KR102168602B1 - SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase)의 단편을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물 및 이를 이용한 단백질 간 상호작용 검출 방법 - Google Patents

SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase)의 단편을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물 및 이를 이용한 단백질 간 상호작용 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase)의 단편(fragment)을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물 및 이를 이용한 단백질 간 상호작용 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물 또는 방법을 이용하면 세포 내에서 단백질 간의 상호작용을 세포의 환경변화(예: 세포 파괴)없이 간편하게 검출할 수 있다. 아울러, 단백질 상호작용을 강화 또는 억제하는 물질의 검출에도 이용할 수 있다.

Description

SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase)의 단편을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물 및 이를 이용한 단백질 간 상호작용 검출 방법{Composition for detecting protein-protein interactions comprising fragments of SEAP and method for detecting protein-protein interactions using the same}
본 발명은 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase)의 단편(fragment)을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물 및 이를 이용한 단백질 간 상호작용 검출 방법에 관한 것이다.
세포는 다양하고 복잡한 단백질-단백질 상호작용을 통하여 유전자 발현, 세포성장, 세포 주기, 대사, 신호전달 등의 여러 생물학적 기능을 수행함으로써 생명현상을 유지하고 있다. 따라서 세포 내에서 단백질-단백질 상호작용 및 상호작용의 기능을 이해하는 것은 생명현상을 이해하는 초석이 되며 신약개발 및 질병 치료의 중요한 기반이 된다.
시험관 내 또는 생체 내에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 종래기술로 친화성 크로마토그래피(affinity chromoatography), 공동면역침전(coimmunoprecipitation), 파아지 디스플레이(phage display), 투-하이브리드 어세이(two-hybrid assays), GST-융합 단백질 풀-다운(GST-fusion protein pulldown), 면역조직화학(immunohistochemistry) 등이 있다. 상기 종래기술들은 여러 장점도 있으나 빠르게 세포 내 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 데 단점이 있다.
단백질 친화성 크로마토그래피(Protein affinity chromatography)는 정제된 단백질을 준비해야 하는 단점이 있고, 단백질 간 상호작용 확인이 시험관 내(in vitro)에서 일어나므로, 세포 내에서는 상호작용하지 않는 단백질들이 컬럼을 통과하는 동안 정전기적 상호작용에 의하여 결합하는 것처럼 보일 수 있는 false-positive 결과를 도출 할 수 있다.
공동면역침전은 정제된 민감성이 높은 항체가 필요하며, 이 항체는 세포 내에 존재하는 단백질의 형태를 인식할 수 있는 것이어야 한다. 따라서 항체의 민감성과 특이성이 낮은 경우 단백질 간 상호작용을 검출하기 힘들다.
파아지 디스플레이는 단백질이 파아지의 캡시드나 외막 단백질과 융합된 형태로 발현되므로 발현할 수 있는 단백질의 크기가 제한되어있다. 포유류 세포의 많은 단백질들이 번역(translation) 과정 이후 여러 변형(modification)을 거치게 되나 파아지에서는 진핵 세포에서 만들어지는 단백질과 동일한 폴딩 및 번역 후 변형을 거치지 못하므로 단백질의 변형을 연구하기 어렵다.
투-하이브리드 어세이는 주로 효모와 포유류 세포에서 많이 사용되는데 효모의 경우 목적 단백질들이 진핵 세포에서와 동일하게 만들어지고 폴딩(folding) 및 변형이 일어나야 한다. 포유류 세포를 이용한 투-하이브리드 어세이의 경우 단백질의 합성 후 폴딩이나 변형이 제대로 일어나지만 단백질의 상호작용을 DNA 결합 도메인을 이용하여 핵에서 전사활성화를 통하여 상호작용을 확인하므로, 세포질에서의 상호작용하는 단백질 간 상호작용의 경우 세포질에서 상호작용을 확인하기 힘들다. 또한 단백질 간 상호작용이 리포터 유전자를 충분히 활성화시키지 못하는 경우, 상호작용하여 오히려 전사를 억제하는 경우 등에서 대조군과 활성화 정도의 차이가 크지 않아 상호작용을 검출하기 어려운 단점이 있다.
면역조직화학은 시료의 준비 과정 중 파라핀 및 포르말린으로 고정하는 과정을 거치게 되는데 이 과정 중 세포가 영향을 받을 수 있으며, 민감한 항체가 요구되고, 단지 목적 단백질들이 존재하는 세포 내 위치를 염료들로 염색 후 이들 결과를 토대로 단백질들의 위치로 이들 간 상호작용을 추측하게 되므로 정확한 단백질 간 상호작용을 확인하기 힘들다.
GST 풀-다운 어세이는 박테리아에서 목적 단백질들을 발현시키고 정제하는 과정을 거치게 되는데 단백질들을 수용성으로 발현시키는 과정이 쉽지 않으며 발현시킨 단백질이 포유류 세포에서 발현되는 것과 다른 구조를 가질 수도 있다. 또한 정제과정 도중 및 정제 후 단백질의 분해가 일어날 수 있으므로 지속적인 단백질 상태가 모니터링 되어야 한다. 또한 단백질 간 결합이 사용하는 버퍼의 조성에 의하여 큰 영향을 받는다. 따라서 적절한 버퍼의 조성 연구가 수반되어야 하며 시험관 내 실험이므로 생체 내 상호작용과 다른 결과를 얻을 수 있다.
기존의 단백질-단백질 상호작용을 분석하는 방법이 가지는 단점, 즉, 정제된 항원 특이적 항체의 필요성, 실험 수행 과정에서 세포 파괴와 같은 과정 중의 오염 및 세포의 환경변화, 단백질 정제의 어려움과 등의 문제점을 극복하여 간편하고 정확하게 단백질 간 상호작용을 검출하기 위한 새로운 방법이 요구되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 간편하고 정확하게 세포 내 단백질 간 상호작용을 검출하기 위해 예의 노력한 결과, SEAP 단백질의 단편에 목적(또는 표적) 단백질을 융합시킨 융합 단백질을 이용하면 세포 파괴 과정을 거치지 않는 간편한 방식으로 단백질 간 상호작용을 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
Gavin et al., Nature 2002, 415:141-147 Ho et al., Nature 2002, 415:180-183, Krogan et al., Nature 2006, 440:637-643
본 발명의 하나의 목적은, 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 (prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 포함하는, 단백질 간 상호작용 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은,
(a) 목적(bait) 단백질 및 SEAP 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 (prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 세포에 도입하는 단계;
(b) 상기 융합 단백질을 발현시키고, 단백질 간 상호작용을 유도하는 단계; 및
(c) 상기 상호작용 유도 전 및 유도 후의 SEAP 활성을 측정하는 단계; 를 포함하는, 단백질 간 상호작용의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 (prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 포함하는, 치료제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 (prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 포함하는, 단백질 간 상호작용 촉진제 또는 억제제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 목적 단백질 및 SEAP 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 포함하는, 단백질 간 상호작용 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, “목적 (bait) 단백질” 및 “표적 (prey) 단백질” 은 서로 상호작용하는 단백질 또는 서로 상호작용 하는지 여부를 알고자 하는 단백질을 의미한다. 상기 목적 단백질 및 표적 단백질은 다양한 치료용 단백질, 신호전달 단백질 등 각각 상호작용의 대상이 되는 물질을 의미할 수 있다. 상기 목적 단백질 및 표적 단백질은 천연형 단백질뿐만 아니라, 기능을 담당하는 도메인, 천연형 단백질의 일부일 수 있다. 상호작용의 검출 또는 스크리닝을 위해 목적 단백질은 실험자가 알고 있는 물질을 의미할 수 있고, 표적 단백질은 미지의 물질을 지칭하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자는 상기 목적 단백질 및 표적 단백질을 공지된 방법으로 적절히 선별할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, FKBP12, FRB를 목적 단백질 또는 표적 단백질로 사용하였다.
본 발명에서 용어,”SEAP 제1단편 단백질” 및 “SEAP 제2단편 단백질”은 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 전장(full length) 단백질을 절단하여 얻은 단편을 의미한다.
상기 “SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase)”은 알칼리성 인산 가수분해 효소(AP: Alkaline Phosphatase)의 C-말단 일부가 결실된 형태를 의미한다. 상기 SEAP은 막 고정 도메인(membrane anchoring domain)이 없어, 세포로부터 분비될 수 있다.
상기 SEAP을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 SEAP의 아미노산 서열 정보는 NCBI의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 그러나, 상기 공지된 서열뿐만 아니라, 상기 SEAP와 동일하게 세포로부터 분비되어 알칼리성 인산 가수분해 활성을 나타내어 단백질 간 상호작용을 검출할 수 있는 한, 이의 상동 단백질 또는 변이 단백질 역시 본 발명에서 제공하는 SEAP의 범주에 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 SEAP의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 SEAP 제1단편 단백질 및 상기 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 전장 단백질을 임의의 위치에서 절단하여 얻은 단편일 수 있다. 본 발명의 목적 상, 상기 단편 단백질은 전장 단백질의 절단에 의해 SEAP 활성을 상실하지만, 이에 융합된 목적 단백질 및 표적 단백질의 상호작용에 의해 SEAP 활성을 회복할 수 있는 한, 단편 단백질의 절단 위치가 제한되는 것은 아니다.
상기 SEAP 제1단편 단백질 및 상기 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 8, 60, 372, 379, 387, 404, 418 또는 481 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 SEAP 제1단편 및 상기 SEAP 제2단편은 동일한 절단위치의 단편 또는 서로 다른 절단위치의 단편일 수 있다.
아울러, 상기 위치에서 전후로 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 아미노산 이동한 위치 역시 단편 단백질 제조를 위한 절단 위치가 될 수 있다.
구체적으로, 상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 1 내지 16, 52 내지 68, 364 내지 395, 396 내지 426, 473 내지 489 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 SEAP 제1단편 및 상기 SEAP 제2단편은 동일한 절단위치의 단편 또는 서로 다른 절단위치의 단편일 수 있다.
본 발명의 SEAP 단백질 및 이의 단편 단백질은 특정 서열로 표현되더라도, 이의 활성을 유지할 수 있는 한, 무의미한 서열의 치환, 결손, 추가 등의 변이 단백질 역시 본 발명의 범주에 속하는 것은 자명하다.
본 발명의 실시예에서는, FKBP12 및 FRB를 목적 단백질 또는 표적 단백질로 사용하고 여기에 다양한 SEAP 단편을 융합시킨 융합 단백질을 발현 시킨 후, 라파마이신 처리에 의해 상기 FKBP12 및 FRB의 상호작용(결합)을 유도하였을 때, 다양한 SEAP 단편 쌍 중 일부의 단편 쌍이 서로 보완(complementation)하여 SEAP 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이때, N-말단으로부터 8, 60, 372, 379, 387, 404, 418 또는 481 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편의 쌍이 서로 보완하여 SEAP 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3 및 도 6).
구체적으로, 상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 55 내지 68 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 SEAP 제1단편 및 상기 SEAP 제2단편은 동일한 절단위치의 단편 또는 서로 다른 절단위치의 단편일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는, FKBP12 및 FRB를 목적 단백질 또는 표적 단백질로 사용하고 여기에 N-말단으로부터 55 내지 68 번째 아미노산 위치에서 절단된 다양한 단편을 융합시킨 융합 단백질을 발현 시킨 후, 라파마이신 처리에 의해 상기 FKBP12 및 FRB의 상호작용(결합)을 유도하였을 때, 상기 단편의 쌍이 서로 보완하여 SEAP 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5).
목적 단백질 및 SEAP 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 은 별개의 벡터 또는 하나의 벡터 내에 존재할 수 있다.
별개의 벡터에 존재할 경우, 목적 단백질 및 SEAP 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 SEAP 제1단편 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 목적 단백질이 융합된 단백질을 발현하는 벡터일 수 있다. 표적 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 SEAP 제2단편 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 표적 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하는 벡터일 수 있다.
또한, 상기 제1구조물 또는 제2구조물은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 그 예로, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 서열은 서로 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된 (operably linked)"은, 하나의 폴리뉴클레오티드 단편이 다른 폴리뉴클레오티드 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 폴리뉴클레오티드 단편의 영향을 받지만, 이들 폴리뉴클레오티드 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 폴리뉴클레오티드 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 또한, 본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"은 SEAP 단편 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 목적 단백질 또는 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 SEAP 단편 단백질의 발현 또는 기능이 가능하도록 연결된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 작동 가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적하는 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 벡터는 단백질 상호작용을 검출할 수 있는 요소를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은
(a) 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted form of Alkaline Phosphatae) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 (prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 세포에 도입하는 단계;
(b) 상기 융합 단백질을 발현시키고, 단백질 간 상호작용을 유도하는 단계; 및
(c) 상기 상호작용 유도 전 및 유도 후의 SEAP 활성을 측정하는 단계; 를 포함하는, 단백질 간 상호작용의 검출 방법을 제공한다.
상기 목적 단백질, 표적 단백질, SEAP 제1단편 단백질, SEAP 제2단편 단백질, 제1구조물, 제2구조물은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "도입"은 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다.
형질전환은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, PEI를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, “단백질 발현”은 세포 내로 도입된 외래 DNA의 정보가 단백질로 표현되는 것을 의미한다. 상기 발현은 프로모터의 종류에 따라 구성적 또는 유도성일 수 있다. 발현 방법은 종래 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단백질 간 상호작용 유도”는 특정 조건 또는 특정 물질을 이용하여 단백질이 서로 상호작용 할 수 있도록 하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 상기 상호작용은 단백질의 발현과 동시에 또는 발현 이후에 유도되는 것일 수 있다. 단백질의 상호작용을 유도하는 방법은 단백질의 종류에 따라 공지된 방법에서 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 목적 단백질 또는 표적 단백질로 사용한 FKBP12 및 FRB는 라파마이신을 처리하여 이들의 상호작용을 유도하였다.
본 발명에서 용어, “SEAP 활성 측정”은 SEAP의 인산 가수분해 효소(phosphatase)로서의 활성을 측정하는 것을 의미한다. 인산 가수분해 효소의 활성은 다양한 방법으로 측정할 수 있으나, 구체적으로 상기 효소의 기질을 이용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 pNpp(p-nitrophenylphosphate)를 기질로 하여, pNpp가 SEAP과 반응하여 생성된 생성물이 405 nm에서 빛을 흡수하는 성질을 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 SEAP의 활성을 측정하였다.
상기 단백질 간 상호작용의 검출 방법은 (d) 상기 (c) 단계에서 측정한 상호작용 유도 후의 SEAP 활성이 상호작용 유도 전의 SEAP 활성보다 크면, 목적 단백질과 표적 단백질이 상호작용하는 것으로 판단하는 단계; 를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 목적 단백질 또는 표적 단백질로 사용한 FKBP12 및 FRB의 상호작용을 유도하는 라파마이신의 처리 전/후로 SEAP 활성을 측정하고 이를 비교하였다.
또한, 상기 단백질 간 상호작용의 검출 방법은 목적 단백질과 표적 단백질의 상호작용을 시간 코스(time course)로 분석하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 SEAP은 세포로부터 분비될 수 있으므로, 세포를 파괴하지 않고도 SEAP 활성을 측정할 수 있어, 목적 단백질과 표적 단백질의 상호작용을 시간 경과에 따라 검출 할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 (prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 포함하는, 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
상기 목적 단백질, 표적 단백질, SEAP 제1단편 단백질, SEAP 제2단편 단백질, 제1구조물, 제2구조물은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 “치료제”는 단백질 간 상호작용 이상으로 인해 발병하는 질병을 치료하기 위한 물질을 의미하며, 구체적으로 목적 단백질 및 표적 단백질의 상호작용을 본래 상태로 회복시키는 물질일 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적 (prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 포함하는 단백질 간 상호작용 촉진제 또는 억제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
상기 목적 단백질, 표적 단백질, SEAP 제1단편 단백질, SEAP 제2단편 단백질, 제1구조물, 제2구조물은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 “촉진제” 또는 “억제제”는 목적 단백질 및 표적 단백질의 상호작용을 강화시키거나 약화시키는 물질일 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 방법을 이용하면 세포 내에서 단백질 간의 상호작용을 세포의 환경변화(예: 세포 파괴)없이 간편하게 검출할 수 있다. 아울러, 단백질 상호작용을 강화 또는 억제하는 물질의 검출에도 이용할 수 있다.
도 1은 SEAP 단백질의 2차 구조 및 본 발명에 따른 절단위치를 나타낸 것이다. 황색은 알파-나선형(α-helix) 구조, 적색은 베타-시트(β-sheet) 구조, 청색은 턴(turn) 구조를 나타내고, 녹색은 절단위치(C-말단 단편 시작위치)를 나타낸다.
도 2는 SEAP N-말단 단편 또는 C-말단 단편이 각각 FKBP 또는 FRB에 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 나타내는 모식도이다.
도 3은 단백질 상호작용을 검출할 수 있는 SEAP 단편을 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 SEAP 단백질 N-말단으로부터 55 내지 68 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP 단편 쌍들의 SEAP 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 SEAP 단백질 N-말단으로부터 59 번째 아미노산 위치에서 절단된 N-말단 단편과 SEAP 단백질 N-말단으로부터 55 내지 65 번째 아미노산 위치에서 절단된 C-말단 단편 쌍들의 SEAP 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 서로 다른 위치에서 절단된 SEAP 단편 쌍 들의 SEAP 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SEAP 단편을 포함하는 융합단백질을 발현하는 벡터 제조
실시예 1-1: SEAP의 절단 위치 결정
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 SEAP의 절단 위치는 UniProtKB (ID: P05187)에서 2차 구조(secondary structure)가 확인되지 않은 부분에서 선택하였다. 도 1에 상기 SEAP의 2차 구조 및 절단위치를 표시하였다. 이때, 황색은 알파-나선형(α-helix) 구조, 적색은 베타-시트(β-sheet) 구조, 청색은 턴(turn) 구조를 나타내고, 녹색은 절단위치(C-말단 단편 시작위치)를 나타낸다.
실시예 1-2: 벡터 제조
상기 실시예 1-1에서 결정한 절단위치에 따라, SEAP의 N-말단 단편을 FKBP12의 C-말단에 융합시키고, SEAP의 C-말단 단편을 FRB의 N-말단 또는 C-말단에 융합시킨 융합 단백질을 코딩하는 벡터(도 2)를 제조하였다.
상기 FKBP12 및 FRB는 라파마이신(rapamycin)을 매개로 하여 헤테로 다이머(heterodimer)를 형성하는 것으로 알려져 있다.
본 실시예에서 사용하거나 제조된 벡터는 표 1에 나타내었다.
또한, 본 실시예에서 사용한 프라이머는 표 2에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112019031882006-pat00001
프라이머 서열 (5'→ 3') 서열번호
oSCAR cagcgggtttaaacgggcccTCATGTCTGCTCGAAGCGGCC 2
oSCA9 tggaagtggaggatccCCGGACTTCTGGAACCGC 3
oSCA31 tggaagtggaggatccACAGCCGCCAAGAACCTC 4
oSCA45 tggaagtggaggatccGGGGTGTCTACGGTGACA 5
oSCA61 tggaagtggaggatccGACAAACTGGGGCCTGAG 6
oSCA70 tggaagtggaggatccGCCATGGACCGCTTCCCA 7
oSCA83 tggaagtggaggatccTACAATGTAGACAAACATGTGCC 8
oSCA91 tggaagtggaggatccGACAGTGGAGCCACAGCC 9
oSCA103 tggaagtggaggatccGTCAAGGGCAACTTCCAG 10
oSCA115 tggaagtggaggatccGCCGCCCGCTTTAACCAG 11
oSCA128 tggaagtggaggatccGAGGTCATCTCCGTGATG 12
oSCA140 tggaagtggaggatccGGGAAGTCAGTGGGAGTG 13
oSCA152 tggaagtggaggatccCAGCACGCCTCGCCAGCC 14
oSCA162 tggaagtggaggatccCACACGGTGAACCGCAAC 15
oSCA169 tggaagtggaggatccTACTCGGACGCCGACGTG 16
oSCA176 tggaagtggaggatccGCCTCGGCCCGCCAGGAG 17
oSCA183 tggaagtggaggatccTGCCAGGACATCGCTACG 18
oSCA194 tggaagtggaggatccATGGACATTGACGTGATCC 19
oSCA210 tggaagtggaggatccATGGGAACCCCAGACCCT 20
oSCA219 tggaagtggaggatccGATGACTACAGCCAAGGT 21
oSCA230 tggaagtggaggatccGGGAAGAATCTGGTGCAG 22
oSCA242 tggaagtggaggatccCAGGGTGCCCGGTATGTG 23
oSCA249 tggaagtggaggatccAACCGCACTGAGCTCATG 24
oSCA260 tggaagtggaggatccCCGTCTGTGACCCATCTC 25
oSCA274 tggaagtggaggatccATGAAATACGAGATCCACCG 26
oSCA281 tggaagtggaggatccGACTCCACACTGGACCCCT 27
oSCA302 tggaagtggaggatccAACCCCCGCGGCTTCTTC 28
oSCA314 tggaagtggaggatccCGCATCGACCATGGTCAT 29
oSCA323 tggaagtggaggatccAGGGCTTACCGGGCACTG 30
oSCA346 tggaagtggaggatccAGCGAGGAGGACACGCTG 31
oSCA366 tggaagtggaggatccGGCTACCCCCTGCGAGGG 32
oSCA373 tggaagtggaggatccTCCATCTTCGGGCTGGCC 33
oSCA380 tggaagtggaggatccGGCAAGGCCCGGGACAGG 34
oSCA388 tggaagtggaggatccTACACGGTCCTCCTATAC 35
oSCA405 tggaagtggaggatccGCCCGGCCGGATGTTACC 36
oSCA419 tggaagtggaggatccTATCGGCAGCAGTCAGCA 37
oSCA444 tggaagtggaggatccCCGCAGGCGCACCTGGTT 38
oSCA457 tggaagtggaggatccTTCATAGCGCACGTCATG 39
oSCA468 tggaagtggaggatccTGCCTGGAGCCCTACACC 40
oSCA474 tggaagtggaggatccTGCGACCTGGCGCCCCCC 41
oSCA482 tggaagtggaggatccACCACCGACGCCGCGCAC 42
oSCBR ctgaacctttggatccTGTCTGCTCGAAGCGGCC 43
oSCB9 catcaagcgctctagaCCGGACTTCTGGAACCGC 44
oSCB31 catcaagcgctctagaACAGCCGCCAAGAACCTC 45
oSCB45 catcaagcgctctagaGGGGTGTCTACGGTGACA 46
oSCB61 catcaagcgctctagaGACAAACTGGGGCCTGAG 47
oSCB70 catcaagcgctctagaGCCATGGACCGCTTCCCA 48
oSCB83 catcaagcgctctagaTACAATGTAGACAAACATGTGCC 49
oSCB91 catcaagcgctctagaGACAGTGGAGCCACAGCC 50
oSCB103 catcaagcgctctagaGTCAAGGGCAACTTCCAG 51
oSCB115 catcaagcgctctagaGCCGCCCGCTTTAACCAG 52
oSCB128 catcaagcgctctagaGAGGTCATCTCCGTGATG 53
oSCB140 catcaagcgctctagaGGGAAGTCAGTGGGAGTG 54
oSCB152 catcaagcgctctagaCAGCACGCCTCGCCAGCC 55
oSCB162 catcaagcgctctagaCACACGGTGAACCGCAAC 56
oSCB169 catcaagcgctctagaTACTCGGACGCCGACGTG 57
oSCB176 catcaagcgctctagaGCCTCGGCCCGCCAGGAG 58
oSCB183 catcaagcgctctagaTGCCAGGACATCGCTACG 59
oSCB194 catcaagcgctctagaATGGACATTGACGTGATCC 60
oSCB210 catcaagcgctctagaATGGGAACCCCAGACCCT 61
oSCB219 catcaagcgctctagaGATGACTACAGCCAAGGT 62
oSCB230 catcaagcgctctagaGGGAAGAATCTGGTGCAG 63
oSCB242 catcaagcgctctagaCAGGGTGCCCGGTATGTG 64
oSCB249 catcaagcgctctagaAACCGCACTGAGCTCATG 65
oSCB260 catcaagcgctctagaCCGTCTGTGACCCATCTC 66
oSCB274 catcaagcgctctagaATGAAATACGAGATCCACCG 67
oSCB281 catcaagcgctctagaGACTCCACACTGGACCCCT 68
oSCB302 catcaagcgctctagaAACCCCCGCGGCTTCTTC 69
oSCB314 catcaagcgctctagaCGCATCGACCATGGTCAT 70
oSCB323 catcaagcgctctagaAGGGCTTACCGGGCACTG 71
oSCB346 catcaagcgctctagaAGCGAGGAGGACACGCTG 72
oSCB366 catcaagcgctctagaGGCTACCCCCTGCGAGGG 73
oSCB373 catcaagcgctctagaTCCATCTTCGGGCTGGCC 74
oSCB380 catcaagcgctctagaGGCAAGGCCCGGGACAGG 75
oSCB388 catcaagcgctctagaTACACGGTCCTCCTATAC 76
oSCB405 catcaagcgctctagaGCCCGGCCGGATGTTACC 77
oSCB419 catcaagcgctctagaTATCGGCAGCAGTCAGCA 78
oSCB444 catcaagcgctctagaCCGCAGGCGCACCTGGTT 79
oSCB457 catcaagcgctctagaTTCATAGCGCACGTCATG 80
oSCB468 catcaagcgctctagaTGCCTGGAGCCCTACACC 81
oSCB474 catcaagcgctctagaTGCGACCTGGCGCCCCCC 82
oSCB482 catcaagcgctctagaACCACCGACGCCGCGCAC 83
oSNAF tggaagtggaggatccATCATCCCAGTTGAGGAG 84
oSNA8a gatccATCATCCCAGTTGAGGAGGAGAACTGAgggcc 85
oSNA8b cTCAGTTCTCCTCCTCAACTGGGATGATg 86
oSNA30 cagcgggtttaaacgggcccTCACTGTGCAGGCTGCAGCTT 87
oSNA44 cagcgggtttaaacgggcccTCACATCCCATCGCCCAGGAA 88
oSNA60 cagcgggtttaaacgggcccTCACTTCTTCTGCCCTTTCAG 89
oSNA69 cagcgggtttaaacgggcccTCACAGGGGTATCTCAGGCCC 90
oSNA82 cagcgggtttaaacgggcccTCATGTCTTGGACAGAGCCAC 91
oSNA90 cagcgggtttaaacgggcccTCATGGCACATGTTTGTCTAC 92
oSNA102 cagcgggtttaaacgggcccTCACCCGCACAGGTAGGCCGT 93
oSNA113 cagcgggtttaaacgggcccTCATGCACTCAAGCCAATGGT 94
oSNA127 cagcgggtttaaacgggcccTCAGTTGCCGCGTGTCGTGTT 95
oSNA139 cagcgggtttaaacgggcccTCATGCTTTCTTGGCCCGATT 96
oSNA151 cagcgggtttaaacgggcccTCACACTCGTGTGGTGGTTAC 97
oSNA161 cagcgggtttaaacgggcccTCAGGCGTAGGTGCCGGCTGG 98
oSNA168 cagcgggtttaaacgggcccTCACCAGTTGCGGTTCACCGT 99
oSNA175 cagcgggtttaaacgggcccTCAAGGCACGTCGGCGTCCGA 100
oSNA182 cagcgggtttaaacgggcccTCACCCCTCCTGGCGGGCCGA 101
oSNA193 cagcgggtttaaacgggcccTCAGTTGGAGATGAGCTGCGT 102
oSNA209 cagcgggtttaaacgggcccTCAGCGAAACATGTACTTTCG 103
oSNA218 cagcgggtttaaacgggcccTCATGGGTACTCAGGGTCTGG 104
oSNA229 cagcgggtttaaacgggcccTCAGTCCAGCCTGGTCCCACC 105
oSNA241 cagcgggtttaaacgggcccTCAGCGCTTCGCCAGCCATTC 106
oSNA248 cagcgggtttaaacgggcccTCACCACACATACCGGGCACC 107
oSNA259 cagcgggtttaaacgggcccTCAGTCCAGGGAAGCCTGCAT 108
oSNA273 cagcgggtttaaacgggcccTCAGTCTCCAGGCTCAAAGAG 109
oSNA280 cagcgggtttaaacgggcccTCATCGGTGGATCTCGTATTTC 110
oSNA301 cagcgggtttaaacgggcccTCACCTGCTCAGCAGGCGCAG 111
oSNA313 cagcgggtttaaacgggcccTCAACCACCCTCCACGAAGAG 112
oSNA322 cagcgggtttaaacgggcccTCAGCTTTCATGATGACCATG 113
oSNA345 cagcgggtttaaacgggcccTCAGGTGAGCTGGCCCGCCCT 114
oSNA365 cagcgggtttaaacgggcccTCATCCGAAGGAGAAGACGTG 115
oSNA372 cagcgggtttaaacgggcccTCAGCTCCCTCGCAGGGGGTA 116
oSNA379 cagcgggtttaaacgggcccTCAAGGGGCCAGCCCGAAGAT 117
oSNA387 cagcgggtttaaacgggcccTCAGGCCTTCCTGTCCCGGGC 118
oSNA404 cagcgggtttaaacgggcccTCAGCCGTCCTTGAGCACATA 119
oSNA418 cagcgggtttaaacgggcccTCACTCGGGGCTCCCGCTCTC 120
oSNA443 cagcgggtttaaacgggcccTCAGCCGCGCGCGAACACCGC 121
oSNA456 cagcgggtttaaacgggcccTCAGGTCTGCTCCTGCACGCC 122
oSNA467 cagcgggtttaaacgggcccTCAGGCGGCGAAGGCCATGAC 123
oSNA473 cagcgggtttaaacgggcccTCAGGCGGTGTAGGGCTCCAG 124
oSNA481 cagcgggtttaaacgggcccTCAGCCGGCGGGGGGCGCCAG 125
표 2에서, 대문자는 어닐링 사이트(annealing site)를 나타내고, 대문자에 밑줄친 부분은 종결코돈(stop codon)을 나타낸다. 또한, 소문자에 밑줄친 부분은 제한효소의 절단위치 또는 오버행(overhang) 부위를 나타낸다.
1) pSCA#(C-말단 단편, #~502) 벡터 제조
상기 벡터는 FLAG-FRB-SEAP 단편(C-말단)을 발현하는 벡터이다.
scSEAP(SEAP의 C-말단 단편)은 pSEAPX 벡터를 주형(template)으로, oSCA# 및 oSCAR를 프라이머로 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물 및 pAH9 벡터를 BamHI 및 ApaI 제한효소로 절단하고, 각각의 절단물을 라이게이션(ligation) 하였다.
2) pSCB#(C-말단 단편, #~502) 벡터 제조
상기 벡터는 SEAP 단편(C-말단)-FRB-FLAG을 발현하는 벡터이다.
scSEAP(SEAP의 C-말단 단편)은 pSEAPX 벡터를 주형으로, oSCB# 및 oSCBR을 프라이머로 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물 및 pAH8 벡터를 XbaI 및 BamHI 제한효소로 절단하고, 각각의 절단물을 라이게이션(ligation) 하였다.
3) pSNA#(N-말단 단편, 1~#) 벡터 제조
상기 벡터는 HA-FKBP-SEAP 단편(N-말단)을 발현하는 벡터이다.
snSEAP(SEAP의 N-말단 단편)은 pSEAPX 벡터를 주형으로, oSNA# 및 oSNAF를 프라이머로 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물 및 pAH7 벡터를 BamHI 및 ApaI 제한효소로 절단하고, 각각의 절단물을 라이게이션(ligation) 하였다.
pSNA8 벡터는 oSNA8a 및 OSC8b 프라이머를 혼성화(hybridization)하고, 이를 BamHI 및 ApaI로 절단된 pAH7에 라이게이션하여 제조하였다.
실시예 2. 단백질 간 상호작용을 검출할 수 있는 SEAP 단편의 스크리닝
실시예 2-1: 세포 배양
HEK-293T(Human embryonic kidney cell, ATCC: CRL-11268) 세포를 10 % (v/v) FBS(HyClone) 및 1 % (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 용액((HyClone)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Gibco, Seoul, South Korea)에서 배양하고, 5 % CO2를 포함하는 가습 분위기(humidified atmosphere)에서 37 ℃에서 배양하였다.
실시예 2-2: 스크리닝
HEK-293T 세포를 48-웰 플레이트에 2x104/웰로 뿌리고(seeding), 형질전환(transfection) 24 시간 전까지 배양하였다.
형질전환을 위해, 0.15 ㎕ PEI (PEI, <20,000 MW, cat no. 23966, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA; 스톡용액: 4 ㎎/㎖ in ddH2O, pH 7.2)를 0.2 ㎍ DNA와 혼합하고 5 초 동안 vortexing 후, 25 ℃에서 20 분간 인큐베이션하여, 40 ㎕ DNA-PEI 혼합물/웰을 제조하였다. 이때, 상기 DNA는 SEAP N-말단 단편이 포함된 벡터(pSNA 시리즈) 및 SEAP C-말단 단편이 포함된 벡터(pSCA 또는 pSCB 시리즈)를 1:1로 혼합한 것이다.
형질전환 24 시간 후, 배양 배지를 100 nM 라파마이신이 포함된 DMEM 또는 라파마이신이 포함되지 않은 DMEM으로 교체하였다.
SEAP 활성은 24 시간 후에 측정하였다. SEAP 활성은 pNpp(p-nitrophenylphosphate)-기반한 흡광(405 nm) 측정법을 이용하여, 시간 별로(time course) 측정하였다. 배양 배지 상층액 80 ㎕, 2X SEAP 완충액(21 % 디에탄올아민(diethanolamine), 20 mM L-호모아르기닌(L-homoarginine) 및 1 mM MgCl2, pH 9.8) 100 ㎕ 및 120 mM pNpp 20 ㎕를 혼합하여 반응시킨 뒤, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 보면, 라파마이신을 처리하여 세포 내 FKBP12와 FRB의 상호작용(결합)을 유도하였을 때, 상기 FKBP12 또는 FRB에 융합된 다양한 SEAP 단편 쌍 중 일부의 단편 쌍이 서로 보완(complementation)하여 SEAP 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
결합하여 SEAP 활성을 나타내는 SEAP 단편 쌍은 N-말단으로부터 8, 60, 379, 404, 481 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편의 쌍이다(도 3). 즉, N-말단으로부터 8, 60, 379, 404, 481 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP 단편의 쌍은 단백질 상호작용을 검출하는데 사용할 수 있다.
실시예 3. N-말단으로부터 55 내지 68 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP 단편 쌍의 SEAP 활성 측정
상기 실시예 2의 스크리닝에서 결과에서, N-말단으로부터 60 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP 단편의 쌍이 SEAP 활성이 가장 우수한 것을 알 수 있다(도 3).
이에, 상기 60 번째 아미노산의 ±8 위치 내에서 절단된 SEAP 단편 쌍들의 SEAP 활성을 실시예 2와 동일한 방법으로 실험하여 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 보면, N-말단으로부터 55 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP 단편 쌍을 제외하고는 모든 단편 쌍들이 서로 보완(complementation)하여 우수한 SEAP 활성을 나타내는 것을 알 수 있다. 즉, N-말단으로부터 56 내지 68 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP 단편의 쌍은 단백질 상호작용을 검출하는데 사용할 수 있다.
실시예 4. SEAP 단백질 N-말단으로부터 59 번째 아미노산 위치에서 절단된 N-말단 단편;과 SEAP 단백질 N-말단으로부터 55 내지 65 번째 아미노산 위치에서 절단된 C-말단 단편; 쌍들의 SEAP 활성 측정
SEAP 단백질 N-말단으로부터 59 번째 아미노산 위치에서 절단된 N-말단 단편(pSNA59)과 SEAP 단백질 N-말단으로부터 55 내지 65 번째 아미노산 위치에서 절단된 C-말단 단편(pSCA55 ~ pSCA65) 쌍들의 SEAP 활성 실시예 2와 동일한 방법으로 실험하여 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5를 보면, SEAP 단백질 N-말단으로부터 59 번째 아미노산 위치에서 절단된 N-말단 단편은 SEAP 단백질 N-말단으로부터 55 내지 65 번째 아미노산 위치에서 절단된 모든 C-말단 단편과 서로 보완하여 SEAP 활성을 나타내는 것을 알 수 있다. 즉, SEAP 단백질 N-말단으로부터 59 번째 아미노산 위치에서 절단된 N-말단 단편과 SEAP 단백질 N-말단으로부터 55 내지 65 번째 아미노산 위치에서 절단된 C-말단 단편 쌍은 단백질 상호작용을 검출하는데 사용할 수 있다.
실시예 5. 서로 다른 위치에서 절단된 SEAP 단편 쌍의 SEAP 활성 측정
서로 다른 위치에서 절단된 SEAP 단편 쌍의 SEAP 활성을 실시예 2와 동일한 방법으로 실험하여 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 보면, N-말단으로부터 379 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP N-말단 단편(pSNA379)은 N-말단으로부터 372 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP C-말단 단편(pSCA373 또는 pSCB373)과 결합하여 우수한 SEAP 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
또한, N-말단으로부터 387 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP N-말단 단편(pSNA387)은 N-말단으로부터 379 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP C-말단 단편(pSCA380)과 결합하여 우수한 SEAP 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
또한, N-말단으로부터 404 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP N-말단 단편(pSNA404)은 N-말단으로부터 387 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP C-말단 단편(pSCA388 또는 pSCB388)과 결합하여 우수한 SEAP 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
또한, N-말단으로부터 418 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP N-말단 단편(pSNA418)은 N-말단으로부터 404 번째 아미노산 위치에서 절단된 SEAP C-말단 단편(pSCA405 또는 pSCB405)과 결합하여 우수한 SEAP 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
즉, 절단위치가 서로 다른 단편의 쌍도 단백질 상호작용을 검출하는데 사용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KIM, Taeuk <120> Composition for detecting protein-protein interactions comprising fragments of SEAP and method for detecting protein-protein interactions using the same <130> KPA181546-KR <160> 125 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 502 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Secreted Alkaline Phosphatase <400> 1 Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala 1 5 10 15 Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala 20 25 30 Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr 35 40 45 Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly 50 55 60 Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser 65 70 75 80 Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu 100 105 110 Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu 115 120 125 Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly 130 135 140 Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr 145 150 155 160 Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala 165 170 175 Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser 180 185 190 Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe 195 200 205 Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly 210 215 220 Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys 225 230 235 240 Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala 245 250 255 Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly 260 265 270 Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu 275 280 285 Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg 290 295 300 Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His 305 310 315 320 Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp 325 330 335 Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser 340 345 350 Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro 355 360 365 Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp 370 375 380 Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val 385 390 395 400 Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser 405 410 415 Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr His 420 425 430 Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu 435 440 445 Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe 450 455 460 Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala 465 470 475 480 Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Tyr Ser Arg Val Gly Ala Ala 485 490 495 Gly Arg Phe Glu Gln Thr 500 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCAR <400> 2 cagcgggttt aaacgggccc tcatgtctgc tcgaagcggc c 41 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA9 <400> 3 tggaagtgga ggatccccgg acttctggaa ccgc 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA31 <400> 4 tggaagtgga ggatccacag ccgccaagaa cctc 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA45 <400> 5 tggaagtgga ggatccgggg tgtctacggt gaca 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA61 <400> 6 tggaagtgga ggatccgaca aactggggcc tgag 34 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA70 <400> 7 tggaagtgga ggatccgcca tggaccgctt ccca 34 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA83 <400> 8 tggaagtgga ggatcctaca atgtagacaa acatgtgcc 39 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA91 <400> 9 tggaagtgga ggatccgaca gtggagccac agcc 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA103 <400> 10 tggaagtgga ggatccgtca agggcaactt ccag 34 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA115 <400> 11 tggaagtgga ggatccgccg cccgctttaa ccag 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<400> 20 tggaagtgga ggatccatgg gaaccccaga ccct 34 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA219 <400> 21 tggaagtgga ggatccgatg actacagcca aggt 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA230 <400> 22 tggaagtgga ggatccggga agaatctggt gcag 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA242 <400> 23 tggaagtgga ggatcccagg gtgcccggta tgtg 34 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA249 <400> 24 tggaagtgga ggatccaacc gcactgagct catg 34 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA260 <400> 25 tggaagtgga ggatccccgt ctgtgaccca tctc 34 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA274 <400> 26 tggaagtgga ggatccatga aatacgagat ccaccg 36 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA281 <400> 27 tggaagtgga ggatccgact ccacactgga cccct 35 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA302 <400> 28 tggaagtgga ggatccaacc cccgcggctt cttc 34 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA314 <400> 29 tggaagtgga ggatcccgca tcgaccatgg tcat 34 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA323 <400> 30 tggaagtgga ggatccaggg cttaccgggc actg 34 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA346 <400> 31 tggaagtgga ggatccagcg aggaggacac gctg 34 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA366 <400> 32 tggaagtgga ggatccggct accccctgcg aggg 34 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA373 <400> 33 tggaagtgga ggatcctcca tcttcgggct ggcc 34 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA380 <400> 34 tggaagtgga ggatccggca aggcccggga cagg 34 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA388 <400> 35 tggaagtgga ggatcctaca cggtcctcct atac 34 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA405 <400> 36 tggaagtgga ggatccgccc ggccggatgt tacc 34 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA419 <400> 37 tggaagtgga ggatcctatc ggcagcagtc agca 34 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA444 <400> 38 tggaagtgga ggatccccgc aggcgcacct ggtt 34 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA457 <400> 39 tggaagtgga ggatccttca tagcgcacgt catg 34 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA468 <400> 40 tggaagtgga ggatcctgcc tggagcccta cacc 34 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA474 <400> 41 tggaagtgga ggatcctgcg acctggcgcc cccc 34 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCA482 <400> 42 tggaagtgga ggatccacca ccgacgccgc gcac 34 <210> 43 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCBR <400> 43 ctgaaccttt ggatcctgtc tgctcgaagc ggcc 34 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB9 <400> 44 catcaagcgc 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tctagagccg cccgctttaa ccag 34 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB128 <400> 53 catcaagcgc tctagagagg tcatctccgt gatg 34 <210> 54 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB140 <400> 54 catcaagcgc tctagaggga agtcagtggg agtg 34 <210> 55 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB152 <400> 55 catcaagcgc tctagacagc acgcctcgcc agcc 34 <210> 56 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB162 <400> 56 catcaagcgc tctagacaca cggtgaaccg caac 34 <210> 57 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB169 <400> 57 catcaagcgc tctagatact cggacgccga cgtg 34 <210> 58 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB176 <400> 58 catcaagcgc tctagagcct cggcccgcca ggag 34 <210> 59 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB183 <400> 59 catcaagcgc tctagatgcc aggacatcgc tacg 34 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB194 <400> 60 catcaagcgc tctagaatgg acattgacgt gatcc 35 <210> 61 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB210 <400> 61 catcaagcgc tctagaatgg gaaccccaga ccct 34 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB219 <400> 62 catcaagcgc tctagagatg actacagcca aggt 34 <210> 63 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB230 <400> 63 catcaagcgc tctagaggga agaatctggt gcag 34 <210> 64 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB242 <400> 64 catcaagcgc tctagacagg gtgcccggta tgtg 34 <210> 65 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB249 <400> 65 catcaagcgc tctagaaacc gcactgagct catg 34 <210> 66 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB260 <400> 66 catcaagcgc tctagaccgt ctgtgaccca tctc 34 <210> 67 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB274 <400> 67 catcaagcgc tctagaatga aatacgagat ccaccg 36 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB281 <400> 68 catcaagcgc tctagagact ccacactgga cccct 35 <210> 69 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB302 <400> 69 catcaagcgc tctagaaacc cccgcggctt cttc 34 <210> 70 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB314 <400> 70 catcaagcgc tctagacgca tcgaccatgg tcat 34 <210> 71 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB323 <400> 71 catcaagcgc tctagaaggg cttaccgggc actg 34 <210> 72 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB346 <400> 72 catcaagcgc tctagaagcg aggaggacac gctg 34 <210> 73 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB366 <400> 73 catcaagcgc tctagaggct accccctgcg aggg 34 <210> 74 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB373 <400> 74 catcaagcgc tctagatcca tcttcgggct ggcc 34 <210> 75 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB380 <400> 75 catcaagcgc tctagaggca aggcccggga cagg 34 <210> 76 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB388 <400> 76 catcaagcgc tctagataca cggtcctcct atac 34 <210> 77 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB405 <400> 77 catcaagcgc tctagagccc ggccggatgt tacc 34 <210> 78 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB419 <400> 78 catcaagcgc tctagatatc ggcagcagtc agca 34 <210> 79 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB444 <400> 79 catcaagcgc tctagaccgc aggcgcacct ggtt 34 <210> 80 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB457 <400> 80 catcaagcgc tctagattca tagcgcacgt catg 34 <210> 81 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB468 <400> 81 catcaagcgc tctagatgcc tggagcccta cacc 34 <210> 82 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB474 <400> 82 catcaagcgc tctagatgcg acctggcgcc cccc 34 <210> 83 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSCB482 <400> 83 catcaagcgc tctagaacca ccgacgccgc gcac 34 <210> 84 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNAF <400> 84 tggaagtgga ggatccatca tcccagttga ggag 34 <210> 85 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA8a <400> 85 gatccatcat cccagttgag gaggagaact gagggcc 37 <210> 86 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA8b <400> 86 ctcagttctc ctcctcaact gggatgatg 29 <210> 87 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA30 <400> 87 cagcgggttt aaacgggccc tcactgtgca ggctgcagct t 41 <210> 88 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA44 <400> 88 cagcgggttt aaacgggccc tcacatccca tcgcccagga a 41 <210> 89 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA60 <400> 89 cagcgggttt aaacgggccc tcacttcttc tgccctttca g 41 <210> 90 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA69 <400> 90 cagcgggttt aaacgggccc tcacaggggt atctcaggcc c 41 <210> 91 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA82 <400> 91 cagcgggttt aaacgggccc tcatgtcttg gacagagcca c 41 <210> 92 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA90 <400> 92 cagcgggttt aaacgggccc tcatggcaca tgtttgtcta c 41 <210> 93 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA102 <400> 93 cagcgggttt aaacgggccc tcacccgcac aggtaggccg t 41 <210> 94 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA113 <400> 94 cagcgggttt aaacgggccc tcatgcactc aagccaatgg t 41 <210> 95 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA127 <400> 95 cagcgggttt aaacgggccc tcagttgccg cgtgtcgtgt t 41 <210> 96 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA139 <400> 96 cagcgggttt aaacgggccc tcatgctttc ttggcccgat t 41 <210> 97 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA151 <400> 97 cagcgggttt aaacgggccc tcacactcgt gtggtggtta c 41 <210> 98 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA161 <400> 98 cagcgggttt aaacgggccc tcaggcgtag gtgccggctg g 41 <210> 99 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA168 <400> 99 cagcgggttt aaacgggccc tcaccagttg cggttcaccg t 41 <210> 100 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA175 <400> 100 cagcgggttt aaacgggccc tcaaggcacg tcggcgtccg a 41 <210> 101 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA182 <400> 101 cagcgggttt aaacgggccc tcacccctcc tggcgggccg a 41 <210> 102 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA193 <400> 102 cagcgggttt aaacgggccc tcagttggag atgagctgcg t 41 <210> 103 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA209 <400> 103 cagcgggttt aaacgggccc tcagcgaaac atgtactttc g 41 <210> 104 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA218 <400> 104 cagcgggttt aaacgggccc tcatgggtac tcagggtctg g 41 <210> 105 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA229 <400> 105 cagcgggttt aaacgggccc tcagtccagc ctggtcccac c 41 <210> 106 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA241 <400> 106 cagcgggttt aaacgggccc tcagcgcttc gccagccatt c 41 <210> 107 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA248 <400> 107 cagcgggttt aaacgggccc tcaccacaca taccgggcac c 41 <210> 108 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA259 <400> 108 cagcgggttt aaacgggccc tcagtccagg gaagcctgca t 41 <210> 109 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA273 <400> 109 cagcgggttt aaacgggccc tcagtctcca ggctcaaaga g 41 <210> 110 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA280 <400> 110 cagcgggttt aaacgggccc tcatcggtgg atctcgtatt tc 42 <210> 111 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA301 <400> 111 cagcgggttt aaacgggccc tcacctgctc agcaggcgca g 41 <210> 112 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA313 <400> 112 cagcgggttt aaacgggccc tcaaccaccc tccacgaaga g 41 <210> 113 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA322 <400> 113 cagcgggttt aaacgggccc tcagctttca tgatgaccat g 41 <210> 114 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA345 <400> 114 cagcgggttt aaacgggccc tcaggtgagc tggcccgccc t 41 <210> 115 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA365 <400> 115 cagcgggttt aaacgggccc tcatccgaag gagaagacgt g 41 <210> 116 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA372 <400> 116 cagcgggttt aaacgggccc tcagctccct cgcagggggt a 41 <210> 117 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA379 <400> 117 cagcgggttt aaacgggccc tcaaggggcc agcccgaaga t 41 <210> 118 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA387 <400> 118 cagcgggttt aaacgggccc tcaggccttc ctgtcccggg c 41 <210> 119 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA404 <400> 119 cagcgggttt aaacgggccc tcagccgtcc ttgagcacat a 41 <210> 120 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA418 <400> 120 cagcgggttt aaacgggccc tcactcgggg ctcccgctct c 41 <210> 121 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA443 <400> 121 cagcgggttt aaacgggccc tcagccgcgc gcgaacaccg c 41 <210> 122 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA456 <400> 122 cagcgggttt aaacgggccc tcaggtctgc tcctgcacgc c 41 <210> 123 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA467 <400> 123 cagcgggttt aaacgggccc tcaggcggcg aaggccatga c 41 <210> 124 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA473 <400> 124 cagcgggttt aaacgggccc tcaggcggtg tagggctcca g 41 <210> 125 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oSNA481 <400> 125 cagcgggttt aaacgggccc tcagccggcg gggggcgcca g 41

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및
    표적(prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물;
    을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물로서,
    상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 1 내지 16, 52 내지 68, 364 내지 395, 396 내지 426, 또는 473 내지 489 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  4. 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및
    표적(prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물;
    을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물로서,
    상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 8, 60, 372, 379, 387, 404, 418 또는 481 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  5. 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및
    표적(prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물;
    을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물로서,
    상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 55 내지 68 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 SEAP은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 SEAP은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 조성물
  8. 제5항에 있어서, 상기 SEAP은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 조성물.
  9. 삭제
  10. (a) 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적(prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 융합 단백질을 발현시키고, 단백질 간 상호작용을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 상호작용 유도 전 및 유도 후의 SEAP 활성을 측정하는 단계; 를 포함하는 단백질 간 상호작용의 검출 방법으로서,
    상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 1 내지 16, 52 내지 68, 364 내지 395, 396 내지 426, 또는 473 내지 489 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  11. (a) 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적(prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 융합 단백질을 발현시키고, 단백질 간 상호작용을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 상호작용 유도 전 및 유도 후의 SEAP 활성을 측정하는 단계; 를 포함하는 단백질 간 상호작용의 검출 방법으로서,
    상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 8, 60, 372, 379, 387, 404, 418 또는 481 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  12. (a) 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및 표적(prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물; 을 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 융합 단백질을 발현시키고, 단백질 간 상호작용을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 상호작용 유도 전 및 유도 후의 SEAP 활성을 측정하는 단계; 를 포함하는 단백질 간 상호작용의 검출 방법으로서,
    상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 55 내지 68 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  13. 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및
    표적(prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물;
    을 포함하는 치료제 스크리닝용 조성물로서,
    상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 1 내지 16, 52 내지 68, 364 내지 395, 396 내지 426, 또는 473 내지 489 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  14. 목적(bait) 단백질 및 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase) 제1단편 단백질을 포함하는 제1융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1구조물; 및
    표적(prey) 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질을 포함하는 제2융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2구조물;
    을 포함하는 단백질 간 상호작용 촉진제 또는 억제제 스크리닝용 조성물로서,
    상기 SEAP 제1단편 단백질 및 SEAP 제2단편 단백질은 SEAP 단백질의 N-말단으로부터 1 내지 16, 52 내지 68, 364 내지 395, 396 내지 426, 또는 473 내지 489 번째 아미노산 위치에서 절단된 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
KR1020190035771A 2019-03-28 2019-03-28 SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase)의 단편을 포함하는 단백질 간 상호작용 검출용 조성물 및 이를 이용한 단백질 간 상호작용 검출 방법 KR102168602B1 (ko)

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