KR101244249B1 - 소포체 스트레스 유발물질 검출 방법 - Google Patents

소포체 스트레스 유발물질 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분비형 알카라인 포스파타아제 (pSEAP) 발현 벡터, SEAP발현 상피세포주 및 SEAP 발현 상피 세포주를 이용한 소포체 스트레스 유발 물질 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인체 소장 상피세포에서 곰팡이 독소인 8-케토 트리코테센이 소포체 스트레스를 일으킨다는 점과 곰팡이 독소 농도의존적으로 SEAP 발현이 감소된다는 점을 밝혀내고, SEAP를 항시 발현하는 상피세포주를 포함하는 소포체 스트레스 유발 물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 소포체 스트레스 유발물질 검출 방법에 관한 것이다.

Description

소포체 스트레스 유발물질 검출 방법 {A method for detecting agent inducing endoplasmic reticulum stress}
본 발명은 분비형 알카라인 포스파타아제 (secretory alkaline phosphatase, SEAP) 발현 벡터, SEAP 발현 상피 세포주 및 SEAP 발현 상피 세포주를 이용한 소포체 스트레스 유발 물질 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, SEAP를 항시 발현하는 인간 상피 세포주를 이용하여 소포체 스트레스 유발물질인 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecene)을 검출하는 방법에 관한 것이다.
마이코톡신은 식품 또는 사료를 통해 인간 또는 동물에 대한 일부 유해 효과를 갖는 진균에 의해 생산되는 2차 대사산물로 정의되고, 박테리아 독소 등과는 구별된다. 박테리아 독소와는 달리, 마이코톡신은 저분자량 물질이고, 많은 공지된 물질을 포함한다. 이들의 화학적 구조 및 생체에 대한 유해 효과는 상당히 다양하다. 이들 중 몇몇은 인간에게 유해하지 않고, 일부는 인체에서 높은 급성 독성을 나타내고, 나머지는 발암성 또는 신장 및 간에서의 종양 형성성을 갖는 것으로 인식된다. 저분자량으로 인해, 마이코톡신은 통상적인 식품 가공 및 요리 조건 하에 분해되거나 제거되기 어렵다.
또한, 마이코톡신은 안정성이 높아, 사료를 통해 식용 동물 내로 섭취되는 경우, 동물로부터의 고기 또는 유제품에 잔류하게 되고, 최종적으로 인체 내로의 섭취 후 독성을 나타낸다.
마이코톡신 오염은 다양한 경로에 의해 일어날 수 있지만, 작물의 재배, 수확, 저장 및 가공 과정에서의 진균의 침입에 의해 일어나는 작물의 1차 오염 및 오염된 사료의 공급에 의해 일어나는 축산물 및 수산물 (예를 들어, 고기, 밀크 및 알)의 2차 오염으로 크게 분류된다. 1차 오염은 작물 (진균의 기질)의 종류, 재배 환경에서 발생하는 진균의 종류 및 환경 조건 (예를 들어, 온도, 습도 및 강수량)과 같은 요인에 따른 지역적 특성을 나타낸다.
트리코테센 마이코톡신은 보리, 밀, 호밀, 귀리 및 옥수수와 같은 주요 곡물을 오염시키는 대표적인 마이코톡신이다. 대표적인 트리코테센 마이코톡신으로는 데옥시니발레놀 (DON), 니발레놀 (NIV) 및 T-2 독소 (T-2)가 있다. 이들을 주로 생산하는 진균인 푸사리움 그라미네아룸 (Fusariumgraminearum), 푸사리움 쿨모룸 (F.culmorum) 및 푸사리움 스포로트리키오이데스 (F.sporotrichioides)는 통상적으로 토양에 존재하고, 온도, 습도 및 강수량과 같은 자연 조건이 만족스러우면 작물을 쉽게 감염시켜, 작물의 마이코톡신 오염이 확산되게 한다.
식품 및 사료의 오염을 방지하기 위한 목적으로, 식품 및 사료 내의 트리코테센 마이코톡신의 잔류 농도에 관한 규제가 많은 나라에서 채택된다. 따라서, 식품 및 사료 내의 트리코테센 마이코톡신을 신속하고 정확하게 정량하는 것이 중요하다. 또한 트리코테센의 독소가 가장 높은 농도로 제일 먼저 노출되는 세포가 장 점막상피 세포이기 때문에 인체 상피세포를 기반으로 하는 트리코테센의 정량분석방법이 절실히 필요한 상태이다.
상기의 필요성을 인지하고, 본 발명자들은 트리코테센이 인체 상피세포에서 소포체 스트레스를 유도함을 발견하고, 이를 바탕으로 분비형 알칼리 포스포타아제를 항시 발현하는 인체 상피 세포주를 이용하여 소포체 스트레스 유발 물질을 검출할 수 있는 바이오 모니터링법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 발현 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 SEAP를 항시 발현하는 인간 상피 세포주를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 소포체 스트레스 유발 물질 검출용 조성물 및 검출 방법을 제공하는데 있다.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 SV40 프로모터, 하이그로마이신 (hygromycin) 유전자 및 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 유전자로 구성된 분비형 알칼리 포스파타아제 발현 벡터를 제공한다.
상기 발현벡터는 도 2A의 구조를 갖는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 발현벡터가 도입된, 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP)를 항시 발현하는 인간 상피 세포주를 제공한다.
상기 상피 세포주는 인간 소장 상피세포인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 인간 상피 세포주를 포함하는 소포체 스트레스 유발 물질 검출용 조성물을 제공한다.
상기 소포체 스트레스 유발물질은 곰팡이 독소인 것이 바람직하다.
상기 곰팡이 독소는 8-케토 트리코테센이 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 데옥시니발레놀 (DON), 3-아세틸 DON, 15-아세틸 DON, 니발레놀 또는 4-아세틸 니발레놀이다.
본 발명의 상기 조성물은 키트 또는 마이크로어레이 형태로 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 제 4항의 조성물에 검사하고자 하는 시료를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (b) 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 의 분비 변화를 관찰하는 단계; 를 포함하는 소포체 스트레스 유발물질 검출 방법을 제공한다.
상기 방법에서, SEAP의 분비가 억제되면 시료가 소포체 스트레스 유발물질에 오염되었다고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 시료는 소포체 스트레스 유발물질에 오염되었는지 여부를 확인하고자 하는 식품, 곡류 또는 사료일 수 있다.
상기 소포체 스트레스 유발물질은 곰팡이 독소인 것이 바람직하며, 그 중 8-케토 트리코테센인 것이 더 바람직하다.
본 발명에 의하면, 가장 높은 농도로 곰팡이 독소에 제일 먼저 노출되는 세포인 인체 상피 세포주를 이용하기 때문에 보다 정확하게 소포체 스트레스를 유도하는 물질을 검출할 수 있다. 또한 소포체 스트레스 유도 물질의 독성 기전작용을 이용하여 직접 모니터링하는 시스템을 구축하고, 독소의 생물학적인 정량활성 분석이 가능하게 되었는 바, 오염된 곡물을 사전에 검출하여 독소에 의해 발생하는 질병을 예방할 수 있다. 특히 세포 밖으로 분비되는 SEAP를 분석하기에 상피세포를 용해하지 않고 계속적으로 실시간으로 간편하게 활성을 측정이 가능하며, 세포기반의 정량화된 바이오에세이를 통하여 구조가 유사한 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecene) 독소들의 상대적인 독성의 정도를 나타내는 toxic equivalent factor (TEF)를 산출하는데 이용이 가능하다.
도 1은 HCT-8 인간 소장 상피세포에서 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecenes)의 소포체 스트레스 유도 결과를 나타낸 것이다. 1은 vehicle처리, 2는 8-케토 트리코테센 DON 처리, 3에는 15-아세틸 DON 처리, 4에는 3-아세틸 DON 처리, 5에는 NIV 처리를, 6에는 4-아세틸 NIV처리를 2분 또는 10분하였다. 도 1중 A는 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석를 나타낸 것으로, 인산화된 eIF2α를 정량한 그래프이다. B는 총 RNA를 추출하여 각 mRNA 의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 SV40 프로모터 및 하이그로마이신 저항 마커를 포함하는 SEAP 유전자 발현 플라스미드 구성을 나타낸 것이다.
도 2b는 제조된 플라스미드가 HCT-8 세포에 도입되어 안정적으로 SEAP 를 발현하고 있는지를 RT-PCR 로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 2c는 소포체 스트레스 유발 물질로 알려진 thapsigargin을 처리하여 SEAP 분비 발현 결과를 확인한 것이다.
도 3은 in vitro 에서 8-케토 트리코테센의 SEAP mRNA 및 효소적 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 1은 vehicle처리, 2는 8-케토 트리코테센 DON 처리, 3에는 15-아세틸 DON 처리, 4에는 3-아세틸 DON 처리, 5에는 NIV 처리를, 6에는 4-아세틸 NIV처리를 24시간동안 하였다. 그 중 A는 RNA를 RT-PCR 로 측정한 결과이고, B는 재조합 SEAP를 ID50 또는 2xID50의 양으로 8-케트 트리코테센을 처리하여 얻은 SEAP의 활성도 결과이다.
도 4는 8-케토 트리코테센 중 DON, 15-아세틸 DON, 3-아세틸 DON, NIV 및 4-아세틸 NIV를 각각 SEAP 발현 세포에 처리하여 SEAP의 활성을 나타낸 것이다. 상대적인 SEAP 활성은 전체 단백질에 대해서 배지 안에서의 SEAP 활성정도를 %로 계산하였으며, 모든 실험은 3번씩 반복하였다.
도 5는 SEAP 기반 DON 모니터링법에서 곡물 매트릭스 효과를 나타낸 것이다. DON 을 함유하는 옥수수 (A) 또는 벼 (B)와 SEAP 발현 세포주를 반응시켜, 실제 DON 양과 SEAP 기반 바이오 모니터링법에서 측정된 DON 양의 상관관계를 확인하였다.
본 발명은 SV40 프로모터, 하이그로마이신 (hygromycin) 유전자 및 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 유전자로 구성된 분비형 알칼리 포스파타아제 발현 벡터에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발현벡터는 pGL3 컨트롤 벡터 (control vector) (Promega company)를 기본 틀로 하여, SV40 프로모터 (위치: 48-250bp), 삽입된 SEAP (위치: 280-1854bp), 삽입된 하이그로마이신 (Hygromycin) 내성유전자 (위치: 2362-3960bp), Amp 내성유전자 (위치: 5044-5904bp)등의 요소를 갖고 있으며, SV40 프로모터 작용에 의해서 항시적으로 SEAP의 발현이 되도록 했으며, 벡터자체 내에 특히, 하이그로마이신 내성 유전자를 넣어서 2주간 선별하여 항시발현 상피 세포주를 창출하는데 용이하도록 벡터를 설계할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 발현 벡터 구조는 도 2A 에 나타난 구조와 같다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션 (ligation)할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, pGL4.14에서 하이그로마이신 유전자 (SalI/BamHI)를 pGL3 컨트롤 벡터로 옮기고, 이 plasmid L은 세포 내 luciferase assay용 세포주를 만드는데 이용하였다. 분비용 리포터시스템 구축을 위하여 pSEAP2-basic 벡터에서 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 유전자를 분리하여 HindIII/HpaI위치의 plasmid L에 다시 클로닝 하였다 (Plasmid P, pSEAP, 도 2). 따라서 본 발명의 벡터는 모두 하이그로마이신 유전자를 소유하기에 안정 세포주 (stable cell line)의 구축이 가능하다.
또한 본 발명은 상기 발현벡터가 도입된 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP)를 항시 발현하는 인간 상피 세포주에 관한 것이다.
발현벡터를 주입하는 형질전환은 Sambrook, et. al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법 (electroporation)(Neumann, et. al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000을 사용하여 상기 SEAP를 항시 발현하는 플라스미드를 HCT-8 세포에 주입 (transfection)하였다.
바람직하게는 본 발명의 상기 세포주는 인간 소장 상피세포임이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 상피 세포주를 포함하는 소포체 스트레스 유발 물질 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 HCT-8 인간 소장 상피에서 8-케토 트리코테센은 소포체 스트레스 유발 반응을 확인하는 대표적인 방법인 eIF2α의 인산화 여부를 실험한 결과, 수분 내에 eIF2α 인산화가 증가되었으며, GRP78은 발현이 감소되었고, ATF6는 발현이 증가하였다. 또한 본 발명에서는 트리코테센으로 조절되는 소포체 스트레스를 모니터링하기 위해 SEAP 리포터를 사용하여 세포-기반 에세이 시스템을 개발하였다. 소포체 스트레스 유발 물질인 8-케토 트리코테센을 SEAP-항시 발현 인간 소장 상피 세포주에 처리했을 때 SEAP의 분비가 감소되는 것을 확인함으로써 소포체 스트레스 유발 물질 검출 조성물 및 시스템을 개발하였다.
상기 조성물의 소포체 스트레스 유발물질은 곰팡이 독소가 바람직하며, 보다 바람직하게는 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecene) 이다. 8-케토 트리코테센에는 데옥시니발레놀 (DON), 3-아세틸 DON, 15-아세틸 DON, 니발레놀 또는 4-아세틸 니발레놀 등을 포함한다.
상기 조성물은 키트 또는 마이크로어레이 형태로 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 (a) SEAP를 안정적으로 발현하는 인간 상피 세포주를 포함하는 조성물에 검사하고자 하는 시료를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (b) 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 의 분비 억제 정도를 관찰하는 단계; 를 포함하는 소포체 스트레스 유발물질 검출 방법에 관한 것이다.
SEAP를 안정적으로 발현하는 인간 상피 세포주가 포함된 세포 배양액을 함유하는 조성물의 SEAP 발현 정도를 측정한다. 상기 세포 배양액에 소포체 스트레스 유발물질에 오염되었는지를 검사하고자 하는 시료를 첨가하여 반응시킨 후, SEAP의 발현 변화를 관찰하여 소포체 스트레스 유발물질 감염 여부를 검출할 수 있다. SEAP의 분비가 억제되면 시료가 소포체 스트레스 유발물질에 오염되었다고 판단할 수 있다. 상기 SEAP 발현 변화는 공지된 ELISA 방법으로 확인할 수 있다.
본 발명의 상기 검출 방법은 세포 배양액만을 통해 쉽게 검출할 수 있다. 상기 검사하고자 하는 시료는 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어, 식품, 곡류 또는 사료일 수 있다. 상기 소포체 스트레스 유발물질은 곰팡이 독소가 바람직하며, 더 바람직하게는 8-케토 트리코테센이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
세포 배양과 시료 준비
HCT-8 인간 상피세포는 인간 회맹부위에서 얻었으며, 이는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포들은 37℃, 5% CO2 가습 배양기에서 열로 불활성화된 10% (v/v) 우태아 혈청 (fetal bovine serum (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)), 50 units/ml 페니실린 (penicillin (Sigma-Aldrich)) 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (streptomycin (Sigma-Aldrich))이 추가된 RPMI 배지로 (Invitrogen, Carlsbad, CA. USA) 배양하였다.
세포 수와 생존력은 혈구 계산기 (hemacytometer)를 사용하여 트립판 블루 (trypan blue (Sigma- Aldrich))를 배제함으로써 표준 분석법으로 확인하였다.
플라스미드의 구축과 트랜스펙션 (transfection)
pGL3 컨트롤 벡터 (control vector) (Promega, Madison, WI, USA)를 기반으로 하여 하이그로마이신 (hygromycin) 저항성을 갖고, SV40을 프로모터로 갖는 SEAP 리포터 플라스미드 (pSV40-SEAP-hyg)를 제조하였다. 보다 구체적으로는, pGL4.14에서 하이그로마이신 유전자 (SalI/BamHI)를 pGL3 컨트롤 벡터로 옮겼다. 이 plasmid L은 세포내 luciferase assay용 세포주를 만드는데 이용하고, 분비용 리포터시스템 구축을 위하여 pSEAP2-basic 벡터에서 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 유전자를 분리하여 HindIII/HpaI위치의 plasmid L에 다시 클로닝 하였다 (Plasmid P, pSEAP). 결국 양벡터 모두 하이그로마이신 유전자를 소유하기에 안정 세포주 (stable cell line)의 구축이 가능하였다.
리포펙타민 (Lipofectamine) 2000을 사용하여 상기 플라스미드를 HCT-8 세포에 주입 (transfection)하였다. pMX-enhanced green fluorescent protein (GFP) 벡터로 확인했을 때 플라스미드 주입 효율은 약 50%~60% 이었다. pSV40-SEAP-hyg 를 안전하게 발현하는 세포주를 얻기 위해서 400 ㎍/ml 하이그로마이신 B (hygromycin B, Invitrogen)가 포함되어 있는 완전배지에서 세포를 선택 (selection)하였다. 선택은 모노레이어 콜로니 (monolayer colonies) 가 생성될 때까지 계속 수행하였다. 단일의 발현세포주 (transfectant)가 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum) 및 200 ㎍/ml 하이그로마이신 B가 추가되어 있는 완전 배지 (complete medium)에서 유지되었다.
SEAP assay
형질변환된 HCT-8 세포를 24-웰 플레이트에 5×104 세포/웰의 농도로 seed 한 후, 다양한 농도의 트리코테센 (trichothecenes)을 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. 모아진 배양액 (400㎕)을 5분간 65℃로 가열하고, 가열된 배양액의 상청액 100㎕를 100㎕의 2x SEAP assay buffer (2M 디에탄올아민 (diethanolamine), 1 mM MgCl2, 20 mM 1- 호모알지닌 (homoarginine) 포함)와 혼합하였다.
혼합물을 10분간 37℃에서 배양시킨 후 1x SEAP assay buffer에 용해된 120mM p-니트로페닐인산염 20㎕를 첨가함으로써 반응을 마쳤다. 최종 혼합물은 15분간 37℃에서 더 암배양시켰다. 반응혼합물의 흡광도는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) reader (Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)로 405 nm에서 측정하였다
웨스턴 블롯 분석 (Western immunoblot analysis)
단백질 발현 레벨은 웨스턴 블롯을 이용하여 비교하였다. 세포들은 차가운 인산염 버퍼로 씻은 후 끓는 용해 버퍼 [1% (w/v) sodium dodecyl sulfate, 1.0 mM sodium ortho-vanadate, and 10 mM Tris, pH 7.4]로 용해시키고, 5초간 초음파 처리하였다.
단백질을 포함하고 있는 용해물은 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 정량화하였다. 단백질의 50㎍을 미니-겔 전기영동 (mini-gel electrophoresis (Bio-Rad, Hercules, CA, USA))으로 분리시켰다. 단백질은 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인 (polyvinylidene fluoride membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)) 으로 이동시킨 후 블롯들을 Tris-buffered saline plus Tween 0.05% (TBST)에서 5% skim milk 로 1시간동안 bloking 하였다. 상온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 각각의 항체로 검사 (probe) 하였다.
TBST로 세 번 씻은 후, 블롯들은 이차항체 (horseradish-conjugated secondary antibody)로 1시간 동안 배양시키고, TBST로 세 번 더 씻었다. 단백질은 enhanced chemiluminescent substrates (Amersham Pharmacia Biotech)로 검출하였다.
역전사 연쇄중합효소반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR))
RNA 을 RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 로 추출하였다. 각 샘플의 RNA (100 ng)는 BD Sprint PowerScript (Clontech, Mountain View, CA, USA)에 의해 cDNA로 전사 (transcribe)되었다. 하기의 프라이머를 사용하여 Mycycler thermal cycler (Bio-Rad)에서 Takara HS ExTaq DNA Polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan)로 증폭시켰다.
<사용한 프라이머>
- SEAP의 포워드 프라이머 (forward primer): 5'-GGTGAACCGCAACTGGTACT-3'; 서열번호 1
SEAP의 리버스 프라이머 (reverse primer): 5'-CATGAGATGGGTCACAGACG -3'; 서열번호 2
- 인간 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: GAPDH)의 포워드 프라이머 : 5'-TCA ACG GAT TTG GTC GTA TT-3'; 서열번호 3
인간 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소의 리버스 프라이머 :5'-CTG TGG TCA TGA GTC CTT CC-3'; 서열번호 4
본 발명에서 실험을 통해 얻은 데이터는 SigmaStat for Windows (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA)를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 데이터의 두 그룹을 비교하기 위해 Student't test를 수행하였다. 여러 그룹을 분석하기 위해서 Student-ewman-euls (SNK) 방법에 의한 쌍별 비교 (pairwise comparisons)와 ANOVA를 수행하였다.
실시예 1: HCT-8세포에서 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecenes)의 소포체 스트레스 유발 확인
본 발명에서는 탐지된 8-keto 트리코테센 (8-keto trichothecenes) [데옥시니발레놀 (deoxynivalenol (DON), 15-아세틸 DON (15-acetyl DON), 3-아세틸 DON (3-acetyl DON), 니발레놀 (nivalenol (NIV)) 및 4-아세틸 NIV (4-acetyl NIV)]의 eIF2α 인산화에 대한 주요 효과를 HCT-8 인간 소장 상피세포에서 확인하였다. 모든 트리코테센은 수분 내에 eIF2α인산화를 증가시켰다 (도 1A). 실험에 사용된 HCT-8는 주로 미생물의 감염과 염증 반응에 사용되는 인간 상피세포 모델이다. 또한 HCT-8 세포가 유래된 인간 소장의 회맹부위는 트리코테센 감염의 주요 타겟부분이다 (Avantaggiato et al., 2004; Obremski et al., 2008). 소포체 스트레스의 다른 대표적인 마커로서, GRP78, ATF6 및 IRE1α를 각각의 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecenes)의 존재 여부 평가에 사용하였다. 소포체 특이적인 샤페론 GRP78은 8-케토 트리코테센에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 1B). 또한 소포체 센서로서, 모든 독소에 의해 ATF6은 유도되었으며, IRE1α의 발현도 HCT-8 세포안에서 달라졌다.
실시예 2: 분비 단백질-기반 리포터를 안정적으로 발현하는 세포주 확인
소포체 스트레스에 세포들이 파괴된 단백질 합성, 접힘, 분비 및 분해를 함으로써 반응하기 때문에 세포 내 분비 기전의 감소는 소포체 스트레스의 주요 과정이다. 본 발명에서는 트리코테센으로 조절되는 소포체 스트레스를 모니터링하기 위해 SEAP 리포터를 사용하여 세포-기반 에세이 시스템을 개발하였다. SV40 프로모터로 활성된 SEAP 리포터 유전자로 플라스미드 (plasmid) 를 구성하였다. 또한 HCT-8 세포에서 안정적인 발현을 위해 하이그로마이신 선택 마커를 삽입하였다 (도 2A).
도입된 SEAP 유전자의 증폭을 위해 특정한 프라이머로 RT-PCR 함으로써 형질감염된 세포에서 SEAP mRNA 가 항시 생산됨을 확인하였다 (도 2B). 바이오 모니터링 에세이 (assay)의 양성 대조군으로써, 소포체 스트레스로 인해 생성되는 thapsigargin 물질을 SEAP 분비 억제 효과 확인을 위해 사용하였다. 감소된 SEAP 단백질의 감소는 바이오 모니터링 에세이에서 소포체 스트레스 물질의 화학적 양과 강한 상관관계를 가졌다 (도 2C).
트리코테센은 리보솜 기능을 방해함으로써 단백질 생합성을 억제한다는 점이 알려져 있으므로, 상기 모니터링법에서 SEAP의 변화가 독소에 의한 번역 (translation) 억제로 인한 것일 수도 있을 것이다. 따라서 이러한 가능성을 배제하기 위해 양성 대조군의 전체 단백질에 대한 SEAP의 활성 정도를 % 비율로 측정하였다.
또한 SEAP 활성은 전사 (transcription), 변화된 효소 활성과 같은 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명에서는 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecenes)을 SEAP mRNA 레벨의 억제 능력 측정을 위해 사용하였다 (도 3A).
그러나 새롭게 합성된 SEAP 전사물은 트리코테센 처리에 의해 억제되지 않았다. 니발레놀 (nivalenol) 또는 4-아세틸 니발레놀과 같은 트리코테센은 오히려 SEAP mRNA 레벨을 더 높였다. 또한 트리코테센 (DON 및 이의 유도체)은 SEAP의 효소적 활성 자체를 변화시키지 않았다 (도 3B).
즉, SEAP를 항시 분비하는 인간 소장 상피세포주는 외부 소포체 스트레스를 모니터링하기 위해 만들어졌으며, SEAP의 전사 및 효소적 활성은 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecenes) 곰팡이 독소에 영향을 받지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 8-케토 트리코테센 (8-keto trichothecenes) 소포체 스트레스 매개 SEAP 바이오 모니터링
8-케토 트리코테센은 소포체 스트레스를 유발하며, 독소로 유발된 세포반응은 SEAP리포터 활성을 측정하여 분석하였다. DON, 3-아세틸 DON (3-acetyl DON) 및 15-아세틸 DON (15-acetyl DON)은 농도 의존적으로 SEAP의 분비를 억제시켰으며, 독소의 양과 HCT-8 세포에서 SEAP의 활성은 음의 상관관계를 가졌다 (도 4A~4C). DON 노출의 상호관계는 강력한 회귀 계수 (r= -0.9978)로 나타났으며, 3-아세틸 DON 및 15-아세틸 DON에 따라 더 높은 결과를 얻었다. 세포-기반 바이오 모니터링법은 DON 및 이의 유도체와 유사한 패턴을 가지는 NIV 및 이의 유도체인 4-아세틸 니발레놀 (푸살레온-X, fusarenon X)에 의한 소포체 스트레스 확인에도 사용할 수 있었다 (도 4D 및 4E).
상기 바이오 에세이는 대조 용액인 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide (DMSO))에서 트리코테센을 사용하여 수행하였으므로, SEAP 활성 측정을 정확히 하기 위해 매트릭스 (matrix) 효과를 고려한 곡물 내 독소를 실험에 사용할 필요가 있었다.
대조 옥수수와 벼 곡물 추출물과 DON을 섞어 SEAP 모니터링에 사용하였다. 생물의 매트릭스 (matrix) 자체는 SEAP 활성능력을 가지고 있기 때문에 곡물 추출물에서의 기초 SEAP 활성레벨은 DMSO 용액에서보다 더 높았다.
곡물 매트릭스에서 DON 농도에 따른 SEAP 활성은 음의 상관관계를 가졌어도 표준 매트릭스에서 측정된 DON 양은 실제 독소의 양과 달랐으며, 매트릭스 효과 식을 유추해낼 수 있었다 (도 5). SESAP 에세이 시스템에서 DMSO 표준 매트릭스에 대한 옥수수 또는 벼의 상대적인 매트릭스 효과는 각각 0.70, 0.90 이었다. 매트릭스 효과를 고려하여 오염된 곡물 내 8-케토 트리코테센은 SEAP 모니터링 법을 사용하여 검출할 수 있다. 또한 상기 에세이의 최소 민감성은 4 ng/ml의 트리코테센으로, 이는 곡물에서 20 ppb DON 과 상응한다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> A method for detecting agent inducing endoplasmic reticulum stress <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for SEAP <400> 1 ggtgaaccgc aactggtact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for SEAP <400> 2 catgagatgg gtcacagacg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for human GAPDH <400> 3 tcaacggatt tggtcgtatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for human GAPDH <400> 4 ctgtggtcat gagtccttcc 20

Claims (14)

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  6. SV40 프로모터, 하이그로마이신 (hygromycin) 유전자 및 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 유전자로 구성된 분비형 알칼리 포스파타아제 발현 벡터;가 도입된, 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP)를 항시 발현하는 인간 상피 세포주;를 포함하는, 식품, 곡류 및 사료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 시료 내의 8-케토 트리코테센 검출용 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 6항에 있어서, 상기 8-케토 트리코테센은 데옥시니발레놀 (Deoxynivalenol, DON), 3-아세틸 DON, 15-아세틸 DON, 니발레놀 및 4-아세틸 니발레놀으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 8-케토 트리코테센 검출용 조성물.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 키트 또는 마이크로어레이 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는, 8-케토 트리코테센 검출용 조성물.
  10. (a) SV40 프로모터, 하이그로마이신 (hygromycin) 유전자 및 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 유전자로 구성된 분비형 알칼리 포스파타아제 발현 벡터;가 도입된, 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP)를 항시 발현하는 인간 상피 세포주;에 검사하고자 하는 식품, 곡류 및 사료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 시료를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 인간 상피 세포주에서 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP)의 분비가 억제되는지 여부를 관찰하는 단계;
    를 포함하는 8-케토 트리코테센의 검출 방법.
  11. 제 10항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 SEAP의 분비가 억제되면 시료가 8-케토 트리코테센에 오염되었다고 판단하는 단계;가 더 포함되는 것을 특징으로 하는, 8-케토 트리코테센의 검출 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 8-케토 트리코테센은 데옥시니발레놀 (Deoxynivalenol, DON), 3-아세틸 DON, 15-아세틸 DON, 니발레놀 및 4-아세틸 니발레놀으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 8-케토 트리코테센의 검출 방법.
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