【発明の詳細な説明】
Mch2、アポトーシス性システインプロテアーゼ、ならびに組成物、ならびに
それを製造および使用する方法
発明の分野
本発明は、アポトーシス性（apoptotic）Ced-3/Iceシステインプロテアーゼ遺
伝子ファミリーの新しいメンバーであるMch2、ならびにそれを製造する方法およ
び使用使用する方法に関する。
発明の背景
新しいクラスのシステインプロテアーゼ遺伝子のいくつかのメンバーが、最近
、プログラム細胞死またはアポトーシスのレギュレーターとして発見されている
。これらの遺伝子には、哺乳動物のIce、Ich-1（Nedd2）およびCpp32（Mch1）遺
伝子、ならびにC．elegans Ced-3細胞死遺伝子が含まれる。ICEを除いて、Ich-1
、Cpp32、またはCed-3のタンパク質構造はいまだ決定されていない。しかし、構
造上の相同性に基づくと、これらの酵素は古典的システインプロテアーゼに類似
の構造および古典的システインプロテアーゼに無関係な独特の構造を有する。こ
れらは全て、活性部位QACRG（配列番号１）ペンタペプチドを含有する。さらに
、構造解析により、これらの酵素が不活性なプロ酵素として合成されることが示
唆される。プロ酵素は、保存されたアスパラギン酸切断部位でタンパク質分解に
よって切断されて２つのポリペプチドサブユニットを生成することにより活性化
される。ICEにおいて、これらのサブユニットは、互いに会合して活性なヘテロ
複合体を形成するp20およびp10サブユニットとして知られている。
アポトーシス性細胞死は、多細胞生物における正常な組識サイズのホメオスタ
シスの発達および維持に不可欠である。アポトーシスの異常調節（dysregulatio
n）が、ガン、ならびにアルツハイマー病およびパーキンソン病のような変性ニ
ューロン疾患を含む、いくつかのヒト疾患に導き得るという証拠は増えつつある
。したがって、ICE様システインプロテアーゼは、これらの疾患の病因に重要な
役
割を果していると思われる。
アポトーシス性Ced-3/Iceシステインプロテアーゼ遺伝子ファミリーのメンバ
ーを同定する必要がある。アポトーシス性Ced-3/Iceシステインプロテアーゼ遺
伝子ファミリーのメンバーを単離する必要があり、そしてアポトーシス性Ced-3/
Iceシステインプロテアーゼ遺伝子ファミリーのメンバーを生産および単離する
ための組成物および方法が必要とされている。アポトーシス性Ced-3/Iceシステ
インプロテアーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである単離されたタンパク質が必
要とされている。アポトーシス性Ced-3/Iceシステインプロテアーゼ遺伝子ファ
ミリーのメンバーをコードする、単離された核酸分子が必要とされている。アポ
トーシス性Ced-3/Iceシステインプロテアーゼ遺伝子ファミリーのメンバーの活
性を阻害する化合物が必要とされている。そのような化合物を同定するためのキ
ットおよび方法が必要とされている。
発明の要旨
本発明は、配列番号５または配列番号７に示すアミノ酸配列を有する、実質的
に純粋なタンパク質に関する。
本発明は、配列番号５または配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク
質を薬学的に受容可能なキャリアと共に含む、薬学的組成物に関する。
本発明は、配列番号５または配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。
本発明は、配列番号５または配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードする核酸配列を含む核酸分子を、薬学的に受容可能なキャリアと共に
含む、薬学的組成物に関する。
本発明は、配列番号４または配列番号６からなる単離された核酸分子、または
少なくとも５ヌクレオチドを有するそのフラグメントに関する。
本発明は、配列番号４または配列番号６を含むヌクレオチド配列を有する核酸
分子を含む、組換え発現ベクターに関する。
本発明は、配列番号４または配列番号６を含むヌクレオチド配列を有する核酸
分子を含む組換え発現ベクターを含む、宿主細胞に関する。
本発明は、配列番号４または配列番号６の少なくとも５ヌクレオチドのヌクレ
オチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド分子に関す
る。
本発明は、配列番号５および/または配列番号７上のエピトープに結合する、
単離された抗体に関する。
本発明は、Mch2αの基質、アクチベーター、またはインヒビターを同定する方
法に関する。
本発明は、Mch2を発現する細胞を、Mch2遺伝子配列の転写またはMch2 mRNAの
翻訳を防止するアンチセンスヌクレオチド配列を含む核酸分子と接触させること
によって、Mch2の発現を阻害する方法に関する。
発明の詳細な説明
新規のシステインプロテアーゼを単離し、そしてそれを特徴づけるために、PC
R技術を開発した。ICE様アポトーシス性システインプロテアーゼに存在する高度
に保存されたアミノ酸配列をコードするDNA配列を、このようなプロテアーゼに
関連する特異的配列に基づいて設計したPCRプライマーを用いて増幅する。この
クローニングストラテジーには、公知のアポトーシス性システインプロテアーゼ
の全てに存在する高度に保存されたペンタペプチドQACRG（配列番号１）およびG
SWFI（配列番号２）をコードする縮重オリゴヌクレオチドを利用した。PCRは、
ヒトJurkatＴリンパ球由来のmRNAを用いて行なった。新しい遺伝子は、ヒトCpp3
2、C．elegans細胞死タンパク質CED-3、哺乳動物Ice-1（Nedd2）、および哺乳動
物インターロイキン-1β転換酵素（ICE）に対して高度に相同な約34kDaのタンパ
ク質をコードする。C．elegans Ced-3遺伝子に対するその高度な相同性から、こ
の新しい遺伝子、哺乳動物Ced-3ホモログをMch2と命名した。これは、2つのイソ
型を含む。
Mch2 mRNAは、以下のヒト腫瘍細胞株から単離した全細胞RNA中に検出されてい
る：Peer、SupT1、CEM C7、CEM C1、Molt4およびJurkatTリンパ球；679および38
0、前Bリンパ球；K562、前骨髄球；HeLa、子宮頸癌腫；A431、外陰癌腫；Colo32
0、結腸腺癌；MCF7、乳癌；A173、神経膠芽腫；293、Ad-5-形質転換腎胚芽線維
芽細胞。
2つのMch2転写産物（Mch2α＝1.7kbおよびMch2β＝1.4kb）が、JurkatＴリン
パ球および他の細胞株で検出された。Mch2α転写産物は完全長Mch2をコードする
と考えられ、Mch2β転写産物は、おそらくはオルタナティブスプラインシング（
alternative splicing）の結果として、より短いMch2イソ型をコードすると考え
られる。
ICEおよびCpp32と同様に、組換えMch2αは、蛍光標識（fluorogenic）ペプチ
ドDEVD-AMC（配列番号３）を切断するその能力によって決定されるプロテアーゼ
活性を有するが、Mch2βはこの活性を有さない。Mch2およびCPP32はまた、ポリ
（ADP-リボース）（PARP）をインビトロで切断し得、このことは、細胞のアポト
ーシスの間に観察されるPARP切断に、これらの酵素が関与することを示唆してい
る。さらに、組換えMch2αの過剰発現は、Sf9昆虫細胞において迅速なアポトー
シスを誘導するが、Mch2βはこれを誘導しない。これらのデータに基づき、Mch2
は、Ced-3/ICE様システインプロテアーゼとして、および哺乳動物細胞における
アポトーシスのメディエーターの候補として特徴づけられた。
Mch2およびその2つのイソ型の発見は、このアポトーシス性システインプロテ
アーゼの特異的なインヒビター、アクチベーターおよび基質を設計および発見す
る手段を提供する。本発明によれば、Mch2αを使用して、インヒビター、アクチ
ベーター、または基質について化合物をスクリーニングし得る。インヒビターは
、抗アポトーシス剤として有用である。アクチベーターは、抗腫瘍活性のような
細胞傷害性効果を有するアポトーシス剤として有用である。基質は、インヒビタ
ーおよびアクチベーターを同定するためのアッセイにおける試薬として有用であ
る。Mch2αインヒビターについて化合物をスクリーニングするためのキットが提
供される。Mch2αアクチベーターについて化合物をスクリーニングするためのキ
ットが提供される。Mch2α基質について化合物をスクリーニングするためのキッ
トが提供される。Mch2イソ型をコードするヌクレオチド配列を本明細書に開示す
る。これは、純粋なタンパク質の生産、Mch2イソ型をコードする核酸分子に特異
的にハイブリダイズするプローブを設計するためのおよびMch2イソ型の転写を阻
害するためのアンチセンス化合物の設計を可能にする。抗Mch2α抗体および抗Mc
h2β
抗体が提供される。抗Mch2α抗体は、Mch2αのインヒビターであり得、そして純
粋なMch2を単離する方法およびMch2α活性を阻害する方法において使用し得る。
抗Mch2β抗体は、Mch2βのインヒビターであり得、そして純粋なMch2を単離する
方法およびMch2β活性を阻害する方法において使用し得る。
本発明は、それぞれ、配列番号５および配列番号７からなるアミノ酸配列を有
する、実質的に精製されたMch2イソ型のMch2αおよびMch2βを提供する。Mch2イ
ソ型のMch2αおよびMch2βは、天然の供給源から単離され得るか、組換えDNA法
によって生産され得るか、または標準的なタンパク質合成技術により合成され得
る。
特定のMch2イソ型に特異的に結合する抗体は、周知の技術および容易に入手可
能な出発物質を用いて、天然の供給源からそのタンパク質を精製するために使用
され得る。このような抗体を使用して、組換えDNA方法論によってタンパク質を
生産する場合に存在する物質から、Mch2イソ型を精製し得る。本発明は、Mch2α
−配列番号５およびMch2β−配列番号７からなる群より選択されるMch2イソ型上
に存在するエピトープに結合する抗体に関する。本明細書中で使用する用語「抗
体」は、完全な無傷の抗体、ならびにそのFabフラグメントおよびF（ab）2フラ
グメントを意味する。完全な無傷の抗体には、マウスモノクローナル抗体のよう
なモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体が含まれる。いくつかの
実施態様において、抗体がMch2−配列番号５およびMch2β−配列番号７の一方の
みのエピトープに特異的に結合する。Mch2イソ型上に存在するエピトープに結合
する抗体は、そのMch2イソ型を、アフィニティークロマトグラフィーのような周
知の技術を用いて天然の供給源または組換え発現系の両方から単離および精製す
るのに有用である。このような抗体は、試料中のこのようなタンパク質の存在を
検出し、そして細胞がそのタンパク質を発現しているかどうかを決定するのに有
用である。
抗体の生産、および完全な無傷の抗体、Fabフラグメント、およびF（ab）2フ
ラグメントのタンパク質構造、ならびにこのような分子をコードする遺伝子配列
の構成は周知であり、そして例えば、Harlow，E.およびD．Lane（1988）ANTIBOD
IES: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harb
or,NY.（これは、本明細書中において参考として援用される）に記載されている
。簡単に述べれば、例えば、Mch2イソ型タンパク質またはその免疫原性フラグメ
ントをマウスに注射する。そのマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞を単離し、そし
て不死化マウス細胞と融合する。そのハイブリッド細胞またはハイブリドーマを
培養し、そして抗体を分泌する細胞を選択する。それらの抗体を分析して、Mch2
イソ型に特異的に結合することが見出される場合、抗体を継続的に供給するため
、それらを産生するハイブリドーマを培養する。
標準的な技術および容易に入手可能な出発物質を使用して、配列番号４または
配列番号６に開示するヌクレオチド配列情報を用いて設計したプローブまたはプ
ライマーを使用することにより、Mch2イソ型のそれぞれをコードする核酸分子を
、cDNAライブラリーから単離し得る。本発明は、それぞれ、配列番号５および配
列番号７のアミノ酸配列を含むMch2αおよびMch2βからなる群より選択されるMc
h2イソ型をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。い
くつかの実施態様において、その核酸分子は、Mch2αまたはMch2βをコードする
ヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施態様において、その核酸分子は、配
列番号４または配列番号６のコード配列からなるヌクレオチド配列を含む。いく
つかの実施態様において、その核酸分子は、配列番号４または配列番号６に記載
のヌクレオチド配列からなる。本発明の単離された核酸分子は、本発明のMch2イ
ソ型を調製するための構築物および組換え発現系を調製するのに有用である。
cDNAライブラリーは、周知の技術によって作製され得る。このヌクレオチド配
列の１つを含有するcDNAクローンは、配列番号４または配列番号６に開示するヌ
クレオチド配列の少なくとも一部を含むプローブを用いて同定される。そのプロ
ーブは、少なくとも16ヌクレオチド、好ましくは24ヌクレオチドを有する。その
プローブを用いて、標準的なハイブリダイゼーション技術を使用し、cDNAライブ
ラリーをスクリーニングする。あるいは、出発物質として任意のヒト細胞由来の
ゲノムDNAを用いて、ゲノムクローンを単離し得る。本発明は、配列番号４また
は配列番号６の少なくとも10ヌクレオチドであるフラグメントと同一または相補
的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。いくつかの実施態様
において、その単離された核酸分子は、配列番号４または配列番号６の少なくと
も10ヌクレオチドであるフラグメントと同一または相補的なヌクレオチド配列か
らなる。いくつかの実施態様において、その単離された核酸分子は、配列番号４
または配列番号６の15〜150ヌクレオチドであるフラグメントと同一または相補
的なヌクレオチド配列を含むか、あるいはそのヌクレオチド配列からなる。いく
つかの実施態様において、その単離された核酸分子は、配列番号４または配列番
号６の15〜30ヌクレオチドであるフラグメントと同一または相補的なヌクレオチ
ド配列を含むか、またはそのヌクレオチド配からなる。配列番号４または配列番
号６の少なくとも10ヌクレオチドであるフラグメントと同一または相補的なヌク
レオチド配列を含むか、またはそのヌクレオチド配列からなる、単離された核酸
分子は、それぞれ、配列番号４または配列番号６を有する遺伝子およびcDNA配列
を同定するためのプローブとして、それぞれ、配列番号４または配列番号６を有
する遺伝子およびcDNAを増幅するためのPCRプライマーとして、ならびに、それ
ぞれ、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を有するMch2イソ型をコード
する、それぞれ、遺伝子およびcDNAの転写および翻訳を阻害するためのアンチセ
ンス分子として有用である。
Mch2イソ型をコードするcDNAは、試料からのcDNAを電気泳動ゲルで分離し、そ
してMch2イソ型プローブを用いてこのようなプローブにハイブリダイズするバン
ドを同定する電気泳動アッセイにおいて、分子量マーカーとして使用され得る。
詳細には、配列番号４もしくはその一部、または配列番号６もしくはその一部は
、試料からのcDNAを電気泳動ゲルで分離し、そしてMch2イソ型特異的プローブを
用いてそれらにハイブリダイズするバンドを同定することにより、そのバンドが
そのプローブの配列に相補的なヌクレオチド配列を有することを示す電気泳動ア
ッセイにおける分子量マーカーとして使用し得る。サイズマーカーとして提供さ
れる単離された核酸分子は、そのプローブにハイブリダイズすることが公知の陽
性バンドとして現われるので、それをMch2αおよびMch2βをコードするcDNAのサ
イズに対する参照点として使用することができる。このようなアッセイに有用な
電気泳動ゲルには、Sambrookら，Molecular Cloning a Laboratory Manual,第2
版，Cold Spring Harbor Press（1989）（これは、本明細書中で参考として援用
される）に記載の標準的なポリアクリルアミドゲルを含む。
配列番号４および配列番号６におけるヌクレオチド配列を使用して、それぞれ
Mch2αおよびMch2βに特有なヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするプ
ローブ、プライマー、および相補分子を設計し得る。Mch2αおよびMch2βをコー
ドするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするプローブ、プライマー、
および相補分子は、当業者により日常的に設計され得る。
本発明はまた、Mch2αおよびMch2βを同定するためにオリゴヌクレオチドハイ
ブリダイゼーション法を行なうためのプローブとして有用な標識オリゴヌクレオ
チドを包含する。したがって本発明は、標識され得、そしてMch2αおよびMch2β
の特有なヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るプローブを包含する。本発明
の標識プローブは、放射線標識ヌクレオチドで標識されているか、そうでなけれ
ば、容易に入手可能な非放射性検出系により検出され得る。いくつかの好ましい
実施態様において、プローブは、10と100との間のヌクレオチドからなるオリゴ
ヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい実施態様において、プローブは、10と
50との間のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの好まし
い実施態様において、プローブは、12と20との間のヌクレオチドからなるオリゴ
ヌクレオチドを含む。このプローブは、好ましくは、Mch2αおよびMch2βの独特
なヌクレオチド配列のフラグメントと完全に同一または相補的なヌクレオチド配
列を含有する。
PCR技術は、当業者により日常的に実施され、そして診断におけるその使用は
周知であり、そして受容されている。PCR技術を実施する方法は、「PCR Protoco
ls: A Guide to Methods and Applications」（Innis，M.A.ら編，Academic Pre
ss，Inc.,San Diego,CA（1990）；これは、本明細書中において参考として援用
される）に開示されている。PCR技術の応用は、「Polymerase Chain Reaction」
（Erlich，H.A.ら編，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY（1989
）；これは本明細書中において参考として援用される）に開示されている。効率
のよいプライマーの設計において、いくつかの簡単の規則が役立つ。代表的なプ
ライマーは、長さが18〜28ヌクレオチドで、50%〜60%のg＋c含量を有する。プラ
イマー全体は、好ましくは、それがハイブリダイズすべき配列に相補的である。
好ましくは、プライマーは、100塩基対〜2000塩基対のPCR産物を生成する。しか
し、50塩基対から10kb以上までの産物を生成することは可能である。
PCR技術は、核酸分子中に存在する配列にハイブリダイズする5'プライマーお
よび3'プライマーを提供し、さらにプライマー間のヌクレオチド配列をその遊離
のヌクレオチドを用いて相補的な塩基で充填して、DNAの相補鎖を生産する遊離
のヌクレオチドと酵素とを提供することにより、ヌクレオチド配列の複数コピー
の迅速な生成を可能にする。その酵素は、プライマーに隣接する相補配列を充填
する。5'プライマーおよび3'プライマーの両方が、同じ核酸フラグメントの相補
鎖上のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合、特異的二本鎖産物の指数関
数的な増幅が起こる。単一のプライマーのみが核酸分子にハイブリダイズする場
合、直線的な増幅により、種々の長さの一本鎖産物が生成される。
当業者は、Mch2αまたはMch2βをコードする核酸分子を単離し得、そして標準
的な技術および容易に入手可能な出発物質を用いて、それを発現ベクターに挿入
し得る。
本発明は、それぞれ、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を含むMch2
αまたはMch2βをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターに関
する。本明細書中で使用する用語「組換え発現ベクター」は、プラスミド、ファ
ージ、ウイルス粒子またはその他の、適当な宿主に導入した場合、本発明のMch2
イソ型をコードするコード配列の発現を指向するのに必要な遺伝子エレメントを
含有するベクターを意味する。コード配列は、その必要な調節配列に作動可能に
連結される。発現ベクターは周知であり、そして容易に入手可能である。発現ベ
クターの例には、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター、および他の核酸配
列または、宿主細胞の形質転換およびコード配列の発現の促進に有用なビヒクル
を含む核酸分子が含まれる。いくつかの実施態様において、組換え発現ベクター
は、配列番号４または配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む。本発明の組
換え発現ベクターは、宿主を形質転換して、本発明のMch2イソ型を調製するため
の組換え発現系を調製するのに有用である。
本発明は、配列番号５または配列番号７を含むMch2イソ型をコードするヌクレ
オチド配列を含有する組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。いくつかの
実施態様において、その宿主細胞は、配列番号４または配列番号６を含む組換え
発現ベクターを含む。タンパク質産生用の周知の組換え発現系で使用するための
宿主細胞は周知であり、そして容易に入手可能である。宿主細胞の例には、E.co
liのような細菌細胞、S．cerevisiaeのような酵母細胞、S．frugiperdaのような
昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のような非ヒト哺乳動物組
識培養細胞、およびHeLa細胞のようなヒト組識培養細胞を含む。
本発明は、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列含有するMch2イソ型を
コードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含むトランスジェニック非ヒト
哺乳動物に関する。組換えタンバク質の産生に有用なトランスジェニック非ヒト
哺乳動物は、トランスジェニック動物の生成に必要な発現ベクターおよび技術が
周知である。一般に、このトランスジェニック動物は、本発明のMch2イソ型をコ
ードするヌクレオチド配列が乳房細胞特異的プロモーターに作動可能に連結され
ている組換え発現ベクターを含むので、コード配列は乳房細胞内でのみ発現し、
そしてそのように、発現された組換えタンパク質は、その動物の乳汁から回収さ
れる。いくつかの実施態様において、Mch2イソ型をコードするコード配列は、配
列番号４または配列番号６である。
例えば、いくつかの実施態様において、当業者は、周知の技術を用いて、この
ようなDNA分子を、周知の発現系において使用される市販の発現ベクターに挿入
し得る。例えば、市販のプラスミドpSE420（Invitrogen，San Diego，CA）は、E
．coliにおけるコラーゲンの生産のために使用され得る。例えば、市販のプラス
ミドpYES2（Invitrogen，San Diego，CA）は、酵母のS．cerevisiae株における
生産のために使用され得る。例えば、市販のMAXBACTM完全バキュロウイルス発現
系（Invitrogen，San Diego，CA）は、昆虫細胞における生産のために使用され
得る。例えば、市販のプラスミドpcDNAI（Invitrogen，San Diego，CA）は、チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳動物細胞における生産のために使用
され得る。当業者は、慣例の技術および容易に利用可能な出発物質を用いて、本
発明のMch2イソ型を生産するためにこれらの市販の発現ベクターおよび系または
その他を用い得る。（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning a Laboratory M
anual，第2版，Cold Spring Harbor Press（1989）を参照のこと；これは、参考
として本明細書に援用される）。従って、所望のタンパク質を、原核生物系およ
び真核生物系の両方において調製して、一連のプロセスされた形態のタンパク質
を得ることができる。
当業者は、他の市販の発現ベクターおよび系を使用し得るか、または周知の方
法および容易に利用可能な出発物質を用いてベクターを生成し得る。プロモータ
ーおよびポリアデニル化シグナル、および好ましくはエンハンサーのような必要
な制御配列を含有する発現系は、容易に利用可能であり、そして当該分野におい
て種々の宿主について公知である。例えば、Sambrookら，Molecular Cloning a
Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press（1989）を参照のこと。
現在、組換え外来タンパク質の生産のために、広範な真核生物宿主もまた利用
可能である。細菌におけると同様に、所望のタンパク質を直接生産する発現系で
、真核生物宿主を形質転換し得るが、より一般的には、そのタンパク質の分泌を
もたらすためにシグナル配列が提供される。真核生物系は、それが高等生物のタ
ンパク質コードするゲノム配列中に生じ得るイントロンをプロセシングし得ると
いうさらなる利点を有する。真核生物系はまた、例えば、グリコシル化、カルボ
キシ末端アミド化、特定のアミノ酸残基の酸化または誘導体化、コンフォメーシ
ョン制御などを生じる種々のプロセシング機構を提供する。
一般的に使用される真核生物系としては、酵母、菌類細胞、昆虫細胞、哺乳動
物細胞、鳥類細胞および高等植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの各々の宿主タイプにおける使用に適合性でありかつ作動可能な適切なプ
ロモーターならびに終結配列およびエンハンサーが利用可能である（例えば、バ
キュロウイルス多角体プロモーター）。上記のように、プロモーターは構成性ま
たは誘導性のいずれでもあり得る。例えば、哺乳動物系において、マウスメタロ
チオネインプロモーターは、重金属イオンの添加によって誘導され得る。
所望の宿主のために適切な発現系の構築についての詳細は、当業者に公知であ
る。簡潔に記載すると、タンパク質の組換え生産のために、ポリペプチドをコー
ドするDNAは、選択した発現ベクター中に適切に連結される。DNAは、選択された
宿主におけるそのDNAの発現のために必要なすべての制御エレメントに、作動可
能に連結される。当業者は、周知の技術を用いて、ポリペプチドの組換え生産の
ための発現ベクターを調製し得る。
Mch2イソ型をコードするDNAを含む発現ベクターを用いて、適合性の宿主を形
質転換し、次いでこれを外来DNAの発現が生じる条件下で培養および維持する。
このようにして生産された本発明のタンパク質は、適切であり、そして当業者に
公知なように、その細胞を溶解することによって、または培養培地からのいずれ
かで、培養物から回収される。当業者は、周知の技術を用いて、このような発現
系を用いて生産されたMch2イソ型を単離し得る。Mch2イソ型を天然の供給源から
、上記のようにMch2イソ型に特異的に結合する抗体を用いて精製する方法は、組
換えDNA法によって生産されたMch2イソ型の精製に、同じく適用され得る。
遺伝子構築物の例としては、その中にその構築物をトランスフェクトされる細
胞株において機能性であるプロモーターに作動可能に連結されたMch2イソ型コー
ド配列が挙げられる。構成性プロモーターの例としては、サイトメガロウイルス
またはSV40由来のプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては
、マウス乳白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
当業者は、Mch2イソ型をコードするDNAで細胞をトランスフェクトすることのた
めに有用な遺伝子構築物を、容易に利用可能な出発物質から、容易に生成し得る
。このような遺伝子構築物は、Mch2イソ型の生産のために有用である。
本発明のいくつかの実施態様において、トランスジェニック非ヒト動物が生成
される。本発明のトランスジェニック動物は、乳特異的プロモーターの調節制御
下で、配列番号４または配列番号６を含む。当業者は、Wagnerの米国特許第4,87
3,191号（1989年10月10日発行）およびLederの米国特許第4,736,866号（1988年
４月12日発行）（これらの両方は、参考として本明細書に援用される）に教示さ
れているような標準的技術を用いて、Mch2イソ型を生産するトランスジェニック
動物を生成し得る。好ましい動物は、齧歯類、特にヤギ、ラットおよびマウスで
ある。
組換え技術によるこれらタンパク質の生産に加えて、本発明のMch2イソ型を生
産するために、自動化ペプチド合成装置も用い得る。そのような技術は、当業者
に周知であり、そしてDNAでコードされるタンパク質の生産においては提供され
ない置換を有する誘導体の場合に有用である。
Mch2βは不活性である。Mch2活性は、この方法で調節され得る。すなわち、Mc
h2βはMch2αと競合し得、そしてMch2βレベルの増加は、全体的なMch2活性を減
少させ得る。オルタナティブスプラインシングされたMch2イソ型の発現の生物学
的意義は、Mch2活性を調整するその能力から認識される。
従って、Mch2βは、アポトーシスに関与するMch2β活性を阻害するための医薬
として使用され得る。同様に、Mch2βをコードする核酸分子は、遺伝子治療のた
めの薬学的組成物の一部として使用され得る。アポトーシスにより特徴付けられ
る疾患としては、HIV感染症およびアルツハイマー病が挙げられる。当業者は、
このような疾患、症状および障害を罹っていることが疑われる個体を、標準的な
診断技術を用いて、容易に同定し得る。
Mch2αは、その除去が所望される細胞におけるアポトーシスを誘導するための
医薬として使用され得る。同様に、Mch2αをコードする核酸分子は、遺伝子治療
のための薬学的組成物の一部として使用され得る。アポトーシスの誘導による細
胞の除去が所望される疾患としては、ガンおよび自己免疫疾患が挙げられる。当
業者は、そのような疾患、症状および障害を罹っていることが疑われる個体を、
標準的な診断技術を用いて、容易に同定し得る。
本発明による薬学的組成物は、Mch2αまたはMch2βと組み合わせて薬学的に受
容可能なキャリアを含む。薬学的組成物は周知であり、そしてMch2αまたはMch2
βを含む薬学的組成物は、当業者により慣例的に処方され得る。適切な薬学的キ
ャリアは、この分野における標準的参考書であるRemington s Pharmaceutical S
ciences，A．Osol（これは参考として本明細書に援用される）に記載されている
。本発明は、薬学的に受容可能なキャリアおよびMch2αまたはMch2βを含む注射
可能な薬学的組成物に関する。本発明のいくつかの実施態様は、薬学的に受容可
能なキャリアおよび配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を含む注射可能
な薬学的組成物に関する。Mch2αまたはMch2βは、好ましくは無菌であり、そし
て無菌の薬学的キャリアと組み合わされる。
例えば、いくつかの実施態様において、Mch2αまたはMch2βは、薬学的に受容
可能な賦形剤とともに、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として
処方され得る。このような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液
、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソー
ム、
および不揮発性油のような非水性賦形剤もまた使用され得る。賦形剤または凍結
乾燥粉末は、等張性を維持する添加物（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール
）および化学的安定性を維持する添加物（例えば、緩衝剤および保存剤）を含有
し得る。処方物は、一般的に使用される技術により滅菌される。
注射可能な組成物は、Mch2αまたはMch2βを、例えば、無菌水、電解質/デキ
ストロース、野菜起源の脂肪油、脂肪エステル、またはポリオール（例えば、プ
ロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）などの希釈剤中に含み得る
。注射可能物は無菌でありかつ発熱物質なしでなければならない。
Mch2αまたはMch2βをコードする核酸分子は、適合性の宿主細胞におけるそれ
らの導入および発現をもたらすように、種々の送達成分（例えば、組換えウイル
ス発現ベクターまたはその他の適切な送達手段）の任意のものを用いて送達され
得る。一般に、ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスおよび組換えワクシ
ニアウイルスのようなDNAウイルスであり得るか、または組換えレトロウイルス
のようなRNAウイルスであり得る。その他の組換えベクターとしては、細胞に感
染し得、そして組換え遺伝子を発現し得る組換え原核生物が挙げられる。組換え
ベクターに加えて、リポソーム中の被包、トランスフェリン媒介性トランスフェ
クションおよびその他のレセプター媒介性手段のようなその他の送達成分もまた
意図される。本発明は、等価な機能を果たし、そして今後当該分野で公知となる
、そのような他の形態の発現ベクター、および他の適切な送達手段を包含するこ
とが意図される。
本発明の１つの実施態様において、DNAが、アデノウイルスによりコンピテン
トな宿主細胞に送達される。当業者は、このような手段によって宿主細胞にDNA
を送達するこの技術を、容易に理解する。本発明は、好ましくはアデノウイルス
を包含するが、本発明は等価な機能を果たす任意のウイルスを包含することが意
図される。
本発明の別の実施熊様において、RNAが、レトロウイルスによりコンピテント
な宿主細胞に送達される。当業者は、このような手段によって宿主細胞にRNAを
送達するこの技術を容易に理解する。RNAによってコードされるタンパク質を発
現させるために役立つ任意のレトロウイルスが、本発明に包含されることが意図
される。
本発明の別の実施態様において、核酸が、葉酸レセプター手段によって送達さ
れる。細胞に送達されるべき核酸配列は、ポリリジンに連結され、そして複合体
が葉酸レセプターにより細胞に送達される。Lowらの米国特許第5,108,921号（19
92年４月28日発行、これは参考として本明細書に援用される）は、そのような送
達成分を記載する。
本発明による薬学的組成物は、Mch2αまたはMch2βをコードする核酸分子と組
み合わせて、さらに薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤（例えば、生理食
塩水）を含有する送達成分を含む。核酸の送達の成功を可能にする任意の媒質が
使用され得る。当業者は、本発明において使用され得る多数の薬学的に受容可能
な媒質を容易に理解する。
本発明の薬学的組成物は、活性な薬剤を哺乳動物の身体におけるその薬物の作
用部位に到達させることを可能にする任意の手段によって投与され得る。薬学的
組成物は、非経口的に（すなわち静脈内、皮下、筋肉内）投与され得る。静脈内
投与が好ましい経路である。
投与量は、特定の薬剤の薬力学的特徴、ならびに、その投与の様式および経路
；レシピエントの年齢、健康および体重；症状の性質および程度；同時処置の種
類；処置の頻度、ならびに所望される効果のような既知の要因に依存して変化す
る。
本発明の１つの局面によれば、化合物をスクリーニングして、Mch2αインヒビ
ター、アクチベーターまたは基質を同定し得る。Mch2αのインヒビターは、抗ア
ポトーシス剤として有用である。Mch2αのアクチベーターは、細胞傷害性薬剤と
して有用である。Mch2αの基質は、Mch2α活性を有する化合物をスクリーニング
するためのアッセイにおける試薬として有用である。
Mch2αのインヒビターは、化合物をスクリーニングして、Mch2α活性に対する
それらの影響を確かめることによって同定され得る。本発明のいくつかの実施態
様において、化合物をスクリーニングして、Mch2αを試験化合物の存在下または
非存在下で細胞に送達することにより、インヒビターを同定する。アッセイ条件
下で、細胞は、試験化合物の非存在下でアポトーシス性になる。試験化合物の存
在下で、細胞がアポトーシス性にならない場合、その試験化合物はMch2αの候補
インヒビターである。Mch2α活性を阻害する抗体はインヒビターとして有用であ
り、そしてそれゆえアッセイにおけるポジティブコントロールとして有用である
。いくつかの実施態様において、Mch2αをタンパク質として細胞に送達する。い
くつかの実施態様において、Mch2αをそのタンパク質をコードする核酸分子とし
て細胞に送達する。本発明のいくつかの実施態様において、Mch2αを試験化合物
の存在下または非存在下で基質と接触させることにより、化合物をスクリーニン
グして、インヒビターを同定する。アッセイ条件下で、試験化合物の非存在下で
、基質は切断される。基質が試験化合物の存在下ではプロセシングされないが、
試験化合物が存在しないネガティブコントロール条件下ではプロセシングされる
場合、その試験化合物はMch2αのインヒビターである。当業者は、基質がプロセ
シングされたか否かを容易に検出し得る。Mch2α活性を阻害する抗体は、インヒ
ビターとして有用であり、そしてそれゆえアッセイにおけるポジティブコントロ
ールとして有用である。
Mch2αのアクチベーターは、化合物をスクリーニングしてMch2α活性に対する
それらの影響を確かめることによって同定され得る。本発明のいくつかの実施態
様において、Mch2αを試験化合物の存在下または非存在下で細胞に送達すること
により、化合物をスクリーニングして、アクチベーターを同定する。アッセイ条
件下で、それらの細胞は試験化合物の非存在下でアポトーシス性になる。試験化
合物の存在下でアポトーシス性活性が増大、拡大または促進される場合、その試
験化合物はMch2αの候補アクチベーターである。いくつかの実施態様において、
Mch2αをタンパク質として細胞に送達する。いくつかの実施態様において、Mch2
αをタンパク質をコードする核酸分子として細胞に送達する。本発明のいくつか
の実施態様において、Mch2αを試験化合物の存在下または非存在下で基質と接触
させることにより、化合物をスクリーニングして、アクチベーターを同定する。
アッセイ条件下で、基質は試験化合物の非存在下で切断される。基質が、試験化
合物が存在しないコントロール条件下に生じるプロセシングのレベルと比較して
、試験化合物の存在下でより迅速にまたはより効率的にプロセシングされる場合
、その試験化合物はMch2αのアクチベーターである。当業者は、基質がプロセシ
ン
グされた速度を容易に検出し得る。
本明細書において用いられる用語、基質は、Mch2αによって切断されるペプチ
ドをいう。基質の例としては、ICE蛍光原性ペプチド基質DEVD-AMC（配列番号３
）または蛍光原性ペプチド基質DEVD-AMC（配列番号３）とタンパク質分解的切断
部位を共有し、そしてMch2αによって切断されるペプチドが挙げられる。本発明
は、Mch2αによってプロセシングされ得る他の基質を同定するための方法および
キットを包含し得る。当業者は、プロセシングされた基質を容易に同定し得る。
本発明のいくつかの実施態様において、試験化合物の好ましい濃度は１μM〜5
00μMの間である。好ましい濃度は、10μM〜100μMである。いくつかの好ましい
実施態様において、試験化合物の連続希釈物を使用することが所望される。
試験化合物をスクリーニングするために必要な試薬を含む容器を含むキットが
包含される。このようなキットは、Mch2αおよび/またはMch2αをコードする核
酸分子、ならびにそのアッセイを行なうための説明書を含む。キットは、細胞、
または蛍光原性ペプチド基質DEVD-AMC（配列番号３）のような基質、およびプロ
セシングされた基質を切断されていない基質から区別するための手段を含み得る
。任意に、Mch2βおよび/またはMch2βをコードする核酸分子がコントロールと
して提供され、そして/あるいは、抗Mch2α抗体がコントロールとして提供され
る。
プロセシングされた基質を切断されていない基質から区別するための手段とし
ては、例えば、プロセシングされた基質には結合するが、切断されていない基質
には結合しない抗体、切断されていない基質には結合するが、プロセシングされ
た基質には結合しない抗体、および標識された切断されていない基質が固相に結
合され、そしてその基質の酵素によるプロセシングに際して、標識が固相から遊
離され、その時にそれが非結合として検出されるか、または結合した物質からそ
の非存在が検出されるかのいずれかである遊離アッセイ試薬が挙げられる。当業
者は、キットを容易に設計して、本発明のアッセイを実施し得、そして試験化合
物がMch2α活性を阻害する能力を測定し得る。インヒビターは抗アポトーシス剤
として有用である。アクチベーターはアポトーシス剤として有用である。
本発明の別の局面によれば、トランスジェニック動物、特にトランスジェニッ
クマウスが生成される。いくつかの実施態様において、本発明によるトランスジ
ェニック動物は、Mch2をコードする核酸分子を含有する。このようなトランスジ
ェニックマウスは、Mch2の過剰発現を研究するための動物モデルとして、そして
Mch2の活性を阻害または調整するために有効な化合物を見出すための薬物評価お
よび発見努力における使用のために、使用され得る。当業者は、Wagnerの米国特
許第4,873,191号（1989年10月10日発行）およびLenderの米国特許第4,736,866号
（1988年４月12日発行）（これらの両方は、参考として本明細書に援用される）
に教示されているような標準的技術を用いて、Mch2を生産するトランスジェニッ
ク動物を生成し得、そしてその動物を薬物評価および発見プロジェクトにおいて
使用し得る。
本発明の別の局面は、ノックアウトマウスおよびその使用法に関する。詳細に
は、周知の技術を用いてそれらに導入された、変異された、非機能性のMch2遺伝
子についてホモ接合型であるトランスジェニックマウスが生成され得る。このマ
ウスは機能性のMch2を生産せず、そしてMch2機能を研究するために有用である。
さらに、このマウスは、Mch2欠損に対する試験化合物の影響を研究するためのア
ッセイにおいて使用され得る。Mch2欠損マウスを用いて、Mch2インヒビターがそ
の動物に影響を及ぼすかどうか、どのようにして影響を及ぼしか、そしてどの程
度影響を及ぼすかを決定し得、それによりその分子の活性の阻害に関連する問題
と取り組み得る。
遺伝的に欠損した「ノックアウト」マウスの生成法は周知であり、そしてCape
cchi，M.R．（1989）Science 244:1288-1292およびLi，P.ら（1995）CELL 80:40
1-411（これらは各々、参考として本明細書に援用される）に開示されている。
ヒトMch2 cDNAクローンを用いて、マウスMch2ゲノムクローンを単離し得る。こ
のゲノムクローンを用いて、相同組換えによりマウス中のMch2遺伝子を破壊し得
るMch2ターゲッティング構築物を調製し得る。
ターゲッティング構築物は、天然のマウス遺伝子の機能性部分の代わりに挿入
する、Mch2遺伝子の非機能性部分を含有する。この非機能性インサートは、一般
に、Mch2の活性領域をコードするエクソンにおける挿入を含有する。ターゲッテ
ィング構築物は、ポジティブ選択およびネガティブ選択両方のためのマーカーを
含有し得る。ポジティブ選択マーカーは、それを含まない細胞の選択的除去を可
能にし、一方ネガティブ選択マーカーは、それを有する細胞の除去を可能にする
。
例えば、第１の選択マーカーは、それを有する細胞の生存を可能にするポジテ
ィブマーカーである。いくつかの実施態様において、第１の選択マーカーは、ネ
オマイシン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子であり、Mch2遺伝子のコード
配列内に配置されて、それを非機能性にし、さらにその構築物を選択可能し得る
。抗生物質耐性遺伝子は、天然の配列と組換え得る相同領域内にある。従って、
相同的再構築に際して、非機能性かつ抗生物質耐性選択遺伝子配列が取り込まれ
る。
ターゲッティング構築物は、ネガティブ選択マーカーである第２の選択マーカ
ーもまた含有する。ネガティブ選択マーカーを有する細胞は除去される。第２の
選択マーカーは、組換え領域の外側にある。従って、構築物全体が細胞内に存在
する場合、両方のマーカーが存在する。構築物が天然配列と組換えると、第１の
選択マーカーはゲノム中に取り込まれ、そして第２の選択マーカーは失われる。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV tk）遺伝子は、それを有する細胞
を除去するための第２のマーカーとして使用され得るネガティブ選択マーカーの
例である。HSV tk遺伝子を有する細胞は、ガングシクロビルの存在下で選択的に
傷害される。
細胞を、ターゲッティング構築物でトランスフェクトし、次いで第１の選択マ
ーカーの存在および第２の選択マーカーの非存在について選択する。次いで、ク
ローンを胚盤胞に注入し、そして偽妊娠雌に移植する。組換え遺伝子をその生殖
系列に転移し得るキメラ子孫を選択し、交配し、そしてそれらの子孫を組換えた
遺伝子のヘテロ接合型キャリアーについて調べる。次いで、ヘテロ接合型子孫の
交配を用いて、Mch2-欠損ノックアウトマウスである完全にホモ接合型の子孫を
生成し得る。
本発明は、細胞におけるMch2の発現を阻害する方法および組成物に関する。１
つの実施態様において、Mch2をコードするmRNAのヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Mch2 mRNAの領域に相補的な配
列を含む。オリゴヌクレオチドは、Mch2 mRNAの配列から選択される領域に相補
的な配列を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、一本鎖DNA配列、
および発現ベタターから産生されるアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドが挙げ
られる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの各々は、Mch2 mRNA配列の
領域に相補的である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４または配列番号６の
フラグメントに相補的な配列を含む。Ullrichら，EMBO J.，1986，5:2503（これ
は参考として本明細書に援用される）を参照のこと。Mch2のコード配列内のオリ
ゴのフラグメントは、この定義により意図される。オリゴヌクレオチドは、好ま
しくは、５〜50ヌクレオチド長、いくつかの実施態様においては８〜40ヌクレオ
チド長、より好ましくは12〜25ヌクレオチド長、いくつかの実施態様においては
10〜15ヌクレオチド長、そしていくつかの実施態様においては12〜20ヌクレオチ
ド長である、ヌクレオチド配列に相補的である。
さらに、ミスマッチした配列が実質的にMch2配列に相補的であるような、本発
明の方法を達成する、上記で同定される配列内のミスマッチもまた、この開示の
範囲内であると見なされる。Mch2配列への実質的な相補性を可能にするミスマッ
チは、一旦本開示を備えれば当業者に公知となる。オリゴはまた修飾されていな
くてもよく、または修飾されていてもよい。
本発明はまた、哺乳動物におけるMch2発現を阻害する方法であって、哺乳動物
をMch2 mRNAの領域に相補的である配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの有効量と接触させる工程を包含する方法に関する。
本発明のアンチセンスオリゴの投与法としては、リポソーム、プラスミド発現
、またはレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターのような当該分野にお
いて周知の技術が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターまたはプラス
ミドを介するオリゴの投与において、細胞によって発現されるアンチセンスRNA
オリゴを産生するために、好ましくは、Mch2の非コードRNA鎖が使用される。次
いで、RNAオリゴは、Mch2のセンスまたはコードRNA配列に結合する。
哺乳動物へのオリゴの投与法としては、リポソームが挙げられ、そして意図さ
れる投与経路および標準的な薬学的慣例を考慮して選択される、薬学的に受容可
能なキャリアとの混合物中であり得る。さらに、抗体、リガンドなどをリポソー
ムに組み込み、それにより、種々の様式のMch2発現の阻害を提供し得る。投与量
は、患者の体重、および臨床的状態を考慮して設定される。キャリアに対する有
効成分の比率は、当然、化合物の化学的性質、溶解度、および安定性、ならびに
意図される投与量に依存する。本発明のオリゴは、哺乳動物が未分化細胞および
/または異常な表現型を有する細胞を含まなくなるに十分な時間投与される。
本発明のオリゴは、本発明の方法において、単独でまたは他の化合物と組み合
わせて使用され得る。投与されべき量はまた、患者の年齢、体重、および臨床的
状態のような要因に依存する。Gennaro，Alfonso編，Remington s Pharmaceutic
al Sciences，第18版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PAを参照のこと。
本発明の化合物は、接種および注射（例えば、静脈内、経口、腹腔内、筋肉内
、皮下、局所）、ならびに上皮または粘膜皮膚内層を介する吸収（例えば、鼻腔
、経口、膣、直腸および胃腸）を含む、任意の適切な経路で投与され得る。
オリゴの投与様式は、化合物が送達される器官中の部位を決定し得る。例えば
、局所適用物は、クリーム、軟膏、ゲル、オイル、エマルジョン、ペースト、ロ
ーションなどで投与され得る。本発明のオリゴは単独で投与され得、または一般
的には、意図される投与経路および標準的な薬学的慣例を考慮して選択された薬
学的キャリアと混合して投与される。非経口投与については、それらは無菌水溶
液の形態で最良に使用され、その水溶液は、他の溶質（例えば、その溶液を等張
性にするに十分な塩、グルコースまたはデキストロース）を含み得る。経口投与
様式については、本発明は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、粉末、シロ
ップ、エリキシル、水溶液および懸濁液などの形態で使用され得る。デンプンな
どの種々の崩壊剤、および潤滑剤が使用され得る。カプセル形態での経口投与に
ついては、有用な希釈剤は、乳糖および高分子量ポリエチレングリコールである
。水性懸濁液が経口使用のために必要である場合、特定の甘味料および/または
着香剤が添加され得る。培養物中の細胞増殖のための培地においてオリゴを提供
するインビトロ法のために、40μg/mlのアンチセンスオリゴを使用した。この濃
度は、インビボにおける使用のために外挿され得る。インビボにおける使用につ
いてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、約40μ/ｇ体重である。RNAオ
リゴヌクレオチドを発現させる発現ベクターのインビボにおける使用は、トラン
スフェクトされた細胞の数によって決定される。
インビボにおける使用については、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、適切
な液体ビヒクルまたは賦形剤のような薬学的に受容可能なキャリアおよび任意の
補助添加物（複数または単数）と組み合わされ得る。液体ビヒクルおよび賦形剤
は従来のものであり、そして市販されている。その例示は、蒸留水、生理食塩水
、デキストロースの水溶液などである。インビボにおける抗新生物使用について
は、アンチセンスオリゴヌクレオチドは静脈内投与され得る。
従来のキャリアによる投与に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、種
々の特殊なオリゴヌクレオチド送達技術により投与され得る。例えば、オリゴヌ
クレオチドは、ユニラメラリポソームにうまく被包された。再構成されたセンダ
イウイルスエンベロープは、細胞へRNAおよびDNAを送達するためにうまく使用さ
れた。Aradら，Biochem．Biophy．Acta，1986，859，88-94。
実施例
材料および方法
Mch2のクローニング。
Ced-3/ICE様アポトーシス性システインプロテアーゼの新規なメンバーを同定
およびクローン化するために設計したPCRアプローチを用いて、CPP32およびCed-
3に対して高い相同性を有する部分cDNA配列を同定した。その新しい部分cDNAを
プローブとして用いて、元のヒトJurkatTリンパ球cDNAライブラリーをスクリー
ニングした。その結果、数個のcDNAクローンが単離された。それらクローンのう
ち２つの配列を配列番号４および配列番号６に示す。
これら２つのcDNAを、哺乳動物のCed-3ホモログ、Mch2αおよびMch2βと名付
ける。Mch2αは、予想分子量約34kDaを有する293アミノ酸タンパク質をコードす
る879bpのオープンリーディングフレームを含有する。ヌクレオチド79の開始メ
チオニンは、コンセンサスKozak翻訳開始配列に従う。Mch2βは、Mch2α配列の
ヌクレオチド119〜385（アミノ酸14〜102）に対応する欠失を含み、そしてこれ
はより長い3非翻訳配列を有する。
Mch2βの欠失は、親のMch2 mRNAのオルタナティブスプライシングに起因し得
た。Mch2αは、そのコード配列内に、GT/AG則に従うオルタナティブスプライス
ドナー/アクセプター部位を含む（bp119〜385）。この部位は、まさしくスプラ
イス接合部位に位置する。Mch2の発現のノーザンブロット分析により、ヒト380
プレBリンパ球およびヒトJurkatTリンパ球において、約1.7kbおよび約1.4kbの２
つのmRNA種が示された。しかし、これら２つの細胞株内の各mRNA種の相対的発現
レベルには相違があるようであり、そしてこれらは、Mch2αおよびMch2βに、そ
れぞれ対応する２つのmRNA種であり得る。
Mch2βcDNAは、予想分子量約23kDaの204アミノ酸タンパク質をコードする612b
pのオープンリーディングフレームを維持していた。Mch2βはその推定のp20サブ
ユニットの約半分を欠損し、そしておそらく不活性である。この不活性なイソ型
は、優性インヒビターとして作用することにより、親酵素の活性を調節し得る。
活性なICE様システインプロテアーゼは、タンパク質分解的切断、およびその後
のそれらのp20サブユニットおよびp10サブユニットのヘテロ二量体化によって生
成するので、不活性なオルタナティブにスプライスされたイソ型は、親の完全長
の酵素と不活性なヘテロ複合体を形成することにより、このプロセスを妨害し得
る。
Mch2は新規なCed/ICE様システインプロテアーゼである。
予想されるMch2αタンパク質配列は、ヒトCPP32、C．elegans CED-3タンパク
質、哺乳動物Ich-1（NEDD2）およびICEタンパク質に類似している。完全長Mch2
αタンパク質は、CPP32に対して最も高い相同性を示す。全体として、これら２
つのタンパク質は、38%の同一性および56%の類似性を共有する。しかしCPP32と
同様に、Mch2αは、残りのシステインプロテアーゼよりも、CED-3により関連す
る：Mch2αは、CED-3と35%の同一性（56%の類似性）を示し、ヒトIhc-1と29%の
同一性（52%の類似性）を示し、そしてヒトIhc-1と29%の同一性（52%の類似性）
を示す。CED-3、ICE、またはIch-1は、互いに29%未満の同一性をである。Mch2α
の予想構造は、ICEおよびCPP32に類似しているようである。Asp176、Asp179、As
p186、および/またはAsp193でのMch2αのタンパク質分解的切断は、ICEおよびCP
P32の、p20およびp10サブユニットに等価な２つのポリペプチドを生成すると考
えられる。Mch2αは、CPP32と同様に、他のシステインプロテアーゼに存在する
長いN-末端プロペプチドを欠損する。しかし、位置23、32、および40には３つの
潜在的アスパラギン酸切断部位があり、これらは、Mch2αの活性酵素へのプロセ
シングの間に、短いプロペプチドを除去するために使用され得る。Mch2αおよび
CPP32は、Ced-3に対して等しく関連するが、Mch2αの推定のp20サブユニット（
アミノ酸1〜179）は、CPP32の推定のp20サブユニット（33%の同一性）よりも、C
ed-3の推定のp20サブユニット（36%の同一性）により関連する。したがって、こ
のp20サブユニットまたはその等価物が、酵素特異性のほとんどを決定するので
あれば、Mch2αは、CPP32よりもCed-3に機能的により関連する。
E.coliにおけるMch2、CPP32、およびICEの発現と自己プロセシング。
Mch2、CPP32またはICEの酵素活性を決定するために、これらの酵素をE.coli中
で、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現
させた。CPP32のアミノ酸1〜175を含有するGST-CPP32-p20融合タンパク質とGST
非融合タンパク質をコントロールとして使用した。IPTGによる誘導後、これらの
組換え融合タンパク質を発現するE.coliから細菌抽出物を調製した。その抽出物
をグルタチオン-セファロース樹脂に吸着させ、数回洗浄した後、SDS-PAGEで分
析した。GST-融合タンパク質を含有するICEγ、CPP32およぴMch2α調製物のサイ
ズは、約28〜35kDaの範囲であった。GST非融合タンパク質コントロールは、約27
〜28kDaタンパク質として移動した。GST-ICEγ融合タンパク質の予想分子量は約
61.5kDaであるが、ICEγ調製物には約28kDaおよび約31kDaの２つのバンドが観察
された。このことは、ICEγが自分自身を自己プロセシングして、N-末端GST-プ
ロペプチドを２つのAsp切断部位のうちの１つで切断することにより、活性なICE
を生成し得るということを示唆している。ICEαのAsp119に対応するICEγのAsp2
6は、ICE活性化の間に切断される部位である。この部位における切断は、約29kD
aの予想分子量を有するGST-融合タンパク質を生成し、それが31kDaバンドに対応
し得る。ICEγのAsp3における切断は、既知のICE切断部位ではないが、28kDaバ
ンドを生成し得た（レーン２）。GST-ICEγ調製物と同様に、GST-CPP32調製物お
よびGST-Mch2調製物は、予想されるGST融合産物よりも小さい産物を含む。GST-C
PP32融合産物は、約29〜30kDaタンパク質として移動する。CPP32のAsp9またはAs
p28における切断により、それぞれ、約27.3kDaまたは約29.4kDaの予想分子量を
有する産物が生じると考えられる。CPP32自己プロセシングの間に、両方の部位
が切断される可能性があるが、GST-CPP32産物の観察されたサイズに基づく、CPP
32は、Asp28で切断されるであろう。完全長CPP32を含有するGST-CPP32とは異な
り、短縮型のCPP32を含有するGST-CPP32-p20産物は、約46kDaタンパク質として
移動し、その予想分子量と合致した。この組換えタンパク質はp11サブユニット
（アミノ酸176〜277）を欠損するので、不活性であり、自己プロセシングして完
全長のCPP32を使用した時に観察される約29〜30kDa GST-CPP32切断産物を生成し
ない。したがって、CPP32がAsp28で切断される場合、CPP32は相対分子量17kDaお
よび11kDaの２つのサブユニットから構成されるようである。しかし、活性なCPP
32を生成するために利用される正確なAsp切断部位は、さらにアミノ酸配列決定
によって決定する必要がある。GST-Mch2α調製物は、約31〜32kDaタンパク質お
よび約34〜35kDaタンパク質として移動する２つの主要なバンドを含有する。こ
のことは、Mch2αのAsp23、Asp32またはAsp40における切断と一致する。これら
のGST-Mch2α切断産物は、GST-Mch2α融合構築物中にMch2αの5'非翻訳領域に由
来する余分な33アミノ酸が存在するために、GST-CPP32産物よりも大きい。この
調製物中には約27kDaの副バンドも存在する。これは、GSTペプチド自体のC-末端
近くの部位での切断により得られると考えられた。GST-Mch2βの大部分は、E.co
liにおいて封入体（occlusion bodies）中に存在し、切断されなかった。
蛍光標識テトラペプチドを用いた、Mch2、CPP32およびICEの酵素活性の分析。
Mch2およびCPP32が細菌中で自己プロセシングし得ることを確認した後、それ
らの酵素活性を２つの蛍光標識ペプチド基質YVAD-AMC（配列番号８）とDEVD-AMC
（配列番号３）を用いて試験した。YVAD（配列番号８）ペンタペプチドは、プロ
IL1β中のICE切断部位であり、そしてDEVD（配列番号９）テトラペプチドはPARP
中に存在する部位であり、これは、アポトーシスの間にICE様タンパク質によっ
て切断される。Mch2α、Mch2β、CPP32、およびICEγの酵素活性を、これらの酵
素をGST-融合タンパク質として発現する細胞からの全細菌抽出物中で、YVAD-AMC
（配列番号８）およびDEVD-AMC（配列番号３）テトラペプチドを基質として研究
した。ICEγおよびCPP32は両方とも、YVAD（配列番号10）基質を切断し得たが、
ICEγはこの基質の切断において、CPP32よりも約３倍活性であった。Mch2αまた
はMch2βでは、この基質に対する検出可能な酵素活性は観察されなかった。一方
、Mch2α、ICEγ、およびCPP32は、DEVD基質（配列番号９）を切断し得た（ただ
しMch2βはこれを切断し得なかった）。CPP32は、この基質に対して、ICEγまた
はMch2αよりもはるかに活性である。細菌抽出物が同様な量の各酵素を含有する
と仮定すると、反応の初速度から決定されるように、CPP32は、DEVD基質（配列
番号９）の切断において、ICEγまたはMch2αよりも約150倍活性であることが見
出された。精製したGST-融合産物またはGSTコントロール抽出物は、どちらの基
質に対しても酵素活性を有さなかった。
Mch2およびCPP32はPARPを切断し得る。
アポトーシス性細胞では、PARP、ラミン、およびU1小核リボ核タンパク質の70
kDaタンパク質成分のような核タンパク質が、未知のICE様システインプロテアー
ゼ（単数または複数）によって特異的に切断される。DEVD（配列番号９）部位（
アミノ酸211〜214）におけるヒトPARPの切断により、予想分子量89.3kDa（アミ
ノ酸215〜1014）の大きなタンパク質産物が生成される。組換えMch2α、Mch2β
、ICEγ、またはCPP32と共にインキュベートした後のヒトPARPのウェスタンブロ
ット分析を、4C10-5抗体を用いて行なった。この抗体はPARPの41kDa C-末端キモ
トリプシンフラグメント中のエピトープを認識する。CPP32はPARPを切断して約9
0kDaの主要なバンドおよび57kDaの副バンドを生成した。この90kDaバンドは、お
そらくPARPの残基214でのDEVD（配列番号９）部位の切断によって生じたと考え
られた。この切断産物は、アポトーシス性細胞において記載されている85kDa PA
RP切断産物に対応すると考えられる。57kDa切断産物は、おそらくDEVD（配列番
号９）部位のC-末端側にある部位での切断によって生成するのだろう。この産物
は、以前の研究で使用されたC-2-10抗体では検出されなかった。これは、おそら
く、この抗体が、本研究に使用した4C10-5抗体によって認識されるエピトープの
N-末端側にあるエピトープを認識するからだろう。Mch2αはまた、PARPを切断し
て、CPP32で得られたものと同様の約83kDaの主要産物および約57kDaの副産物
を生成した。PARPはMch2βまたはICEγにより切断されなかった。これらのデー
タは、CPP32および4ch2αの両方が、PARPを切断し得ることを示唆している。Mch
2αで得られた主要な切断産物は、CPP32で得られた産物よりもサイズが小さい。
このことは、Mch2α切断部位がCPP32切断部位のC-末端側にあることを示唆して
いる。さらに、Mch2βにおける欠失は、その酵素活性を排除する。
Sf9細胞におけるMch2αの発現はアポトーシスを誘導する。
Mch2αの発現が同様のアポトーシス効果を有するか否かを試験するために、Sf
9細胞を、多角体（polyhedron）プロモーター下で、Mch2αまたはMch2βを発現
する組換えバキュロウイルスで感染させた。また、コントロールとして、細胞を
野生型ウイルスおよび組換えICEバクロウイルスで感染させた。形態学的分析、
生化学的分析、および生存能力の分析により、ICEまたはMch2αで感染した細胞
は、細胞質膜泡状突起形成（blebbing）、核のフラグメント化および凝縮、なら
びにヌクレオソーム間のDNA切断を含む、アポトーシスに特有の兆候をいくつか
有したが、野生型ウイルスまたはMch2βで感染した細胞の場合は、それらの兆候
を有さないことが示された。ICEまたはCPP32を発現する細胞について以前に観察
されたのと同様の生存能力の減少が、Mch2αを発現させる細胞においても観察さ
れたが、Mch2βを発現する細胞においては観察されなかった。
Mch2と命名したこの新規なアポトーシス性システインプロテアーゼを、Ced3/I
CE様アポトーシス性システインプロテアーゼファミリーの新規なメンバーを同定
し、そしてクローニングするために設計したPCR法を用いてクローニングした。M
ch2のアミノ酸配列および予想される構造は、ICEおよびこのファミリーの他のメ
ンバー（例えば、CED-3、CPP32、およびIch-1のアミノ酸配列および予測される
構造に類似する。Mch2αおよびCPP32は、ペプチド基質DEVD-AMC（配列番号３）
のP1位置にAsp残基を必要とする。このことは、それらがICEと同様の基質要求性
を有することを示唆している。
これらのデータは、PARPがMch2αおよびCPP32の両方についての基質であるこ
とを明確に示している。ICEおよびIch-1と同様に、Mch2の活性は、オルタナティ
ブなスプライシングによって調節され得る。オルタナティブにスプライスされた
イソ型Mch2βをまた単離した。Ich-1sと同様に、Mch2βはMch2αの優性インヒビ
ターであり得、そしてアポトーシスのネガティブレギュレーターとして機能し得
る。あるいは、このイソ型が切断されて機能的p11サブユニットを生成する場合
、それはMch2のアクチベーターとして作用し得る。
したがって、これらの酵素のオルタナティブにスプライスされたイソ型は、そ
れらの活性化または阻害において、重要な役割を果たし得る。これらイソ型の発
現レベルの組識特異的調節は、アポトーシスの誘導に対する感受性または耐性を
担い得る。この重要なシステインプロテアーゼのクラスの新規なメンバーの単離
および特徴づけは、それらの内因性基質およびレギュレーターを同定するための
、およびそれらの活性を調節する特異的薬物を設計するための努力を増大させる
。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
// Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ
Ｎ
45/00 ＡＤＳ 45/00 ＡＤＳ
48/00 48/00
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
21/08 21/08
(72)発明者 アルネムリ，エマド エス.
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19002,
アンブラー，ミーティングハウス ロード
805
(72)発明者 フェルナンデス−アルネムリ，テレサ
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19002,
アンブラー，ミーティングハウス ロード
805