【発明の詳細な説明】
Ｅ６結合タンパク質
［政府の助成］
本明細書に記載の業績は、米国国立衛生研究所交付番号第CM44174 号からの助
成によって部分的に支援された。したがって、合衆国政府は本発明に一定の権利
を有する。
［発明の背景］
乳頭腫ウイルス（ＰＶ）は、広く普及した、重篤なヒトの疾患、特に生殖器や
口腔の粘膜の癌腫に関連している。現在、生殖路のヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ
）感染症に罹患した数千万の女性が、近隣のどこかに存在すると推定される。こ
れらの女性の多くは、遂には子宮頚部の癌を発症する。例えば、世界中の女性の
癌死全体のうち約２０％は、ＨＰＶに付随する癌によると推定されている。子宮
頚癌全体のうち９０％がＨＰＶに関連するとも推定されている。
乳頭腫ウイルスは、皮膚または粘膜上皮の良性過増殖、異形成性過増殖および
悪性過増殖を誘発する［例えば、乳頭腫ウイルスの分子的、細胞的および臨床的
側面の総説については、MansurおよびAndrophy（1993）、Biochim．Biophys．Ac
ta、1,155 ：323 〜345 ；Pfister （1984）、Rev．Physiol．Biochem．Pharmac
ol．、99：111 〜181 ；ならびにBrokerら（1986）、Cancer Cells、４：17〜36
を参照されたい］。ほとんど７０種類のヒト乳頭腫ウイルスの類型が同定されて
おり、異なる乳頭腫ウイルスの類型が、別個の疾病を生じることが知られている
［Pfister （1987）、Adv．Cancer Res.、48：113 〜147 ；Syrjanen（1984）、
Obstet．Gynecol．Survey、39：252 〜265］。ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は
、扁平上皮の過増殖性病変（疣、コンジローム）、前癌性病変および悪性病変（
癌腫）に付随するＤＮＡ腫瘍ウイルスの一異種群である。例えば、ＨＰＶの１お
よび２型は、尋常性疣贅を生じ、６および１１型は、外性器、肛門および子宮頚
部の疣を生じる。ＨＰＶの１６、１８、３１および３３は、子宮頚癌全体の約５
０％に存在するＨＰＶ−１６による子宮頚癌の大部分から単離されている。こ
れらのＨＰＶは、「高危険性」と呼ばれる。ＨＰＶ６および１１は、子宮頚部の
疣の最も一般的な単離体であるが、これらの感染症が浸潤性の癌へと進行するこ
とは滅多になく、そのため、これらのＨＰＢは、「低危険性」と呼ばれる。
癌腫におけるウイルス遺伝子発現の研究は、悪性の発症の際の、ＨＰＶにコー
ドされる２種類のタンパク質、すなわちＥ６およびＥ７の重要性を示唆し、これ
らのタンパク質が、形質転換や不死化の活性をコードしていることを示した。２
種類のタンパク質は、アデノウイルスやＳＶ４０のような、他の小型のＤＮＡ腫
瘍ウイルスの形質転換タンパク質との多少の機能的類似を示す。Ｅ７は、機能お
よび構造上の特徴をアデノウイルスＥ１Ａと共有する。ＡｄＥ１Ａや、ポリオー
マウイルスの大型のＴタンパク質と同様に、Ｅ７はｐＲＢを複合させることがで
きる。同様に、「高危険性」ＨＰＶにコードされるＥ６腫瘍タンパク質は、ｐ５
３との複合体を形成できる。生体外では、Ｅ６タンパク質は、ｐ５３の分解を促
進し、この分解は、ユビキノン依存性プロテアーセ系を必要とする。ｐ５３調節
機能のような、細胞性負の調節タンパク質の選択的分解は、支配的な作用性腫瘍
タンパク質に対する作用の説明を与える。ヒト子宮頚部発癌の際のｐＲＢおよび
ｐ５３の正常な機能の不活化の関連性は、一連のＨＰＶ陽性およびＨＰＶ陰性細
胞系におけるこれら２遺伝子やそれらの産物の分析によって、最近立証されてい
る。これらの研究は、腫瘍サプレッサータンパク質であるｐＲＢやｐ５３の正常
な機能の不活化が、突然変異、またはＨＰＶＥ６やＥ７腫瘍タンパク質との複合
体形成のいずれかによる、ヒト子宮頚部発癌の重要な段階であるとの意見を裏付
ける。
［発明の要約］
本発明は、真核細胞、特にヒトの細胞における、乳頭腫ウイルス形質転換タン
パク質Ｅ６と、以後「Ｅ６結合タンパク質」または「Ｅ６−ＢＰ」と呼ぶ、ある
種の細胞性タンパク質との新規なタンパク質−タンパク質相互作用の発見に関す
る。
一般的には、本発明は、Ｅ６−ＢＰSD-7というポリペプチド、好ましくはＥ６
−ＢＰSD-7ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または組換えＥ６−ＢＰSD-7
ポリペプチドを特徴とする。好適実施態様では、該ポリペプチドは、生物学的活
性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質を特異的に結合し；該ポリペ
プチドは、配列番号８のアミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％以
上相同であるアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配
列と基本的に同じアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、長さが５、１０、２
０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該ポリペプチドは、配列番
号８からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上、より
好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；Ｅ６−ＢＰSD-7
ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば細胞増殖の調節の作動
体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、本発明は、拮抗体活性を有し、好ましくは、例えば内在性
Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑制でき；乳頭腫ウイ
ルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；アポプトーシスを遮断
または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞、例えば高危
険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３感染細
胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を阻害でき；乳頭腫ウ
イルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、
−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞
の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険
性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭
腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害できるＥ６結合タンパ
ク質を包含する。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-7ポリペプチドの１種類以上の生物学
的活性を有するペプチドは、配列番号８の配列とはアミノ酸配列が異なってよい
が、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の方式で
機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の特徴性を有
する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、第二のポリペプチド部分
、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質に無関係なアミノ酸
配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であって、例えば
第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであり；例えば
第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二のポリペプ
チド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タンパク質は、
二ハイブリッド検定法で機能性である。
配列番号８と相同なタンパク質の好適実施態様では、該タンパク質は、約５０
キロダルトン、例えば４５〜５５kDの範囲内、例えば４８〜５２kDの範囲内の分
子量を有する。
好適実施態様では、該ペプチドは、配列番号８の第１〜１３３残基からの１、
２、３または５個以上の、好ましくは１０、２０および３０個のアミノ酸残基を
有する。
本発明の更にもう一面は、免疫原性調製物中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む
免疫原に関し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答、例
えば体液性応答、例えば抗体応答；例えば細胞性応答を誘発できる。好適実施態
様では、該免疫原は、配列番号８で表されるタンパク質からの抗原決定基、例え
ば独自決定基を含む。
本発明のそれ以上の一面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープと特異的に反応す
る抗体調製物を特徴とする。
もう一面では、本発明は、Ｅ６−ＢＰSD-8ポリペプチド、好ましくはＥ６−Ｂ
ＰSD-8ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または組換えＥ６−ＢＰSD-8ポリ
ペプチドを特徴とする。好適実施態様では、該ポリペプチドは、生物学的活性を
有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質を特異的に結合し；該ポリペプチ
ドは、配列番号９のアミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％以上相
同であるアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列と
基本的に同じアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、長さが５、１０、２０、
５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該ポリペプチドは、配列番号９
からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上、より好ま
しくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；Ｅ６−ＢＰSD-8
ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば細胞増殖の調節の作動体か
、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、本発明は、拮抗体活性を有し、好ましくは、例えば内在性
Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑制でき；乳頭腫ウイ
ルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；アポプトーシスを遮断
または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞、例えば高危
険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３感染細
胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を阻害でき；乳頭腫ウ
イルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、
−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞
の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険
性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭
腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害できるＥ６結合タンパ
ク質を包含する。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-8ポリペプチドの１種類以上の生物学
的活性を有するペプチドは、配列番号９の配列とはアミノ酸配列が異なってよい
が、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の方式で
機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の特徴性を有
する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、第二のポリペプチド部分
、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質に無関係なアミノ酸
配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であって、例えば
第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであり；例えば
第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二のポリペプ
チド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タンパク質は、
二ハイブリッド検定法で機能性である。
本発明の更にもう一面は、免疫原性調製物中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む
免疫原に関し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答、例
えば体液性応答、例えば抗体応答；例えば細胞性応答を誘発できる。好適実施態
様では、該免疫原は、配列番号９で表されるタンパク質からの抗原決定基、例え
ば独自決定基を含む。
本発明のそれ以上の一面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエビトープと特異的に反応す
る抗体調製物を特徴とする。
もう一面では、本発明は、Ｅ６−ＢＰSD-12ポリペプチド、好ましくはＥ６−
ＢＰSD-12ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または組換えＥ６−ＢＰSD-12
ポリペプチドを特徴とする。好適実施態様では、該ポリペプチドは、生物学的活
性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質を特異的に結合し；該ポリペ
プチドは、配列番号１０のアミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％
以上相同であるアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ
酸配列と基本的に同じアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、長さが５、１０
、２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該ポリペプチドは、配
列番号１０からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上
、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；Ｅ６
−ＢＰSD-12ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば細胞増殖の調
節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、本発明は、拮抗体活性を有し、好ましくは、例えば内在性
Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑制でき；乳頭腫ウイ
ルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；アポプトーシスを遮断
または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞、例えば高危
険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３感染細
胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を阻害でき；乳頭腫ウ
イルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、
−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞
の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険
性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭
腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害できるＥ６結合タンパ
ク質を包含する。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-12ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有するペプチドは、配列番号１０の配列とはアミノ酸配列が異なって
よいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の方
式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の特徴性
を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、第二のポリペプチド部分
、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質に無関係なアミノ酸
配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であって、例えば
第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであり；例えば
第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二のポリペプ
チド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タンパク質は、
二ハイブリッド検定法で機能性である。
本発明の更にもう一面は、免疫原性調製物中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む
免疫原に関し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答、例
えば体液性応答、例えば抗体応答；例えば細胞性応答を誘発できる。好適実施態
様では、該免疫原は、配列番号１０で表されるタンパク質からの抗原決定基、例
えば独自決定基を含む。
本発明のそれ以上の一面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープと特異的に反応す
る抗体調製物を特徴とする。
もう一面では、本発明は、Ｅ６−ＢＰSD-16ポリペプチド、好ましくはＥ６−
ＢＰSD-16ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または組換えＥ６−ＢＰSD-16
ポリペプチドを特徴とする。好適実施態様では、該ポリペプチドは、生物学的活
性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質を特異的に結合し；該ポリペ
プチドは、配列番号１１のアミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％
以上相同であるアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ
酸配列と基本的に同じアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、長さが５、１
０、２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該ポリペプチドは、
配列番号１１からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以
上、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；Ｅ
６−ＢＰSD-16ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば細胞増殖の
調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、本発明は、拮抗体活性を有し、好ましくは、例えば内在性
Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑制でき；乳頭腫ウイ
ルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；アポプトーシスを遮断
または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞、例えば高危
険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３感染細
胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を阻害でき；乳頭腫ウ
イルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、
−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞
の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険
性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭
腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害できるＥ６結合タンパ
ク質を包含する。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-16ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有するペプチドは、配列番号１１の配列とはアミノ酸配列が異なって
よいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の方
式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の特徴性
を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、第二のポリペプチド部分
、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質に無関係なアミノ酸
配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であって、例えば
第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであり；例えば
第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二のポリペプ
チド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タンパク質は、
二ハイブリッド検定法で機能性である。
本発明の更にもう一面は、免疫原性調製物中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む
免疫原に関し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答、例
えば体液性応答、例えば抗体応答；例えば細胞性応答を誘発できる。好適実施態
様では、該免疫原は、配列番号１１で表されるタンパク質からの抗原決定基、例
えば独自決定基を含む。
本発明のそれ以上の一面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープと特異的に反応す
る抗体調製物を特徴とする。
もう一面では、本発明は、Ｅ６−ＢＰSD-22ポリペプチド、好ましくはＥ６−
ＢＰSD-22ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または組換えＥ６−ＢＰSD-22
ポリペプチドを特徴とする。好適実施態様では、該ポリペプチドは、生物学的活
性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質を特異的に結合し；該ポリペ
プチドは、配列番号１２のアミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％
以上相同であるアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ
酸配列と基本的に同じアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、長さが５、１０
、２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該ポリペプチドは、配
列番号１２からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上
、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；Ｅ６
−ＢＰSD-22ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば細胞増殖の調
節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、本発明は、拮抗体活性を有し、好ましくは、例えば内在性
Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑制でき；乳頭腫ウイ
ルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；アポプトーシスを遮断
または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞、例えば高危
険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３感染細
胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を阻害でき；乳頭腫ウ
イルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、
−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞
の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険
性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭
腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害できるＥ６結合タンパ
ク質を包含する。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-22ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有するペプチドは、配列番号１２の配列とはアミノ酸配列が異なって
よいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の方
式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の特徴性
を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、第二のポリペプチド部分
、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質に無関係なアミノ酸
配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であって、例えば
第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであり；例えば
第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二のポリペプ
チド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タンパク質は、
二ハイブリッド検定法で機能性である。
本発明の更にもう一面は、免疫原性調製物中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む
免疫原に関し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答、例
えば体液性応答、例えば抗体応答；例えば細胞性応答を誘発できる。好適実施態
様では、該免疫原は、配列番号１２で表されるタンパク質からの抗原決定基、例
えば独自決定基を含む。
本発明のそれ以上の一面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープと特異的に反応す
る抗体調製物を特徴とする。
もう一面では、本発明は、Ｅ６−ＢＰSD-28ポリペプチド、好ましくはＥ６−
ＢＰSD-28ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または組換えＥ６−ＢＰSD-28
ポリペプチドを特徴とする。好適実施態様では、該ポリペプチドは、生物学的活
性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質を特異的に結合し；該ポリ
ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５
％以上相同であるアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、配列番号１３のアミ
ノ酸配列と基本的に同じアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、長さが５、１
０、２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該ポリペプチドは、
配列番号１３からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以
上、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；Ｅ
６−ＢＰSD-28ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば細胞増殖の
調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、本発明は、拮抗体活性を有し、好ましくは、例えば内在性
Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑制でき；乳頭腫ウイ
ルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；アポプトーシスを遮断
または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞、例えば高危
険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３感染細
胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を阻害でき；乳頭腫ウ
イルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、
−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞
の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険
性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭
腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害できるＥ６結合タンパ
ク質を包含する。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-28ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有するペプチドは、配列番号１３の配列とはアミノ酸配列が異なって
よいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の方
式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の特徴性
を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、第二のポリペプチド部分
、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質に無関係なアミノ酸
配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であって、例えば
第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであり；例えば
第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二のポリペプ
チド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タンパク質は、
二ハイブリッド検定法で機能性である。
本発明の更にもう一面は、免疫原性調製物中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む
免疫原に関し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答、例
えば体液性応答、例えば抗体応答；例えば細胞性応答を誘発できる。好適実施態
様では、該免疫原は、配列番号１３で表されるタンパク質からの抗原決定基、例
えば独自決定基を含む。
本発明のそれ以上の一面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープと特異的に反応す
る抗体調製物を特徴とする。
もう一面では、本発明は、Ｅ６−ＢＰSD-32ポリペプチド、好ましくはＥ６−
ＢＰSD-32ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または組換えＥ６−ＢＰSD-32
ポリペプチドを特徴とする。好適実施態様では、該ポリペプチドは、生物学的活
性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質を特異的に結合し；該ポリペ
プチドは、配列番号１４のアミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％
以上相同であるアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ
酸配列と基本的に同じアミノ酸配列を有し；該ポリペプチドは、長さが５、１０
、２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該ポリペプチドは、配
列番号１４からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上
、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；Ｅ６
−ＢＰSD-32ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば細胞増殖の調
節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、本発明は、拮抗体活性を有し、好ましくは、例えば内在性
Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑制でき；乳頭腫ウイ
ルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；アポプトーシスを遮断
または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞、例えば高危
険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３感染細
胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を阻害でき；乳頭腫ウ
イルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、
−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞
の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険
性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭
腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害できるＥ６結合タンパ
ク質を包含する。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-32ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有するペプチドは、配列番号１４の配列とはアミノ酸配列が異なって
よいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の方
式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の特徴性
を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、第二のポリペプチド部分
、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質に無関係なアミノ酸
配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であって、例えば
第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであり；例えば
第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二のポリペプ
チド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タンパク質は、
二ハイブリッド検定法で機能性である。
本発明の更にもう一面は、免疫原性調製物中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む
免疫原に関し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答、例
えば体液性応答、例えば抗体応答；例えば細胞性応答を誘発できる。好適実施態
様では、該免疫原は、配列番号１４で表されるタンパク質からの抗原決定基、例
えば独自決定基を含む。
本発明のそれ以上の一面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープと特異的に反応す
る抗体調製物を特徴とする。
本発明のもう一面は、Ｅ６−ＢＰSD-7ポリペプチドをコードしているヌクレオ
チド配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好適実施態様では、コードさ
れるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパ
ク質を特異的に結合し；該コードされるポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸
配列と６０％、８０％、９０％または９５％以上相同であるアミノ酸配列を有し
；該コードされるポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列と基本的に同じア
ミノ酸配列を有し；該コードされるポリペプチドは、長さが５、１０、２０、５
０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該コードされるポリペプチドは、
配列番号８からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上
、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；コー
ドされるＥ６−ＢＰSD-7ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば細
胞増殖の調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、コードされるポリペプチドは、拮抗体活性を有し、好まし
くは、例えば内在性Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑
制でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；ア
ポプトーシスを遮断または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感
染細胞、例えば高危険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１
または−３３感染細胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）
による細胞の感染を阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性
ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫
ウイルスによる細胞の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨ
ＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３
３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害で
きる。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-7ポリペプチドの１種類以上の生物学
的活性を有する該コードされるペプチドは、配列番号８の配列とはアミノ酸配列
が異なってよいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしく
は類似の方式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類
似の特徴性を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、該コードされるポリペプチドは、第二のポリペプ
チド部分、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質に無関係な
アミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であって
、例えば第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであり
；例えば第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二の
ポリペプチド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タンパ
ク質は、二ハイブリッド検定法で機能性である。
その上、一定の好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-7核酸は、例えば、Ｅ
６−ＢＰSD-7遺伝子配列を発現ベクターとしての用途に適するようにするよう、
Ｅ６−ＢＰSD-7遺伝子配列に機能的に結合した転写調節配列、例えば転写プロモ
ーターまたは転写エンハンサーの少なくとも一方を含むことになる。
更にもう一つの好適実施態様では、本発明のＥ６−ＢＰSD-7ポリペプチドをコ
ードする核酸は、配列番号１の１２以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配
列番号１の２０以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配列番号１の４０以上
の連続ヌクレオチドに対応する核酸プローブと、緊縮条件下でハイブリッド形成
する。更にもう一つの好適実施態様では、Ｅ６−ＢＰコード核酸は、配列番号８
の第１〜１３３残基間の４以上の連続アミノ酸、より好ましくは１０以上の連続
アミノ酸、はるかに好ましくは２０以上のアミノ酸残基をコードしている部分配
列に対応する核酸プローブとハイブリッド形成する。
好適実施態様では、該核酸配列は、配列番号８の第１〜１３３アミノ酸残基を
コードしている配列番号１の領域からの１、２、３または５個以上の、好ましく
は１０、２０、５０または１００以上のヌクレオチドを有し；コードされるペプ
チドは、配列番号８の第１〜１３３アミノ酸残基からの１、２、３、５、１０、
２０または３０アミノ酸残基を有し；該ヌクレオチド配列は、配列番号１の第５
７２〜８７５ヌクレオチド残基以外であり、例えばそれより長いか、または短く
、異なる３’末端もしくは異なる５’末端を有する。
本発明のもう一面は、Ｅ６−ＢＰSD-8ポリペプチドをコードしているヌクレオ
チド配列を有する、実質的に純粋な核酸を提供する。好適実施態様では、コード
されるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タン
パク質を特異的に結合し；該コードされるポリペプチドは、配列番号９のアミノ
酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％以上相同であるアミノ酸配列を有
し；該コードされるポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列と基本的に同じ
アミノ酸配列を有し；該コードされるポリペプチドは、長さが５、１０、２０、
５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該コードされるポリペプチドは
、配列番号９からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以
上、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を含み；コ
ードされるＥ６−ＢＰSD-8ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活性、例えば
細胞増殖の調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、コードされるポリペプチドは、拮抗体活性を有し、好まし
くは、例えば内在性Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑
制でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；ア
ポプトーシスを遮断または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感
染細胞、例えば高危険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１
または−３３感染細胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）
による細胞の感染を阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性
ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫
ウイルスによる細胞の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨ
ＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３
３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害で
きる。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-8ポリペプチドの１種類以上の生物学
的活性を有する該コードされるペプチドは、配列番号９の配列とはアミノ酸配列
が異なってよいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一もしく
は類似の方式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類
似の特徴性を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、該コードされるポリペプチドは、第二のポリペプ
チド部分、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質とは無関係
なアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であっ
て、例えば第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであ
り；例えば第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二
のポリペプチド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タン
パク質は、二ハイブリッド検定法で機能性である。
その上、一定の好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-8核酸は、例えばＥ６
−ＢＰSD-8遺伝子配列を発現ベクターとしての用途に適するようにするよう、Ｅ
６−ＢＰSD-8遺伝子配列に機能的に結合した転写調節配列、例えば転写プロモー
ターまたは転写エンハンサーの配列の少なくとも一方を含むことになる。
更にもう一つの好適実施態様では、本発明のＥ６−ＢＰポリペプチドをコード
している核酸は、配列番号２の１２以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配
列番号２の２０以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配列番号２の４０以上
の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブと、緊縮条件下でハイブリッド形成
する。
本発明のもう一面は、Ｅ６−ＢＰSD-12ポリペプチドをコードしているヌクレ
オチド配列を有する、実質的に純粋な核酸を提供する。好適実施態様では、コー
ドされるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タ
ンパク質を特異的に結合し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１０のア
ミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％以上相同であるアミノ酸配列
を有し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列と基本的
に同じアミノ酸配列を有し；該コードされるポリペプチドは、長さが５、１０、
２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該コードされるポリペプ
チドは、配列番号１０からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは
２０個以上、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を
含み；コードされるＥ６−ＢＰSD-12ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活
性、例えば細胞増殖の調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、コードされるポリペプチドは、拮抗体活性を有し、好まし
くは、例えば内在性Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑
制でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；ア
ポプトーシスを遮断または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感
染細胞、例えば高危険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１
または−３３感染細胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）
による細胞の感染を阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性
ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫
ウイルスによる細胞の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨ
ＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３
３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害で
きる。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-12ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有する該コードされるペプチドは、配列番号１０の配列とはアミノ酸
配列が異なってよいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一も
しくは類似の方式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしく
は類似の特徴性を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、該コードされるポリペプチドは、第二のポリペプ
チド部分、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質とは無関係
なアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であっ
て、例えば第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであ
り；例えば第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二
のポリペプチド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タン
パク質は、二ハイブリッド検定法で機能性である。
その上、一定の好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-12核酸は、例えばＥ
６−ＢＰSD-12遺伝子配列を発現ベクターとしての用途に適するようにするよう
、Ｅ６−ＢＰSD-12遺伝子配列に機能的に結合した転写調節配列、例えば転写プ
ロモーターまたは転写エンハンサーの配列の少なくとも一方を含むことになる。
更にもう一つの好適実施態様では、本発明のＥ６−ＢＰポリペプチドをコード
している核酸は、配列番号３の１２以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配
列番号３の２０以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配列番号３の４０以上
の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブと、緊縮条件下でハイブリッド形成
する。
本発明のもう一面は、Ｅ６−ＢＰSD-16ポリペプチドをコードしているヌクレ
オチド配列を有する、実質的に純粋な核酸を提供する。好適実施態様では、コー
ドされるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タ
ンパク質を特異的に結合し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１１のア
ミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％以上相同であるアミノ酸配列
を有し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列と基本的
に同じアミノ酸配列を有し；該コードされるポリペプチドは、長さが５、１０、
２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該コードされるポリペプ
チドは、配列番号１１からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは
２０個以上、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を
含み；コードされるＥ６−ＢＰSD-16ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活
性、例えば細胞増殖の調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、コードされるポリペプチドは、拮抗体活性を有し、好まし
くは、例えば内在性Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑
制でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；ア
ポプトーシスを遮断または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感
染細胞、例えば高危険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１
または−３３感染細胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）
による細胞の感染を阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性
ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫
ウイルスによる細胞の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨ
ＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３
３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害で
きる。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-16ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有する該コードされるペプチドは、配列番号１１の配列とはアミノ酸
配列が異なってよいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一も
しくは類似の方式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしく
は類似の特徴性を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、該コードされるポリペプチドは、第二のポリペプ
チド部分、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質とは無関係
なアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であっ
て、例えば第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであ
り；例えば第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二
のポリペプチド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タン
パク質は、二ハイブリッド検定法で機能性である。
その上、一定の好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-16核酸は、例えばＥ
６−ＢＰSD-16遺伝子配列を発現ベクターとしての用途に適するようにするよう
、Ｅ６−ＢＰSD-16遺伝子配列に機能的に結合した転写調節配列、例えば転写プ
ロモーターまたは転写エンハンサーの配列の少なくとも一方を含むことになる。
更にもう一つの好適実施態様では、本発明のＥ６−ＢＰポリペプチドをコード
している核酸は、配列番号４の１２以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配
列番号４の２０以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配列番号４の４０以上
の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブと、緊縮条件下でハイブリッド形成
する。
本発明のもう一面は、Ｅ６−ＢＰSD-22ポリペプチドをコードしているヌクレ
オチド配列を有する、実質的に純粋な核酸を提供する。好適実施態様では、コー
ドされるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タ
ンパク質を特異的に結合し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１２のア
ミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％以上相同であるアミノ酸配列
を有し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列と基本的
に同じアミノ酸配列を有し；該コードされるポリペプチドは、長さが５、１０、
２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該コードされるポリペプ
チドは、配列番号１２からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは
２０個以上、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を
含み；コードされるＥ６−ＢＰSD-22ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活
性、例えば細胞増殖の調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、コードされるポリペプチドは、拮抗体活性を有し、好まし
くは、例えば内在性Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑
制でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；ア
ポプトーシスを遮断または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感
染細胞、例えば高危険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１
または−３３感染細胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）
による細胞の感染を阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性
ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫
ウイルスによる細胞の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨ
ＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３
３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害で
きる。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-22ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有する該コードされるペプチドは、配列番号１２の配列とはアミノ酸
配列が異なってよいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一も
しくは類似の方式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしく
は類似の特徴性を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、該コードされるポリペプチドは、第二のポリペプ
チド部分、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質とは無関係
なアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であっ
て、例えば第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであ
り；例えば第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二
のポリペプチド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タン
パク質は、二ハイブリッド検定法で機能性である。
その上、一定の好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-22核酸は、例えばＥ
６−ＢＰSD-22遺伝子配列を発現ベクターとしての用途に適するようにするよう
、Ｅ６−ＢＰSD-22遺伝子配列に機能的に結合した転写調節配列、例えば転写プ
ロモーターまたは転写エンハンサーの配列の少なくとも一方を含むことになる。
更にもう一つの好適実施態様では、本発明のＥ６−ＢＰポリペプチドをコード
している核酸は、配列番号５の１２以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配
列番号５の２０以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配列番号５の４０以上
の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブと、緊縮条件下でハイブリッド形成
する。
本発明のもう一面は、Ｅ６−ＢＰSD-28ポリペプチドをコードしているヌクレ
オチド配列を有する、実質的に純粋な核酸を提供する。好適実施態様では、コー
ドされるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タ
ンパク質を特異的に結合し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１３のア
ミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％以上相同であるアミノ酸配列
を有し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列と基本的
に同じアミノ酸配列を有し；該コードされるポリペプチドは、長さが５、１０、
２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該コードされるポリペプ
チドは、配列番号１３からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは
２０個以上、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を
含み；コードされるＥ６−ＢＰSD-28ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活
性、例えば細胞増殖の調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、コードされるポリペプチドは、拮抗体活性を有し、好まし
くは、例えば内在性Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑
制でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；ア
ポプトーシスを遮断または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感
染細胞、例えば高危険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１
または−３３感染細胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）
による細胞の感染を阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性
ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫
ウイルスによる細胞の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨ
ＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３
３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害で
きる。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-28ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有する該コードされるペプチドは、配列番号１３の配列とはアミノ酸
配列が異なってよいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一も
しくは類似の方式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしく
は類似の特徴性を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、該コードされるポリペプチドは、第二のポリペプ
チド部分、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質とは無関係
なアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であっ
て、例えば第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであ
り；例えば第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二
のポリペプチド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タン
パク質は、二ハイブリッド検定法で機能性である。
その上、一定の好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-28核酸は、例えばＥ
６−ＢＰSD-28遺伝子配列を発現ベクターとしての用途に適するようにするよう
、Ｅ６−ＢＰSD-28遺伝子配列に機能的に結合した転写調節配列、例えば転写プ
ロモーターまたは転写エンハンサーの配列の少なくとも一方を含むことになる。
更にもう一つの好適実施態様では、本発明のＥ６−ＢＰポリペプチドをコード
している核酸は、配列番号６の１２以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配
列番号６の２０以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配列番号６の４０以上
の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブと、緊縮条件下でハイブリッド形成
する。
本発明のもう一面は、Ｅ６−ＢＰSD-32ポリペプチドをコードしているヌクレ
オチド配列を有する、実質的に純粋な核酸を提供する。好適実施態様では、コー
ドされるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タ
ンパク質を特異的に結合し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１４のア
ミノ酸配列と６０％、８０％、９０％または９５％以上相同であるアミノ酸配列
を有し；該コードされるポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列と基本的
に同じアミノ酸配列を有し；該コードされるポリペプチドは、長さが５、１０、
２０、５０、１００または１５０アミノ酸以上であり；該コードされるポリペプ
チドは、配列番号１４からの５個以上、好ましくは１０個以上、より好ましくは
２０個以上、より好ましくは５０、１００または１５０個以上の隣接アミノ酸を
含み；コードされるＥ６−ＢＰSD-32ポリペプチドは、Ｅ６−ＰＢの生物学的活
性、例えば細胞増殖の調節の作動体か、拮抗体かのいずれかである。
好適実施態様では、コードされるポリペプチドは、拮抗体活性を有し、好まし
くは、例えば内在性Ｅ６−ＢＰが誤発現されている腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑
制でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感染細胞の増殖を抑制でき；ア
ポプトーシスを遮断または誘導でき；乳頭腫ウイルス感染細胞、例えばＨＰＶ感
染細胞、例えば高危険性ＨＰＶ感染細胞、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１
または−３３感染細胞、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の増殖を
阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰ
Ｖ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）
による細胞の感染を阻害でき；乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ、例えば高危険性
ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３３、例えばウシ乳頭腫
ウイルスによる細胞の形質転換を阻害でき；あるいは乳頭腫ウイルス、例えばＨ
ＰＶ、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、−１８、−３１または−３
３、例えばウシ乳頭腫ウイルスによる細胞、例えばヒトの細胞の不死化を阻害で
きる。
好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-32ポリペプチドの１種類以上の生物
学的活性を有する該コードされるペプチドは、配列番号１４の配列とはアミノ酸
配列が異なってよいが、そのような差異は、本来のＥ６結合タンパク質と同一も
しくは類似の方式で機能するか、または本来のＥ６結合タンパク質と同一もしく
は類似の特徴性を有する、修飾されたタンパク質を生じる。
更に別の好適実施態様では、該コードされるポリペプチドは、第二のポリペプ
チド部分、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表されるタンパク質とは無関係
なアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質であっ
て、例えば第二のポリペプチド部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼであ
り；例えば第二のポリペプチド部分は、ＤＮＡ結合ドメインであり；例えば第二
のポリペプチド部分は、ポリメラーゼ活性化ドメインであり；例えば該融合タン
パク質は、二ハイブリッド検定法で機能性である。
その上、一定の好適実施態様では、主題のＥ６−ＢＰSD-32核酸は、例えばＥ
６−ＢＰSD-32遺伝子配列を発現ベクターとしての用途に適するようにするよう
、Ｅ６−ＢＰSD-32遺伝子配列に機能的に結合した転写調節配列、例えば転写プ
ロモーターまたは転写エンハンサーの配列の少なくとも一方を含むことになる。
更にもう一つの好適実施態様では、本発明のＥ６−ＢＰポリペプチドをコード
している核酸は、配列番号７の１２以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配
列番号７の２０以上の連続ヌクレオチド；より好ましくは配列番号７の４０以上
の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブと、緊縮条件下でハイブリッド形成
する。
本発明は、トランス遺伝子を有するトランスジェニックな、ヒトではない動物
、例えばマウス、ラット、ウサギまたはブタ、例えば、本明細書に記載の新規Ｅ
６−ＢＰ遺伝子、例えばヒトに由来する遺伝子、または内在性Ｅ６−ＢＰ遺伝子
を誤発現する遺伝子のうち一つの異種形態を有する（かつ好ましくは発現する）
動物、例えば、主題のＥ６−ＢＰのうち一つまたはそれ以上の発現が混乱してい
る動物を特徴とする。そのようなトランスジェニック動物は、突然変異したか、
または誤発現されたＥ６−ＢＰ対立遺伝子を含む細胞性疾患を研究するための、
あるいは薬物のふるい分けに用いるための動物モデルとして役立て得る。
本発明は、配列番号１〜７のうち一つ、または天然に産するその突然変異体の
センスもしくはアンチセンス配列の１０個以上の連続ヌクレオチドと緊縮条件下
でハイブリッド形成する、ヌクレオチド配列の領域を含む実質的に精製されたオ
リゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーも提供する。好適実施態様では、
該プローブ／プライマーは、それに結合した、かつ検出できる標識基を更に有す
る。標識基は、例えば、放射性同位元素、蛍光性化合物、酵素および酵素補因子
よりなる群から選ぶことができる。本発明のプローブは、形質転換した細胞を同
定するための、例えば、患者から単離した細胞の試料で、主題のＥ６結合タンパ
ク質のうち１種類をコードしている核酸のレベルを測定するため；例えば細胞中
のＥ６−ＢＰｍＲＮＡレベルを測定するため；例えば、ゲノムのＥ６−ＢＰ遺伝
子が変異または欠失しているか否かを決定するための診断用試験キットの一部と
して用いることができる。好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、長さが１０ヌ
クレオチド以上で、２０、３０、５０、１００または１５０ヌクレオチド未満で
ある。
更にもう一面では、本発明は、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質とのＥ６−ＢＰ
ポリペプチドの相互作用、例えば阻害について試験化合物をふるい分けるための
検定法を提供する。この方法は、（ｉ）例えば、試験化合物の不在下では、Ｅ６
タンパク質とＥ６結合タンパク質とが作用し合える条件下で、ウイルスのＥ６タ
ンパク質、すなわちＥ６−ＢＰ、例えば本発明のＥ６−ＢＰ（例えば群ＳＤ−７
、ＳＤ−８、ＳＤ−１２、ＳＤ−１６、ＳＤ−２２、ＳＤ−２８もしくはＳＤ−
３２、またはケラチン−１７、アポフェリチン、ヌクレオホサミン、リボ核タン
パク質、プロテアソームサブユニット、補体崩壊促進因子）と試験化合物とを結
合する段階；ならびに（ii）Ｅ６タンパク質およびＥ６結合タンパク質を含む複
合体の形成を検出する段階を包含する。試験化合物の存在下での複合体形成にお
ける（試験化合物の不在下で見られるものと比しての）変化、例えば低下が、Ｅ
６タンパク質とＥ６結合タンパク質との相互作用の変調、例えば阻害を示す。好
適実施態様では、Ｅ６タンパク質は、例えば高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１
６、−１８、−３１または−３３からの、ＨＰＶのＥ６タンパク質であり；Ｅ６
タンパク質は、ＢＰＶのＥ６タンパク質であり；Ｅ６タンパク質およびＥ６結合
タンパク質を、無細胞系で結合させ、試験化合物と接触させる；すなわち、無細
胞系は、細胞溶解物および再構成タンパク質混合物よりなる群から選び；Ｅ６結
合タンパク質を細胞中で同時に発現させ、細胞を試験化合物と接触させ、例えば
、Ｅ６結合タンパク質は、相互作用トラップ検定法（二ハイブリッド検定法）を
構成する。
本発明は、１種類またはそれ以上の主題のＥ６結合タンパク質の野生型の機能
の喪失を特徴とする、望ましくない細胞増殖を有する動物を治療する方法であっ
て、Ｅ６結合タンパク質と他の細胞性またはウイルス性タンパク質との相互作用
を阻害できる治療的有効量の薬剤を投与することを含む方法も提供する。一実施
態様では、この方法は、配列番号８〜１４のうち一つで表されるポリペプチドを
コードしている核酸構成体を、そのＥ６結合タンパク質を欠く細胞によって該構
成体が組み込まれる条件下で、およびこの組換え遺伝子が、例えば遺伝子療法の
方法で発現される条件下で投与することを含む。
本発明のもう一面は、被験者、例えばヒトの患者に、望ましくない細胞増殖を
特徴とする疾患の危険性があるかを決定する方法を提供する。この方法は、被験
者の組織中での、（ｉ）配列番号８〜１４のうち一つで示されるタンパク質もし
くはその同族体をコードしている遺伝子の突然変異；または（ii）配列番号８〜
１４のうち一つで表されるタンパク質をコードしている遺伝子の誤発現のうち少
なくとも一方を特徴とする遺伝的病変の存否を検出することを包含する。好適実
施態様では、遺伝的病変を検出することは、Ｅ６−ＢＰ遺伝子の１個もしくはそ
れ以上のヌクレオチドの欠失；該遺伝子への１個もしくはそれ以上のヌクレオチ
ドの付加、該遺伝子の１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、該遺伝子の
染色体上の大規模な配置転換；該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベル
の変化；該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパタ
ーンの存在；または非野生型レベルの該タンパク質のうち少なくとも一つの存在
を確認することを包含する。
例えば、遺伝的病変を検出することは、（ｉ）配列番号１〜７のうち一つ、ま
たは天然に産するその突然変異体のセンスもしくはアンチセンス配列とハイブリ
ッド形成するヌクレオチド配列の領域、またはＥ６−ＢＰ遺伝子に天然に付随す
る５’もしくは３’フランキング配列を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ
／プライマーを与えること；（ii）該プローブ／プライマーを該組織の核酸と接
触させること；および（iii）該プローブ／プライマーと該核酸とのハイブリッ
ド形成によって、該遺伝的病変の存否をを検出することを包含できるが、例えば
、ここで該病変の検出は、該プローブ／プライマーを用いて、Ｅ６−ＢＰ遺伝子
および、任意には、該フランキング核酸配列のヌクレオチド配列を決定すること
を含み；例えば、ここで該病変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で該
プローブ／プライマーを用いることを含み；例えば、ここで該病変の検出は、結
合連鎖反応（ＬＣＲ）で該プローブ／プライマーを用いることを含む。代替的実
施態様では、該タンパク質のレベルは、例えば配列番号８〜１４のうち一つで表
されるタンパク質と、特異的に免疫反応性である抗体を用いる免疫検定法法で検
出する。
本発明の実施は、別途指示されない限り、当技術の技量の範囲内にある細胞生
物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤ
ＮＡおよび免疫学の慣用の手法を用いることになる。そのような手法は、文献中
に充分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、
第２版、Sambrook，Fritsch およびManiatis編（Cold Spring Harbor Laborator
y Press ：1989）；DNA Cloning，Volumes I and II （D.N．Glover 編、1985）
；Oligonucleotide Synthesis （M.J．Gait 編、1984） ；Mullisら、米国特許
第4,683,195 号明細書；Nucleic Acid Hybridization（B.D．HamesおよびS.J．H
iggins編、1984）；Transcription And Translation （B.D．HamesおよびS.J．H
iggins編、1984）；Culture Of Animal Cells （R.I．Freshney、Alan R．Liss
，Inc.、1987）；Immobilized Cells And Enzymes （IRL Press、1986）；B．Pe
rbal、A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）；The Treatise、Meth
ods In Enzymology （Academic Press，Inc.，N.Y.）；Gene Transfer Vectors
For Mammalian Cells （J.H．Miller およびM.P．Calos編、1987、Cold Spring
Harbor Laboratory）；Methods In Enzymology、Vols．154 & 155 （Wuら編）、
Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（Mayer およびWalker
編、Academic Press，London、1987）；Handbook Of Experimental Immunology
、Volumes I-IV（D.M．Weir およびC.C．Blackwell編、1986）；Manipulating t
he Mouse Embryo （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbo
r、ニューヨーク、1986）を参照されたい。
本発明のその他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および請求の範囲から
明白になると思われる。
［図面の説明］
図１は、二ハイブリッド検定法での発現のためにＶＰ１６／ｃＤＮＡ融合遺伝
子を構築するのに用いられるｐＲＳ３０６プラスミド［Sikorskiら（1989）、Ge
netics、122 ：19］の概略マップである。
［発明の詳細な説明］
乳頭腫ウイルス（ＰＶ）は、それらの天然の宿主に良性の上皮腫瘍、すなわち
疣を生起できる、感染性因子である。ヒトの癌の分野に特に関連するもののうち
、特異的なヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）による感染は、子宮頚部、性器、皮膚
および、より低頻度で、その他の部位のそれをはじめとする、ヒト上皮の悪性腫
瘍の発症に付随している。乳頭腫ウイルスが生産する形質転換タンパク質のうち
２種類、すなわちＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質は、それぞれ、腫瘍サプ
レッサー遺伝子ｐ５３およびＲｂと複合体を形成し、これらのウイルスタンパク
質が、細胞増殖の制御を調節する決定的な経路を通じてそれらの機能を発揮し得
ることを示している。
しかし、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質による不死化についての本発明者らの
研究は、ｐ５３の結合は、有効な不死化に必要であるが、Ｅ６タンパク質は、不
死状態の確立の際に追加的特性を有することを示す。その上、本発明者らの知見
は、ＢＰＶおよび「低危険性」ＨＰＶのＥ６タンパク質はともに、高危険性ＨＰ
ＶのＥ６タンパク質に共通する一つまたはそれ以上の機能を有することを示唆す
る。本発明者らは、ウイルスのＥ６腫瘍タンパク質と作用し合い、ＰＶの感染性
および／または形質転換に参加する候補となるタンパク質であり得る、その他の
ヒトの細胞性タンパク質を同定するように、二ハイブリッド検定法［米国特許願
第5,283,173 号明細書］を適合させた。
そのＣ末端でＢＰＶのＥ２ＤＮＡ結合ドメインに融合したＨＰＶ−１６のＥ６
遺伝子を発現し、更に、４種類のＥ２結合要素を有するプロモーターによって推
進されるｌａｃＺリポーター構成体を含む、酵母の菌株から開始して、本発明者
らは、ヒトｃＤＮＡライブラリーをふるい分けるための二ハイブリッド検定法を
創作した。次いで、この菌株を、ランダムに始動したＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡを
挿入した酵母のシャトルベクタープラスミドのライブラリーで、強力なＶＰ１６
転写活性化ドメインへとＣ末端で形質転換した。ＶＰ１６／ｃＤＮＡ融合タンパ
ク質とＥ６／Ｅ２ハイブリッドタンパク質との相互作用は、ＶＰ１６転写活性化
ドメインをＥ２結合部位に補充し、ｌａｃＺ遺伝子の発現を活性化すると思われ
た。これは、Ｅ６と特異的に作用し合うタンパク質をコードする多数のヒト遺伝
子を好成績で単離することに導いた。そのため、本発明は、後述するとおり、腫
瘍サプレッサータンパク質「ｐ５３」および細胞性タンパク質「Ｅ６−ＡＰ」に
加えて、乳頭腫ウイルス形質転換タンパク質Ｅ６も、他のいくつかの細胞性タン
パク質（以後、「細胞性Ｅ６結合タンパク質」または「Ｅ６−ＢＰ」と呼ぶ）と
会合していて、この会合が、乳頭腫ウイルスの感染と、乳頭腫ウイルスに媒介さ
れる病的状態との病態形成におそらく重要なのであるとの発見から、部分的には
派生している。例えば、主題Ｅ６結合タンパク質のうち１種類とＥ６との会合は
、いずれかまたは両方のタンパク質の局在性の変化、そのタンパク質の生物学的
活性の変化、そのタンパク質の細胞半減期の変更、またはそれらの組合せを招く
ことができる。したがって、本発明の実施態様は、診断および治療用の検定法、
ならびに乳頭腫ウイルス感染細胞を検出かつ治療するための試薬を利用可能にす
る。
例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質に結合し、それによって、Ｅ６−ＢＰ
／Ｅ６複合体の阻害を通じて、乳頭腫ウイルスによる感染、形質転換および／ま
たは不死化を阻害できる、特定のＥ６結合タンパク質の能力を変化させる、例え
ば低下させる薬剤を同定する検定法の基盤として、主題のＥ６−ＢＰのそれぞれ
を用いることができる。そのような薬剤は、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス、例え
ばＨＰＶ−１、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−３、ＨＰＶ−４、ＨＰＶ−５、ＨＰＶ−６
、ＨＰＶ−７、ＨＰＶ−８、ＨＰＶ−９、ＨＰＶ−１０、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ
−１２、ＨＰＶ−１４、ＨＰＶ−１３、ＨＰＶ−１５、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−
１７またはＨＰＶ−１８、特に高危険性ＨＰＶ、例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−
１８、ＨＰＶ−３１およびＨＰＶ−３３に感染した細胞でのＥ６−ＢＰ／Ｅ６複
合体を治療的に防止する用途があり得る。そのような細胞を、１種類またはそれ
以上のＥ６−ＢＰ／Ｅ６複合体の形成を変化させる薬剤と接触させることは、乳
頭腫ウイルス感染の病理学的進行を阻害して、例えば、疣、例えば足底疣贅（ve
rruca plantaris）、尋常性疣贅（扁平疣verruca plana）、肉屋の尋常性疣贅、
扁平疣、性器疣贅（尖圭コンジローム）または疣状表皮異形成の形成を防止また
は逆転し；形質転換および／もしくは不死化したか、またはその危険性がある乳
頭腫ウイルス細胞、例えば癌性の、例えば喉頭乳頭腫、巣状上皮癌、子宮頚癌を
治療することができる。
一実施態様では、細胞性Ｅ６結合タンパク質はサイトケラチンであり、サイト
ケラチンへのＥ６結合タンパク質の結合は、例えば、サイトケラチン細胞間質の
崩壊、細胞外被の破壊、感染上皮組織の空間的構成の破壊、および／またはＰＶ
感染細胞による巣状接着の喪失に寄与し得る。好適実施態様では、サイトケラチ
ンはケラチン−１７である。そのため、Ｅ６／サイトケラチン相互作用の破壊は
、例えば感染細胞からのウイルス粒子の放出を左右することによって、および、
例えば扁平上皮、例えば層状扁平上皮の、例えばケラチノサイトの上皮性表現型
のＰＶで誘発される変化を防ぐことによって、乳頭腫ウイルスの感染性に影響す
る可能性がある。
もう一つの実施態様では、細胞性Ｅ６結合タンパク質は、例えば転写調節、ｍ
ＲＮＡのプロセシング、ｍＲＮＡの局在性、またはリボソームの成熟などの細胞
増殖に関与する仁タンパク質であり、この仁タンパク質への乳頭腫ウイルスＥ６
の結合は、これらの機能のうち一つの変化、Ｅ６の仁局在性および／または仁の
構成の変化を招く。好適実施態様では、この仁タンパク質は、例えばGenBank 受
託番号第X16934号で示される配列を有する、ヌクレオホスミンである。
更にもう一つの実施態様では、細胞性Ｅ６結合タンパク質は、アポフェリチン
、好ましくはGenBank 受託番号第X00318号で与えられる配列を有するアポフェリ
チンである。アポフェリチンというタンパク質へのＥ６の結合は、例えば、ＰＶ
に感染した細胞での酸化的事象の調節を変えて、例えば、酸化体損傷に応答でき
る細胞の能力を変えることができる。アポフェリチンの結合は、新生物性の形質
転換に、例えば細胞が危機に陥るのに重要なその他の細胞性タンパク質、例えば
熱ショックタンパク質の発現を、直接的にであれ、細胞の酸化的状態の変化を通
じてであれ、変えることができる。その上、Ｅ２の発現やＤＮＡの複製によるウ
イルス遺伝子の転写活性および抑制は、細胞内酸化還元環境の変化によって変調
されることが示唆されている。したがって、この相互作用を阻害する薬剤は、乳
頭腫ウイルスによる感染および／または形質転換を防止するのに役立ち得る。
もう一つの実施態様では、細胞性Ｅ６結合タンパク質は、核のリボ核タンパク
質、好ましくは、ＡＴＣＣ受託番号第M16342号で与えられるような核のリボ核タ
ンパク質粒子ＣのＣタンパク質、または、代替的には、GenBank 受託番号第X124
66号で示されるようなリボ核タンパク質である。ＲＮＡプロセシング反応に関与
する一定のタンパク質とのＥ６の会合は、ＲＮＡスプライシングの転写後調節に
よる細胞性および／またはウイルス性遺伝子の直接的調節を包含する、Ｅ６につ
いての役割を示唆する。Ｅ６とのそのような相互作用のもう一つの役割は、核内
へのＥ６の封鎖を生じることによって、タンパク質に対する核局在化シグナルを
与えることであり得る。そのような相互作用も、乳頭腫ウイルスによる感染およ
び／または形質転換の阻害剤のための潜在的な治療標的となり得る。
更にもう一つの実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、GenBank 受託番号第M1
5799号で示されるような補体崩壊促進因子である。
更にもう一つの実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、プロテアソームサブユ
ニット、例えば、GenBank 受託番号第D00762号で示されるプロテアソームサブユ
ニットＨＣ８である。プロテアソームサブユニットへのＥ６の結合は、Ｅ６に結
合したタンパク質、例えばｐ５３の分解を促進および／または強化するために、
プロテアーゼ複合体をＥ６に関与するその他の複合体へと補充する機序を与え得
る。
Ｅ６と、既にクローン化されている細胞性タンパク質との相互作用の発見に加
えて、本明細書では、多数の新規タンパク質を、Ｅ６結合能を有するとして同定
する。これらのタンパク質へのＥ６の結合は、例えばこれらのタンパク質の細胞
性機能の変化、および／またはＥ６タンパク質やＥ６−ＢＰの一方もしくは双方
の局在性の変化を生じることがあり得る。したがって、これらの一定のタンパク
質の正常な細胞での役割のすべての面が充分に解明されているわけではないが、
これらのタンパク質が、ウイルス性Ｅ６タンパク質に結合すること、およびＥ６
が、乳頭腫ウイルスによる感染の病理学に決定的であることは、これらのタンパ
ク質のそれぞれとＥ６との相互作用が、例えばＨＰＶ感染を標的とするのに役立
つ、薬剤を開発するための潜在的な治療標的を提供することを示す。
例えば、一実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、配列番号８（クローンＳＤ
−７）で示されるタンパク質配列、例えば、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質を結
合させるポリペプチドを包含し；例えば、Ｅ６−ＢＰは、一つまたはそれ以上の
カルシウム結合モチーフ、例えばＥＦの手のモチーフを含み；例えばＥ６−ＢＰ
は、ＥＲ／ゴルジ横断局在化シグナル、例えばカルボキシル末端His-Asp-Glu-Le
u （ＫＤＥＬ）配列を含む。
もう一つの実施態様では、Ｅ６結合タンパク質は、分子的シャペロンタンパク
質のヒトの相同体、例えば配列番号１２（クローンＳＤ−２２）で示されるヒト
シャペロン１０タンパク質である。
その他の好適実施態様では：Ｅ６結合タンパク質は、配列番号９、１０、１１
、１３または１４（それぞれ、クローンＳＤ−８、ＳＤ−１２、ＳＤ−１６、Ｓ
Ｄ−２８およびＳＤ−３２）のうち一つで表されるポリペプチド、例えば乳頭腫
ウイルスＥ６タンパク質を結合するポリペプチドを含む。
本発明のもう一面は、主題のＥ６結合タンパク質のうち一つをコードしている
ヌクレオチド配列、および／またはそのような核酸の等価物を含む単離された核
酸に関する。本明細書で用いる限りで、核酸という用語は、フラグメントおよび
等価物を包含する。等価物という用語は、機能的に等価のＥ６結合タンパク質、
または機能的に等価の、例えばＥ６に結合できる能力を保持し、かつ本明細書に
記載のようなＥ６−ＢＰのその他の活性を更に保持してよいペプチドをコードし
ているヌクレオチド配列を包含するものとする。等価のヌクレオチド配列は、１
個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または削除によって異なる、配列
、例えば対立遺伝子変異型を包含することになり；そのため、遺伝暗号の縮重の
ために、配列番号１〜７のいずれかに示されるＥ６結合タンパク質ヌクレオチド
配列と異なる配列を包含することになる。等価物は、配列番号１〜７に示される
本請求のＥ６結合タンパク質のヌクレオチド配列と、またはｐＲＳ３０６−Ｅ６
ＢＰライブラリー（ＡＴＣＣ受託番号第75827 号）からのＥ６結合タンパク質の
ヌクレオチド配列と、緊縮条件（すなわち、約１モルの塩中に形成されるＤＮＡ
二重らせんの融点（Ｔm）より約２０〜２７℃低い温度と同等）の下でハイブリ
ッド形成するヌクレオチド配列も包含することになる。一実施態様では、等価物
は、配列番号１〜７のいずれかに示されるヌクレオチド配列に由来し、かつそれ
と進化論上類縁関係にあるヌクレオチド配列も包含することになる。
その上、一定の状況下では、該タンパク質の天然に産する形態の生物学的活性
の一サブセットのみを促進または阻害するために、Ｅ６−ＢＰ作動体またはＥ６
−ＢＰ拮抗体のいずれか一方としての限定された能力において機能する、主題の
Ｅ６結合タンパク質の相同体を提供することが好都合であり得ることが、一般的
に認識されると思われる。すなわち、あるＥ６結合タンパク質の生物学的活性の
すべてに指向された作動体または拮抗体の投与に比して、限定された機能を有す
るか、またはより少ない副作用を有する相同体の投与によって、特異的な生物学
的効果が誘発できる。
主題のＥ６結合タンパク質のそのような相同体は、突然変異誘発、例えば離散
点突然変異または断端によって生成できる。例えば、突然変異は、それが由来す
るＥ６−ＢＰの生物学的活性と実質的に同じか、またはサブセットにすぎない活
性を保持する相同体を出現させることができる。これに代えて、該タンパク質の
天然に産する形態の機能を、例えばＥ６に競合的に結合することによって、阻害
できる該タンパク質の拮抗体形態を生成することができる。
タンパク質は、下記の特性のうち一つまたはそれ以上を有するならば、Ｅ６−
ＢＰの生物学的活性を有する：真核細胞、例えば哺乳類の細胞、例えばヒトの細
胞の増殖／細胞増殖を変調できる能力；乳頭腫ウイルス、例えばヒト乳頭腫ウイ
ルスによる感染、例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１もしくはＨ
ＰＶ−３３による感染の有効性を変調できる能力；細胞の形質転換、例えばＰＶ
媒介形質転換、例えばＰＶ媒介形質転換、例えば高危険性ＨＰＶ媒介形質転換の
有効性を左右できる能力；細胞の不死化、例えばＰＶ媒介形質転換、例えばＨＰ
Ｖ媒介形質転換、例えば高危険性ＨＰＶ媒介不死化の有効性を左右できる能力；
またはＰＶのＥ６タンパク質、例えばＨＰＶのＥ６タンパク質、例えば高危険性
ＨＰＶのＥ６タンパク質を結合できる能力。また、タンパク質は、上記の特性の
うち一つの特異的な作動体または拮抗体であるならば、生物学的活性を有する。
本明細書で用いる限りで、用語「遺伝子」または「組換え遺伝子」は、本発明
のあるＥ６結合タンパク質をコードしている、エキソンおよび（場合により）イ
ントロン配列をともに包含する開放読み忰を含む核酸を意味する。「組換え遺伝
子」は、あるＥ６結合タンパク質をコードし、Ｅ６−ＢＰコード化エキソンを含
む核酸を意味するが、場合により、染色体Ｅ６−ＢＰ遺伝子、または無関係な染
色体遺伝子のいずれかに由来するイントロン配列を包含してよい。主題のＥ６結
合タンパク質をコードしている例示的組換え遺伝子は、配列番号１〜７のいずれ
か一つで示される。その上、主題のＥ６結合タンパク質のそれぞれをコードして
いる組換え遺伝子は、下記のとおり、ＡＴＣＣ寄託物第75827 号から単離できる
。用語「イントロン」は、タンパク質に翻訳されず、一般的にはエキソン間に見
出される、所定のＥ６−ＢＰ遺伝子中に存在するＤＮＡ配列を意味する。
本明細書で用いる限りで、用語「（核酸）移入」は、核酸に媒介される遺伝子
の転移による、受容体細胞への核酸、例えば発現ベクターの導入を意味する。本
明細書で用いる限りで、「形質転換」は、外来性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞性取
り込みの結果として、細胞の遺伝子型が変えられる過程を意味し、例えば、形質
転換された細胞は、組換え形態の本発明のＥ６結合タンパク質を発現するか、ま
たは、転移された遺伝子からアンチセンス発現が生じる場合は、天然に産する形
態のＥ６結合タンパク質の発現が破壊される。
本明細書で用いる限りで、用語「ベクター」は、それに結合させたもう一つの
核酸を輸送できる核酸分子を意味する。好適なベクターの一類型は、エピソーム
、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好適なベクターは、それに結合さ
せた核酸の自動複製および／発現が可能なそれである。それに機能的に結合させ
た遺伝子の発現を支配できるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ば
れる。一般に、組換えＤＮＡの手法に役立つ発現ベクターは、そのベクターの形
態では染色体に結合されていない、環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラ
スミド」の形態であることが多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベク
ター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であるため、互
換性を有して用いられる。しかし、本発明は、同等の機能に役立ち、今後は当技
術に公知となる、そのような他の形態の発現ベクターも包含するものとする。
「転写調節配列」は、それらに機能的に結合されたタンパク質コード化配列の
転写を誘発または制御するＤＮＡ配列、例えば開始シグナル、エンハンサーおよ
びプロモーターを指すために、本明細書に終始用いられる包括的用語である。好
適実施態様では、組換えＥ６−ＢＰ遺伝子の転写は、そこで発現させようとする
細胞型での組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調
節配列）の制御下にある。該組換え遺伝子は、天然に産する形態のＥ６結合タン
パク質の転写を制御する配列と同じであるか、または異なる転写調節配列の制御
下にあり得ることも、理解されるものと思われる。
本明細書で用いる限りで、用語「組織特異性プロモーター」は、プロモーター
として役立つ、すなわちそのプロモーターに機能的に結合された、選ばれたＤＮ
Ａ配列の発現を調節し、組織の特異的な細胞、例えば上皮系統の細胞、例えば頚
部扁平細胞での選ばれたＤＮＡ配列の発現を遂行するＤＮＡ配列を意味する。上
皮特異性プロモーターの例示的実施態様では、乳頭腫ウイルスに媒介される疾患
、例えば乳頭腫における主題のＥ６結合タンパク質のうち１種類を含むＥ６／Ｅ
６−ＢＰ複合体のレベルを変調するため、または上皮組織のみでの主題のＥ６結
合タンパク質のうち一つのアンチセンス構成体の発現を支配するために、例えば
Ｅ６−ＢＰ拮抗体を送達する遺伝子療法の一部として、遺伝子構成体を用いるこ
とができる。この用語は、選ばれたＤＮＡの発現を専ら一組織で調節するが、他
の組織でも発現を生じる、いわゆる「漏出性」プロモーターも網羅する。
本明細書で用いる限りで、「トランスジェニック動物」は、該動物の細胞のう
ち一つまたはそれ以上がトランス遺伝子を有するいかなる動物でもあり、好まし
くはヒトではない動物、例えばラット、マウスまたはブタである。トランス遺伝
子は、計画的な遺伝子操作、例えば微量注入、または組換えウイルスによる感染
を用い、細胞の前駆体への導入によって細胞へと直接もしくは間接的に導入され
る。遺伝子操作という用語は、古典的な交配、または生体外受精を包含せず、む
しろ組換えＤＮＡ分子の導入に向けられる。この分子は、染色体に組み込まれて
よく、あるいは染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。本明細書に記載のト
ランスジェニック動物では、トランス遺伝子が、主題のＥ６結合タンパク質のう
ち１種類またはそれ以上の組換え形態を細胞に発現させるか、または、これに代
えて、天然に産する形態のＥ６−ＢＰ遺伝子のうち一つまたはそれ以上の発現を
破壊させる。
本明細書で用いる限りで、用語「トランス遺伝子」は、それが導入されるトラ
ンスジェニックな動物または細胞に対して、部分的もしくは全体的に異種、すな
わち異質であるか、あるいはそれが導入されるトランスジェニックな動物または
細胞の内在性遺伝子に対しては同種であるが、それが挿入される細胞のゲノムを
変えるようにして、その動物のゲノムに挿入することが設定されるか、または挿
入される（例えば、天然の遺伝子とは異なる位置に挿入されるか、またはその挿
入がノックアウトを招く）、（例えば１種類またはそれ以上の造血性ペプチドを
コードしている）核酸配列を意味する。トランス遺伝子は、選ばれた核酸の最適
の発現に必要であり得る、一つまたはそれ以上の転写調節配列、およびその他の
いかなる核酸、例えばイントロンも包含できる。
周知のとおり、特定のポリペプチドに対する遺伝子は、個体内では単一または
多重コピーとして存在し得る。そのような重複遺伝子は、同一であってよく、あ
るいは、実質的に同じ活性を有するポリペプチドをすべてが依然としてコードし
ている、ヌクレオチドの置換、付加または削除を包含する一定の修飾を有しても
よい。したがって、用語「あるＥ６結合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列
」は、特定の個体内の一つまたはそれ以上の遺伝子を意味してよい。その上、ヌ
クレオチド配列における一定の相違が個々の生物間に存在してよく、対立遺伝子
と呼ばれる。そのような対立遺伝子の相違は、コードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列の相違を招いても、招かなくてもよいが、それでも、同じ生物学的活性
を有するタンパク質をコードしている。
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書では互換性を
有して用いられる用語である。そのような用語は、特定の主題の細胞ばかりでな
く、そのような細胞の子孫または潜在的子孫をも意味するものとする。後継世代
には、突然変異または環境的影響のために一定の変更が生じ得ることから、その
ような子孫は、実際は、親細胞と同一ではないこともあるが、依然として、本明
細書で用いる限りでの用語の範囲内に包含される。
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、主題のＥ６結合タンパク
質のうち一つをコードしている第一のアミノ酸配列と、主題のＥ６−ＢＰのいか
なるドメインとも異質であって、実質的に同種ではないドメインを規定する第二
のアミノ酸配列との融合である。キメラタンパク質は、第一のタンパク質も発現
する生物に（異なるタンパク質としてではあるが）見出される異質のドメインを
提示してよく、あるいは異なる種類の生物が発現するタンパク質構造の「種間の
」、「属間の」等々の融合であってもよい。
Ｅ６結合タンパク質をコードしている核酸配列に関しての用語「進化論上類縁
関係にある」は、天然に産する突然変異種も包含する、ある生物に天然に出現す
る核酸配列を意味する。この用語は、天然に産するＥ６−ＢＰに由来するが、例
えば下記の組合せ突然変異誘発としての、突然変異誘発によって変えられてはい
るが、なおかつ、あるＥ６結合タンパク質の少なくとも１種類の活性を有するポ
リペプチドをコードしている核酸配列も意味する。
一実施態様では、該核酸は、主題のＥ６結合タンパク質の少なくとも１種類の
活性を有するペプチドをコードしているｃＤＮＡである。好ましくは、該核酸は
、配列番号１〜７のうち一つに示されるヌクレオチド配列の少なくとも一部を含
むｃＤＮＡ分子である。これらのｃＤＮＡの好適な一部は、該遺伝子のコード化
領域を有する。
好適な核酸は、配列番号８〜１４の一つに示されるアミノ酸配列と６０％以上
相同な、より好ましくは７０％相同な、最も好ましくは８０、９０または９５％
相同なアミノ酸配列を含むＥ６結合タンパク質をコードしている。主題のＥ６結
合タンパク質の活性を有し、かつ配列番号８〜１４の一つに示される配列との約
９０％以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８〜９９％以上
の相同性を有するポリペプチドをコードしている核酸も、本発明の範囲内にある
。相同性は、２ペプチド間または２核酸分子間の配列の類似性を意味する。相同
性は、比較の目的で整列させ得るそれぞれの配列での位置を比較することによっ
て、決定できる。比較された配列でのある位置が、同じ塩基またはアミノ酸で占
められているときは、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、
配列に共有される対合する位置または相同な位置の数の関数である。
添付の配列リストに示したヌクレオチド配列のうちのあるものは、主題のＥ６
結合タンパク質の部分をコードしている。そのため、本発明のもう一つの実施態
様では、組換えＥ６−ＢＰ遺伝子は、配列番号１〜７に示したアミノ酸配列をコ
ードしているヌクレオチドに加えて、各タンパク質のＣ末端およびＮ末端のアミ
ノ酸をコードしている追加のヌクレオチド配列を有することができる。例えば、
組換えＥ６−ＢＰ遺伝子は、下記の表１から誘導される何組かのプライマーを用
いて、ＡＴＣＣ寄託物第 号のＥ６−ＢＰクローンの一つに対するコード化配
列の一つを増幅することによって生成された、ＰＣＲフラグメントのヌクレオチ
ド配列を有することができる。
本発明のもう一面は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３または１４に
示したあるアミノ酸配列の全部もしくは一部を有するペプチドをコードしている
核酸と、高度または低度の緊縮条件下でハイブリッド形成する核酸を提供する。
ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切な緊縮条件、例えば、約４５℃での６．
０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃での２．０ｘ
ＳＳＣの洗浄は、当業者には公知であるか、またはCurrent Protocols in Molec
ular Biology、John Wiley & Sons、米国ニューヨーク（1989）、６．３．１〜
６．３．６に見出すことができる。例えば、洗浄段階での塩濃度は、５０℃での
約２．０ｘＳＳＣという低い緊縮度から５０℃で約０．２ｘＳＳＣという高い緊
縮度までから選択できる。加えて、洗浄段階での温度は、室温、すなわち２０℃
という低緊縮度の条件から約６５℃という高い緊縮度の条件まで上昇させること
ができる。
遺伝暗号の縮重のために、配列番号１〜７のいずれかで示したヌクレオチド配
列とは異なる配列を有する核酸も、本発明の範囲内にある。そのような核酸は、
機能的に同等のペプチド（すなわち、あるＥ６結合タンパク質の生物学的活性を
有するペプチド）をコードしているが、遺伝暗号の縮重のために、該配列リスト
に示した配列とは配列が異なる。例えば、多数のアミノ酸が、１個より多いトリ
プレットで指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、すなわち同義コドン（
例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、それぞれヒスチジンをコードしている）は、Ｅ
６結合タンパク質のアミノ酸配列に影響しない「サイレント」突然変異を招き得
る。しかし、主題のＥ６結合タンパク質のアミノ酸配列の変化へと実際に導くＤ
ＮＡ配列の多形性が、脊椎動物間に存在するものと期待される。当業者は、ある
Ｅ６結合タンパク質の活性を有するポリペプチドをコードしている、核酸の１個
またはそれ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％以下）のこれらの変
異が、天然の対立遺伝子の変異のために、与えられた種の個体間に存在し得るこ
とを認識すると思われる。いかなるかつ全てのそのようなヌクレオチドの変異、
および結果的なアミノ酸の多形性も、本発明の範囲内にある。
本請求のＥ６結合タンパク質の活性部分をコードしている核酸のフラグメント
も、本発明の範囲内にある。本明細書で用いる限りで、あるＥ６結合タンパク質
の活性部分をコードしている核酸のフラグメントは、Ｅ６結合タンパク質の全ア
ミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列より少数のヌクレオチドを有する
が、それでも、あるＥ６−ＢＰの生物学的活性、例えばあるＥ６結合タンパク質
の作動体活性を有するペプチドをコードしている核酸を意味する。本発明の範囲
内の核酸フラグメントは、Ｅ６−ＢＰ相同体を検出するためのプロトコルをふる
い分けるのに用いるための、他の種からの核酸と高または低緊縮条件下でハイブ
リッド形成できるもの、ならびに、交互のイソ型、例えばｍＲＮＡスプライシン
グ変異型を包含する、主題のＥ６−ＢＰの一つをコードしている核酸の存在を検
出するのに用いるための、ヒトの試料からの核酸とハイブリッド形成できるもの
を包含する。本発明の範囲内の核酸は、リンカー配列、修飾された制限エンドヌ
クレアーゼ部位その他の、主題のＥ６結合タンパク質の組換え形態の分子クロー
ニング、発現または精製に役立つ配列も含有してよい。
下記に説明する実施例で示されるとおり、Ｅ６結合タンパク質の活性を有する
ペプチドをコードしている核酸は、多数の真核細胞のいずれに存在するｍＲＮＡ
からも得てよい。成体と胚の双方から得られるゲノムＤＮＡから、本発明のＥ６
結合タンパク質をコードしている核酸を得ることも可能であると思われる。例え
ば、本明細書に記載のプロトコルはもとより、当業者には一般的に公知であるそ
れに従って、ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーのいずれかから、Ｅ６結合タ
ンパク質をコードしている遺伝子をクローニングできる。主題のＥ６結合タンパ
ク質の一つをコードしているｃＤＮＡは、腫瘍細胞をはじめとする細胞、例えば
哺乳類の細胞、例えばヒトの細胞から全ｍＲＮＡを単離することによって、得る
ことができる。次いで、全ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製し、次いで、公知
の多数の手法の一つを用いて、適切なプラスミドまたはバクテリオファージのベ
クターに挿入する。Ｅ６結合タンパク質をコードしている遺伝子は、本発明が提
供するヌクレオチド配列の情報に従って、確立されたポリメラーゼ連鎖反応の手
法を用いてクローニングすることもできる。本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａであることができる。好適な核酸は、例えば、該核酸が、配列番号８の第１〜
１３３残基の間の４個以上の連続アミノ酸残基、より好ましくは１０個以上の連
続アミノ酸残基、より好ましくは２０個以上の連続アミノ酸残基を好ましくはコ
ードしている、下位配列を含む核酸プローブとハイブリッド形成するならば、配
列番号１に示される配列が表すｃＤＮＡである。
もう一つの核酸は、配列番号２に示される配列が表すｃＤＮＡである。その他
の好適な核酸は、配列番号３〜７の一つに示される配列が表すｃＤＮＡ分子を包
含する。好適な核酸は、ｐＲＳ３０６−Ｅ６ＢＰのライブラリー（ＡＴＣＣ寄託
物第75827 号）から誘導されるｃＤＮＡである。
本発明は、少なくとも一つの転写調節配列に機能的に結合された、Ｅ６結合タ
ンパク質の活性を有するペプチドをコードしている核酸を含む発現ベクターも提
供する。機能的に結合されたとは、該ヌクレオチド配列が調節配列に、ヌクレオ
チド配列の発現を許す方式で結合されていることを意味するものとする。調節配
列は、当業界に認められたものであり、Ｅ６結合タンパク質の活性を有するペプ
チドの発現を支配するように選ぶ。したがって、転写調節配列という用語は、プ
ロモーター、エンハンサーその他の発現制御要素を包含する。そのような調節配
列は、Goeddel、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185、Ac
ademic Press、米国カリフォルニア州San Diego （1990）に記載されている。発
現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞、および／または発現させ
たいタンパク質の形式の選択のような要因に依存してよいことを理解しなければ
ならない。一実施態様では、発現ベクターは、主題のＥ６結合タンパク質の活性
を有するペプチドまたは、これに代えて、主題のＥ６結合タンパク質の拮抗体形
態であるペプチドをコードしている組換え遺伝子を有する。そのような発現ベク
ターは、細胞に核酸移入し、それによって、本明細書に記載のような核酸がコー
ドしている融合タンパク質またはペプチドをはじめとする、タンパク質またはペ
プチドを生産するのに用いることができる。
その上、そのようなベクターは、Ｅ６−ＢＰが誤発現される細胞で、主題のＥ
６結合タンパク質の一つの機能を再構成するか、または、これに代えて、機能を
排除するための、遺伝子療法のプロトコルの一部として用いることができる。標
的細胞へのＥ６−ＢＰ構成体の送達に役立つ治療用伝播体の実例は、例えばＰＣ
Ｔ出版物の国際公開特許第93/04701号公報、第92/22635号公報、第92/20316号公
報、第92/19749号公報および第92/06180号公報に開示されている。
本発明のもう一面は、真核生物、例えば哺乳類、例えばヒトに由来する遺伝子
によってコードされ、あるＥ６結合タンパク質の少なくとも１種類の活性を有す
る、例えば本発明のＥ６−ＢＰの少なくとも１種類の活性の拮抗体である、天然
に産する機能不全の突然変異体を包含する、組換え形態の主題のＥ６結合タンパ
ク質に関する。用語「組換えタンパク質」は、主題のＥ６結合タンパク質をコー
ドしているＤＮＡを、一般的には、適切な発現ベクターに挿入し、次いで、それ
を、異種タンパク質を生産するよう宿主細胞を形質転換するのに用いる、組換え
ＤＮＡの手法によって生産される、本発明のタンパク質を意味する。その上、組
換えＥ６−ＢＰをコードしている組換え遺伝子に関しての、語句「由来する」は
、「組換えタンパク質」の意味の範囲内で、本発明の本来のＥ６−ＢＰのアミノ
酸配列、またはある生物の天然に産するＥ６結合タンパク質の置換および削除（
断端を含む）を包含する突然変異によって生成された、それに類似するアミノ酸
配列を有するタンパク質を包含するものとする。本発明に好適とされる組換えタ
ンパク質は、本来のＥ６結合タンパク質に加えて、配列番号８〜１４の一つに示
されるアミノ酸配列と６０％以上、より好ましくは７０％、最も好ましくは８０
％相同である。主題のＥ６結合タンパク質の活性（すなわち、作動性または拮抗
性のいずれか）を有し、かつ配列番号８〜１４のいずれかの配列との約９０％以
上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８〜９９％以上の相同性
を有するポリペプチドも、本発明の範囲内にある。
更に、本発明は、ある生物に由来する遺伝子によってコードされ、配列番号８
〜１４のいずれかのＥ６結合タンパク質と進化論上類縁関係にあるアミノ酸配列
を有する、組換え形態の主題のＥ６結合タンパク質にも関する。そのような組換
えＥ６結合タンパク質は、好ましくは、本Ｅ６−ＢＰの少なくとも１種類の生物
学的活性の作動体または拮抗体のいずれかの役割の一方で機能できる。本組換え
Ｅ６結合タンパク質のアミノ酸配列に関しての、用語「進化論上類縁関係にある
」は、天然に出現するアミノ酸配列を有するＥ６結合タンパク質はもとより、例
えば組合せ突然変異誘発によって誘導される、Ｅ６結合タンパク質の突然変異に
よる変異型も意味する。本発明に好適とされるそのような進化論上誘導されたＥ
６結合タンパク質は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３または１４のい
ずれかに示されるアミノ酸配列と６０％以上、より好ましくは７０％、最も好ま
しくは８０％相同である。配列番号８〜１４のいずれかに示される配列との約９
０％以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８〜９９％以上の
相同性を有するポリペプチドも、本発明の範囲内にある。
更に、本発明は、主題のＥ６結合タンパク質を生産する方法にも関する。例え
ば、主題のＥ６結合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の発現を支配
する核酸ベクターを移入した宿主細胞は、該ペプチドの発現を生じさせる適切な
条件下で培養できる。該ペプチドは、分泌され、組換えＥ６−ＢＰを含有する細
胞および培地の混合物から単離され得る。これに代えて、ペプチドが細胞質に保
持され、細胞を採集し、溶解し、そしてタンパク質を単離してもよい。細胞培養
は、宿主細胞、培地およびその他の副生物を包含する。細胞培養に適した培地は
、当技術に周知である。組換えＥ６−ＢＰペプチドは、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびそのような
ペプチドに特異的な抗体による免疫親和性精製を包含する、タンパク質を精製す
るための当技術に公知の手法を用いて、細胞培養の培地、宿主細胞またはその双
方から単離できる。好適実施態様では、組換えＥ６結合タンパク質は、その精製
を容易にするドメインを有する融合タンパク質、例えばＥ６−ＢＰ−ＧＳＴ融合
タンパク質である。
本発明は、組換え形態の主題のＥ６結合タンパク質のうち少なくとも１種類を
発現するように核酸移入した宿主細胞にも関する。宿主細胞は、いかなる原核ま
たは真核細胞であってもよい。したがって、本発明のＥ６結合タンパク質のクロ
ーニングから誘導した、あるタンパク質の全部または選ばれた一部をコードして
いるヌクレオチド配列を、微生物または真核細胞による方法によって、組換え形
態のＥ６−ＢＰを生産するのに用いることができる。ポリヌクレオチド配列を遺
伝子構成体、例えば発現ベクター中に結合し、真核（酵母、鳥類、昆虫もしくは
哺乳類）であれ原核（細菌細胞）であれ、宿主中に形質転換または核酸移入する
ことは、他の周知のタンパク質、例えばインシュリン、インターフェロン、ヒト
成長ホルモン、ＩＬ−１、ＩＬ−２などを生産するのに用いられる標準的操作で
ある。類似の操作またはその変更は、主題の発明による微生物手段または組織培
養手法によって、組換えＥ６結合タンパク質もしくはその部分を調製するのに用
いることができる。
組換えＥ６結合遺伝子は、主題のＥ６結合タンパク質をコードしている核酸ま
たはその一部を、原核細胞、真核細胞のいずれか、またはその双方で発現するの
に適したベクター中に結合することによって生産できる。組換え形態の主題のＥ
６結合タンパク質の生産のための発現ベクターは、プラスミドその他のベクター
を包含する。例えば、Ｅ６−ＢＰの発現に適したベクターは、原核細胞、例えば
大腸菌での発現のためのｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラ
スミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由
来のプラスミドの形式のプラスミドを包含する。
酵母での組換えタンパク質の発現のための多数のベクターが存在する。例えば
、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２およびＹＲＰ１
７は、サッカロミセス・セレビシエS．cerevisiae への遺伝的構成体の導入に役
立つクローニングおよび発現の伝播体である［例えば、Experimental Manipulat
ion of Gene Expression、M．Inouye 編、Academic Press社、83ページのBroach
ら（1983）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい］。これらの
ベクターは、ｐＢＲ３２２のオリ点の存在のために大腸菌で、また酵母の２ミク
ロンプラスミドの複製決定因子のためにサッカロミセス・セレビシエで複製でき
る。加えて、アンピシリンのような薬物体制マーカーを用いることができる。例
示的実施態様では、Ｅ６結合タンパク質を、例えば、配列番号１〜７に基づくプ
ライマー、および／またはフランキングプラスミド配列に基づくプライマー（例
えば配列番号１５〜１７で表されるプライマー）を用い、ｐＲＳ３０６−Ｅ６Ｂ
Ｐライブラリー（ＡＴＣＣ受託番号第75827 号）から該タンパク質をコードして
いる遺伝子をサブクローニングすることによって生成した発現ベクターを組換え
で利用して、生産する。
好適な哺乳類の発現ベクターは、細菌でのベクターの増殖を促進するための原
核配列と、真核細胞で発現される一つまたはそれ以上の真核転写ユニットとの双
方を有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、
ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎ
ｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは
、真核細胞の核酸移入に適した哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクタ
ーのうちいくつかは、原核および真核細胞の双方での複製や薬物耐性淘汰を促進
するために、細菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２からの配列で修飾する。これ
に代えて、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＶＰ−１）またはエプスタイン・バーウイル
ス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来の、およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体
を、真核細胞でのタンパク質の過渡的発現のために用いることができる。プラス
ミドの調製、および宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法が、当技術に周
知である。原核および真核細胞の双方に適したその他の発現系、ならびに一般的
組換え操作については、Sambrook、Fritsch およびManiatis編、Molecular Clon
ing A Laboratory Manual、第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press ：1
989）、第１６および１７章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイル
ス発現系を用いることによって、組換えＥ６−ＢＰを発現するのが望ましいこと
がある。そのようなバキュロウイルス発現系の例は、ｐＶＬ由来のベクター（例
えばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来の
ベクター（例えばｐＡｃＵＷ１）ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例
えばｐＢｌｕｅＢａｃIII を有するβ−ｇａｌ）を包含する。
主題のＥ６結合タンパク質の一つの一部、すなわち断端突然変異体の発現が望
まれるときは、発現しようとする望みの配列を含むオリゴヌクレオチドフラグメ
ントに、開始コドン（ＡＴＣ）を付加するのが必要なことがある。メチオニンア
ミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）という酵素を用いることによって、Ｎ末端のメチオ
ニンを酵素的に切断できることは、当技術に周知である。ＭＡＰは、大腸菌［Be
n-Bassatら（1987）、J．Bacteriol．、169 ：751 〜757］およびネズミチフス
菌Salmonella typhimuriumからクローニングされていて、その生体外活性は、組
換えタンパク質で立証されている［Millerら（1987）、PNAS、84：2,718 〜1,72
2］。したがって、望まれるならば、Ｎ末端メチオニンの除去は、ＭＡＰを生産
する宿主（例えば大腸菌もしくはＣＭ８９またはサッカロミセス・セレビシエ）
でＥ６−ＢＰ由来のポリペプチドを生体内で発現させるか、または精製されたＭ
ＡＰを生体外で用いるか［例えばMillerら、前掲］のいずれかによって達成でき
る。
これに代えて、ポリペプチドに対するコード化配列を、異なるポリペプチドを
コードしているヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として組み込むことが
できる。この形式の発現系は、Ｅ６結合タンパク質の免疫原性フラグメントを生
産するのが望ましい条件下で役立つことがある。例えば、ロタウイルスのＶＰ６
というキャプシドタンパク質は、単量体形態またはウイルス粒子の形態のいずれ
でも、Ｅ６−ＢＰポリペプチドの一部に対する免疫学的担体として用い得る。そ
れに対する抗体を誘発しようとする主題のＥ６結合タンパク質の、その一部に対
応する核酸配列を、ワクシニアウイルスの後期構造タンパク質に対するコード化
配列を有する融合遺伝子構成体に組み込んで、Ｅ６−ＢＰタンパク質の一部をビ
リオンの一部として含む融合タンパク質を発現する、一セットの組換えウイルス
を生産できる。Ｂ型肝炎表面抗原融合タンパク質を利用する免疫原性融合タンパ
ク質を用いることによって、組換えＢ型肝炎ビリオンもこの役割に利用できるこ
とが立証されている。同様に、Ｅ６結合タンパク質の一部を含む融合タンパク質
と、ポリオウイルスのキャプシドタンパク質とをコードしているキメラ構成体を
、この一セットのポリペプチド抗原の免疫原性を強化するために生成できる［例
えば、ヨーロッパ公開特許第0259149 号公報；ならびにEvans ら（1989）、Natu
re、339 ：385 ；Huang ら（1988）、J．Virol．、62：3855；およびSchlienger
ら（1992）、J．Virol．、66：２を参照されたい］。
ペプチドに基づく免疫化のための多重抗原ペプチド系も、免疫原を生成するの
に利用でき、ここでは、主題のＥ６結合タンパク質の望みの部分は、オリゴマー
の分枝リシンコアへのペプチドの有機化学的合成から直接得られる［例えば、Po
snett ら（1988）、JBC、263 ：1,719、およびNardelliら（1992）、J．Immunol
．、148 ：914 を参照されたい］。主題のＥ６結合タンパク質の抗原決定基も、
細菌細胞によって発現かつ提示され得る。
免疫原性を強化するために融合タンパク質を利用することに加えて、融合タン
パク質が、タンパク質、例えば本発明のＥ６結合タンパク質のいずれの発現も促
進できることが、広く認識されている。例えば、下記のとおり、本発明のＥ６結
合タンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ融合タンパク質）
として生成できる。そのようなＧＳＴ融合タンパク質は、例えばグルタチオン由
来の基質を用いることによって、Ｅ６結合タンパク質の精製を容易にすることが
できる［例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausabel ら編（John
Wiley & Sons、米国ニューヨーク、1991）を参照されたい］。もう一つの実施
態様では、精製リーダー配列、例えばＥ６結合タンパク質の望みの部分のＮ末端
でのポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列をコードしている融合タン
パク質は、Ｎｉ2+金属樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによるポ
リ（Ｈｉｓ）で発現されるＥ６−ＢＰ融合タンパク質の精製を可能にできる。次
いで、この精製リーダー配列を、エンテロキナーゼによる処理によってその後に
除去できる［例えば、Hochuli ら（1987）、J．Chromatography、411 ：177 ；
およびJanknecht ら、PNAS、88：8,972 を参照されたい］。
融合遺伝子を作成する手法は、当業者に公知である。基本的には、異なるポリ
ペプチド配列をコードしている様々なＤＮＡフラグメントの結合を、慣用の手法
に従って実施するが、結合のために平滑断端または食い違い断端の末端を、適切
な末端を与えるために制限酵素消化を、望ましくない結合を避けるための適切な
アルカリホスファターゼ処理として、付着末端の充填と酵素による結合とを用い
る。もう一つの実施態様では、自動ＤＮＡ合成装置を包含する慣用の手法によっ
て、融合遺伝子を合成できる。これに代えて、連続する２本の遺伝子フラグメン
トの間に相補的な突出部を生じさせ、次いでそれらをアニーリングして、キメラ
遺伝子配列を生成できるアンカープライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰ
ＣＲ増幅を実施できる［例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausu
bel ら編、John Wiley & Sons ：1991）を参照されたい］。
本発明のもう一面は、主題のＥ６結合タンパク質の一つの活性を有するか、主
題のＥ６−ＢＰの生物学的活性のうち少なくとも１種類の拮抗体である単離タン
パク質に関する。好適実施態様では、Ｅ６結合タンパク質の生物学的活性は：真
核細胞、例えば哺乳類の細胞、例えばヒトの細胞の増殖／細胞増殖を変調できる
能力；乳頭腫ウイルス感染、例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１
またはＨＰＶ−３３による感染の有効性を左右できる能力；細胞の形質転換、例
えばＰＶ媒介形質転換、例えばＰＶ媒介形質転換、例えば高危険性ＨＰＶ媒介形
質転換の有効性を左右できる能力；細胞の不死化、例えばＰＶ媒介形質転換、例
えばＨＰＶ媒介形質転換、例えば高危険性ＨＰＶ媒介不死化の有効性を左右でき
る能力；ＰＶのＥ６タンパク質、例えばＨＰＶのＥ６タンパク質、例えば高危険
性ＨＰＶのＥ６タンパク質を結合できる能力を包含する。本発明のＥ６結合タン
パク質、特に拮抗活性を有するそれは、例えば内在性Ｅ６−ＢＰが誤発現されて
いる腫瘍細胞での、腫瘍成長を抑制できる能力を有し得る。主題のＥ６結合タン
パク質のその他の生物学的活性は、本明細書に記載されているか、または当業者
には合理的に明白であると思われる。主題のＥ６結合タンパク質の少なくとも１
種類以上の生物学的活性を有するポリペプチドは、配列番号８〜１４のいずれか
に示される配列とアミノ酸配列が異なっていてよいが、そのような差異は、本来
のＥ６結合タンパク質と同一もしくは類似の方式で機能するか、または本来のＥ
６結合タンパク質の同一もしくは類似の特徴を有する、修飾されたタンパク質を
生じる。これらの、および他の機能的に等価のペプチドを生産するための、本発
明のＥ６結合タンパク質の様々な修飾は、本明細書に詳細に記載されている。本
明細書で用いる限りで、ペプチドという用語は、ペプチド、タンパク質およびポ
リペプチドを意味する。
本発明は、また、通常はＥ６結合タンパク質に付随する、他の細胞もしくはウ
イルス性タンパク質、特に乳頭腫ウイルスタンパク質から単離されたか、さもな
ければ実質的にそれらを含まない単離Ｅ６結合タンパク質を入手可能にする。用
語「他の細胞またはウイルス性タンパク質を実質的に含まない」（本明細書では
「混入タンパク質」とも呼ぶ）、または「実質的に純粋な、または精製された調
製品（製剤）」は、２０％（乾燥重量による）未満の混入タンパク質、好ましく
は５％未満の混入タンパク質を有するＥ６−ＢＰ調製品を包含するとして定義さ
れる。機能的な形態の主題のＥ６結合タンパク質は、本明細書に記載のようなク
ローニングされた遺伝子を用いることによって精製された調製品として、最初に
調製できる。「精製された」とは、ペプチド、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列
を指すときは、指示された分子が、他の生体高分子、例えば他のタンパク質（特
にＥ６のようなウイルスタンパク質、および他の混入タンパク質）の実質的不在
下で存在することを意味する。本明細書で用いる限りで、用語「精製された」は
、好ましくは、乾燥重量で８０％以上、より好ましくは９５〜９９重量％の範囲
、最も好ましくは９９．８重量％以上の、存在する同形式の生体高分子を意味す
る（しかし、水、緩衝液などの小分子、特に５，０００未満の分子量を有する分
子は存在できる）。本明細書で用いる限りで、用語「純粋な」は、好ましくは、
直前の「精製された」と同じ数値的限度を有する。「単離された」および「精製
された」は、それらの本来の状態での天然材料、または（例えばアクリルアミド
ゲル中で）成分へと分離されているが、純粋な（例えば、混入タンパク質、また
は変性剤および重合体、例えばアクリルアミドもしくはアガロースのようなクロ
マトグラフィー試薬を欠く）物質もしくは溶液のいずれとしても得られなかった
天然材料のいずれも包含しない。
核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関してやはり本明細書で用いる限りで、用
語「単離された」は、該高分子の天然の産出源に存在する、それぞれ他のＤＮＡ
またはＲＮＡから分離された分子を意味する。例えば、主題のＥ６結合タンパク
質の一つをコードしている単離された核酸は、好ましくは、自然界ではゲノムＤ
ＮＡ中で特定のＥ６−ＢＰを直接挟んで存在する１０キロベース（kb）以下の核
酸配列、より好ましくは５kb以下のそのような天然に産するフランキング配列、
最も好ましくは１．５kb未満のそのような天然に産するフランキング配列を包含
する。本明細書で用いる限りで、単離されたという用語は、組換えＤＮＡの手法
で生産したときは、細胞性材料、ウイルス性材料、もしくは培養の培地も、また
は化学的に合成したときは、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含ま
ない核酸またはペプチドも意味する。その上、「単離された核酸」は、フラグメ
ントとしては天然に産せず、自然状態では見出されないような核酸フラグメント
を包含するものとする。
更に、主題のＥ６結合タンパク質の単離されたペプチジル部分は、そのような
ペプチドをコードしている核酸の対応するフラグメントから、組換えによって生
産されたペプチドをふるい分けることによっても得ることができる。加えて、フ
ラグメントは、慣用のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学のよ
うな、当技術に公知の手法を用いて化学的に合成できる。例えば、本発明のＥ６
結合タンパク質は、任意に、フラグメントの重複が皆無である望みの長さのフラ
グメントへと分割するか、または、好ましくは、望みの長さの重複するフラグメ
ントへと分割してよい。フラグメントは、Ｅ６結合タンパク質活性の作動体また
は拮抗体のいずれかとして機能できるようなペプチジルフラグメントを同定する
ために（組換えによるか、または化学的合成によって）生産し、例えば微量注入
検定法によって、試験することができる。
治療もしくは予防の有効性、または安定性（例えば、生体外での有効期間、お
よび生体内でのタンパク質分解性分解に対する耐性）を強化するような目的で、
主題のＥ６結合タンパク質の構造を修飾することができる。そのような修飾した
ペプチドは、天然に産する形態のタンパク質の少なくとも１種類の活性を保持す
るよう設計したときは、より詳細に本明細書に記載したＥ６結合タンパク質の機
能的等価物と見なされる。そのような修飾したペプチドは、例えば、アミノ酸の
置換、削除または付加によって生産できる。
その上、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるア
スパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離された置換、または構造的に関
連するアミノ酸によるアミノ酸の類似の置換（すなわち保存的突然変異）は、得
られる分子の生物学的活性に対して重大な効果はないものと期待するのが合理的
である。同類置換は、それらの側鎖に関連性があるアミノ酸の一族内で実施され
る置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、４族に分割できる：（１）酸
性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒス
チジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン
、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝
グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロ
シン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸と
してまとめて分類されることがある。同様にして、このアミノ酸の目録は、（１
）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、
ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、セリン、トレオニン、ただしセリンおよびトレオニンは、場合により脂肪
族ヒドロキシルとして別個に類別される；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チ
ロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；ならびに
（６）硫黄含有＝システインおよびメチオニンとして類別できる［例えばL．Str
yer 編、Biochemistry、第２版、WH Freeman and Co.、1981を参照されたい］。
ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的なＥ６−ＢＰ相同体を生じるか否かは、
野生型Ｅ６−ＢＰと同様にして細胞に応答を生起できる変異型ペプチドの能力を
評価することによって、容易に決定できる。１回より多くの置換を生じたペプチ
ドは、同じようにして容易に試験できる。
本発明は、更に、本発明に開示の新規Ｅ６結合タンパク質の何セットかの組合
せ突然変異体、および断端突然変異体を生成する方法も企図し、ＰＶのＥ６タン
パク質、特に高危険性ＨＰＶのＥ６タンパク質に結合するのに機能的である、潜
在的変異型配列を同定するのに特に役立つ。そのような組合せライブラリーをふ
るい分ける一つの目的は、例えば、野生型（「標準的」）タンパク質の生物学的
活性の作動体もしくは拮抗体のいずれか一方として機能するか、または、これに
代えて、全体として新規な活性を有する新規Ｅ６−ＢＰ相同体を単離することで
ある。例示するならば、本方法によってＥ６−ＢＰ相同体を加工して、Ｅ６を結
合するが、それでも、乳頭腫ウイルスによる感染、形質転換および／または不死
化における本来のＥ６−ＢＰの役割に対して拮抗的に作用するタンパク質を与え
ることができる。そのようなタンパク質は、組換えＤＮＡ構成体から発現したと
きに、遺伝子療法のプロトコルに用いることができる。
同様に、突然変異誘発は、対応する野生型タンパク質とは劇的に異なる細胞内
半減期を有する、Ｅ６−ＢＰ相同体を生成できる。例えば、変化したタンパク質
を、Ｅ６結合タンパク質の破壊か、さもなければ活性化を招く、タンパク質分解
による分解もしくは他の細胞性過程に対して、より安定的であるか、またはより
安定的でないかのいずれかにできる。そのようなＥ６−ＢＰ相同体、およびそれ
らをコードしている遺伝子は、組換えタンパク質の半減期を変調することによっ
て、特定の組換えＥ６結合タンパク質に対する発現の外延を変えるのに利用でき
る。例えば、短い半減期は、特定の組換えＥ６−ＢＰに付随する、より過渡的な
生物学的効果を発生でき、誘導できる発現系の一部の場合は、細胞内の組換えＥ
６−ＢＰのレベルの、より厳格な制御を可能にできる。上記のとおり、そのよう
なタンパク質、および特にそれらの組換え核酸構成体は、遺伝子療法のプロトコ
ルに用いることができる。
本方法の例示的実施態様では、Ｅ６−ＢＰ相同体または他の関連タンパク質の
集団についてのアミノ酸配列を、好ましくはできるだけ最高の相同性を促進する
よう整列させる。変異型のそのような集団は、例えば一つまたはそれ以上の種か
らのＥ６−ＢＰ相同体、または同種からではあるが、突然変異のために異なるＥ
６−ＢＰ相同体を含み得る。整列した配列の各位置に出現するアミノ酸を、組合
せ配列の縮重したセットを形成するように選択する。
好適実施態様では、潜在的なＥ６−ＢＰ配列の少なくとも一部をそれぞれが含
むポリペプチドのライブラリーをコードしている遺伝子の縮重ライブラリーを用
いて、組合せＥ６−ＢＰライブラリーを形成する。潜在的Ｅ６−ＢＰ配列の縮重
セットが、個々のポリペプチドとしてか、これに代えて、Ｅ６−ＢＰ配列のセッ
トをその中に含む１セットの、より大きい融合タンパク質（例えば、ファージ表
示のため）として発現できるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子
配列内に酵素的に結合できる。
潜在的Ｅ６−ＢＰ相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から形
成できる、多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合
成装置で実施でき、そうして、合成遺伝子を、発現のための適切な遺伝子中に結
合する。遺伝子の縮重セットの目的は、潜在的Ｅ６−ＢＰ配列の望みのセットを
コードしている配列をすべて、一つの混合物として与えることである。縮重オリ
ゴヌクレオチドの合成は、当技術に周知である［例えばS.A．Narang （1983）、
Tetrahedron、39：３；Itakura ら（1981）、Recombinant DNA，Proc．3rd Clev
eland Sympos．Macromolecules、A.G．Walton 編、Elsevier、オランダ国アムス
テルダム：273 〜289 ページ；Itakura ら（1984）、Annu．Rev．Biochem．、53
：323 ；Itakura ら（1984）、Science、198 ：1,056 ；Ike ら（1983）、Nucle
ic Acids Res.、11：477 を参照されたい］。そのような手法は、他のタンパ
ク質の指向された進化に用いられている［例えばScott ら（1990）、Science、2
49 ：386 〜390 ；Roberts ら（1992）、PNAS、89：2,429 〜2,433 ；Devlinら
（1990）、Science、249 ：404 〜406 ；Cwirlaら（1990）、PNAS、87：6,378〜
6,382 ；ならびに米国特許第5,223,409 号明細書、第5,198,346 号明細書および
第5,096,815 号明細書を参照されたい］。
点突然変異によって作成された組合せライブラリーの遺伝子産物をふるい分け
るため、および一定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーを
ふるい分けるための、広範囲の手法が当技術に公知である。そのような手法は、
Ｅ６−ＢＰ相同体の組合せ突然変異誘発によって形成された遺伝子ライブラリー
の迅速なふるい分けに、一般的に適合させ得ると思われる。大きい遺伝子ライブ
ラリーをふるい分けるための最も広く用いられる手法は、代表的には、遺伝子ラ
イブラリーを、複製できる発現ベクターへとクローニングすること、得られるベ
クターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および望みの活性の検
出が、その産物が検出された遺伝子をコードしているベクターの比較的容易な単
離を促進する条件下で、組合せ遺伝子を発現させることを含む。下記の例示的検
定法のそれぞれは、組合せ突然変異誘発の手法で生成された多数の縮重Ｅ６−Ｂ
Ｐ配列をふるい分けるのに必要な、高処理量分析に応じられる。
一ふるい分け検定法では、候補のＥ６−ＢＰ遺伝子産物が、細胞またはウイル
ス粒子の表面に表示され、この遺伝子産物を介してＥ６タンパク質、例えばＨＰ
Ｖ−１６のＥ６を結合できる特定の細胞またはウイルス粒子の能力を、「選鉱検
定法」で検出する。例えば、遺伝子ライブラリーを、細菌細胞の表面膜タンパク
質について遺伝子内にクローニングし、得られる融合タンパク質を選鉱によって
検出することができる［Ladnerら、国際公開特許第88/06630号公報；Fuchs ら（
1991）、Bio/Technology、９：1,370 〜1,371 ；およびGowardら（1992）、TIBS
、18：136 〜140］。同様にして、蛍光標識したＥ６を用いて、潜在的に機能的
であるＥ６−ＢＰ相同体を評定できる。細胞は、視覚的に検査でき、蛍光顕微鏡
下で分離するか、または、細胞の形態学的形状が許すならば、蛍光活性化細胞選
別機によって分離することができる。
代替的実施態様では、遺伝子ライブラリーを、ウイルス粒子の表面の融合タン
パク質として発現させる。例えば、繊維状ファージ系では、伝染性ファージの表
面に異質ペプチド配列を発現させ、それによって、二つの有意義な利点が賦与で
きる。第一に、これらのファージは、非常に高濃度で親和性基質に塗布できるた
め、非常に多数のファージを一度にふるい分けられる。第二に、伝染性ファージ
はそれぞれ、その表面に組合せ遺伝子産物を表示するため、特定のファージを低
収率で親和性基質から回収するならば、もう１回の感染によって、ファージを増
幅できる。ほとんど同一の大腸菌繊維状ファージであるＭ１３、ｆｄおよびｆ１
の群は、ファージ表示ライブラリーに最も多く用いられるが、それは、ファージ
ｇIII またはｇVIIIコートタンパク質のどちらも、ウイルス粒子の最終的なパッ
ケージングを破壊することなく融合タンパク質を生成するのに用い得るからであ
る［Ladnerら、ＰＣＴ出版物、国際公開特許第90/02909号公報；Garrard ら、Ｐ
ＣＴ出版物、国際公開特許第92/09690号公報；Marksら（1992）、J．Biol．Chem
.、267 ：16,007〜16,010；Griffiths ら（1993）、EMBO J．、12：725 〜734；
Clacksonら（1991）、Nature、352 ：624 〜628 ；およびBarbasら（1992）、PN
AS、89：4,457 〜4,461］。
例示的実施態様では、組換えファージ抗体系（ＲＰＡＳ、Pharmasia カタログ
番号第27-9400-01）は、Ｅ６−ＢＰ組合せライブラリーを発現させ、ふるい分け
るために容易に変更できる。例えば、ＲＰＡＳのキットのｐＣＡＮＴＡＢ５とい
うファージミドphagemidは、ファージｇIII コートタンパク質をコードしている
遺伝子を含む。Ｅ６−ＢＰ組合せ遺伝子ライブラリーは、ｇIII シグナル配列に
隣接するファージミドに、ｇIII 融合タンパク質として発現されるようにクロー
ニングできる。結合の後、このファージミドを用いて、適格な大腸菌ＴＧ１細胞
を形質転換する。次いで、形質転換した細胞をＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに
感染させて、ファージミド、およびその候補となるＥ６−ＢＰ遺伝子挿入断片を
取り戻す。得られる組換えファージは、特異的な候補Ｅ６−ＢＰをコードしてい
るファージミドＤＮＡを含み、対応する融合コートタンパク質の１個またはそれ
以上のコピーを表示する。Ｅ６を結合できる、これらファージに表示される候補
Ｅ６−ＢＰを、Ｅ６で選鉱することによって、選別または濃縮する。例えば、こ
のファージライブラリーをグルタチオン固定化Ｅ６−ＧＳＴ融合タンパク質に対
して選鉱し、未結合ファージを細胞から洗浄し去ることができる。次いで、結合
したファージを単離し、組換えファージが野生型ｇIII コートタンパク質の少な
くとも１コピーを発現するならば、それらは、大腸菌に感染する能力を保持して
いることになる。こうして、大腸菌感染および選鉱を連続的に反復することは、
Ｅ６−ＢＰ相同体を著しく濃縮することになり、それらは、Ｅ６を結合できる能
力を保持できて、作動体と拮抗体とを分別するためのそれ以上の生物学的活性に
ついて、その後にふるい分けできる。
本開示を考慮すると、上記の組合せ突然変異誘発という取り組み方に加えて、
突然変異誘発の一般的に適用できるその他の形態は、当業者には明らかであると
思われる。例えば、Ｅ６−ＢＰ相同体（作動体および拮抗体形態の双方）を生成
かつふるい分けることが、例えばアラニン走査突然変異誘発などを用いて［Ruf
ら（1994）、Biochemistry、33：1,565 〜1,572 ；Wangら（1994）、J．Biol．C
hem.、269 ：3,095 〜3,099 ；Balintら（1993）、Gene、137 ：109〜118 ；Gro
dbergら（1993）、Eur．J．Biochem.、218 ：597 〜601 ；Nagashima ら（1993
）、J．Biol．Chem.、268 ：2,888 〜2,892 ；Lowmanら（1991）、Biochemistry
、30：10,832〜10,838；およびCunninghamら（1989）、Science、244 ：1,081〜
1,085］、リンカー走査突然変異誘発によって［Gustinら（1993）、Virology、1
93 ：653 〜660 ；Brown ら（1992）、Mol．Cell．Biol.、12：2,644 〜2,652
；McKnightら（1982）、Science、232 ：316］、または飽和突然変異誘発によっ
て［Meyersら（1986）、Science、232 ：613］、可能である。
本発明は、主題のＥ６結合タンパク質のＥ６結合ドメインを縮小して、模擬体
、例えば、本発明のＥ６−ＢＰの結合を乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質で破壊で
きるペプチドまたは非ペプチド作用因を生成することも、提供する。したがって
、そのような突然変異誘発の手法は、例えばＰＶのＥ６タンパク質への主題のＥ
６結合タンパク質の結合に関与する、タンパク質−タンパク質相互作用に参加す
る、Ｅ６−ＢＰの決定基をマッピングするのに特に役立つ。例示すると、Ｅ６の
分子的認識に関与する、Ｅ６結合タンパク質の枢要な残基を決定すること、およ
びＥ６とのＥ６−ＢＰの結合を競合阻害する、Ｅ６−ＢＰ由来のペプチド模擬体
を生成することができる（例えば、「網膜芽腫の遺伝子タンパク質に結合するヒ
ト乳頭腫ウイルスタンパク質のペプチド阻害剤」、ヨーロッパ公開特許第EP-412
,762A 号公報および第EP-B31,080A 号公報を参照されたい）。例えば走査突然変
異誘発を用いて、Ｅ６の結合に関与する特定のＥ６結合タンパク質のアミノ酸残
基をマッピングすることによって、Ｅ６に結合する際にこれらの残基を模倣し、
そのためにＥ６とのＥ６−ＢＰの結合を阻害でき、それによってＰＶ感染におけ
るＥ６の機能に干渉できる、ペプチド模擬化合物（例えばジアゼピンまたはイソ
キノリン誘導体）を生成することができる。例えば、そのような残基の加水分解
できないペプチド類似体を生成することが、ベンゾジアゼピン［例えばFreiding
erら、Peptides: Chemistry and Biology、G.R．Marshall 編、ESCOM Publisher
：オランダ国Leiden、1988を参照されたい］、アゼピン［例えばHuffman ら、P
eptides: Chemistry and Biology、G.R．Marshall 編、ESCOM Publisher ：オラ
ンダ国Leiden、1988を参照されたい］、置換γ−ラクタム環［Garveyら、Peptid
es: Chemistry and Biology、G.R．Marshall 編、ESCOM Publisher ：オランダ
国Leiden、1988］、ケトメチレン偽ペプチド［Ewenson ら（1986）、J．Med．Ch
em．、29：295 ；およびEwenson ら、Peptides: Structure and Function（Proc
eedings of the 9th American Peptide Symposium）、Pierce Chemical Co.、米
国イリノイ州Rockland、1985］、β回転ジペプチドコア［Nagai ら（1985）、Te
trahedron Lett．、26：647 ；およびSatoら（1986）、J．Chem．Soc．Perkin T
rans．、１：1,231］、ならびにβ−アミノアルコール［Gordonら（1985）、Bio
chem．Biophys．Res．Commun.、126 ：419 ；およびDannら（1986）、Biochem．
Biophys．Res．Commun.、134 ：71］を用いて可能である。
本発明のもう一面は、主題のＥ６結合タンパク質の一つと特異的に反応する抗
体に関する。例えば、本発明の活性Ｅ６結合タンパク質から誘導された免疫原を
用いることによって、そのｃＤＮＡ配列に基づいて、標準的プロトコルを用いて
、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を作成できる［例
えばAntibodies: A Laboratory Manual、HarlowおよびLane編（Cold Spring Har
bor Press：（1988）を参照されたい］。マウス、ハムスターまたはウサギのよ
うな哺乳類が、該ペプチドの免疫原形態（例えば、抗体応答を誘発できるＥ６結
合タンパク質または抗原性フラグメント）で免疫できる。タンパク質またはペプ
チドに免疫原性を賦与する手法は、担体との接合その他の当技術に周知の手法を
包含する。主題のＥ６結合タンパク質の免疫原性部分は、アジュバントの存在下
で投与できる。免疫化の経過は、血漿または血清中の抗体価の検出によって監視
できる。標準的ＥＬＩＳＡその他の免疫検定法を抗原としての免疫原とともに用
いて、抗体のレベルを評価できる。好適実施態様では、主題の抗体は、本発明の
Ｅ６結合タンパク質の抗原決定基、例えば、配列番号８〜１４の一つで表される
タンパク質、または密接に関連するヒトもしくはヒトではない哺乳類の相同体（
例えば９０％相同体、より好ましくは９５％以上の相同体）の抗原決定基に免疫
特異的である。本発明の更にもう一つの好適実施態様では、抗Ｅ６−ＢＰ抗体は
、タンパク質、例えば配列番号８〜１４の一つと９０％未満相同である、例えば
配列番号８〜１４の一つと９５％未満相同である、例えば配列番号８〜１４の一
つと９８〜９９％未満相同であるそれと実質的に交差反応（すなわち特異的に反
応）しない。「実質的に交差反応しない」とは、該抗体が、配列番号８〜１４の
一タンパク質に対する結合親和性の１０％未満、より好ましくは５％未満、更に
好ましくは１％未満である、非相同タンパク質（例えばＥ６）に対する結合親和
性を有することを意味する。
免疫化に続いて、抗Ｅ６−ＢＰ抗血清を得ることができ、望まれるならば、ポ
リクローナル抗Ｅ６−ＢＰ抗体が、血清から単離できる。モノクローナル抗体を
生成するには、免疫した動物から抗体生産細胞（リンパ球）を採集し、標準的な
体細胞融合操作によって、骨髄腫細胞のような不死化するための細胞と融合させ
て、ハイブリドーマ細胞を生じることができる。そのような手法は、当技術に周
知であり、例えば、ハイブリドーマの手法［KohlerおよびMilstein（1975）、Na
ture、256 ：495 〜497 により最初に開発］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマの手法
［Kozbarら（1983）、Immunology Today、４：72］、およびヒトモノクローナル
抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマの手法［Coleら（1985）、Monocl
onal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77〜96ページ］。
ハイブリドーマ細胞は、本発明のＥ６結合タンパク質と特異的に反応する抗体の
生産について免疫化学的にふるい分けでき、そのような細胞を含む培養体から、
モノクローナル抗体を単離できる。
本明細書で用いる限りでの抗体という用語は、やはり主題のＥ６結合タンパク
質の一つと特異的に反応するそのフラグメントを包含するものとする。抗体は、
慣用の手法を用いて断片化でき、フラグメントは、抗体全体について上に記載し
たのと同じようにして、有用性についてふるい分けできる。例えば、抗体をペプ
シンで処理することによって、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントが生成できる。得ら
れるＦ（ａｂ’）2フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元して、Ｆａｂ’フ
ラグメントを生成できる。本発明の抗体は、更に、抗Ｅ６−ＢＰ部分を有する二
重特異性でキメラ性の分子も包含するものとする。
例えば本発明の抗Ｅ６ＢＰ抗体の微量注入によって、Ｅ６−ＢＰまたはＥ６−
ＢＰの変異型に向けたモノクローナルとポリクローナル抗体（Ａｂ）の双方、お
よびＦａｂ’やＦ（ａｂ’）2のような抗体フラグメントを用いて、Ｅ６−ＢＰ
の作用を遮断し、乳頭腫ウイルスによる感染、形質転換および／または不死化に
おける本発明の特定のＥ６結合タンパク質の役割、ならびにＥ６結合タンパク質
の正常な細胞の機能についての研究を可能にできる。
Ｅ６−ＢＰエピトープを特異的に結合する抗体は、主題のＥ６−ＢＰのそれぞ
れの発現の多量性およびパターンを評価するために、組織試料の免疫化学的染色
に用いることもできる。抗Ｅ６−ＢＰ抗体は、臨床試験操作の一部として、組織
または体液中のＥ６−ＢＰレベルを検出かつ評価するために、免疫沈降および免
疫ブロッティングに診断用に用いることができる。例えば、そのような測定は、
ＨＰＶ感染の開始または経過の予測評価に役立ち得る。同様に、個体でのＥ６−
ＢＰレベルを監視できる能力は、そのような疾患に侵された個体に対する与えら
れた治療法の有効性の決定を可能にできる。Ｅ６−ＢＰのレベルは、体液、例え
ば脳脊髄液の試料中に見出される細胞で測定できるか、または組織、例えば生検
によって得られたそれで測定できる。抗Ｅ６−ＢＰ抗体を用いる診断用検定法は
、例えば、新生物性または過剰形成性の疾患、例えば試料中の癌性細胞の存在、
例えばＰＶに感染した細胞、例えばＰＶで形質転換した細胞、例えばＰＶで不死
化した細胞の早期診断に援用するために、例えばＥ６−ＢＰ遺伝子の病変が生じ
た細胞を検出するために設定された免疫検定法を包含できる。
抗Ｅ６−ＢＰ抗体のもう一つの応用は、λｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺ
ＡＰおよびλＯＲＦ８のような発現ベクター中に構成したｃＤＮＡライブラリー
の免疫学的ふるい分けにおいてである。適正な読み枠および配向に挿入されたコ
ード化配列を有する、この形式のメッセンジャーライブラリーは、融合タンパク
質を生成できる。例えば、λｇｔ１１は、そのアミノ末端がβ−ガラクトシダー
ゼのアミノ酸配列よりなり、カルボキシル末端が異質のポリペプチドよりなる融
合タンパク質を生成することになる。次いで、主題のＥ６−ＢＰの抗原エピトー
プは、抗体によって、例えば、感染した平板から取り上げたニトロセルロースフ
ィルターを抗Ｅ６−ＢＰ抗体と反応させる際に検出できる。次いで、この検定法
で評定したファージは、感染平板から単離できる。こうして、Ｅ６−ＢＰ相同体
の存在は、他の入手源から検出かつクローニングすることができ、代替的イソ型
（スプライシング変異型を包含する）は、ヒトの入手源から検出かつクローニン
グすることができる。
その上、ヒトの細胞系からの主題のＥ６結合タンパク質のクローニングから決
定されたヌクレオチド配列は、更に、ヒトのその他の細胞型中のＥ６−ＢＰ相同
体、ならびに他の動物からのＥ６−ＢＰ相同体を同定するのに用いるために設定
されたプローブの生成を可能にすることになる。例えば、本発明は、実質的に精
製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーも提供するが、該オリ
ゴヌクレオチドは、配列番号１〜７の一つ、またはその天然に産する突然変異体
のセンスもしくはアンチセンス配列の１０個以上の連続するヌクレオチドと緊縮
条件下でハイブリッド形成するヌクレオチドの領域を含む。好適実施態様では、
該プローブ／プライマーは、それに結合した標識基を更に含み、検出することが
でき、例えば、該標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素および酵素補因
子よりなる群から選ばれる。そのようなプローブは、例えば、患者からの細胞の
試料中のＥ６−ＢＰ核酸のレベルを測定し；例えばＥ６−ＢＰｍＲＮＡのレベル
を測定し；例えばゲノムのＥ６−ＢＰ遺伝子が変異し、または削除されたか否か
を決定するために、形質転換した細胞を同定する診断用試験キットの一部として
用い得る。
加えて、ヌクレオチドプローブは、主題のＥ６結合タンパク質のクローニング
された配列から生成でき、Ｅ６−ＢＰｍＲＮＡの存在についての健全な組織およ
び組織試料の史的ふるい分けを可能にする。抗Ｅ６−ＢＰ抗体の診断の用途と同
様に、Ｅ６−ＢＰｍＲＮＡまたはゲノムのＥ６−ＢＰ配列に仕向けたプローブの
用途は、例えば新生物性または過形成性の疾患（例えば望ましくない細胞増殖）
で明白となり得る対立遺伝子突然変異の、予測的および治療的評価の双方に用い
得る。抗Ｅ６−ＢＰ抗体の免疫検定法と併用すると、ヌクレオチドプローブは、
Ｅ６結合タンパク質の発現（またはその欠如）に付随する何らかの異常を伴う可
能性のある、発生上の疾患についての分子的基盤の決定を容易にするのを助ける
ことができる。例えば、Ｅ６−ＢＰ合成の変異は、Ｅ６−ＢＰコード化配列の突
然変異から分別できる。同様に、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質によるＥ６−Ｂ
Ｐの狙い定めた破壊は、ｐ５３で生じると考えられるとおり、Ｅ６結合タンパク
質のＥ６封鎖（すなわち、Ｅ６−ＢＰの細胞性機能の変更を招き得るそれ）とは
区別できる。
例えば、本方法は、被験者に、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患の危険
性があるかを決定する方法を提供する。好適実施態様では、主題の方法は、一般
的には、被験者（例えばヒトの患者）の組織中に、（ｉ）主題のＥ６−ＢＰの一
つをコードしている遺伝子の突然変異、または（ii）Ｅ６−ＢＰ遺伝子の誤発現
のうち少なくとも一つを特徴とする遺伝的病変の存否を検出することを含むとし
て特徴付けることができる。例示すると、そのような遺伝的病変は、（ｉ）主題
のＥ６−ＢＰ遺伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、（ii）そ
のようなＥ６−ＢＰ遺伝子への１個またはそれ以上のヌクレオチドの付加、（ii
i）Ｅ６−ＢＰ遺伝子の１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、（iv）主題
のＥ６−ＢＰ遺伝子のうち一つの大規模な配置転換、（ｖ）Ｅ６−ＢＰ遺伝子の
ｍＲＮＡ転写のレベルの大規模な変化、（vi）Ｅ６−ＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写
の非野生型スプライシングパターンの存在、および（vii）Ｅ６結合タンパク質
の非野生型レベルのうち少なくとも一つの存在を確認することによって、検出で
きる。
本発明の一面では、配列番号１〜７のうち一つ、または天然に産するその突然
変異体のセンスもしくはアンチセンス配列とハイブリッド形成できるヌクレオチ
ド配列の領域を有するオリゴヌクレオチド、あるいは主題のＥ６−ＢＰ遺伝子に
天然に付随する５’もしくは３’フランキング配列またはイントロン性配列を含
む、プローブ／プライマーが提供される。該プローブを組織試料の核酸と接触さ
せ、試料核酸とのプローブのハイブリッド形成を検出する。一定の実施態様では
、病変の検出は、該プローブ／プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（
例えば米国特許第4,683,195 号明細書および第4,683,202 号明細書を参照された
い）にか、これに代えて、結合連鎖反応（ＬＣＲ）［例えばLandegran ら（1988
）、Science、241 ：1,077 〜1,080 を参照されたい］に用いることを含む。こ
れに代えて、Ｅ６結合タンパク質は、免疫検定法で検出できる。
また、アンチセンスの手法の用途（例えば、アンチセンス分子の微量注入、ま
たは、その転写体がＥ６−ＢＰのｍＲＮＡもしくは遺伝子配列に関してアンチセ
ンスである、プラスミドによる感染）は、ＨＰＶに媒介される事象（感染、形質
転換および／または不死化）における主題のＥ６−ＢＰのそれぞれの役割、なら
びに、例えば特定のＥ６結合タンパク質の内在性生産を阻害することによる細胞
増殖における、該新規Ｅ６−ＢＰのそれぞれの正常な細胞性機能を調査すること
に用い得る。そのような手法は、細胞培養に用い得るが、トランスジェニック動
物の創出にも用い得る。
更に、精製および組換えＥ６結合タンパク質を入手可能にすることによって、
本発明は、主題のＥ６結合タンパク質の正常な細胞性機能、または乳頭腫ウイル
スによる感染におけるそれらの役割の作動体もしくは拮抗体のいずれかである薬
物についてふるい分けるのに用い得る、検定法の開発を促進する。一実施態様で
は、該検定法は、Ｅ６−ＢＰとＥ６タンパク質、例えば高危険性ＨＰＶからのＥ
６との結合を阻害できる、化合物の能力について評点するよう誘導される。各種
の検定法の体裁が、当業者には充分であり、本発明を考慮すると、直ちに明白に
なると思われる。例えば、一つのそのようなふるい分け検定法では、問題の化合
物を、本発明の単離かつ精製したＥ６結合タンパク質に接触させる。次いで、該
化合物とＥ６−ＢＰとの混合物を、Ｅ６を含有するが、Ｅ６−ＢＰは含有しない
組成物に加える。標識されたＥ６／Ｅ６−ＢＰ複合体の検出および定量は、乳頭
腫ウイルスのＥ６タンパク質と主題のＥ６−ＢＰとの間の複合体形成を阻害する
際の化合物の効力を決定する手段を提供する。好都合には、比較のための基線を
与えるために、対照検定も実施する。対照検定では、単離かつ精製したＥ６−Ｂ
Ｐを、Ｅ６を含有する組成物に加え、試験化合物の不在下でＥ６／Ｅ６−ＢＰ複
合体の形成を定量する。
Ｅ６−ＢＰとＥ６との間の複合体形成は、その他の各種の方法によっても検出
してよい。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ／Ｅ６（ＧＳＴ／Ｅ６）
融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズに吸着させ、次いで、35Ｓ標
識化Ｅ６ タンパク質と結合し、複合体形成を実施する条件下、例えば２０５
mMトリスＨＣｌ（pH７．２）の緩衝液、５０mMＮａＣｌ、および０．２％ＮＰ−
４０中で４℃で温置する。温置後、ビーズを洗浄していかなる未結合Ｅ６−ＢＰ
も除去し、セファロースビーズに結合した放射能標識を直接にか（例えばビーズ
をシンチレーション蛍光液に入れる）、または（例えばＤＴＴでの処理によって
）Ｅ６／Ｅ６−ＢＰ複合体を解離させた後の上清中で、決定する。複合体を含有
する上清は、場合により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分離してから、検出す
る。
加えて、主題のＥ６結合タンパク質は、下記の実施例に記載のとおり［米国特
許第5,283,317 号明細書；Zervosら（1993）、Cell、72：223 〜232 ；Maduraら
（1993）、J．Biol．Chem.、268 ：12,046〜12,054；Bartelら（1993）、Biotec
hniques、14：920〜924 ；およびIwabuchiら（1993）、Oncogene、８：1,693〜1
,696 も参照されたい］、その後に、Ｅ６タンパク質とのＥ６−ＢＰの結合を破
壊する薬剤を検出するための、相互作用トラップ検定法を形成するのに用い得る
。相互作用トラップ検定法は、その一方が、Ｅ６タンパク質と融合した転写活性
化因子のＤＮＡ結合ドメインを含む、２種類の別個の融合タンパク質からの機能
性転写活性化因子を生体内で再構成することに依拠している。第二の融合タンパ
ク質は、主題のＥ６結合タンパク質の一つと融合した（例えば、ＲＮＡポリメラ
ーゼ転写を開始できる）転写活性化ドメインを含む。Ｅ６とＥ６結合タンパク質
とが作用し合うとき、転写活性化因子のタンパク質の２ドメインは、リポーター
遺伝子の転写を生起するのに充分に近付けられる。例示的実施態様では、サッ
カロミセス・セレビシエＹＰＢ２細胞を、ＧＡＬ４ｄｂ−Ｅ６融合をコードして
いるプラスミド、および主題のＥ６−ＢＰと融合したＧＡＬ４ａｄドメインをコ
ードしているプラスミドで同時に形質転換する。その上、ＧＡＬ４応答性プロモ
ーターが表現型のマーカーの発現を推進するように、この菌株を形質転換する。
例えば、ヒスチジンの不在下で増殖できる能力は、ＨＩＳ３遺伝子の発現に依存
できる。ＨＩＳ３遺伝子がＧＡＬ４応答性プロモーターの制御下に置かれたとき
は、この栄養要求性表現型の除去が、機能性ＧＡＬ４活性化因子がＥ６とＥ６−
ＢＰとの相互作用によって再構成されたことを示す。したがって、Ｅ６とのＥ６
−ＢＰの相互作用を阻害できる薬剤は、ヒスチジンの不在下では増殖ができない
酵母細胞を生じる。これに代えて、表現型マーカー（例えばＨＩＳ３遺伝子に代
えての）は、Ｅ６／Ｅ６−ＢＰ相互作用を破壊する薬剤が、細胞に正の増殖選択
を与えるように発現したときは、負の選択を与えるそれであることができる。
その上、主題のＥ６結合タンパク質の一つが酵素活性を有する場合、その酵素
活性の阻害剤は、主題の酵素による基質の接触転換を阻害できる、その薬剤の能
力を測定するに由来する検定法を用いて同定することができる。
もう一面では、本発明は、本発明の組換えＥ６−ＢＰ遺伝子を発現するか、あ
るいは、例えばヘテロ接合性もしくはホモ接合性の、主題のＥ６−ＢＰ遺伝子の
うち一つもしくはそれ以上がその動物の少なくとも一つの組織または細胞型で破
壊されている、ヒトではないトランスジェニック動物を特徴とする。
もう一面では、本発明は、誤発現されたＥ６−ＢＰ対立遺伝子を有する、発生
上の疾病のための動物モデルを特徴とする。例えば、Ｅ６−ＢＰの対立遺伝子が
欠失しているか、あるいは１個もしくはそれ以上ののＥ６−ＢＰのエキソンの全
部または一部が欠失しているマウスを育種できる。そうして、そのようなマウス
モデルは、誤発現されたＥ６−ＢＰ遺伝子から生じる疾患を研究するのに用いる
ことができる。
実施例
ここで、本発明を一般的に説明するが、本発明の一定の側面および実施態様の
例示のためにのみ包含され、本発明を限定しようとするものではない下記の実施
例を参照することによって、それは、より容易に理解されるものと思われる。
ＨＰＶ１６のＥ６タンパク質に付随するタンパク質をコードしている遺伝子を
同定するために、作用し合うタンパク質をコードしている遺伝子に対する遺伝的
選択を利用する、変更した二ハイブリッド系を用いた［例えばFieldsら（1989）
、Nature、340 ：245 〜246 ；Chien ら（1991）、PNAS、88：9,578 〜9,582 ；
Morrissey ら（1989）、J．Virol．、63：4,422 〜5 ；およびLambertiら（1990
）、EMBO J．、９：1,907 〜1,913 を参照されたい］。ＨＰＶ１６のＥ６／ウシ
乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）Ｅ２ＤＮＡ結合ドメイン（Ｅ２Ｒ）の融合タンパク質
（「Ｅ６−Ｅ２Ｒ」）、および４種類のＥ２結合要素を有するプロモーターによ
って推進されるｌａｃＺリポーターを発現する酵母の菌株で開始することによっ
て、この「二ハイブリッド系」を適合させた。Ｅ６−Ｅ２Ｒ融合タンパク質は、
Ｅ２結合部位を結合できるが、リポーター遺伝子の発現を誘導しない。次いで、
この菌株を、ランダムに始動したＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを挿入したプラスミドの
ライブラリーで、強力なＶＰ１６転写活性化ドメインへとＣ末端で形質転換した
［Daltonら（1992）、Cell、68：597 〜612］。Ｅ６−Ｅ２Ｒと作用し合えるか
、またはリポータープロモーターを直接結合できるＶＰ１６／ｃＤＮＡ融合タン
パク質は、ＶＰ１６活性化ドメインをＥ２結合部位に補充し、ｌａｃＺ遺伝子の
発現を活性化することになり、次いで、これらの酵母細胞は、ｘ−ｇａｌ平板上
で青色に染まることになった。
約１０6個の独立した酵母のコロニーをふるい分けた後、ガラクトース／ｘ−
ｇａｌ上で青色になる４０個を同定した。大腸菌への形質転換後に、ＶＰ１６／
ｃＤＮＡプラスミドを回収した。これらのＶＰ−１６／ｃＤＮＡ遺伝子を、Ｅ６
−Ｅ２ハイブリッド遺伝子、調節ベクター、または最初のキメラに用いたＥ２遺
伝子の部分のいずれかとともにＥ２リポーター遺伝子を有する、新鮮な酵母に導
入した。これの分析の結果は、ＶＰ−１６／ｃＤＮＡのいくつかが、ハイブリッ
ドのＢＰＶのＥ２部分と作用し、その他は、Ｅ６−Ｅ２の不在下でもリポーター
遺伝子を活性化するタンパク質をコードしているが、９個は、ＨＰＶ１６のＥ６
−Ｅ２の存在下でのみ、ｌａｃＺの発現を複製可能なように刺激するにすぎない
ことが見出された。４０クローンのうちいくつかは、これらの条件下のいずれに
おいても、リポーターの発現を活性化せず、概して、当初のふるいで最も青いコ
ロニーからのものであった。２０２アミノ酸のＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインよ
りなるＮ末端と、枠内でＨＰＶ１６Ｅ６とを有するキメラも作成した。Ｌｅｕ２
遺伝子を調節する染色体ＬｅｘＡ依存性プロモーターを有する酵母の菌株を用い
て、ロイシン欠如培地での増殖は、６種類のＶＰ−１６ｃＤＮＡのすべてによっ
て与えられ得るが、いくつかの対照ＶＰ−１６キメラは生存できないことを見出
した。このことは、ｃＤＮＡがＨＰＶ１６Ｅ６と作用し合えるという追加の証拠
を与える。
Ｅ６と特異的に作用し合ったｃＤＮＡを、ＶＰ１６コード化配列内で開始する
プライマーを用いてＤＮＡ配列分析に付した。これは、ｃＤＮＡとの融合点での
読み枠に関する情報を与える。概してこのプライマーを用いて、約２００〜３０
０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を決定した。すべての場合に、枠内の開放読み枠を
同定した。適切なプライマーを用いて、ｃＤＮＡ挿入断片の３’末端も配列決定
している。３例で、同じ遺伝子が２回見出された。これらは、ＶＰ１６活性化ド
メインとの融合点で異なり、したがって、同じライブラリークローンの正確な複
製ではなくて、無関係の単離体を表していた。
ＳＤ−７のクローンは、カルボキシル末端にＨＤＥＬシグナル配列を有する２
１０アミノ酸残基の開放読み枠をコードしていた。ＳＤ７の５’部分を、ＨｅＬ
ａλファージライブラリーから完全な長さのｃＤＮＡを単離するためのプローブ
として用いた。重複する挿入断片を有するいくつかのクローンを単離した。これ
らは、合わせて２kbにわたるｃＤＮＡの回収を招いた。こうして、ＳＤ−７タン
パク質をコードしているｃＤＮＡの完全なコピーを得た。ＳＤ−７ｃＤＮＡクロ
ーンのヌクレオチド配列、および推定されるアミノ酸配列を、添付の配列リスト
に提示する。カルボキシル末端のＨＤＥＬシグナル配列に加え、Ｅ６−ＢＰのＣ
’側半部には４本のＥＦの手がある。
ＳＤ７配列（またはすべてのｃＤＮＡフラグメント）による高度の緊縮条件下
でのノーザンブロット分析は、試験したすべての細胞系に類似のレベルで存在す
る、２，０００ヌクレオチドの大きさの転写体とハイブリッド形成する。更に、
ＳＤ−７のｍＲＮＡのレベルは、乳頭腫ウイルスＥ６遺伝子によって形質転換し
た細胞系でさえ、変動しない。
主題のＥ６結合タンパク質とのＥ６の生体内会合を更に確認するため、生体外
で翻訳したＥ６および不死化ＧＳＴ−Ｅ６ＢＰを用いて、生体内結合検定を実施
した。例えば、ＧＳＴ−ＳＤ７およびＧＳＴのみを、それぞれ、正および負の対
照として用いたことを認める。ＧＳＴ−Ｅ６−ＢＰは、Ｅ６−ＡＰで認められた
のと匹敵する程度にＨＰＶ１６Ｅ６を結合するが、ＧＳＴのみは、ＨＰＶ１６Ｅ
６に結合しない。
ｃＤＮＡの５’および３’末端のＤＮＡ配列を用いて、既にクローニングされ
、配列決定された遺伝子との相同性についてGenBank ／ＥＭＢＬデータベースを
検索した。このコンピュータ検索は、ｃＤＮＡのいくつかは公知の遺伝子に由来
するが、少なくとも８種類（ＳＤ７、８、１２、１６、２２、２８および３２の
クローン）は新規遺伝子であることを明らかにした。２種類は、潜在的な金属結
合モチーフを有するが、これは、亜鉛をＥ６ペプチドに装荷することに関与して
いる可能性があると考えられる。１種類は、ヒトからはクローニングされていな
いが、タンパク質分解機構の一員に関係し、Ｅ６／Ｅ６−ＡＰと複合体形成する
のではないかと思われる。Ｅ２キメラとしてクローニングされる多重ＨＰＶ１６
Ｅ６突然変異の研究からのデータは、相互作用に特異性があることを示す。すな
わち、ある突然変異体は、いくつかのＶＰ１６ｃＤＮＡで陽性のままであるが、
その他は陰性である。この情報は、これらのクローンの有効性を更に裏付ける。
更に、Ｅ６相互作用トラップで単離された８種類の異なる新規クローンを含む
ｐＲＳ３０６プラスミドのライブラリー（「ｐＲＳ３０６−Ｅ６ＢＰ」と呼ぶ）
として、これらのクローンのそれぞれの寄託を、ブダペスト条約の約定の下に、
1994年７月８日、アメリカンタイプカルチャーコレクション（米国メリーランド
州Rockville）で行なった。ＡＴＣＣ受託番号第75827 号が、該寄託物に与えら
れた。この寄託物を手にして、当業者は、主題の組換えＥ６−ＢＰ遺伝子を生成
し、主題のＥ６結合タンパク質の組換え形態を発現できる。例えば、本発明のＥ
６結合タンパク質はそれぞれ、下記のプライマーを用いるＰＣＲによって、ＡＴ
ＣＣ寄託物第75827 号から増幅できるが：
これらは、それぞれＶＰ−１６遺伝子の上流、およびこのｃＤＮＡ挿入断片の下
流をハイブリッド形成することによって、ｃＤＮＡ挿入断片の増幅を始動する。
プライマー：
は、ＶＰ１６遺伝子内で、かつＶＰ１６／ｃＤＮＡ境界付近で始動するが、これ
も、ＡＴＣＣ寄託物のクローンを単離するのに用い得る。
その上、表１に与えたクローンのそれぞれに対する５’（および、場合によっ
ては３’末端）への便覧に照らして、ＡＴＣＣ寄託物の個々のクローンのそれぞ
れを、配列番号１〜７で与えたヌクレオチド配列に基づくプライマー、またはそ
のようなプライマーと、配列番号１５、１６および１７との組合せを用いて単離
できることは、当業者には直ちに明らかになるものと思われる。
単離したクローンは、組換えタンパク質を生成するために、発現ベクターへと
サブクローニングできるか、またはオリゴヌクレオチドプローブを生成するのに
用い得る。例示的実施態様では、主題のＡＴＣＣ寄託物のクローンのそれぞれに
対するコード化配列を用いて、オリゴヌクレオチドプローブを生成し、サザンハ
イブリッド形成および原位置ハイブリッド形成の検定法に用いて、Ｅ６結合タン
パク質のそれぞれの発現のパターンおよび多量性を検出している。
その上、各番号のＡＴＣＣ寄託物は、相互作用トラップ検定法から同定された
融合タンパク質をコードしているプラスミドであるから、このクローンは、例え
ば薬物ふるい分け検定法、またはこれに代えて、Ｅ６結合エピトープをマッピン
グするための突然変異誘発検定法として用いられる、類似のＩＴＳに、寄託物か
ら直接利用できる。
細菌および酵母の菌株
大腸菌ＤＨα（ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９（８０ｌａｃＺΔＭ１５）、
ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ１、ｒｅｌＡ１
）が、別途指示されない限り、すべてのプラスミド構築のための形質転換受容体
であった。酵母菌株ＤＢＹ１は、ＴＲＰ１遺伝子の不活化によって、ＢＧＷ１−
７α（ＭＡＴα ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｈｉｓ４−５１９ ａｄｅ
ｌｌ−１００ ｕｒａ３−５２）から誘導した。ＤＢＹ１を酵母の二ハイブリッ
ド系のための宿主として用いた。
プラスミド
ｐＢＹ−４中のＵＲＡ選択遺伝子を、ＳａｌＩによる消化で不活化し、プラス
ミドＣＶ−１３［Morrissey ら（1989）、J．Virol．、63：4,422 〜4,425］か
らのＬＥＵ２遺伝子で置き換えて、ｐＬ−７２を作成した。そのＣ末端でｐＫＰ
ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ２からのＢＰＶＥ２ＤＮＡ結合ドメインに融合したＨＰＶ−１
６Ｅ６遺伝子を有する、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ＢａｍＨＩに挿
入することによって、ｐＥ６Ｅ２Ｔを構築し、ＢＰＶ−１Ｅ２活性化ドメインを
有するＮｃｏＩフラグメントの削除によって、ｐＹＥｐｌａｃ１１２ＧＥ２から
ｐＹＥｐｌａｃ１１２ＧｐＹＥｐｌａｃ１１２ＧＥ２−ＲのＳａｌＩ部位を作成
した。
ＧＳＴ融合タンパク質の発現には、ｐＧＥＸプラスミド（Pharmacia）を用い
た。例えば、ＳＤ７クローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を、ｐＧ
ＥＸ−３Ｔに結合することによって、ｐＧＳＴＳＤ７を構築した。ｐＧＥＸ−２
ＴへのＨＰＶ６Ｅ６およびＨＰＶ６Ｅ６の開放読み枠の結合によって、ｐＧＳＴ
６Ｅ６およびｐＧＳＴ１６Ｅ６を構築した。ＧＳＴ−Ｅ６−ＡＰをコードしてい
るプラスミドは、既に記載されている［Huibregtseら（1993）、Mol．Cell．Bio
l.、13：4,918 〜4,927、1993］。生体外転写／翻訳のための遺伝子をクローニ
ングするには、ｐＳＰ６５プラスミドを用いた。ｐＳＰ６５の適切な部位へのＢ
ＰＶ−１Ｅ６、ＨＰＶ８Ｅ６およびＨＰＶ３１Ｅ６開放読み枠の結合によって、
ｐＳＰＢＰＶＥ６、ｐＳＰ８Ｅ６およびｐＳＰ３１Ｅ６を構築した。ｐＳＰ１Ｅ
６およびｐＳＰ１８Ｅ６は記載されている［Crook ら（1991）、Cell、67：547
〜556］。ｐＳＰ１１Ｅ６およびｐＳＰ１８Ｅ６も記載されている［Werness ら
（1990）、Science、248 ：76〜79］。ｐＳＰ７は、ｐＳＰ６５中のｐＳＤ７か
らのＥ６−ＢＰフラグメントを有する。
ライブラリーのふるい分け
酵母の形質転換はすべて、酢酸リチウム法によって実施した［Schiestlら（19
89）、Curr．Genet.、16：339 〜346］。酵母菌株ＤＢＹ１をｐＬ−７２および
ｐＥ６Ｅ２Ｔで形質転換して、ＤＬＥ６Ｅ２株を生成し、ＬＥＵ２+およびＴＲ
Ｐ１+マーカーについての選択下で維持した。次いで、ＤＬＥ６Ｅ２細胞を、ラ
ンダムに始動したＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡをＶＰ１６転写活性化ドメインにＣ末端
で挿入した酵母シャトルベクタープラスミドのライブラリーで形質転換した。形
質転換体を、２％グルコースを炭素源として含有するｔｒｐ-、ｕｒａ-および
ｌｅｕ-選択培地（ＹＭＭ）に播種した。３０℃で温置４８〜７２時間後に、選
択培地および２％ガラクトースを含有する新鮮平板に、コロニーをフィルター上
で形質転換し、更に１８時間温置して、Ｅ６Ｅ２およびＶＰ１６／ｃＤＮＡの発
現を誘導した。次いで、選択培地、２％ガラクトースおよびＸ−ｇａｌを含有す
る平板に、フィルターを形質転換した。発色時間は、８〜２４時間にわたり、そ
の間に、青色のコロニーを拾い出し、下記のとおり処理した。
２％ガラクトースを含有するｕｒａ-選択液体ＹＭＭ培地中で１週間またはそ
れ以上温置した後、陽性（青色）のコロニーからＶＰ１６／ｃＤＮＡプラスミド
を回収し、次いでＤＨ５αへと形質転換した。これらのＶＰ１６／ｃＤＮＡ遺伝
子を、新鮮ＤＬＥＥ６Ｅ２、またはｐＥ２−ＲとともにｐＬ−７２を含有する酵
母（ＤＬＥ２−Ｒ）中に導入した。ＤＬＥ６Ｅ２でのみ青色のコロニーを生じ、
ＤＬＥ２−Ｒでは生じなかったクローンを、Ｅ６特異的であると見なし、更に研
究した。
ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定
Ｅ６結合タンパク質の完全な長さのコード化配列を有するｃＤＮＡを得るため
、λｇｔ１１中でランダムに始動したケラチノサイト（Clontech）、およびポリ
ｄ（Ｔ）で始動したそれのｃＤＮＡライブラリーを、非放射能標識であるジゴキ
シゲニン−ｄＵＴＰによるランダムプライマー標識化キット（Boehringer-Mannh
eim）を用いて調製したＥ６−ＢＰの32Ｐ標識化５’フラグメントで、高い緊縮
度でふるい分けした。いくつかの陽性のラムダクローンを単離し、挿入断片を、
ＳａｃＩ−ＫｐｎＩフラグメントとしてのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ＋／−
、またはＰＣＲ産物としてのｐＵＣ１９へとサブクローニングした。シークエナ
ーゼ試薬（U.S．Biochemical）を用いるジデオキシ鎖終結法［Sangerら（1977）
、PNAS、74：5,463 〜5,467］によって、二本鎖ＤＮＡを配列決定した。ＧＣＧ
（Genetics Computer Group）のＦＡＳＴＡというプログラムを用いて、データ
ベースによる配列の比較を実施した。
タンパク質の発現および抗体
グルタチオンＳトランスフェラーセ（ＧＳＴ）融合タンパク質を大腸菌の菌株
ＤＨ５αまたはＪＭ１０９で発現させた。培養体１リットルを静止培養体１００
mlとともに接種し、１時間増殖させてから、０．２mMのＩＰＴＧで３時間誘導し
た。遠心分離によって細胞を採集し、０．０３％ＳＤＳ、２mMＤＴＴを加えた低
塩類会合緩衝液（ＬＳＡＢ：１００mMトリスＨＣｌ、pH８．０、１００mMＮａＣ
ｌ、１％ＮＰ−４０および１mMフッ化フェニルメチルスルホニル）に再懸濁し、
超音波によって溶菌した。10,000Ｇで１０分間の遠心分離の後、上清を捕集し、
グルタチオンセファロース（Pharmacia）と混合した。混合物を４℃で２時間回
転した。次いで、１，０００Ｇで２分間の遠心分離によって、ビーズを捕集し、
ＬＳＡＢ２０容で３回洗浄し、４℃で貯蔵した。
ウサギ網状赤血球溶菌液翻訳系（Promega）、および35Ｓ標識化システインま
たはメチオニン（ＩＣＮ）を用いることによって、生体外で翻訳されたタンパク
質を調製した。
ＧＳＴ−ＳＤ７融合タンパク質を精製し、ウサギに注射するのに用いた。血清
を捕集し、免疫沈降に用いた。
生体外結合
生体外結合のために、ＧＳＴ融合タンパク質約２μg を含有するグルタチオン
セファロース３０μl を、全体積を２５０μl としたＬＳＡＢ中で、35Ｓで標識
した生体外で翻訳されたタンパク質２〜２０μl と併せた。混合物を４℃で３時
間回転した。次いで、混合物をＬＳＡＢで６回洗浄し、ＳＤＳゲル装荷用緩衝液
中で沸騰させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。ゲルを固
定し、自己蛍光体（Dupont）に浸漬し、乾燥し、コダックＸＡＲフィルムに感光
させた。ゲルは、また、分子動的燐光体造影機（Molecular Dynamic Phosphor I
mager）で走査した。
上記で引用した参考文献および出版物はすべて、これにより参照によって組み
込まれる。
等価物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多数の等価物を
認識するか、または、通常の範囲内の実験を用いて確認できるものと思われる。
そのような等価物は、下記の請求の範囲によって包含されるものとする。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 38/17 Ｃ１２Ｎ 1/21
38/43 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
39/12 Ｃ１２Ｑ 1/68
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
19/00 33/48 Ｍ
Ｃ１２Ｎ 1/21 33/569 Ｌ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/12
Ｃ１２Ｑ 1/68 37/10 ＡＤＹ
Ｇ０１Ｎ 33/15 37/14 ＡＤＳ
33/48 37/02
33/569 37/48
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）