혹은 GFP의 형광변화를 각각 비교한 도이다. 여기서 결합력이 강한 순서대로 mLZ1(4/27)은 남색, LZ1은 하늘색, mLZ1(25)는 녹색, mLZ1(11)은 연두색, mLZ1(13/25/27)은 주황색으로 나타나고 있다. (C)는 GFP(FL1)과 RFP(FL2)의 상대적 평균 형광값을 나타난 도이다.
도 13은 유세포분석기로 mLZ1-LZ2에 대한 형광을 측정하였을 때, 결합력에 따른 FCIB값(FL2/FL1의 비)의 패턴을 분석한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 유전자 및 효소 확보

패밀리 II의 CBD (cellulose-binding domain) 유전자는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection of Type Cultures, KCTC)의 셀루로모나스 피미 (Cellulomonas fimi) KCTC 9143 균주의 엑소글루카네이즈 (exoglucanase) 유전자로부터 클로닝하였다. 개선된 GFP (green fluorescent protein) 유전자는 상용 플라스미드 벡터인 pEGFP (Clontech, CA)로부터 얻었다. RFP (monomeric red fluorescent protein 1) 유전자를 갖고있는 플라스미드 벡터 pRFP는 한국 대전에 위치한 KAIST로부터 제공받았다. 역평행의 두개의 류신 지퍼 유전자인 LZ1 (EQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQ; 전하를 띄는 잔기는 밑줄로 표시함, 서열번호 1) 및 LZ2 (ALKKELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ; 전하를 띄는 잔기는 밑줄로 표시함, 서열번호 2)는 각각 예일 대학교의 Regan 박사로부터 제공받은 pMRBAD-Z-CGFP 및 pET11a-Z-NGFP로부터 얻었다 (Magliery, T. J., et al., 2005. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J. Am. Chem. Soc. 127:146-57.). 모든 제한 효소는 Roche Applied Science (Indianapolis, IN)로부터 구입하였다. T4 DNA 라이게이즈는 Fermentas (Glen Burnie, MD)로부터 구입하였다.

실시예 2: DNA 조작

모든 프라이머는 한국 대전의 바이오니아에서 합성하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머를 하기 표 1에 나타냈다. NdeI 및 XhoI 제한효소 부위를 볼드체로 표시하였다.

프라이머 이름	서열(5'→3')	서열번호
프라이머 1	GATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAG	3
프라이머 2	GGTGCTCGAGTTACTTGTACAGCTTGTCCATGCC	4
프라이머 3	CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAAGCGAGCAGCTGGAA	5
프라이머 4	CAATTCTTTTTTGAGGGCCATATGATAATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTTAGGCGCCGGTGGAGTGGCGGCC	6
프라이머 5	GGCCGCCACTCCACCGGCGCCTAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATTATCATATGGCCCTCAAAAAAGAATTG	7
프라이머 6	CAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCTGCGCCAGTTCCTTTTTCAG	8
프라이머 7	CTGAAAAAGGAACTGGCGCAGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG	9
프라이머 8	GCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGCCGACCGTGCAGGGCGTGCC	10

gfp 유전자를 프라이머 1 (서열번호 3) 및 프라이머 2 (서열번호 4)를 이용하여 pEGFP로부터 증폭시키고, NdeI 및 XhoI으로 절단하고, pET21a 벡터(Invitrogen, CA)로 클로닝하여 pGFP를 제조하였다. gfp 및 cbd 유전자를 Ha, J.-S., et al., (2008. Thermostable beta-glycosidase-CBD fusion protein for biochemical analysis of cotton scouring efficiency. J Microbiol Biotechnol 18:443-448.)에 기재된 방법에 따라 overlap PCR로 융합하고, pET21a 벡터의 NdeI and HindIII 부위로 삽입하여 pGFP-CBD 플라스미드 벡터를 제조하였다.

두 개의 류신 지퍼 유전자인 LZ1 및 LZ2를 각각 pRFP 및 pGFP-CBD에 연결하여, pET21 플라스미드 벡터 내의 LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 프라이머 3 내지 프라미어 8 (서열번호 5 내지 10)을 이용하여 overlap PCR로 융합하고, Datsenko, K. A., et al. (2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 97:6640-5.)에 기재된 방법에 따라 pKD46를 포함하는 E. coli DH5α 세포를 이용하여 재조합하였다. IRES (internal ribosome entry site, 5'-AATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATTATCAT-3', 서열번호 11)는 LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD 유전자 사이에 위치하였다 (도 1). 상기 방법에 의해 제조된 플라스미드 벡터를 pCBD(LZ1-LZ2)로 명명하였다. LZ1-RFP 및 GFP-CBD 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 pCBD(LZ1) 플라스미드 벡터를 상기에서 설명한 overlap PCR로 제조하였다 (도 2).

실시예 3: 단백질 발현

E. coli BL21(DE3)를 발현 숙주세포로 사용하였다. 상기 세포를 실시예 2에서 제조한 pCBD(LZ1-LZ2) 또는 pCBD(LZ1)로 형질전환하고, 앰피실린 (50 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 배지에서 배양하였다. 600 nm에서 OD 값이 0.5일 때, CBD-유도 봉입체 (CBD-IB)를 유도하기 위하여, IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, 1 mM)를 첨가하고, 세포를 37 ℃에서 6시간 배양하였다. 배양된 세포가 봉입체를 형성하였는지를 현미경으로 확인하였다. E. coli 세포를 얼음 상에서 소니케이션으로 파괴하고, 융합 단백질의 발현을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 분석으로 확인하였다. 비수용성 분획 또는 CBD-IB를 16,300xg에서 10분간 원심분리로 분리 및 수득하여, Triton X-100 (0.5%)을 포함하는 PBS 버퍼 (pH 7.4)로 재현탁하여, 막-결합 침전물을 제거하였다.

실시예 4: 웨스턴 블롯팅 분석

전체 세포 추출물의 분획 (20 ㎕)을 SDS-PAGE (12%)에 전기영동하고, PVF 막 (polyvinylidene fluoride membrane, Millipore, MA)으로 전기-이동시켰다. 블롯을 1차 항-GFP 마우스 항체 (Sigma-Aldrich, WI)로 혼성화하고, 항-마우스-IgG 염소 항체 HRP 컨쥬게이트 (Bio-Rad, CA)를 5 % 스킴 밀크를 포함하는 TTBS 버퍼 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl, 0.1% Tween-20)에 준비하였다. 혼성화 밴드를 Opti-4CN 기질 키트 (Bio-Rad, CA)를 이용하여 검출하였다.

실시예 5: 형광 현미경 분석

아가 플레이트 상의 형광 E. coli 콜로니를 GFP 필터 (Ex: 455-485 nm, Em: 500-545 nm) 및 RFP 필터 (Ex: 540/25 nm, Em: 605/55 nm)를 장착한 AZ100 멀티줌 현미경 (Nikon, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 형광 CBD-IB를 발현하는 E. coli 세포의 GFP 및 RFP 각각의 형광 이미지를 필터 세트 44 (Ex: BP 475/40 nm, Em: BP 530/50 nm) 및 필터 세트 15 (Ex: BP 546/12 nm, Em: LP 590 nm)를 장착한 Axiovert 2000M 형광 현미경 (Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다. 칼라 이미지 (pseudo-color image)를 Axioversion 4.5 프로그램 (Carl Zeiss)로 생성하였다.

실시예 6: 전자 현미경 분석

E. coli 세포를 0.1 M 인산 나트륨 버퍼 (pH 7.2)내의 2.5 % 파라포름알데히드 및 2.5 % 글루타알데히드 혼합물로 2시간 동안 고정시키고, 동일한 버퍼 내의 1% 4산화 오스뮴에서 1시간 동안 후-고정시켰다. 에탄올 및 프로필렌 옥시드로 탈수시키고, Epon-812 내에 포매시켰다. 초박편을 ULTRACUTE microtome (Leica, Germany)으로 제조하고, 아세트산 우라닐 및 납 시트레이트로 염색한 후, CM20 투과전자현미경 (Philips, Netherlands)으로 관찰하였다.

분리한 CBD-IB를 상기와 동일한 조전에서 고정시키고, 점층적 농도의 에탄올로 탈수시키고, 아세트산 이소아밀로 치환시키고, CO₂의 임계점에서 건조시켰다. 시료를 금속 코팅기 (sputter coater, SC502, Polaron, UK) 내의 금으로 코팅하고, 주사전자현미경 LEO 1455VP (LEO GmbH, Germany)으로 관찰하였다.

실시예 7: 유세포분석기 분석

유세포 분석을 FACS Calibur (BD Biosciences, CA)로 수행하였다. 분석 게이트는 SSC 및 FSC 파라미터를 바탕으로 세팅하였다. GFP 및 RFP 형광을 각각 FL1 (530/30 nm) 및 FL2 (585/42 nm) PMT로 검출하였다. 5,000의 이벤트가 각 시료에서 카운팅되었다. 데이터를 BD CellQuest Pro (version 4.0.2, 145 BD Biosciences) 소프트웨어를 이용하여 수집하였다. 세포 분류를 한국생명공학연구원 전북 지원에서 FACS Aria Cell Sorter (BD Biosciences, CA)를 이용하여 수행하였다. GFP 및 RFP 형광을 각각 FITC (530/30 nm) 및 PE-Texas Red (610/20 nm) PMT로 검출하였다. 데이터를 BD FACSDiVa 소프트웨어 (version 4.0.2, BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

실시예 8: 박테리아 세포 내의 CBD-유도 봉입체에 의한 형광 집중 (foci)

CBD 융합에 의한 형광 봉입체 (IB)의 형성이 이루어지는지 확인하기 위하여, pGFP 또는 pGFP-CBD를 포함하는 IPTG-유도 E. coli 세포를 관찰하였다 (도 3A).

그 결과, E. coli 내의 gfp 유전자 단독의 발현은 세포질 내에 녹색 형광이 분산되어 있으나, GFP-CBD 융합 단백질은 세포 내의 봉입체에 높은 형광 집중을 형성하는 경향이 있었다 (도 3B). 이와 같은 결과는 CBD-유도 봉입체가 GFP의 적절한 접힘 (folding) 및 천연 형태 형성을 방해하지 않는다는 것을 뒷받침하는 것이다. 즉, 본 발명의 방법이 목적 및 표적 단백질의 실제 구조에는 변형이 없이 실제 단백질 간의 상호작용을 분석할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

세포질 내의 수용성 GFP (옅은 녹색)를 포함하는 세포와 봉입체 상의 GFP (짙은 녹색)를 나타내는 세포를 유세포분석기 분석을 수행하여 비교하였다. 결과적으로, 세포질 내에 GFP가 분산되어 있는 세포의 형광 수준은 봉입체 상의 GFP를 나타내는 세포보다 약 10 배 높았다 (도 3C). 이러한 차이는 봉입체 내에 응집된 GFP 분자와 비교하여 세포질 내의 분산된 GFP가 레이저에 의해 더 많이 조사 (excitation)되기 때문일 것이다. 상기와 같은 결과는 형광 현미경뿐만 아니라 유세포분석기를 이용하여 세포 내 봉입체에 위치하는 형광 단백질과 세포질에 분산된 형광 단백질을 서로 완전히 구분할 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 9: 단백질 상호작용의 표지자로서 FCIB (Fluorescence colocalization on inclusion bodies)

목적 (bait) 단백질을 포함하는 형광 봉입체가 세포질 내의 표적 (prey) 단백질을 모집할 수 있는지 조사하였다. 역평행 류신 지퍼 LZ1 및 LZ2 (K_D= 20 μM)를 박테리아세포 내에서 FCIB를 형성하는 모델 단백질로 이용하였다. LZ1 및 LZ2은 반대 펩타이드의 반대 전하 간의 이온잔기 상호결합 및 소수성 잔기 상호결합에 의해 상호 간에 안정적인 헤테로다이머 상호작용을 수행할 수 있다고 알려져 있으며, 이는 LZ1 및 LZ2 호모다이머 결합력보다 10⁵ 배 더 높은 것이다.

Edward er al. ((2009) An in vivo imaging-based assay for detecting protein interactions over a wide range of binding affinities. Anal. Biochem. 395, 166-177.)은 DivIVA (cell division protein)가 특정 염색체 부위에 위치하는 특징을 이용한 형광 이미지 분석은 실용적이며 넓은 범위의 결합 친화도 (1 nM 내지 15 μM)를 걸쳐 검출할 수 있다고 보고하고 있다. 그러나, 본 발명의 FCIB 기술을 이용하면 역평행 류신 지퍼 (K_D= 20 μM)와 같이 매우 약한 PPI도 검출할 수 있다. 이것은 봉입체가 세포 내에서 커다란 크기의 인공적 세포 소기관 구조를 형성하므로 표적 단백질이 봉입체 내에 표지되는 목적 단백질에 더 결합할 수 있고, 더 강한 형광 신호를 나타낼 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 FCIB는 약한 결합 친화도를 갖는 PPI도 검출할 수 있는 아주 민감한 분석 방법임을 알 수 있다.

LZ1을 RFP의 N-말단에 융합시켜서 표적 단백질인 LZ1-RFP을 제조하고, 목적 단백질로서 LZ2를 GFP-CBD의 N-말단에 연결한 LZ2-GFP-CBD를 제조하였다. 상기 표적 및 목적 단백질 (LZ1-RFP 및 LZ2-GFP-CBD)을 동시에 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켜, PPI를 유도하였다. 또한, 대조군으로 LZ1-RFP 및 GFP-CBD를 E.coli BL21 (DE3)에 발현시켰다.

그 결과, 놀랍게도 배양액 (culture broth)에서 빨간색이 검출되지 않은 반면 (PPI⁺, 도 4A), LZ1-RFP 및 GFP-CBD 단백질을 모두 발현하는 세포를 포함하는 배양액에서 빨간색이 현저하게 나타났다 (PPI^-, 도 4A).

현미경 관찰 결과, 양 E. coli 세포 (PPI⁺ 및 PPI^-)의 말단 영역에서 봉입체가 나타났고 (도 4B의 검정색 화살표), 상기 영역에 GFP 집중이 정확하게 존재하는 것을 확인하였다 (도 4B의 흰색 화살표). RFP 현미경 관찰은 LZ1-RFP 또한 노란색 화살표로 나타낸 것과 같이, LZ2를 나타내는 CBD-유도 녹색 형광 봉입체에 위치한다는 것을 나타냈다 (도 4B). 그러나, LZ1-RFP 단백질은 LZ2가 녹색 형광 봉입체에 포함되지 않을 때에는 세포질 전체에 분산되어 있었다.

결론적으로, PPI가 세포 내에서 일어나면, 녹색 및 빨간색 형광 단백질이 세포 내의 봉입체 위치에 동일하게 집적한다는 것을 알 수 있다. 반면에, PPI가 세포 내에서 일어나지 않으면, 빨간색 형광 단백질이 녹색 형광 봉입체 위치에 동일하게 집적하는 대신에 세포질에 분산된 상태로 관찰된다 (도 4C). 이와 같은 결과들은 FCIB가 살아있는 세포 내의 PPI를 빠르게 모니터할 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 10: 박테리아 세포 내의 PPI 유세포 분석

유세포 분석은 세포-대-세포의 형광 분석에 가장 강력한 도구 중 하나로 사용되어 왔다. 상기 실시예 8에서 언급한 바와 같이, 봉입체 형성에 의해 세포 내에 집중된 GFP 단백질이 세포 내에서 분산된 GFP 단백질과 비교하여 분명한 차이를 나타낸다는 것을 유세포 분석을 통해 입증하였다 (도 3C). 이에, LZ1 및 LZ2 간의 PPI 결과에 의해 RFP 단백질이 봉입체에 집중되는 현상과 PPI가 없어 RFP 단백질이 분산되는 현상이 유세포분석기로 확인될 수 있는지를 알아보았다.

그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, FCIB 상의 PPI⁺ 세포 (파란색 점) 및 PPI^- 세포 (검정색 점)는 FL1 및 FL2 plot에서 다른 위치에서 분포하고 있었다. FL1 및 FL2 형광 강도의 데이터는 두 개의 히스토그램으로 구분되어 개별적으로 구획되었다. 각 RFP(FL2)와 GFP(FL1)의 히스토그램에서 PPI⁺ 세포와 PPI^- 세포는 상호작용의 존재여부에 따른 형광차이를 분명하게 보여주고 있었다 (도 5B, 5C). RFP의 경우 PPI⁺ 세포에서는 LZ1 및 LZ2의 상호작용에 의하여 봉입체에 위치함에 따라 PPI^- 세포에 비하여 낮은 형광 수준을 나타내는 반면, GFP의 경우에는 LZ2-RFP와의 결합에 의해 증가된 GFP 형광 수준을 나타내었다. 이와 같은 결과를 통해 단백질 간 상호작용의 존재 여부에 따른 형광 차이를 분명하게 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 FCIB를 바탕으로 한 유세포분석기 결과가 작은-크기의 박테리아 세포에서도 PPI 결정에 매우 유효하다는 것을 뒷받침하는 것이다.

다음으로 본 발명자들은 PPI⁺ 및 PPI^- 세포가 RFP 형광 강도의 차이를 이용하여 고속 대량 유세포분석기로 PPI 스크리닝이 가능한지를 조사하였다. 동일한 수의 PPI⁺ 세포와 PPI^- 세포를 혼합하고 유세포분석기에 투입하였다. PPI⁺ 세포를 검출할 수 있는 조건에서 PPI⁺ 세포와 PPI^- 세포 혼합물로부터 세포를 분류하였다. 분류된 세포를 항-GFP 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다 (도 6).

그 결과, 분류 전의 세포들은 PPI⁺ 세포 내의 LZ2-GFP-CBD에 대한 44.7 kDa 및 PPI^- 세포 내의 GFP-CBD에 대한 41.2 kDa의 두 개의 혼합 밴드를 나타냈다. 웨스턴 블롯팅 분석의 분류된 PPI⁺ 세포의 레인 (레인 4)에서는 GFP-CBD의 밴드와 비교하여 매우 분명하게 관찰되는 LZ2-GFP-CBD에 상응하는 강한 신호를 검출하였다. 이와 같은 결과는 PPI⁺ 혹은 PPI^-를 가진 박테리아 세포를 초고속 분석장비인 FACS를 이용하여 선택적으로 분류할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

포유동물 세포에서는 FRET을 이용한 유세포분석기 분석은 PPI를 갖는 많은 수의 세포를 분석하는 강력한 도구로 이용되어 왔으나, 비교적 적은 변동 범위로 인하여 FRET 세포는 박테리아 세포내의 FACS-기반 스크리닝에는 적합하지 않은 단점이 있어 왔으나, 본 발명은 이와 같은 단점을 극복할 수 있다.

실시예 11: 상호작용 형광 입자의 현미경 분석

CBD를 C-말단에 융합 태그로 사용하면, E. coli 세포 내에서 봉입체의 형성을 촉진한다 (도 3B 및 4B). CBD 태그에 의한 In vivo 봉입체 형성을 전자 현미경으로 관찰하였다 (도 7). 세포 내의 CBD-IB는 TEM 사진에서 전형적인 굴절형의 봉입체로 나타나며, SEM (scanning electron microscopy) 사진에서 분리된 봉입체는 무정형 단백질 입자의 다중 복합체로 나타났다.

실시예 12: 동물세포 내의 CBD-유도 봉입체에 의한 형광 집중 (foci)

CBD 융합에 의한 형광 봉입체 (IB)의 형성이 동물세포에서도 박테리아와 동일하게 관찰되는 지를 확인하였다. GFP-CBD가 동물세포에서도 발현될 수 있도록 대장균-동물세포 셔틀벡터인 pCMV벡터(Stratagene, CA)에 GFP-CBD 유전자를 클로닝 하였다 (도 8A). GFP-CBD가 클로닝 된 pCMV벡터를 Plasmid Midi Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 정제 및 회수하였다. 동물세포주로서 HeLa(CCL-2, ATCC)를 이용하였다. HeLa 세포주는 10%의 혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS)과 1%의 antibiotic-antimycotic (Invitrogen)이 포함된 DMEM 배지 (Invitrogen, CA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건을 유지하는 배양기에서 계대배양하며 실험에 사용할 수 있도록 준비하였다. 동물세포주에 유전자를 도입하는 방법은 다음과 같다. 먼저 T-25 flask의 바닥에 HeLa 세포의 개수가 90% 정도 되도록 37℃, 5% CO₂ 조건에서 충분히 배양시킨 후, trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 flask의 바닥에서 분리하여 4-well plate에 1x10⁵ cell/well의 개체수가 되도록 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24 시간이 지난 후 LipofectaminTM 2000을 이용하여 pCMV벡터에 클로닝된 GFP-CBD 유전자를 세포에 도입시킨 후, 4시간 뒤에 10%의 혈청이 포함된 DMEM 배지로 교환 하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음 날 공초점 현미경으로 GFP-CBD가 발현된 HeLa 세포를 관찰하였다.

그 결과, 박테리아와 동일하게 동물세포에서도 CBD의 유도에 의해 GFP 봉입체가 형성되어 있는 것을 확인할 수가 있었다 (도 8B). 이러한 결과는 박테리아 세포 뿐만 아니라, 동물 세포에서도 CBD를 이용하여 봉입체를 형성시켜 PPI를 관찰할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 13: 다양한 결합력을 가지는 루신지퍼(LZ) 유전자의 제작

앞서 본 실시예 9, 10에서는 상호작용의 존재여부, 즉, LZ2의 존재여부를 형광현미경과 유세포분석기로 분석할 수 있음을 확인하였다. 다음으로는 다양한 결합력을 지니는 LZ1에 대해 FCIB방법으로 정량적으로 측정할 수 있는지를 조사하였다. 참고문헌을 기반으로 다양한 결합력을 지니는 돌연변이 mLZ1을 제작하였다 (Magliery, T. J., et al., 2005. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J. Am. Chem. Soc. 127:146-57.). 돌연변이 mLZ1(mLZ1(4/27)은 야생형 LZ1에 비하여 루신지퍼 상호작용이 증대된 돌연변이이고, mLZ1(25), mLZ1(11) 및 mLZ1(13/25/27))은 야생형 LZ1에 비하여 루신지퍼 상호작용이 감소된 돌연변이이다. 돌연변이 mLZ1(mLZ1(4/27), mLZ1(25), mLZ1(11), mLZ1(13/25/27))에 대한 아미노산서열 및 결합력에 대한 정보는 표 2에 나타냈다. 여기서 밑줄은 치환된 아미노산을 나타나고 있다.

돌연변이체	아미노산 서열	돌연변이 위치	K_d (μM)	서열번호
LZ1	EQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQ	없음	20	1
mLZ1(4/27)	EQLKKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKELAQ	4/27	8	12
mLZ1(25)	EQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALKKKLAQ	25	31	13
mLZ1(11)	EQLEKKLQALKKKLAQLEWKNQALEKKLAQ	11	50	14
mLZ1 (13/25/27)	EQLEKKLQALEKELAQLEWKNQALKKELAQ	13/25/27	1000	15

돌연변이 mLZ1유전자의 제작은 Quikchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, CA)를 사용하였다. pCBD(mLZ1(4/27)-LZ2) 벡터를 제작하기 위해서 pCBD(LZ1-LZ2) 벡터를 주형으로 하여 프라이머 9 내지 프라이머 10 (서열번호 16 내지 17)으로 1차 PCR를 수행한 다음, PCR 산물을 주형으로 하여 프라이머 11 내지 프라이머 12 (서열번호 18 내지 19)로 2차 PCR를 수행하였다. 만들어진 2차 PCR산물에 DpnI 처리를 하여 주형 유전자를 제거하고 pCBD(mLZ1(4/27)-LZ2) 벡터를 XL1-Blue competent 균주에 형질전환시켰다. 다음으로는, pCBD(mLZ1(25)-LZ2) 벡터를 제작하기 위해서 pCBD(LZ1-LZ2) 벡터를 주형으로 하여 프라이머 13 내지 프라이머 14 (서열번호 20 내지 21)로 PCR을 수행하고 상기 방법과 동일하게 pCBD(mLZ1(25)-LZ2) 벡터가 삽입된 형질전환 균주를 제작하였다. 다음으로는, pCBD(mLZ1(11)-LZ2) 벡터를 제작하기 위해서 pCBD(LZ1-LZ2) 벡터를 주형으로 하여 프라이머 15 내지 프라이머 16 (서열번호 22 내지 23)으로 PCR을 수행하고 상기 방법과 동일하게 pCBD(mLZ1(11)-LZ2) 벡터가 삽입된 형질전환 균주를 제작하였다. 다음으로는, pCBD(mLZ1(13/25/27)-LZ2) 벡터를 제작하기 위해서 pCBD(LZ1-LZ2) 벡터를 주형으로 하여 프라이머 17 내지 프라이머 18 (서열번호 24 내지 25)로 1차 PCR을 수행하고, PCR 산물을 주형으로 하여 프라이머 19 내지 프라이머 20 (서열번호 26 내지 27)으로 2차 PCR를 수행하였다. 그리고 상기 방법과 동일하게 pCBD(mLZ1(13/25/27)-LZ2) 벡터가 삽입된 형질전환 균주를 제작하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머를 하기 표 3에 나타냈다. 치환된 염기의 위치는 밑줄로 표시하였다.

프라이머 이름	서열(5'→3')	서열번호
프라이머 9	GCAAGCGAGCAGCTGAAAAAGAAGTTACAAGCC	16
프라이머 10	GGCTTGTAACTTCTTTTTCAGCTGCTCGCTTGC	17
프라이머 11	CCAAGCATTGGAAAAAGAACTCGCGCAGATGGCC	18
프라이머 12	GGCCATCTGCGCGAGTTCTTTTTCCAATGCTTGG	19
프라이머 13	GGAAAAACCAAGCATTGAAAAAAAAACTCGCGCAG	20
프라이머 14	CTGCGCGAGTTTTTTTTTCAATGCTTGGTTTTTCC	21
프라이머 15	GAAGTTACAAGCCCTGAAGAAAAAACTTGCTCAGCTG	22
프라이머 16	CAGCTGAGCAAGTTTTTTCTTCAGGGCTTGTAACTTC	23
프라이머 17	CAAGCCCTGGAGAAAGAACTTGCTCAGCTGG	24
프라이머 18	CCAGCTGAGCAAGTTCTTTCTCCAGGGCTTG	25
프라이머 19	GGAAAAACCAAGCATTGAAAAAAGAACTCGCGCAGATGGCC	26
프라이머 20	GGCCATCTGCGCGAGTTCTTTTTTCAATGCTTGGTTTTTCC	27

단백질 발현을 위하여 각 유전자를 E. coli BL21(DE3) 발현 숙주세포에 형질전환시켰고 실시예 3의 방법으로 단백질 발현을 유도하였다.

실시예 14: 다양한 결합력을 가지는 루신지퍼(LZ)간 상호작용의 정량적 분석

pCBD(LZ1-LZ2) 벡터 또는 돌연변이 mLZ1을 포함하는 pCBD(mLZ1-LZ2) 벡터들을 각각 도입한 균주를 대장균에서 발현시킨 결과, 세포내에서 mLZ1-RFP와 LZ2-GFP-CBD은 1:1 수준으로 발현되고 있었으며, 각 균주간의 발현율은 비슷하였다 (도 9). 그 다음, 각 균주에서의 GFP 및 RFP의 동시집적 현상을 형광현미경으로 관찰하였다. 예상대로 상호작용의 결합력이 강할수록 RFP 단백질이 GFP 단백질이 존재하는 봉입체의 위치에 동일하게 집적되었으며, 반면에, 결합력이 약할수록 빨간색 형광 단백질이 점점 세포안에 퍼지는 것을 확인하였다 (도 10A). 또한 결합력에 따라 봉입체에서의 GFP와 RFP 단백질의 형광도 현격한 차이를 보여주었다. 결합력이 강할수록 GFP의 형광은 증가한 반면, RFP의 형광은 감소하였다. 반대로, 결합력이 약할수록 GFP의 형광은 감소한 반면, RFP의 형광은 증가하였다 (도 10B). 결합력에 따른 RFP의 형광감소는 실시예 8의 결과와 동일하게 집적현상에 의해 형광이 감소된 것으로 추측되었고 결합력에 따른 봉입체에서의 GFP의 형광의 증가 현상은 실시예 10에서 수행된 루신지퍼의 결합이 존재하면 형광이 증가한 결과와 동일한 것으로 LZ2-RFP의 결합이 GFP-봉입체의 자체활성에도 영향을 미치고 있음을 보여주는 결과였다.

본 발명자들은 GFP 봉입체를 소니케이션으로 부분적으로 파쇄시켰을 때, 전체적인 형광이 증가하는 것을 관찰하였다 (도 11). 이것은 봉입체가 물리적 충격에 의하여 일부 부풀어지고 내부에 있는 GFP가 노출되어 형광이 증가한 것으로, 봉입체 내부에 제대로 활성되지 못한 GFP 단백질이 다수 존재하고 있음을 유추할 수 있었다. 한편, 본 발명에서는 표적 및 목적 단백질 (LZ1-RFP, LZ2-GFP-CBD)이 세포 내에서 발현되어 LZ1-GFP 봉입체가 형성되는 중간에서도 류신지퍼 간의 상호작용이 존재하고 있기 때문에, LZ2-RFP는 GFP-봉입체 표면 뿐만 아니라, 내부에도 존재할 수 있다. 즉, 봉입체 내부에 존재하는 RFP 단백질이 봉입체 내부에 있는 활성되지 못한 GFP 단백질의 활성을 회복시키는 데 기여한 것으로 추측되었다.

다음으로 유세포 분석기를 이용하여 동일한 돌연변이 균주들을 정량적으로 분석하고자 하였다. 형광 현미경에서 관찰된 결과와 마찬가지로 결합력이 강할수록 RFP의 형광이 감소하였으며, GFP의 형광이 증가하였다 (도 12A, C). 유세포 분석기에서 RFP의 형광의 감소는 적었지만, GFP의 형광 증가는 매우 커서 결합력에 의한 차이를 잘 반영하고 있었다 (도 12B). 그러나 RFP 관찰에서는 상호작용 증가에 따른 RFP 형광감소 폭이 예상보다 작게 나타났는데 이는 유세포분석기가 488nm 아르곤 레이져를 사용하고 있기 때문이다. 즉, EGFP가 488nm에서의 extinction coefficient (ε)가 55,000 M^-1cm^-1로 높은 반면에, RFP는 488 nm에서 extinction coefficient는 15,400 M^-1cm^-1로 매우 낮고, 최대 excitation (584 nm)의 10분의 1수준으로 밖에 excitation되지 않기 때문에 EGFP에 비해 민감도가 매우 낮은 것이다. 더구나 상호작용에 따라 GFP-RFP FRET이 역으로 RFP 형광을 증가시키게 되므로 RFP 형광감소 폭은 더욱 좁아지게 되는 것으로 판단된다. 하지만 유세포 분석에서는 두 형광이 동시에 관찰되므로 결합력에 의한 형광증가 및 형광감소를 통하여 대장균 내 상호작용을 더욱 분명하게 구분 짓게 해 주었다.

유세포분석기에 의한 측정값을 정량적으로 분석하기 위해 RFP와 GFP의 형광비 (FL2/FL1 ratio)를 계산하였다. 계산값을 보고된 결합력(affinity, 1/Kd)과 비교하였을 때, FCIB값은 결합력에 의존적임을 확인하였다. 또한 FICB방법을 통하여 Kd= 8~1000 uM의 결합력을 감지할 수 있었다(도 13). 이러한 결과들은 FCIB방법을 이용하여 다양한 범위의 결합력을 정량적으로 측정 및 분석할 수 있음을 보여주고 있다.

현재까지 대량의 세포를 신속하고 민감하게 분석할 수 있는 유세포분석기에서 미생물내 상호작용을 분석하는 것은 매우 어려운 일로 생각되었다. 왜냐하면 미생물에서는 상호작용의 다이나믹 범위가 동물세포에 비해 매우 적었기 때문이다. 그러나 본 발명인 형광동시집적 분석방법(FCIB)을 통해서는 형광현미경뿐만 아니라 유세포분석기에서도 상호작용의 결합력을 정량적으로 분명하게 구별할 수 있었다. 따라서 본 발명은 대량의 라이브러리에 대한 고속탐색을 수행하는 분자수준에서의 상호작용 분석 (예를 들면, single chain antibody, decoy receptor, artificial scaffold protein) 및 개량(특이성, 결합력 향상) 연구에 광범위하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Detecting Protein-Protein Interactions in Cells <130> PA120478KR <150> KR 10-2011-0086057 <151> 2011-08-26 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ1(Leucine zipper 1) <400> 1 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LZ2(Leucine zipper 2) <400> 2 Ala Leu Lys Lys Glu Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln Leu 1 5 10 15 Lys Trp Glu Leu Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 3 gatatacata tggtgagcaa gggcgag 27 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 4 ggtgctcgag ttacttgtac agcttgtcca tgcc 34 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 5 cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatggca agcgagcagc 60 tggaa 65 <210> 6 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 6 caattctttt ttgagggcca tatgataatc tccttcttaa agttaaacaa aattatttta 60 ggcgccggtg gagtggcggc c 81 <210> 7 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 <400> 7 ggccgccact ccaccggcgc ctaaaataat tttgtttaac tttaagaagg agattatcat 60 atggccctca aaaaagaatt g 81 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 <400> 8 cagctcctcg cccttgctca cctgcgccag ttcctttttc ag 42 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 <400> 9 ctgaaaaagg aactggcgca ggtgagcaag ggcgaggagc tg 42 <210> 10 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 <400> 10 gcagccaact cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatctcagcc gaccgtgcag 60 ggcgtgcc 68 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES <400> 11 aataattttg tttaacttta agaaggagat tatcat 36 <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mLZ1(4/27) <400> 12 Glu Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mLZ1(25) <400> 13 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mLZ1(11) <400> 14 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mLZ1(13/25/27) <400> 15 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 9 <400> 16 gcaagcgagc agctgaaaaa gaagttacaa gcc 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 10 <400> 17 ggcttgtaac ttctttttca gctgctcgct tgc 33 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 11 <400> 18 ccaagcattg gaaaaagaac tcgcgcagat ggcc 34 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 12 <400> 19 ggccatctgc gcgagttctt tttccaatgc ttgg 34 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 13 <400> 20 ggaaaaacca agcattgaaa aaaaaactcg cgcag 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 14 <400> 21 ctgcgcgagt ttttttttca atgcttggtt tttcc 35 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 15 <400> 22 gaagttacaa gccctgaaga aaaaacttgc tcagctg 37 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 16 <400> 23 cagctgagca agttttttct tcagggcttg taacttc 37 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 17 <400> 24 caagccctgg agaaagaact tgctcagctg g 31 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 18 <400> 25 ccagctgagc aagttctttc tccagggctt g 31 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 19 <400> 26 ggaaaaacca agcattgaaa aaagaactcg cgcagatggc c 41 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 20 <400> 27 ggccatctgc gcgagttctt ttttcaatgc ttggtttttc c 41 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD(cellulose binding domain) <400> 28 Ser Gly Pro Ala Gly Cys Gln Val Leu Trp Gly Val Asn Gln Trp Asn 1 5 10 15 Thr Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Val Lys Asn Thr Ser Ser Ala Pro 20 25 30 Val Asp Gly Trp Thr Leu Thr Phe Ser Phe Pro Ser Gly Gln Gln Val 35 40 45 Thr Gln Ala Trp Ser Ser Thr Val Thr Gln Ser Gly Ser Ala Val Thr 50 55 60 Val Arg Asn Ala Pro Trp Asn Gly Ser Ile Pro Ala Gly Gly Thr Ala 65 70 75 80 Gln Phe Gly Phe Asn Gly Ser His Thr Gly Thr Asn Ala Ala Pro Thr 85 90 95 Ala Phe Ser Leu Asn Gly Thr Pro Cys Thr Val Gly 100 105 <210> 29 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD(cellulose binding domain) <400> 29 agtggtccgg ccgggtgcca ggtgctgtgg ggcgtcaacc agtggaacac cggcttcacc 60 gcgaacgtca ccgtgaagaa cacgtcctcc gctccggtcg acggctggac gctcacgttc 120 agcttcccgt ccggccagca ggtcacccag gcgtggagct cgacggtcac gcagtccggc 180 tcggccgtga cggtccgcaa cgccccgtgg aacggctcga tcccggcggg cggcaccgcg 240 cagttcggct tcaacggctc gcacacgggc accaacgccg cgccgacggc gttctcgctc 300 aacggcacgc cctgcacggt cggctga 327

Claims

(i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는, 진핵 세포를 제공하는 단계;
(ii) 상기 융합 단백질을 발현시켜 진핵 세포 내에서 봉입체 (inclusion body)를 형성시키는 단계; 및
(iii) 목적 단백질과 표적 단백질의 상호작용을 형광 단백질의 형광 신호로 측정하는 단계를 포함하는, 진핵 세포 내 단백질 간 상호작용을 분석하는 방법.
제1항에 있어서, (iv) 봉입체에 형광이 응집되면 목적 단백질 및 표적 단백질이 상호작용하는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 목적 단백질과 표적 단백질 간의 상호작용을 형광 단백질의 형광으로 정량적으로 분석하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (i) 단계의 제1 구조물 및 제2 구조물은 별개의 벡터 또는 하나의 벡터 내에 존재하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 제1 구조물 및 제2 구조물이 IRES (internal ribosome entry site) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 연결되어 하나의 벡터에 존재하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 IRES는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로 기재되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 라이브러리로부터 유래된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 형광 단백질 및 제2 형광 단백질은 서로 다른 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 형광 단백질은 GFP (Green Fluorescent Protein), EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), mGFP (modified green fluorescent protein), RFP (Red Fluorescent Protein), mRFP (Monomeric Red Fluorescent Protein), ERFP (Enhanced Red Fluorescent Protein), DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), BFP (Blue Fluorescent Protein), EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein), CGFP (Cyan Green Fluorescent Protein), ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), AzG (Azami Green), HcR (HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP (Blue Fluorescent Protein)로 이루어지는 군에서 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 형광 검출은 형광 현미경 또는 유세포분석기로 수행하는 것인 방법.
(i) 목적 (bait) 단백질, 제1 형광 단백질 및 CBD (cellulose-binding domain) 단백질로 구성된 제1 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 구조물, 및 표적 (prey) 단백질 및 제2 형광 단백질로 구성된 제2 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 구조물을 포함하는 진핵 세포를 제공하는 단계;
(ii) 상기 융합 단백질을 발현시켜 진핵 세포 내에서 봉입체 (inclusion body)를 형성시키는 단계; 및
(iii) 목적 단백질에 결합된 표적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 목적 단백질과 상호 작용하는 표적 단백질을 분리하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 (i) 단계의 제1 구조물 및 제2 구조물은 별개의 벡터 또는 하나의 벡터 내에 존재하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 제1 구조물 및 제2 구조물이 IRES (internal ribosome entry site) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 연결되어 하나의 벡터에 존재하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 IRES는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로 기재되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 표적 단백질의 분리는 유세포분석기를 이용하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 라이브러리로부터 유래된 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 제1 형광 단백질 및 제2 형광 단백질은 서로 다른 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 형광 단백질은 GFP (Green Fluorescent Protein), EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), mGFP (modified green fluorescent protein), RFP (Red Fluorescent Protein), mRFP (Monomeric Red Fluorescent Protein), ERFP (Enhanced Red Fluorescent Protein), DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), BFP (Blue Fluorescent Protein), EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein), CGFP (Cyan Green Fluorescent Protein), ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), AzG (Azami Green), HcR (HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP (Blue Fluorescent Protein)로 이루어지는 군에서 선택된 것인 방법.
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