JP2001501443A - Ｅ６結合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｅ６−ＢＰポリペプチド、Ｅ６−ＢＰポリペプチドをコードする核酸及びそれらの利用。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｅ６結合蛋白質 発明の背景 パピローマウイルス（ＰＶ）は、広く行きわたった重大なヒトの病気特に性器 及び口腔粘膜の癌腫に関連付けられてきた。現在数千万人近い女性が、生殖道の ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を受けていると見積もられている。これ らの女性の多くで、最終的には、子宮頚癌が発生する。例えば、世界中における 女性の癌死の約２０％は、ＨＰＶに関連する癌によるものと見積もられている。 すべての子宮頚癌の９０％がＨＰＶに関連付けられるという見積もりもされてい る。 パピローマウイルスは又、皮膚及び粘膜上皮の、良性の、異形成の及び悪性の 増殖過剰をも誘導する（パピローマウイルスの分子、細胞及び臨床面の概観のた めには、例えば、Mansur及びAndrophy，(1993)Biochim Biophys Acta 1155:323- 345;Pfister（1984）Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol．99:111-181;及びBroker 等（1986）Cancer Cells 4:17-36を参照されたい）。殆ど７０のヒトパピローマ ウイルスの型が同定されており、異なるパピローマウイルス型は異なる病気を引 き起こすことが知られている、Pfister，(1987)Adv.Cancer Res.,48:113-147,Sy rjanen，（1984）Obstet.Gynecol.Survey 39:252-265。ヒトパビローマウイルス （ＨＰＶ）は、扁平上皮の過形成（いぼ、コンジローム）、前悪性及び悪性の病 変（癌腫）と関連するＤＮＡ腫瘍ウイルスの異質群である。例えば、１型及び２ 型ＨＰＶは、一般的ないぼを引き起こし、６型及び１１型は、外性器、肛門及び 子宮頚のいぼを引き起こす。ＨＰＶの１６、１８、３１及び３３型は、子宮頚癌 の大多数から単離することができ、ＨＰＶ−１６は、すべての子宮頚癌の約５０ ％に存在する。これらのＨＰＶは、「ハイリスク」と呼ばれる。ＨＰＶ６及び１ １は、子宮頚いぼに関して最も一般的な単離株であるが、これらの感染は、稀に しか、侵襲性の癌に進行せず、それ故、これらのＨＰＶは、「ローリスク」と呼 ばれる。 癌腫におけるウイルス遺伝子発現の研究は、２つのＨＰＶにコードされた蛋白 質Ｅ６及びＥ７の悪性の発生における重要性を示唆し、これらの蛋白質は、トラ ンスフォーム活性及び不滅化活性をコードすることが示されている。これらの２ つの蛋白質は、他の小型ＤＮＡ腫瘍ウイルス例えばアデノウイルス及びＳＶ４０ のトランスフォーミング蛋白質に対する幾つかの機能的類似点を示す。Ｅ７は、 アデノウイルスＥ１Ａ蛋白質と機能的及び構造的特徴を共有している。ＡｄＥ１ Ａ及びポリオーマウイルスの大型Ｔ蛋白質と同様に、Ｅ７は、ｐＲＢと複合体形 成することができる。同様に、「ハイリスク」ＨＰＶによりコードされるＥ６オ ンコ蛋白質は、ｐ５３と複合体を形成することができる。イン・ビトロでは、Ｅ ６は、ｐ５３の分解を促進し、この分解は、ユビキチン依存性プロテアーゼ系を 含む。細胞性の負の調節蛋白質例えばｐ５３調節機能の選択的分解は、優性に作 用するオンコ蛋白質についての作用の説明を与える。ヒトの子宮頚発癌における ｐＲＢ及びｐ５３の正常機能の不活性化の関連が、最近、これらの２つの遺伝子 及びそれらの産物の分析により一連のＨＰＶ陽性及びＨＰＶ陰性の細胞系統にお いて示された。これらの研究は、腫瘍抑制蛋白質ｐＲＢ及びｐ５３の正常機能の 不活性化が、突然変異によるか又はＨＰＶＥ６及びＥ７オンコ蛋白質との複合体 形成によるヒトの子宮頚発癌における重要なステップであるという考えを支持し ている。発明の要約 本発明は、真核生物細胞特にヒト細胞におけるパピローマウイルストランスフ ォーミング蛋白質Ｅ６とある種の細胞性蛋白質（以後、「Ｅ６結合蛋白質」又は 「Ｅ６−ＢＰ」と呼ぶ）との間の新規な蛋白質−蛋白質相互作用の発見に関係す るものである。 一般に、この発明は、Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチド（好ましくは、実質的に純 粋なＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチド標品）又は組換えＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチド を特徴とする。好適具体例において：このポリペプチドは、生物学的活性を有し （例えば、それは、パピローマウイルスＥ６蛋白質に特異的に結合する）；この ポリペプチドは、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０ ％、８０％、９０％又は９５％相同性であるアミノ酸配列を有し；このポリペプ チドは、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；この ポリペプチドは、少なくとも５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、１００ 又は１５０アミノ酸長であり；このポリペプチドは、SEQ ID NO:８に由来する少 なくとも５の、好ましくは少なくとも１０の、一層好ましくは少なくとも２０、 ２５、３０、４０の、一層好ましくは少なくとも５０、１００又は１５０の連続 するアミノ酸を含み；Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドは、Ｅ６−ＢＰの生物学的活 性の（例えば、細胞増殖の調節の）アゴニスト又はアンタゴニストの何れかであ り：このポリペプチドは、SEQ ID NO:８のＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８に対応す るＥ６結合モチーフを含む。 好適具体例において、この発明は、アンタゴニスト活性を有するＥ６結合蛋白 質を含み且つ該蛋白質は、好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される 腫瘍細胞において腫瘍の成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細 胞例えばＨＰＶ感染細胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロック し又は誘導することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞 例えばハイリスクＨＰＶ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染 細胞例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することが でき；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ− １６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞 の感染を阻止することができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリス クＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイル スによる細胞のトランスフォーメーションを阻止することができ；或は、パピロ ーマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、 ３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化 を阻止することができる。好適具体例において、このアンタゴニストは、完全長 ＳＤ−７蛋白質のフラグメントであり、該フラグメントは、例えば、Ｅ６に結合 する能力及び完全長ＳＤ−７蛋白質の結合を競争的に阻止する能力を保持してい る。例えば、ほぼＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８に対応するＥ６結合モチーフを含 むフラグメントを、完全長蛋白質のアンタゴニストとして与えることがで きる。 好適具体例において、少なくとも一つの主題のＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドの 生物学的活性を有するペプチドは、SEQ ID NO:８の配列とアミノ酸配列が異なっ てよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若しくは類似の様式で機 能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しくは類似する性質を有す る改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、第２のポリペプチド部分（ 例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つによって表される蛋白質と無関係のアミノ酸配 列を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質である（例えば、この 第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例え ばこの第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えばこの第２の ポリペプチド部分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質 は２ハイブリッドアッセイにおいて機能的である）。 SEQ ID NO:８に相同な蛋白質の好適具体例において、この蛋白質は、約５０キ ロダルトン（例えば４５〜５５ｋＤの範囲、例えば４８〜５２ｋＤの範囲）の分 子量を有する。 好適具体例において：このペプチドは、SEQ ID NO:８の残基１〜１３３由来の 少なくとも１、２、３又は５アミノ酸残基を、好ましくは１０、２０、３０アミ ノ酸残基を含む。 本発明の更に別の面は、免疫原性標品中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む免疫 原に関係し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答（例え ば液性応答例えば抗体応答：例えば細胞性応答）を誘出することができる。好適 具体例において、この免疫原は、SEQ ID NO:８により表される蛋白質に由来する 抗原決定基例えばユニークな決定基を含む。 本発明の尚更なる面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープと特異的に反応性の抗 体標品を特徴とする。 他の面において、この発明は、Ｅ６−ＢＰ^SD-8ポリペプチド（好ましくは、実 質的に純粋なＥ６−ＢＰ^SD-8ポリペプチドの標品）又は組換えＥ６−ＢＰ^SD-8ポ リペプチドを特徴とする。好適具体例において：このポリペプチドは、生物学 的活性を有し（例えば、それはパピローマウイルスＥ６蛋白質に特異的に結合す る）；このポリペプチドは、SEQ ID NO:９のアミノ酸配列と少なくとも６０％、 ８０％、９０％又は９５％相同であるアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは 、SEQ ID NO:９のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；このポリペ プチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であ り；このポリペプチドは、SEQ ID NO:９由来の少なくとも５の好ましくは少なく とも１０の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５０、１ ００又は１５０の連続するアミノ酸を含み；このＥ６−ＢＰ^SD-8ポリペプチドは 、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば細胞増殖の調節の）アゴニスト又はアン タゴニストの何れかである。 好適具体例において、この発明は、アンタゴニスト活性を有するＥ６結合蛋白 質を含み且つ該蛋白質は、好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される 腫瘍細胞において腫瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞 例えばＨＰＶ感染細胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし 又は誘導することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例 えばハイリスクＨＰＶ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細 胞例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することがで き；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１ ６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の 感染を阻止することができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスク ＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス による細胞のトランスフォーメーションを阻止することができ；或は、パピロー マウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３ １又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を 阻止することができる。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-8ポリペプチドの少なくとも一つの 生物学的活性を有するペプチドは、アミノ酸配列においてSEQ ID NO:９の配列と 異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若しくは類似の様 式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しくは類似する 性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、第２のポリペプチド部分（ 例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のアミノ酸配列 を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例えば、第２の ポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例えば第２ のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、第２のポリペプチド部分はポ リメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ハイブリッドアッ セイにおいて機能的である。 本発明の更に別の面は、免疫原性標品中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む免疫 原に関係し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答（例え ば液性応答例えば抗体応答；例えば細胞性応答）を誘出することができる。好適 具体例において、この免疫原は、SEQ ID NO:９により表される蛋白質に由来する 抗原決定基例えばユニークな決定基を含む。 本発明の尚更なる面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープと特異的に反応性の抗 体標品を特徴とする。 他の面において、この発明は、Ｅ６−ＢＰ^SD-12ポリペプチド（好ましくは実 質的に純粋なＥ６−ＢＰ^SD-12ポリペプチド標品）又は組換えＥ６−ＢＰ^SD-12ポ リペプチドを特徴とする。好適具体例において：このポリペプチドは、生物学的 活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルスＥ６蛋白質に特異的に結合す る）：このポリペプチドは、SEQ ID NO：１０のアミノ酸配列に少なくとも６０ ％、８０％、９０％又は９５％相同であるアミノ酸配列を有し；このポリペプチ ドは、SEQ ID NO：１０のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；こ のポリペプチドは、少なくとも少なくとも５、１０、２０、５０、１００又は１ ５０アミノ酸長であり；このポリペプチドは、SEQ ID NO：１０に由来する少な くとも５の好ましくは少なくとも１０の一層好ましくは少なくとも２０の更に好 ましくは少なくとも５０、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含み；Ｅ６− ＢＰ^SD-12ポリペプチドは、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば細胞増殖の調 節の）アゴニスト又はアンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、この発明は、アンタゴニスト活性を有するＥ６結合蛋白 質を含み且つ該蛋白質は、好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される 腫瘍細胞において腫瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞 例えばＨＰＶ感染細胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし 又は誘導することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例 えばハイリスクＨＰＶ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細 胞例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することがで き；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１ ６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の 感染を阻止することができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスク ＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス による細胞のトランスフォーメーションを阻止することができ；或は、パピロー マウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３ １又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を 阻止することができる。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-12ポリペプチドの少なくとも一つ の生物学的活性を有するペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO：１０ の配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若しくは 類似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しくは類似 する性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、第２のポリペプチド部分（ 例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のアミノ酸配列 を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例えば、第２の ポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例えば第２ のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリペプチド部 分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ハイブリッ ドアッセイにおいて機能的である。 本発明の更に他の面は、免疫原性標品中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む免疫 原に関係し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答（例え ば液性応答例えば抗体応答；例えば細胞性応答）を誘出することができる。好適 具体例において、この免疫原は、SEQ ID NO:10により表される蛋白質に由来する 抗原決定基例えばユニークな決定基を含む。 本発明の尚更なる面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープに特異的に反応性の抗 体標品を特徴とする。 他の面において、この発明は、Ｅ６−ＢＰ^SD-16ポリペプチド（好ましくは実 質的に純粋なＥ６−ＢＰ^SD-16ポリペプチド標品）又は組換えＥ６−ＢＰ^SD-16ポ リペプチドを特徴とする。好適具体例において：このポリペプチドは、生物学的 活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルスＥ６蛋白質に特異的に結合す る）；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１１のアミノ酸配列に少なくとも６０％ 、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは、 SEQ ID NO:１１のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；このポリペ プチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であ り；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１１に由来する少なくとも５の好ましくは 少なくとも１０の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５ ０、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含み；Ｅ６−ＢＰ^SD-16ポリペプチ ドは、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば細胞増殖の調節の）アゴニスト又は アンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、この発明は、アンタゴニスト活性を有するＥ６結合蛋白 質を含み且つ該蛋白質は、好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される 腫瘍細胞において腫瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞 例えばＨＰＶ感染細胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし 又は誘導することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例 えばハイリスクＨＰＶ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細 胞例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することがで き；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１ ６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の 感染を阻止することができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスク ＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス による細胞のトランスフォーメーションを阻止することができ；或は、 パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、 １８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の 不滅化を阻止することができる。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-16ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１１の 配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若しくは類 似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しくは類似す る性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、第２のポリペプチド部分（ 例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のアミノ酸配列 を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例えば、第２の ポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例えば第２ のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリペプチド部 分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ハイブリッ ドアッセイにおいて機能的である。 本発明の更に他の面は、免疫原性標品中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む免疫 原に関係し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答（例え ば液性応答例えば抗体応答；例えば細胞性応答）を誘出することができる。好適 具体例において、この免疫原は、SEQ ID NO:１１により表される蛋白質に由来す る抗原決定基例えばユニークな決定基を含む。 本発明の尚更なる面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープに特異的に反応性の抗 体標品を特徴とする。 他の面において、この発明は、Ｅ６−ＢＰ^SD-22ポリペプチド（好ましくは実 質的に純粋なＥ６−ＢＰ^SD-22ポリペプチド標品）又は組換えＥ６−ＢＰ^SD-22ポ リペプチドを特徴とする。好適具体例において：このポリペプチドは、生物学的 活性を有し（例えば、それは、パビローマウイルスＥ６蛋白質に特異的に結合す る）；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１２のアミノ酸配列に少なくとも６０％ 、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは、 SEQ ID NO:１２のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；このポ リペプチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長 であり；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１２に由来する少なくとも５の好まし くは少なくとも１０の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくと も５０、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含み；Ｅ６−ＢＰ^SD-22ポリペ プチドは、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば細胞増殖の調節の）アゴニスト 又はアンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、この発明は、アンタゴニスト活性を有するＥ６結合蛋白 質を含み且つ該蛋白質は、好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される 腫瘍細胞において腫瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞 例えばＨＰＶ感染細胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし 又は誘導することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例 えばハイリスクＨＰＶ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細 胞例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することがで き；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１ ６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の 感染を阻止することができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスク ＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス による細胞のトランスフォーメーションを阻止することができ；或は、パピロー マウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３ １又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を 阻止することができる。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-22ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１２の 配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若しくは類 似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しくは類似す る性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、第２のポリペプチド部分（ 例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のアミノ酸配列 を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例えば、 第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例え ば第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリペプ チド部分はポリメラーセ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ハイ ブリッドアッセイにおいて機能的である。 本発明の更に他の面は、免疫原性標品中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む免疫 原に関係し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答（例え ば液性応答例えば抗体応答；例えば細胞性応答）を誘出することができる。好適 具体例において、この免疫原は、SEQ ID NO:１２により表される蛋白質に由来す る抗原決定基例えばユニークな決定基を含む。 本発明の尚更なる面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープに特異的に反応性の抗 体標品を特徴とする。 他の面において、この発明は、Ｅ６−ＢＰ^SD-28ポリペプチド（好ましくは実 質的に純粋なＥ６−ＢＰ^SD-28ポリペプチド標品）又は組換えＥ６−ＢＰ^SD-28ポ リペプチドを特徴とする。好適具体例において：このポリペプチドは、生物学的 活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルスＥ６蛋白質に特異的に結合す る）；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１３のアミノ酸配列に少なくとも６０％ 、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは、 SEQ ID NO:１３のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；このポリペ プチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であ り；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１３に由来する少なくとも５の好ましくは 少なくとも１０の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５ ０、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含み；Ｅ６−ＢＰ^SD-28ポリペプチ ドは、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば細胞増殖の調節の）アゴニスト又は アンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、この発明は、アンタゴニスト活性を有するＥ６結合蛋白 質を含み且つ該蛋白質は、好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される 腫瘍細胞において腫瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞 例えばＨＰＶ感染細胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし 又は誘導することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞 例えばハイリスクＨＰＶ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染 細胞例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することが でき；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ− １６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞 の感染を阻止することができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリス クＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイル スによる細胞のトランスフォーメーションを阻止することができ；或は、パピロ ーマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、 ３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化 を阻止することができる。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-28ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１３の 配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若しくは類 似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しくは類似す る性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、第２のポリペプチド部分（ 例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のアミノ酸配列 を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例えば、第２の ポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例えば第２ のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリペプチド部 分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ハイブリッ ドアッセイにおいて機能的である。 本発明の更に他の面は、免疫原性標品中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む免疫 原に関係し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答（例え ば液性応答例えば抗体応答；例えば細胞性応答）を誘出することができる。好適 具体例において、この免疫原は、SEQ ID NO:１３により表される蛋白質に由来す る抗原決定基例えばユニークな決定基を含む。 本発明の尚更なる面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープに特異的に反応性の抗 体標品を特徴とする。 他の面において、この発明は、Ｅ６−ＢＰ^SD-32ポリペプチド（好ましくは実 質的に純粋なＥ６−ＢＰＳ^D-32ポリペプチド標品）又は組換えＥ６−ＢＰ^SD-32 ポリペプチドを特徴とする。好適具体例において：このポリペプチドは、生物学 的活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルスＥ６蛋白質に特異的に結合 する）；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１４のアミノ酸配列に少なくとも６０ ％、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは 、SEQ ID NO:１４のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；このポリ ペプチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長で あり：このポリペプチドは、SEQ ID NO:１４に由来する少なくとも５の好ましく は少なくとも１０の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも ５０、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含み；Ｅ６−ＢＰ^SD-32ポリペプ チドは、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば細胞増殖の調節の）アゴニスト又 はアンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、この発明は、アンタゴニスト活性を有するＥ６結合蛋白 質を含み且つ該蛋白質は、好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される 腫瘍細胞において腫瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞 例えばＨＰＶ感染細胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし 又は誘導することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例 えばハイリスクＨＰＶ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細 胞例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することがで き；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１ ６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の 感染を阻止することができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスク ＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルス による細胞のトランスフォーメーションを阻止することができ；或は、パピロー マウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３ １又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を 阻止することができる。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-32ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１４の 配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若しくは類 似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しくは類似す る性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、第２のポリペプチド部分（ 例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のアミノ酸配列 を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例えば、第２の ポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例えば第２ のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリペプチド部 分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ハイブリッ ドアッセイにおいて機能的である。 本発明の更に他の面は、免疫原性標品中にＥ６−ＢＰポリペプチドを含む免疫 原に関係し、該免疫原は、該Ｅ６−ＢＰポリペプチドに特異的な免疫応答（例え ば液性応答例えば抗体応答；例えば細胞性応答）を誘出することができる。好適 具体例において、この免疫原は、SEQ ID NO:１４により表される蛋白質に由来す る抗原決定基例えばユニークな決定基を含む。 本発明の尚更なる面は、Ｅ６−ＢＰ免疫原のエピトープに特異的に反応性の抗 体標品を特徴とする。 本発明の他の面は、Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドをコードするヌクレオチド配 列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好適具体例において：コードされる ポリペプチドは、生物学的活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルスＥ ６蛋白質に特異的に結合する）；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:８の アミノ酸配列に少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ酸配 列を有し；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列と本質的 に同じアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、少なくとも５、１０ 、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり；コードされるポリペプチド は、SEQ ID NO:８に由来する少なくとも５の好ましくは少なくとも１０の一層好 ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５０、１００又は１５０の 連続するアミノ酸を含み；コードされるＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチド は、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば、細胞増殖の調節の）アゴニスト又は アンタゴニストの何れかであり；このポリペプチドは、SEQ ID NO:８のＡｌａ１ ９４〜Ａｓｐ２１８に対応するＥ６結合モチーフを含む。好適具体例において、 この核酸は、SEQ ID NO:１のヌクレオチド残基５８０〜６５４に対応するヌクレ オチド配列を含む。 好適具体例において、コードされるポリペプチドは、アンタゴニスト活性を有 し且つ好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される腫瘍細胞において腫 瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細 胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし又は誘導することが でき；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例えばハイリスクＨＰ Ｖ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細胞例えばウシパピロ ーマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することができ；パピローマウイ ルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は ３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を阻止すること ができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ −１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞のトラン スフォーメーションを阻止することができ；或は、パピローマウイルス例えばＨ ＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウ シパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を阻止することができ る。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドの少なくとも１つの 生物学的活性を有するコードされるペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:８の配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若 しくは類似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しく は類似する性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、コードされるポリペプチドは、第２のポリペプ チド部分（例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のア ミノ酸配列を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例え ば、第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、 例えば第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリ ペプチド部分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。 更に、ある好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-7核酸は、例えば、発現 ベクターとしての使用に適したＥ６−ＢＰ^SD-7遺伝子配列を与える転写調節配列 例えば少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列（Ｅ６−Ｂ Ｐ^SD-7遺伝子配列に操作可能に結合されている）を含む。 尚更なる好適具体例において、この発明のＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドをコー ドする核酸（それは、厳しい条件下で、SEQ ID NO:１の少なくとも１２の連続す るヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズし；一層好ましくは、 SEQ ID NO:１の少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プローブ とハイブリダイズし；一層好ましくは、SEQ ID NO:１の少なくとも４０の連続す るヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする）。尚更なる好適 具体例において、Ｅ６−ＢＰをコードする核酸は、SEQ ID NO:８の残基１〜１３ ３の間の少なくとも４つの連続するアミノ酸、一層好ましくは少なくとも１０の 連続するアミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも２０のアミノ酸残基をコード する配列に対応する核酸プローブとハイブリダイズする。 好適具体例において、この核酸配列は、SEQ ID NO:８のアミノ酸残基１〜１３ ３をコードするSEQ ID NO:１の領域に由来する少なくとも１、２、３又は５ヌク レオチド好ましくは少なくとも１０、２０、５０又は１００ヌクレオチドを含み ；コードされるペプチドは、SEQ ID NO:８のアミノ酸残基１〜１３３に由来する 少なくとも１、２、３、５、１０、２０又は３０アミノ酸残基を含み；この核酸 配列は、SEQ ID NO:１のヌクレオチド残基５７２〜８７５以外である（例えば、 それは、一層長く、一層短く、異なる３’末端又は異なる５’末端を有する）。 好適具体例において、この核酸は、それにもかかわらず、SEQ ID NO:１のヌクレ オチド残基５８０〜６５４によりコードされるＥ６結合モチーフに対応するよう なＥ６結合モチーフのコード配列を含む。 本発明の他の面は、Ｅ６−ＢＰ^SD-8ポリペプチドをコードするヌクレオチド配 列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好適具体例において：コードされる ポリペプチドは、生物学的活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルスＥ ６蛋白質に特異的に結合する）；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:９の アミノ酸配列に少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ酸配 列を有し；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:９のアミノ酸配列と本質的 に同じアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、少なくとも５、１０ 、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり；コードされるポリペプチド は、SEQ ID NO:９に由来する少なくとも５の好ましくは少なくとも１０の一層好 ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５０、１００又は１５０の 連続するアミノ酸を含み；コードされるＥ６−ＢＰ^SD-8ポリペプチドは、Ｅ６− ＢＰの生物学的活性の（例えば、細胞増殖の調節の）アゴニスト又はアンタゴニ ストの何れかである。 好適具体例において、コードされるポリペプチドは、アンタゴニスト活性を有 し且つ好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される腫瘍細胞において腫 瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細 胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし又は誘導することが でき；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例えばハイリスクＨＰ Ｖ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細胞例えばウシパピロ ーマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することができ；パピローマウイ ルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は ３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を阻止すること ができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ −１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞のトラン スフォーメーションを阻止することができ；或は、パピローマウイルス例えばＨ ＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウ シパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を阻止することができ る。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-8ポリペプチドの少なくとも１つの 生物学的活性を有するコードされるペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:９の配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若 しくは類似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しく は類似する性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、コードされるポリペプチドは、第２のポリペプ チド部分（例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のア ミノ酸配列を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例え ば、第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、 例えば第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリ ペプチド部分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。 更に、ある好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-8核酸は、例えば、発現 ベクターとしての使用に適したＥ６−ＢＰ^SD-8遺伝子配列を与える転写調節配列 例えば少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列（Ｅ６−Ｂ Ｐ^SD-8遺伝子配列に操作可能に結合されている）を含む。 尚更なる好適具体例において、この発明のＥ６−ＢＰ^SD-8ポリペプチドをコー ドする核酸（それは、厳しい条件下で、SEQ ID NO:２の少なくとも１２の連続す るヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズし；一層好ましくは、 SEQ ID NO:２の少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プローブ とハイブリダイズし；一層好ましくは、SEQ ID NO:２の少なくとも４０の連続す るヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする）。 本発明の他の面は、Ｅ６−ＢＰ^SD-12ポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好適具体例において：コードされ るポリペプチドは、生物学的活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルス Ｅ６蛋白質に特異的に結合する）；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１ ０のアミノ酸配列に少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ 酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１０のアミノ酸配列と 本質的に同じアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、少なくとも５ 、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり；コードされるポリ ペプチドは、SEQ ID NO:１０に由来する少なくとも５の好ましくは少なくとも１ ０の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５０、１００又 は１５０の連続するアミノ酸を含み；コードされるＥ６−ＢＰ^SD-12ポリペプチ ドは、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば、細胞増殖の調節の）アゴニスト又 はアンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、コードされるポリペプチドは、アンタゴニスト活性を有 し且つ好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される腫瘍細胞において腫 瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細 胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし又は誘導することが でき；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例えばハイリスクＨＰ Ｖ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細胞例えばウシパピロ ーマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することができ；パピローマウイ ルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は ３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を阻止すること ができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ −１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞のトラン スフォーメーションを阻止することができ；或は、パピローマウイルス例えばＨ ＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウ シパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を阻止することができ る。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-12ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するコードされるペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１０の配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同 じ若しくは類似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若 しくは類似する性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、コードされるポリペプチドは、第２のポリペプ チド部分（例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のア ミノ酸配列を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例え ば、第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーセであり、 例えば第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリ ペプチド部分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。 更に、ある好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-12核酸は、例えば、発 現ベクターとしての使用に適したＥ６−ＢＰ^SD-12遺伝子配列を与える転写調節 配列例えば少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列（Ｅ６ −ＢＰ^SD-12遺伝子配列に操作可能に結合されている）を含む。 尚更なる好適具体例において、この発明のＥ６−ＢＰ^SD-12ポリペプチドをコ ードする核酸（それは、厳しい条件下で、SEQ ID NO:３の少なくとも１２の連続 するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズし；一層好ましくは 、SEQ ID NO:３の少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プロー ブとハイブリダイズし；一層好ましくは、SEQ ID NO:３の少なくとも４０の連続 するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする）。 本発明の他の面は、Ｅ６−ＢＰ^SD-16ポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好適具体例において：コードされ るポリペプチドは、生物学的活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルス Ｅ６蛋白質に特異的に結合する）；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１ １のアミノ酸配列に少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ 酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１１のアミノ酸配列と 本質的に同じアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、少なくとも５ 、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり；コードされるポリペ プチドは、SEQ ID NO:１１に由来する少なくとも５の好ましくは少なくとも１０ の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５０、１００又は １５０の連続するアミノ酸を含み；コードされるＥ６−ＢＰ^SD-16ポリペプチド は、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば、細胞増殖の調節の）アゴニスト又は アンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、コードされるポリペプチドは、アンタゴニスト活性を有 し且つ好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される腫瘍細胞において腫 瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染 細胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし又は誘導すること ができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例えばハイリスクＨ ＰＶ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細胞例えばウシパピ ローマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することができ；パピローマウ イルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又 は３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を阻止するこ とができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰ Ｖ−１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞のトラ ンスフォーメーションを阻止することができ；或は、パピローマウイルス例えば ＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えば ウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を阻止することがで きる。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-16ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するコードされるペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１１の配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同 じ若しくは類似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若 しくは類似する性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、コードされるポリペプチドは、第２のポリペプ チド部分（例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のア ミノ酸配列を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例え ば、第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、 例えば第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリ ペプチド部分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。 更に、ある好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-16核酸は、例えば、発 現ベクターとしての使用に適したＥ６−ＢＰ^SD-16遺伝子配列を与える転写調節 配列例えば少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列（Ｅ６ −ＢＰ^SD-16遺伝子配列に操作可能に結合されている）を含む。 尚更なる好適具体例において、この発明のＥ６−ＢＰ^SD-16ポリペプチドを コードする核酸（それは、厳しい条件下で、SEQ ID NO:４の少なくとも１２の連 続するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズし；一層好ましく は、SEQ ID NO:４の少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プロ ーブとハイブリダイズし；一層好ましくは、SEQ ID NO:４の少なくとも４０の連 続するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする）。 本発明の他の面は、Ｅ６−ＢＰ^SD-22ポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好適具体例において：コードされ るポリペプチドは、生物学的活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルス Ｅ６蛋白質に特異的に結合する）；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１ ２のアミノ酸配列に少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ 酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１２のアミノ酸配列と 本質的に同じアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、少なくとも５ 、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり；コードされるポリペ プチドは、SEQ ID NO:１２に由来する少なくとも５の好ましくは少なくとも１０ の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５０、１００又は １５０の連続するアミノ酸を含み；コードされるＥ６−ＢＰ^SD-22ポリペプチド は、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば、細胞増殖の調節の）アゴニスト又は アンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、コードされるポリペプチドは、アンタゴニスト活性を有 し且つ好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される腫瘍細胞において腫 瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細 胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし又は誘導することが でき；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例えばハイリスクＨＰ Ｖ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細胞例えばウシパピロ ーマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することができ；パピローマウイ ルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は ３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を阻止すること ができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ −１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞 のトランスフォーメーションを阻止することができ；或は、パピローマウイルス 例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３ 例えばウシパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を阻止するこ とができる。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-22ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するコードされるペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１２の配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と 同じ若しくは類似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ 若しはく類似する性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、コードされるポリペプチドは、第２のポリペプ チド部分（例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のア ミノ酸配列を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例え ば、第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、 例えば第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリ ペプチド部分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。 更に、ある好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-22核酸は、例えば、発 現ベクターとしての使用に適したＥ６−ＢＰ^SD-22遺伝子配列を与える転写調節 配列例えば少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列（Ｅ６ −ＢＰ^SD-22遺伝子配列に操作可能に結合されている）を含む。 尚更なる好適具体例において、この発明のＥ６−ＢＰ^SD-22ポリペプチドをコ ードする核酸（それは、厳しい条件下で、SEQ ID NO:５の少なくとも１２の連続 するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズし；一層好ましくは 、SEQ ID NO:５の少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プロー ブとハイブリダイズし；一層好ましくは、SEQ ID NO:５の少なくとも４０の連続 するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする）。 本発明の他の面は、Ｅ６−ＢＰ^SD-28ポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好適具体例において：コードされ るポリペプチドは、生物学的活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルス Ｅ６蛋白質に特異的に結合する）；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１ ３のアミノ酸配列に少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ 酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１３のアミノ酸配列と 本質的に同じアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、少なくとも５ 、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり；コードされるポリペ プチドは、SEQ ID NO:１３に由来する少なくとも５の好ましくは少なくとも１０ の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５０、１００又は １５０の連続するアミノ酸を含み；コードされるＥ６−ＢＰ^SD-28ポリペプチド は、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば、細胞増殖の調節の）アゴニスト又は アンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、コードされるポリペプチドは、アンタゴニスト活性を有 し且つ好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される腫瘍細胞において腫 瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細 胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし又は誘導することが でき；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例えばハイリスクＨＰ Ｖ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細胞例えばウシパピロ ーマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することができ；パピローマウイ ルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は ３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を阻止すること ができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ −１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞のトラン スフォーメーションを阻止することができ；或は、パピローマウイルス例えばＨ ＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウ シパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を阻止することができ る。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-28ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するコードされるペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１３の配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同 じ若しくは類似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ 若しくは類似する性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、コードされるポリペプチドは、第２のポリペプ チド部分（例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のア ミノ酸配列を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例え ば、第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、 例えば第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリ ペプチド部分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。 更に、ある好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-28核酸は、例えば、発 現ベクターとしての使用に適したＥ６−ＢＰ^SD-28遺伝子配列を与える転写調節 配列例えば少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列（Ｅ６ −ＢＰ^SD-28遺伝子配列に操作可能に結合されている）を含む。 尚更なる好適具体例において、この発明のＥ６−ＢＰ^SD-28ポリペプチドをコ ードする核酸（それは、厳しい条件下で、SEQ ID NO:６の少なくとも１２の連続 するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズし；一層好ましくは 、SEQ ID NO:６の少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プロー ブとハイブリダイズし；一層好ましくは、SEQ ID NO:６の少なくとも４０の連続 するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする）。 本発明の他の面は、Ｅ６−ＢＰ^SD-32ポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好適具体例において：コードされ るポリペプチドは、生物学的活性を有し（例えば、それは、パピローマウイルス Ｅ６蛋白質に特異的に結合する）；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１ ４のアミノ酸配列に少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％相同なアミノ 酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO:１４のアミノ酸配列と 本質的に同じアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、少なくとも５ 、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり；コードされるポリペ プチドは、SEQ ID NO:１４に由来する少なくとも５の好ましくは少なくとも１０ の一層好ましくは少なくとも２０の更に好ましくは少なくとも５０、１００又は １５０の連続するアミノ酸を含み；コードされるＥ６−ＢＰ^SD-32ポリペプ チドは、Ｅ６−ＢＰの生物学的活性の（例えば、細胞増殖の調節の）アゴニスト 又はアンタゴニストの何れかである。 好適具体例において、コードされるポリペプチドは、アンタゴニスト活性を有 し且つ好ましくは：例えば内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される腫瘍細胞において腫 瘍成長を抑制することができ；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細 胞の成長を抑制することができ；アポトーシスをブロックし又は誘導することが でき；パピローマウイルス感染細胞例えばＨＰＶ感染細胞例えばハイリスクＨＰ Ｖ感染細胞例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３感染細胞例えばウシパピロ ーマウイルス（ＢＰＶ）感染細胞の成長を阻止することができ；パピローマウイ ルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は ３３例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）による細胞の感染を阻止すること ができ；パピローマウイルス例えばＨＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ −１６、１８、３１又は３３例えばウシパピローマウイルスによる細胞のトラン スフォーメーションを阻止することができ；或は、パピローマウイルス例えばＨ ＰＶ例えばハイリスクＨＰＶ例えばＨＰＶ−１６、１８、３１又は３３例えばウ シパピローマウイルスによる細胞例えばヒト細胞の不滅化を阻止することができ る。 好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-32ポリペプチドの少なくとも１つ の生物学的活性を有するコードされるペプチドは、アミノ酸配列において、SEQ ID NO:１４の配列と異なってよいが、かかる差異は、天然のＥ６結合蛋白質と同 じ若しくは類似の様式で機能する改変蛋白質又は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若 しくは類似する性質を有する改変蛋白質を生じるものである。 更に別の好適具体例において、コードされるポリペプチドは、第２のポリペプ チド部分（例えばSEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質と無関係のア ミノ酸配列を有する第２のポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質であり、例え ば、第２のポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、 例えば第２のポリペプチド部分はＤＮＡ結合ドメインであり、例えば第２のポリ ペプチド部分はポリメラーゼ活性化ドメインであり、例えばこの融合蛋白質は２ ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。 更に、ある好適具体例において、主題のＥ６−ＢＰ^SD-32核酸は、例えば、発 現ベクターとしての使用に適したＥ６−ＢＰ^SD-32遺伝子配列を与える転写調節 配列例えば少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列（Ｅ６ −ＢＰ^SD-32遺伝子配列に操作可能に結合されている）を含む。 尚更なる好適具体例において、この発明のＥ６−ＢＰ^SD-32ポリペプチドをコ ードする核酸（それは、厳しい条件下で、SEQ ID NO:７の少なくとも１２の連続 するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズし；一層好ましくは 、SEQ ID NO:７の少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プロー ブとハイブリダイズし；一層好ましくは、SEQ ID NO:７の少なくとも４０の連続 するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする）。 この発明は又、トランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物（例え ばマウス、ラット、ウサギ又はブタ）、例えばここに記載の新規なＥ６−ＢＰ遺 伝子の一つの異種型例えばヒトに由来する遺伝子又は内因性Ｅ６−ＢＰ遺伝子を 誤発現する遺伝子を含む（そして好ましくは発現する）動物、例えば主題のＥ６ −ＢＰの一つ以上の発現が破壊されている動物をも特徴とする。かかるトランス ジェニック動物は、変異した若しくは誤発現されるＥ６−ＢＰ対立遺伝子を含む 細胞性疾患を研究するためのモデル動物として又は薬物スクリーニングにおける 利用のために役立ち得る。 この発明は又、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドよりなるプローブ／プ ライマーをも提供し、該オリゴヌクレオチドは、厳しい条件下で、SEQ ID NO:１ 〜７の一つのセンス若しくはアンチセンス鎖又はその天然の変異物の少なくとも １０の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含 む。好適具体例において、このプローブ／プライマーは、更に、それに結合され た検出可能な標識基を含む。この標識基は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物 、酵素及び酵素補助因子よりなる群から選択することができる。この発明のプロ ーブは、トランスフォームされた細胞を同定するための、例えば患者から単離し た細胞の試料において主題のＥ６結合蛋白質の一つをコードする核酸のレベルを 測定するための；例えば細胞中のＥ６−ＢＰｍＲＮＡレベルを測定するための； 例えばゲノムＥ６−ＢＰ遺伝子が変異し又は欠失しているかどうかを測定す るための診断試験キットの一部として利用することができる。好ましくは、この オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長以上であり且つ２０、３０、５０、 １００又は１５０ヌクレオチド長未満である。 更に別の面において、この発明は、試験化合物を、Ｅ６−ＢＰポリペプチドの パピローマウイルスＥ６蛋白質との相互作用（例えば阻害）についてスクリーニ ングするためのアッセイを提供する。この方法は、（ｉ）ウイルス性Ｅ６蛋白質 Ｅ６−ＢＰ例えばこの発明のＥ６−ＢＰ（例えば、ＳＤ−７、ＳＤ−８、ＳＤ− １２、ＳＤ−１６、ＳＤ−２２、ＳＤ−２８若しくはＳＤ−３２の群から選択さ れるクローンの１つから発現される蛋白質又はケラチン−１７、アポフェリチン 、ヌクレオフォサミン、リボ核蛋白質、プロテオソームサブユニット、補体崩壊 加速因子）と試験化合物とを、この試験化合物の不在時にはＥ６蛋白質とＥ６結 合蛋白質とが相互作用し得る条件下で合わせること；及び（ii）Ｅ６蛋白質とＥ ６結合蛋白質とを含む複合体の形成を検出することのステップを含む。試験化合 物の存在時における複合体形成の（その試験化合物の不在時にみられるものと比 較しての）変化（例えば減少）は、Ｅ６蛋白質とＥ６結合蛋白質との間の相互作 用の調節（例えば阻害）を示す。好適具体例において：Ｅ６蛋白質は、例えばハ イリスクＨＰＶ由来の例えばＨＰＶ−１６、１８、３１若しくは３３由来のＨＰ ＶＥ６蛋白質であり；Ｅ６蛋白質は、ＢＰＶＥ６蛋白質であり；Ｅ６蛋白質とＥ ６結合蛋白質とを無細胞系で合わせて試験化合物と接触させ；即ち、無細胞系を 細胞溶解物及び再構成した蛋白質混合物よりなる群から選択し；Ｅ６結合蛋白質 を細胞中で同時に発現させてその細胞を試験化合物と接触させ、例えば、Ｅ６結 合蛋白質は、相互作用トラップアッセイ（２ハイブリッドアッセイ）を構成する 。好適具体例において、このアッセイは、Ｅ６結合モチーフ例えばほぼＡｌａ１ ９４〜Ａｓｐ２１８に対応するＥ６結合モチーフを含む蛋白質を利用して生成さ れる。 本発明は又、主題のＥ６結合蛋白質の少なくとも１つの野生型機能の喪失によ り特徴付けられる望ましくない細胞成長を有する動物を治療する方法であって、 Ｅ６結合蛋白質の他の細胞性又はウイルス性蛋白質との相互作用を阻止すること のできる薬剤の治療上有効な量を投与することを含む上記の方法をも提供する。 一具体例において、この方法は、SEQ ID NO:８〜１４の一つに表されるポリペプ チドをコードする核酸構築物を、その構築物がＥ６結合蛋白質の欠乏している細 胞により取り込まれる条件下で、及び組換え遺伝子が例えば遺伝子治療技術によ り発現される条件下で投与することを含む。他の具体例において、Ｅ６結合蛋白 質のアンタゴニストフラグメントを医薬製剤中に供給してかかる疾患を治療する ために利用することができる。例えば、Ｅ６結合モチーフを含み得るようなＳＤ −７のアンタゴニスト型を用いて、パピローマウイルス感染した及び／又はトラ ンスフォームされた細胞を治療することができる（このポリペプチドの、好まし くは例えば全長で２５〜５０アミノ酸の小さいポリペプチドの皮下適用による） 。 本発明の他の面は、患者例えばヒト患者が望ましくない細胞増殖により特徴付 けられる病気の危険にあるかどうかを測定する方法を提供する。この方法は、患 者の組織において、（ｉ）SEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋白質をコ ードする遺伝子の変異；又は（ii）SEQ ID NO:８〜１４の一つにより表される蛋 白質をコードする遺伝子の誤発現の少なくとも１つにより特徴付けられる遺伝的 障害の存否を検出することを含む。好適具体例において：遺伝的障害を検出する ことは、次の内の少なくとも１つの存在を確認することを含む：Ｅ６−ＢＰから の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失；この遺伝子への少なくとも１つのヌク レオチドの付加、この遺伝子の少なくとも１つのヌクレオチドの置換、この遺伝 子の大きい染色体再配置；この遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの 変化；この遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパタ ーンの存在；又はこの蛋白質の非野生型レベル。 例えば、遺伝的障害を検出することは、（ｉ）SEQ ID NO:１〜７の１つのセン ス又はアンチセンス配列に、又はその天然の変異物に又はＥ６−ＢＰ遺伝子と天 然において結合している５’若しくは３’フランキング配列にハイブリダイズす るヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマ ーを用意し；（ii）このプローブ／プライマーを組織の核酸にさらし；そして（ iii）このプローブ／プライマーのその核酸へのハイブリダイゼーションによっ て、遺伝的障害の存否を検出することを含み；ここに、この障害の検出は、この プローブ／プライマーを利用してＥ６−ＢＰ遺伝子及び適宜フランキング核酸配 列のヌクレオチドを決定することを含み；例えばこの障害の検出は、このプロー ブ／プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において利用することを含み 、例えば該障害の検出は、このプローブ／プライマーをライゲーション連鎖反応 （ＬＣＲ）において利用することを含む。代わりの具体例においては、該蛋白質 のレベルを、例えばSEQ ID NO:８〜１４の１つにより表される蛋白質と特異的に 免疫反応する抗体を用いる免疫アッセイにて検出する。 本発明の実施は、別途指示しない限り、当業者の範囲内にある細胞生物学、細 胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び 免疫学の慣用技術を用いる。かかる技術は、文献中に十分に説明されている。 例えば、 を参照されたい。 この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らか となろう。図面の説明 図１は、２ハイブリッドアッセイにおける発現のためのＶＰ１６／ｃＤＮＡ融 合遺伝子を構築するために用いたｐＲＳ３０６プラスミッド（Sikorski等(1989) Genetics 122:19）の一般的地図である。 図２及び図３は、ＳＤ−７蛋白質の様々な欠失及び切り詰めのＥ６結合に対す る効果を示す表である。発明の詳細な説明 パピローマウイルス（ＰＶ）は、それらの天然の宿主に良性の上皮の腫瘍即ち いぼを引き起こす感染性作用因子である。ヒトの癌の分野に特に関係して、特定 のヒトパビローマウイルス（ＨＰＶ）の感染は、子宮頚、性器、皮膚の及び他の 部位のものを含むヒト上皮の悪性腫瘍の発生と関係してきた。パピローマウイル スにより生成されるトランスフォーミング蛋白質の２つであるＥ６蛋白質及びＥ ７蛋白質は、それぞれ、腫瘍サプレッサー遺伝子産物ｐ５３及びＲｂと複合体を 形成し、これは、これらのウイルス性蛋白質が、細胞成長制御を調節する決定的 に重大な経路を介してそれらの機能を発揮し得ることを示している。 しかしながら、我々のパピローマウイルスＥ６蛋白質による不滅化の研究は、 ｐ５３結合は有効な不滅化に必要であるが、Ｅ６蛋白質が不滅状態の確立におい て付加的特性を有することを示している。その上、我々の発見は、ＢＰＶ及び「 ローリスク」ＨＰＶ Ｅ６蛋白質の両方がハイリスクＨＰＶ Ｅ６蛋白質と少な くとも１つの共通の機能を有することを示唆している。我々は、２ハイブリッド アッセイ（米国特許第５，２８３、１７３号）を改作して、Ｅ６オンコ蛋白質と 相互作用し、ＰＶ感染性及び／又はトランスフォーメーションに関係する候補蛋 白質であり得る他のヒト細胞蛋白質を同定した。 Ｃ末端でＢＰＶ Ｅ２ＤＮＡ結合ドメインに融合されたＨＰＶ−１６ Ｅ６の 遺伝子を発現し、更に、４つのＥ２結合要素を含むプロモーターにより駆動され るｌａｃＺレポーター構築物を含む酵母株を用いて開始して、我々は、ヒトのｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための２ハイブリッドアッセイを生成 した。次いで、この株を、ランダムにプライムされたＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを 強いＶＰ１６転写活性化ドメインのＣ末端側に挿入した酵母シャトルベクタープ ラスミッドのライブラリーを用いてトランスフォームした。ＶＰ１６／ｃＤＮＡ 融合蛋白質のＥ６／Ｅ２ハイブリッド蛋白質との相互作用は、ＶＰ１６転写活性 化ドメインをＥ２結合部位に補充してｌａｃＺ遺伝子の発現を活性化する。これ は、Ｅ６と特異的に相互作用する蛋白質をコードする幾つかのヒト遺伝子の上首 尾の単離へと導いた。それ故、この発明は、後述のように、部分的に、腫瘍サプ レッサー蛋白質「ｐ５３」及び細胞性蛋白質「Ｅ６−ＡＰ」に加えて、パピロー マウイルストランスフォーミング蛋白質Ｅ６は幾つかの他の細胞性蛋白質（以後 「細胞性Ｅ６結合蛋白質」と呼ぶ）とも会合し、この会合がおそらくパピローマ ウイルス感染及びパビローマウイルス媒介による病態の病因論にとって重要であ るという発見に由来する。例えば、主題のＥ６結合蛋白質の１つのＥ６との会合 は、何れかの若しくは両蛋白質の局在性の変化、この蛋白質の生物学的活性の変 化、この蛋白質の細胞における半減期の変化又はこれらの組合せを生じ得る。従 って、この発明の具体例は、パピローマウイルス感染細胞を検出し治療するため の診断及び治療用のアッセイ及び試薬を利用可能にする。 例えば、主題のＥ６−ＢＰの各々をアッセイの基礎として用いて、特定のＥ６ 結合蛋白質のパピローマウイルスＥ６蛋白質に結合する能力を変え（例えば、減 少させ）、それにより、Ｅ６−ＢＰ／Ｅ６複合体の阻止を介して、パピローマウ イルス感染、トランスフォーメーション及び／又は不滅化を阻止する薬剤を同定 することができる。かかる薬剤は、例えば、ヒトパピローマウイルス例えばＨＰ Ｖ−１、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−３、ＨＰＶ−４、ＨＰＶ−５、ＨＰＶ−６、ＨＰ Ｖ−７、ＨＰＶ−８、ＨＰＶ−９、ＨＰＶ−１０、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１２ 、ＨＰＶ−１４、ＨＰＶ−１３、ＨＰＶ−１５、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１７又 はＨＰＶ−１８が感染した、特にＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１及 びＨＰＶ−３３等のハイリスクＨＰＶが感染した細胞におけるＥ６−ＢＰ／Ｅ６ 複合体を妨げるように治療に用いることができる。細胞を、１つ以上のＥ６−Ｂ Ｐ／Ｅ６複合体の形成を変える薬剤と接触させることは、パピローマウイルス感 染の病理学的進行を阻止することができ、例えばいぼ例えば足底いぼ（足底疣贅 ）、尋常性いぼ（扁平疣贅）、Butcher尋常性いぼ、扁平いぼ、性器いぼ（尖圭 コンジローム）、又は疣贅状表皮発育異常症の形成を阻止し又は逆行させること ができ；並びにトランスフォームされ及び／又は不滅化された又はこれらの危険 にあるパピローマウイルス細胞例えば癌様の例えば喉頭パピローマ、巣状上皮、 子宮頚癌腫を治療することができる。 一具体例に置いて、細胞性Ｅ６結合蛋白質は、サイトケラチンであり、ＰＶ Ｅ６蛋白質のサイトケラチンへの結合は、例えば、サイトケラチンマトリックス の崩壊、細胞エンベロープの破壊、感染上皮組織の空間的構成の破壊及び／又は ＰＶ感染細胞による局部的接着の喪失に寄与し得る。好適具体例において、サイ トケラチンは、ケラチン−１７である。それ故、Ｅ６／サイトケラチン相互作用 の破壊は、パピローマウイルスの感染性に、例えば、感染細胞からのウイルス粒 子の放出に影響することにより並びに例えばケラチノサイトの例えば扁平上皮の 例えば層化扁平上皮の上皮表現型のＰＶ誘導された変化を阻止することによって 影響を及ぼし得る。 他の具体例において、細胞性Ｅ６結合蛋白質は、細胞増殖（例えば、転写調節 、ｍＲＮＡプロセッシング、ｍＲＮＡ局在化又はリボソーム成熟）に関与する 核小体蛋白質であり、パピローマウイルスＥ６のこの核小体蛋白質への結合は、 これらの機能の１つの変化、Ｅ６の核小体局在化及び／又は核小体構成の変化を 生じる。好適具体例において、この核小体蛋白質は、例えば、GenBank受託番号 Ｘ１６９３４により与えられる配列を有するヌクレオフォスミンである。 更に別の具体例において、細胞性Ｅ６結合蛋白質は、アポフェリチン好ましく はGenBank受託番号Ｘ００３１８により与えられる配列を有するアポフェリチン である。Ｅ６のアポフェリチン蛋白質への結合は、例えば、ＰＶ感染細胞におけ る酸化事象の調節を変える（例えば、オキシデート損傷に対して応答する細胞の 能力を変える）ことができた。アポフェリチンの結合は、直接に又は細胞の酸化 状態の変化を介して、新生物トランスフォーメーションに（例えば、危機に直面 した細胞に）重要な他の細胞性蛋白質例えば熱ショック蛋白質の発現を変えるこ とができた。その上、Ｅ２発現及びＤＮＡ複製によるウイルス遺伝子の転写の活 性化及び抑制は、細胞内の酸化還元環境の変化によって調節されることが示唆さ れてきた。それ故、この相互作用を阻害する薬剤は、パピローマウイルス感染及 び／又はトランスフォーメーションの阻止において有用であり得よう。 更なる具体例において、細胞性Ｅ６結合蛋白質は、核のリボ核蛋白質好ましく はＡＴＣＣ受託番号Ｍ１６３４２により与えられる核のリボ核蛋白質粒子ＣのＣ 蛋白質であるか、或は、GenBank受託番号Ｘ１２４６６により表されるようなリ ボ核蛋白質Ｅである。Ｅ６のＲＮＡプロセッシング反応に関係するある種の蛋白 質との会合は、ＲＮＡスプライシングの転写後制御による細胞性及び／又はウイ ルス遺伝子の発現の直接的調節を包含するＥ６の役割を示唆する。かかるＥ６と の相互作用の他の役割は、Ｅ６の核内封鎖を引き起こすことによりこの蛋白質に 核局在化シグナルを与えることであろう。かかる相互作用は、パピローマウイル ス感染及び／又はトランスフォーメーションのインヒビターのための潜在的な治 療標的でもある。 尚更なる具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、GenBank受託番号Ｍ１５７９９ にて表されるような補体崩壊加速因子である。 更に別の具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、プロテアソーム例えばGenBank 受託番号Ｄ００７６２により表されるプロテアソームサブユニットＨＣ８であ る。Ｅ６のプロテオソームサブユニットへの結合は、Ｅ６に結合した蛋白質例え ばｐ５３の分解を容易にし／促進させるためにプロテアーゼ複合体をＥ６を含む 他の複合体に補充する機構を提供することができた。 Ｅ６の前にクローン化された細胞性蛋白質との相互作用の発見に加えて、ここ では、幾つかの新規な蛋白質が、Ｅ６結合能力を有するので同定される。Ｅ６の これらの蛋白質への結合が、例えば、これらの蛋白質の細胞性機能の変化及び／ 又はＥ６蛋白質とＥ６−ＢＰの一方若しくは両方の局在化の変化を引き起こすと いうことはあり得る。従って、これらの蛋白質のある種の正常な細胞での役割の すべての面は完全に解明されていないが、これらの蛋白質がウイルス性Ｅ６蛋白 質に結合する事実及びＥ６がパピローマウイルス感染の病因論に決定的に重要で あるという事実は、これらの蛋白質の各々のＥ６との相互作用が、例えばＨＰＶ 感染の治療に有用な薬剤を開発するための潜在的な治療標的を提供することを示 す。 例えば、一具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、SEQ ID NO:８（クローンＳＤ −７）により表される蛋白質配列を含み（例えば、パピローマウイルスＥ６蛋白 質に結合するポリペプチド）；例えば、Ｅ６−ＢＰは、少なくとも１つのカルシ ウム結合モチーフを含み（例えば、ＥＦハンドモチーフ）；例えば、Ｅ６−ＢＰ は、ＥＲ／トランス−ゴルジ局在化シグナルを含む（例えば、カルボキシ末端Ｈ ｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（ＫＤＥＬ）配列）。 他の具体例において、Ｅ６結合蛋白質は、分子シャペロン蛋白質のヒト同族体 である（例えば、SEQ ID NO:１２（クローンＳＤ−２２）により表されるヒトシ ャペロン１０蛋白質）。 尚更なる好適具体例において：Ｅ６結合蛋白質は、SEQ ID NO:９、１０、１１ 、１３又は１４（それぞれ、クローンＳＤ−８、ＳＤ−１２、ＳＤ−１６、ＳＤ ２８及びＳＤ−３２）の１つによって表されるポリペプチドを含む（例えば、パ ピローマウイルスＥ６蛋白質に結合するポリペプチド）。我々は又、最小のＥ６ 結合モチーフ（例えば、ＳＤ−７由来のもの）をも決定した。添付の実施例に記 載のように、このＥ６結合モチーフは、Ｅ６結合を指示するのに必要且つ十分で ある。その上、この最小のＥ６結合モチーフがイン・ビボでアンタゴニス トとして機能することは、ありそうなことである。 この発明の他の面は、主題のＥ６結合蛋白質の１つをコードするヌクレオチド 配列を含む単離された核酸及び／又はかかる核酸の同等物に関係する。この用語 核酸は、ここで用いる場合、フラグメント及び同等物を含むことを意図している 。用語同等物は、機能的に同等のＥ６結合蛋白質又は機能的に同等のペプチド（ 例えば、Ｅ６に結合する能力を保持し、そして更に、ここに記載したようなＥ６ −ＢＰの他の活性をも保持し得るもの）をコードするヌクレオチド配列を含むも のと理解される。同等物のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチド の置換、付加又は欠失により異なり（例えば対立遺伝子変異物）；そして、それ 故に、SEQ ID NO:１〜７の何れかに示したヌクレオチド配列Ｅ６結合蛋白質と遺 伝コードの縮重のために異なる配列を含むであろう。同等物は又、厳しい条件下 （即ち、約１Ｍの塩において形成された二本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔ_m）より約 ２０〜２７℃低温と同等）で、SEQ ID NO:１〜７に表された現在クレームしてい るＥ６結合蛋白質のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、又はｐＲＳ３０６− Ｅ６ＢＰライブラリー（ＡＴＣＣ受理番号：７５８２７）からのＥ６結合蛋白質 のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列をも含む。一具体例 において、同等物は、更に、SEQ ID NO:１〜７の何れかに示したヌクレオチド配 列から導かれた及び該ヌクレオチド配列に進化的に関連する核酸配列を含む。 その上、ある種の状況下では、この蛋白質の天然型の生物学的活性のあるサブ セットのみを促進し又は阻止するために、Ｅ６−ＢＰアゴニスト又はＥ６−ＢＰ アンタゴニストの何れか一つとして限られた能力にて機能する主題のＥ６結合蛋 白質の同族体を提供することが有利であるということは、一般に、認められるで あろう。従って、特定の生物学的効果を、限られた機能の同族体での処理により 誘出することができ、これは、Ｅ６結合蛋白質の生物学的活性のすべてに向けら れたアゴニスト又はアンタゴニストを用いる処理に比べて一層少ない副作用しか 伴わない。 かかる主題のＥ６結合蛋白質の同族体は、突然変異誘発により、例えば離散し た点突然変異により若しくは切り詰めにより生成することができる。例えば、 突然変異は、同族体が由来したＥ６−ＢＰの生物学的活性の実質的に同じ又はあ るサブセットのみを保持する同族体を生じさせることができる。或は、例えば競 争的にＥ６に結合することによりこの蛋白質の天然型の機能を阻害することので きるこの蛋白質のアンタゴニスト型を生成することができる。 蛋白質は、もし次の特性の少なくとも１つを有するならば、Ｅ６−ＢＰの生物 学的活性を有する：真核細胞例えば哺乳動物細胞例えばヒト細胞の増殖／細胞成 長を調節する能力；パピローマウイルス感染（例えばヒトパピローマウイルス、 例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１又はＨＰＶ−３３による感染 ）の効力を調節する能力；細胞トランスフォーメーション（例えばＰＶ媒介によ るトランスフォーメーション、例えばＰＶ媒介のトランスフォーメーション例え ばハイリスクＨＰＶ媒介のトランスフォーメーション）の効力に影響する能力； 細胞の不滅化（例えばＰＶ媒介のトランスフォーメーション、例えばＨＰＶ媒介 のトランスフォーメーション、例えばハイリスクＨＰＶ媒介の不滅化）の効力に 影響する能力；又はＰＶ Ｅ６蛋白質（例えばＨＰＶ Ｅ６蛋白質、例えばハイ リスクＨＰＶ Ｅ６）に結合する能力。蛋白質は又、上記の特性の一つの特異的 アゴニスト又はアンタゴニストであるならば、生物学的活性を有する。 ここで用いる場合、用語「核酸」は、ポリヌクレオチド例えばデオキシリボ核 酸（ＤＮＡ）をいい、適宜、リボ核酸（ＲＮＡ）をいう。この用語は又、ヌクレ オチドアナログから作られるＲＮＡ又はＤＮＡのアナログをも同等物として含み 且つ、記載した具体例に適用可能であるので、一本鎖の（センス又はアンチセン ス）及び二本鎖のポリヌクレオチドも含むと理解されるべきである。 ここで用いる場合、用語「遺伝子」又は「組換え遺伝子」は、本発明のＥ６結 合蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸をいい、それは 、エキソン及び（適宜）イントロンの配列の両者を含む。「組換え遺伝子」は、 Ｅ６結合蛋白質をコードする核酸及び、適宜染色体のＥ６−ＢＰ遺伝子又は無関 係の染色体遺伝子に由来するイントロン配列を含んでよいが、Ｅ６−ＢＰをコー ドするエキソン配列を含む核酸をいう。主題のＥ６結合蛋白質をコードする典型 的な組換え遺伝子は、SEQ ID NO:１〜７の何れか１つによって表されている。更 に、主題のＥ６結合蛋白質の各々をコードする組換え遺伝子は、下記のよ うに、ＡＴＣＣ寄託番号７５８２７から単離することができる。用語「イントロ ン」は、所定のＥ６−ＢＰ遺伝子中に存在する蛋白質に翻訳されないＤＮＡ配列 をいい、一般に、エキソンの間に見出される。 ここで用いる場合、用語「トランスフェクション」は、核酸例えば発現ベクタ ーの、レシピエント細胞への、核酸媒介による遺伝子トランスファーによる導入 を意味する。「トランスフォーメーション」は、ここで用いる場合、外因性ＤＮ Ａ又はＲＮＡの細胞による取り込みの結果としてその細胞の遺伝子型が変化する 過程をいい、例えば、トランスフォームされた細胞は、本発明のＥ６結合蛋白質 の組換え型を発現し、アンチセンス発現がトランスフェクトされた遺伝子から生 じ、Ｅ６結合蛋白質の天然型からの発現は破壊される。 ここで用いる場合、用語「ベクター」は、それに結合された他の核酸を輸送す ることのできる核酸分子をいう。好適ベクターの一つの型は、エピソーム即ち染 色体外で複製可能な核酸である。好適ベクターは、それらが結合された核酸の自 律的な複製及び／発現が可能なものである。機能的に結合された遺伝子の発現を 指令することのできるベクターを、ここでは、「発現ベクター」と呼ぶ。一般に 、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、「プラスミッド 」の形態であり、それは、ベクター型では染色体に結合しない環状の二本鎖ＤＮ Ａループをいう。本明細書においては、「プラスミッド」及び「ベクター」は、 プラスミッドが殆ど一般に用いられるベクターの形態であるので、交換可能に使 用する。しかしながら、この発明は、同等の機能をする及びこの後に当業者に公 知となる他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。 「転写調節配列」は、操作可能に結合された蛋白質コード配列の転写を誘導し 又は制御する開始シグナル、エンハンサー及びプロモーター等のＤＮＡ配列をい う、この明細書中で用いられる包括的用語である。好適具体例において、組換え Ｅ６−ＢＰ遺伝子の転写は、発現を意図する細胞型中の組換え遺伝子の発現を制 御するプロモーター配列（又は他の転写調節配列）の制御下にある。組換え遺伝 子は、天然型のＥ６結合蛋白質の転写を制御する配列と同じか又は異なる転写調 節配列の制御下にあってよいということは理解されよう。 ここで用いる場合、用語「組織特異的プロモーター」は、プロモータ−として 働く即ちそのプロモーターに操作可能に結合された選択されたＤＮＡ配列の発現 を調節し、組織の特異的な細胞例えば上皮系統の細胞例えば子宮頚扁平上皮細胞 における選択したＤＮＡ配列の発現を達成するＤＮＡ配列を意味する。上皮特異 的なプロモーターの説明のための具体例において、遺伝子構築物を、遺伝子治療 の一部として用いて、例えば、パピローマウイルス媒介による病気例えば乳頭腫 における主題のＥ６結合蛋白質の１つを含むＥ６／Ｅ６−ＢＰ複合体のレベルを 調節するためにＥ６−ＢＰアンタゴニストを送達し、又は上皮組織のみにおける 主題のＥ６結合蛋白質の１つのアンチセンス構築物の発現を指示することができ る。この用語は又、選択したＤＮＡの発現を主として１つの組織において調節す るが他の組織においても発現を生じるいわゆる「漏れ易い」プロモーターをもカ バーするものである。 ここで用いる場合、「トランスジェニック動物」は、１つ以上の細胞がトラン スジーンを含む任意の動物好ましくは非ヒト哺乳動物例えばラット、マウス又は ブタである。トランスジーンは、細胞中へ、故意の遺伝的操作例えばマイクロイ ンジェクション又は組換えウイルスでのトランスフェクションによるその細胞の 前駆細胞への導入により、直接又は間接に導入される。用語遺伝的操作は、古典 的な交配又はイン・ビトロでの受精を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入に 向けられている。この分子は、染色体中にインテグレートされ得るし、又は染色 体外で複製するＤＮＡであってよい。ここに記載のトランスジェニック動物にお いて、トランスジーンは、細胞に、主題のＥ６−ＢＰ蛋白質の１つ以上の組換え 型を発現させ、或は、天然型のＥ６−ＢＰ遺伝子の１つ以上の発現を破壊する。 しかしながら、組換えＥ６−ＢＰ遺伝子がサイレントであるトランスジェニック 動物は又、例えば、下記のＦＬＰ又はＣＲＥレコンビナーゼ依存性構築物と予期 される。この発明の「非ヒト動物」は、脊椎動物例えばゲッ歯類、非ヒト霊長類 、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。好適な非ヒト動物 は、ラット及びマウスを含むゲッ歯類科から選択され、トランスジェニック両生 類例えばXenopus属のメンバー及びトランスジェニックニワトリも又、例えば胚 形成及び組織パターンを理解するための重要なツールを提供し得るが、最も好ま しいのはマウスである。用語「キメラ動物」は、ここでは、組換え遺伝子が 見出される動物か又は組換え遺伝子がその動物のすべての細胞ではないが幾つか の細胞において発現されている動物を呼ぶのに用いる。用語「組織特異的キメラ 動物」は、組換えＥ６−ＢＰ遺伝子が幾つかの組織に存在し及び／又は発現され ているが他の組織ではそうではないものを指す。 ここで用いる場合、用語「トランスジーン」は、核酸配列（例えば、１つ以上 のＥ６結合蛋白質をコードするもの）を意味し、それはトランスジェニック動物 に対して部分的に又は完全に異質（即ち、外来物）であり、又はそれが導入され たトランスジェニック動物又は細胞の内因性遺伝子に対して同種であるが、それ が挿入された細胞のゲノムを変えるような仕方で動物ゲノム中に挿入されるよう にデザインされ又は挿入される（例えば、それは、天然の遺伝子の位置とは異な る位置に挿入され又はその挿入はノックアウトを生じる）。トランスジーンは、 選択した核酸の最適な発現に必要な１つ以上の転写調節配列及び他の核酸例えば イントロンを含むことができる。 周知のように、特定のポリペプチドに対する遺伝子は、単一の又は複数のコピ ーにて、個体のゲノム中に存在することができる。かかる重複遺伝子は、同一で あってもよく、又は実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレ オチド置換、付加又は欠失を含むある種の修飾を有してもよい。従って、用語「 Ｅ６結合蛋白質をコードするＤＮＡ配列」は、特定の個体中の１つ以上の遺伝子 をいうことができる。更に、対立遺伝子と呼ばれるヌクレオチド配列におけるあ る種の差異が個々の生物間に存在し得る。かかる対立遺伝子の差異は、コードさ れるポリペプチドのアミノ酸配列に変化を生じても生じなくてもよく、やはり同 じ生物学的活性を有する蛋白質をコードする。 「相同性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間における配列類似性を いう。相同性は、比較の目的のために整列され得る各配列中の一の位置を比較す ることにより測定することができる。比較した配列中の一つの位置が同じ塩基又 はアミノ酸により占められているならば、それらの分子は、その位置で相同であ る。配列間の相同性の程度は、それらの配列により共有されるマッチング又は相 同な位置の数の関数である。 「細胞」、「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」は、ここでは、交換可能に用 いられる用語である。かかる用語が特定の患者の細胞をいうだけではなく、かか る細胞の子孫又は潜在的子孫をもいうものであることは理解されることである。 突然変異又は環境の影響のためにある種の修飾が連続する世代において生じ得る ので、かかる子孫は、実際は、親の細胞と同一ではあり得ないが、やはり、ここ で用いるこの用語の範囲内に含まれる。 「キメラ蛋白質」又は「融合蛋白質」は、主題のＥ６結合蛋白質の１つをコー ドする第１のアミノ酸配列の、主題のＥ６−ＢＰの何れのドメインに対しても外 来性であって実質的に相同でないドメインを規定する第２のアミノ酸配列との融 合物である。キメラ蛋白質は、第１の蛋白質をも発現する生物中に見出される外 来性ドメイン（異なる蛋白質中ではあるが）を与えることができ、それは、異な る種類の生物により発現される蛋白質構造の「種間」融合物、「遺伝子間」融合 物等であってよい。 用語「進化的に関連した」は、Ｅ６結合蛋白質をコードする核酸配列に関して 、天然の変異体を含む、生物中で自然に生じた核酸配列をいう。この用語は又、 天然のＥ６−ＢＰから導かれるが、突然変異誘発例えば下記の組合せ突然変異誘 発により変化した核酸配列で、Ｅ６結合蛋白質の少なくとも１つの活性を有する ポリペプチドを依然としてコードするものをもいう。 用語「単離された」は、ここで核酸例えばＤＮＡ又はＲＮＡについて用いる場 合、それぞれ、巨大分子の天然の起源に存在する他のＤＮＡ又はＲＮＡから分離 された分子をいう。例えば、主題のＥ６結合蛋白質をコードする単離された核酸 は、好ましくは、天然のゲノムＤＮＡ中で特定のＥ６−ＢＰ遺伝子に直接隣接す る核酸配列の１０キロベース（ｋｂ）以下を含み、一層好ましくは、かかる天然 のフランキング配列の５ｋｂ以下を含み、最も好ましくは、かかる天然のフラン キング配列の１．５ｋｂ以下を含む。用語単離されたは、ここで用いる場合、組 換えＤＮＡ技術により生成した場合に、細胞性物質、ウイルス性物質若しくは培 養培地を実質的に含まず、又は化学合成した場合に、化学的前駆体若しくは他の 化学物質を実質的に含まない核酸又はペプチドをもいう。その上、「単離された 核酸」は、天然には断片として存在せず、天然状態では見出されない核酸断片を 含むことを意味する。 一具体例において、核酸は、主題のＥ６結合蛋白質の少なくとも１つの活性を 有するペプチドをコードするｃＤＮＡである。好ましくは、核酸は、SEQ ID NO: １〜７の１つに表されたヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含むｃＤＮＡ分 子である。これらのｃＤＮＡ分子の好適部分は、この遺伝子のコード領域を含む 。 好適な核酸は、SEQ ID NO:８〜１４の１つに示したアミノ酸配列と少なくとも ６０％相同であり、一層好ましくは７０％相同であり、最も好ましくは８０％、 ９０％又は９５％相同であるアミノ酸配列を含むＥ６結合蛋白質をコードする。 主題のＥ６結合蛋白質の活性を有し、SEQ ID NO:８〜１４の１つに示した配列と 少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少な くとも約９８〜９９％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸も又、こ の発明の範囲内にある。 添付の配列表に示したこれらのヌクレオチド配列の幾つかは、主題のＥ６結合 蛋白質の部分をコードする。それ故、この発明の更なる具体例において、組換え Ｅ６−ＢＰ遺伝子は、SEQ ID NO:１〜７に示すアミノ酸配列をコードするヌクレ オチドに加えて、各蛋白質のＣ末端及びＮ末端のアミノ酸をコードする更なるヌ クレオチド配列を含むことができる。例えば、組換えＥ６−ＢＰ遺伝子は、下記 の表１から引き出したプライマーのセットを用いて、ＡＴＣＣ寄託番号７５８２ ７のＥ６−ＢＰクローンの１つのコード配列の１つを増幅することにより生成し たＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を含むことができる。 この発明の他の面は、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、SEQ ID NO:１２、SEQ ID NO:１３又はSEQ ID NO:１４に示したアミノ 酸配列の全部又は一部を有するペプチドをコードする核酸に厳しい又は厳しくな い条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーション を促進する適度に厳しい条件例えば６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウ ム（ＳＳＣ）（約４５℃）及びその後の５０℃での２．０×ＳＳＣ洗浄は、当業 者に公知であり、又はCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.中に見出すことができる。例えば、洗浄工程に おける塩濃度は、５０℃の約２．０×ＳＳＣの低緊縮〜５０℃の約０．２× ＳＳＣの高緊縮から選択することができる。更に、洗浄工程の温度は、室温（約 ２２℃）の低緊縮条件から約６５℃の高緊縮条件まで増大させることができる。 遺伝コードの縮重のためにSEQ ID NO:１〜７の何れかに示したヌクレオチド配 列と異なる配列を有する核酸も又、この発明の範囲内にある。かかる核酸は、機 能的に同等のペプチド（即ち、Ｅ６結合蛋白質の生物学的活性を有するペプチド ）をコードするが、遺伝コードの縮重のために該配列表に示した配列と配列が異 なる。例えば、幾つかのアミノ酸は、１種類より多くのトリプレットにより指定 される。同じアミノ酸を特定するコドン即ちシノニム（例えば、ＣＡＵ及びＣＡ Ｃは、それぞれ、ヒスチジンをコードする）は、Ｅ６結合蛋白質のアミノ酸配列 に影響を与えない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、主題のＥ６結 合蛋白質のアミノ酸配列の変化へと導くＤＮＡ配列多型が脊椎動物間に存在する であろうことが予想される。当業者は、Ｅ６結合蛋白質の活性を有するポリペプ チドをコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（最大で、例えば、ヌクレオチ ドの約３〜５％）におけるこれらの変化は、自然の対立遺伝子変異のために、所 定の種の個体間に存在し得るということを認めるであろう。任意の及びすべての かかるヌクレオチド変異及びその結果生じるアミノ酸多型は、この発明の範囲内 にある。 現在請求項に記載されているＥ６結合蛋白質の活性部分をコードする核酸の断 片も又、この発明の範囲内にある。ここで用いる場合、Ｅ６結合蛋白質の活性部 分をコードする核酸の断片は、Ｅ６結合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードす るヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有するが、それにもかかわらずＥ ６−ＢＰ生物学的活性（例えばＥ６結合蛋白質のアゴニスト活性）を有するペプ チドをコードする核酸をいう。本発明の範囲内の核酸断片は、高緊縮及び低緊縮 条件下で、Ｅ６−ＢＰ同族体を検出するためのスクリーニングプロトコールにお ける使用のために他の種からの核酸とハイブリダイズし得るもの、並びに主題の Ｅ６−ＢＰの１つをコードする核酸の存在の検出における使用のためにヒトの試 料からの核酸とハイブリダイズし得るものを含む（代わりのイソ型例えばｍＲＮ Ａのスプライシング変化物）。この発明の範囲内の核酸は又、 リンカー配列、修飾された制限エンドヌクレアーゼ部位及び主題のＥ６結合蛋白 質の組換え型の分子クローニング、発現又は精製に有用な他の配列も含むことが できる。 ここで用いる場合、「Ｅ６結合モチーフ」は、パピローマウイルスＥ６蛋白質 と特異的に相互作用するための結合活性を与えるポリペプチド配列をいう。典型 的なＥ６結合結合モチーフは、SEQ ID NO:７のＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８によ り表される。 下記の実施例により示したように、Ｅ６結合蛋白質の活性を有するペプチドを コードする核酸は、多くの真核細胞の何れかの中に存在するｍＲＮＡから得るこ とができる。成体及び胎児の両者から得られるゲノムＤＮＡから本発明のＥ６結 合蛋白質をコードする核酸を得ることも可能であろう。例えば、Ｅ６結合蛋白質 をコードする遺伝子を、ここに記載のプロトコール並びに当業者に一般に公知の プロトコールに従ってｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーからクローン化すること ができる。主題のＥ６結合蛋白質の１つをコードするｃＤＮＡは、全ｍＲＮＡを 細胞例えば哺乳動物細胞例えばヒト細胞（腫瘍細胞を含む）から単離することに より得ることができる。次いで、二本鎖ｃＤＮＡを、全ｍＲＮＡから調製し、続 いて、多くの公知の技術の何れかを用いて適当なプラスミッド又はバクテリオフ ァージベクターに挿入することができる。Ｅ６結合蛋白質をコードする遺伝子は 又、この発明により提供されるヌクレオチド配列情報に従って、確立されたポリ メラーゼ連鎖反応を用いてクローン化することもできる。この発明の核酸は、Ｄ ＮＡ又はＲＮＡであってよい。好適な核酸は、SEQ ID NO:１に示した配列により 表されるｃＤＮＡである（但し、この核酸が、好ましくはSEQ ID NO:８の残基１ 〜１３３間の少なくとも４つの連続アミノ酸残基を、一層好ましくは少なくとも １０個の連続アミノ酸残基を、一層好ましくは少なくとも２０個の連続アミノ酸 残基をコードするサブ配列を含む核酸プローブにハイブリダイズするならば）。 更に別の好適具体例において、この核酸は、Ｅ６結合モチーフをコードするヌク レオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。他の核酸は、SEQ ID NO:２に示した配列により表されるｃＤＮＡである。他の好適核酸には、SEQ ID NO:３〜７の１つに示された配列により表されるｃＤＮＡ分子が含ま れる。好適核酸は、ｐＲＳ３０６−Ｅ６ＢＰライブラリーから得られたｃＤＮＡ である（ＡＴＣＣ寄託番号７５８２７）。 この発明の他の面は、「アンチセンス」治療における単離された核酸の利用に 関係する。ここで用いる場合、「アンチセンス」治療は、細胞性条件下で、Ｅ６ 結合蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと、その蛋白質 の発現を例えば転写及び／又は翻訳を阻止することにより阻止するように特異的 にハイブリダイズする（例えば、結合する）オリゴヌクレオチドプローブ又はそ れらの誘導体の投与又はイン・シトゥー生成をいう。この結合は、伝統的な塩基 対相補性によるものでよく、又は例えば二本鎖ＤＮＡへの結合の場合、二重らせ んの大きい溝における特異的相互作用によるものであってよい。一般に、「アン チセンス」治療は、当分野で一般的に用いられる技術の範囲をいい、オリゴヌク レオチド配列への特異的結合に依存する任意の治療を含む。 本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞中で転写されたときにＥ６結合 蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも１つのユニーク部分に相補的で あるＲＮＡを生成する発現プラスミッドとして送達され得る。或は、このアンチ センス構築物は、エキソ・ビボで生成し且つ細胞に導入されたときにＥ６結合蛋 白質をコードするｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリダイズすることによ り発現の阻止を引き起こすオリゴヌクレオチドプローブである。かかるオリゴヌ クレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ例えばエキソヌクレア ーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに耐性であり、それ故に、イン・ビボで安定 である修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして の利用のための典型的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオ エート及びメチルホスホネートアナログである（米国特許第５，１７６，９９６ 号；５，２６４，５６４号；及び５，２５６，７７５号も参照されたい）。 更に、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築するための一般的アプ ローチは、例えば、Van der Krol等(1988)Biotechniques 6:958-976;及びStein 等(1988)Cancer Res 48:2659-2668により総説されている。 従って、この発明の修飾オリゴマーは、治療、診断及び研究のコンテキストに おいて有用である。治療応用において、これらのオリゴマーは、一般にアンチセ ンス治療に適した方法にて利用される。かかる治療のために、この発明のオリゴ マーを、全身投与及び局所又は局在化投与を含む、種々の投与方法のために配合 することができる。技術及び配合は、一般に、Remmington's Pharmaceutical Sc iences ，Meade Publishing Co.,ペンシルベニア、Easton中に見出すことができる。全身 投与のためには、筋肉注射、静脈注射、腹腔内注射及び皮下注射を含む注射が好 適であり、この発明のオリゴマーを、液体溶液好ましくは生理学的に適合性の緩 衝液例えばハンクス溶液又はリンゲル溶液にて配合することができる。更に、こ れらのオリゴマーを、固体形態で配合し、使用直前に溶解させ又は懸濁させるこ とができる。凍結乾燥形態も又、この発明に含まれる。 経粘膜若しくは経皮的手段によって全身投与も可能であり、又はこれらの化合 物は、経口投与することができる。経粘膜又は経皮的投与のために、透過すべき バリヤーに対する適当な浸透剤をこの配合物において用いる。かかる浸透剤は、 一般に当分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用の、胆汁酸塩及びフシジン酸 誘導体が含まれる。更に、デタージェントを用いて透過を容易にすることができ る。経粘膜投与は、鼻スプレーにより又は坐剤を用いることができる。経口投与 のためには、これらのオリゴマーを、慣用の経口投与形態例えばカプセル、錠剤 及びトニックに配合することができる。局所投与のためには、この発明のオリゴ マーを、当分野で公知の、軟膏、膏薬、ジェル又はクリームに配合する。 治療における利用に加えて、この発明のオリゴマーを診断試薬として用いて、 それらが特異的に結合する標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在又は不在を検出する ことができる。 本発明は又、Ｅ６結合蛋白質の一部分のみ（例えばＥ６結合モチーフ）をコー ドする核酸をも提供する。ここで用いる場合、かかるＥ６結合蛋白質の一部分を コードする核酸の断片は、完全長のＥ６結合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコー ドするヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有するが、それでもやはりＥ ６蛋白質に結合することのできるポリペプチドをコードするのに十分なコード配 列を含むヌクレオチド配列をいう。その上、この発明の範囲内の核酸断片は、厳 しい又は緩い条件下で他の脊椎動物種（特に哺乳動物）由来の核酸とハイブリダ イズすることのできる断片を含み、主題のＥ６結合蛋白質の同族体を検出する スクリーニングプロトコールにおいて用いることができる。この発明の範囲内の 核酸は又、Ｅ６結合蛋白質に由来する組換えペプチドの分子クローニング、発現 又は精製に有用なリンカー配列、改変された制限エンドヌクレアーゼ部位及びそ の他の配列をも含んでよい。 この発明は又、少なくとも１つの転写調節配列に操作可能に結合されたＥ６結 合蛋白質の活性を有するペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターをも提供 する。操作可能に結合されたとは、ヌクレオチド配列が調節配列にそのヌクレオ チド配列の発現を与えるように結合されることを意味するものである。調節配列 は、技術的に認められ、Ｅ６結合蛋白質の活性を有するペプチドの発現を指示す るように選択される。従って、用語転写調節配列は、プロモーター、エンハンサ 一及び他の発現制御要素を含む。典型的調節配列は、Goeddel;Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,（1990）Academic Press，カリフォルニア、Sa n Diegoに記載されている。例えば、種々の発現制御配列（機能的に結合された ときにＤＮＡ配列の発現を制御する配列）の何れかを、これらのベクターで用い て、この発明のＥ６結合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を発現させることができ る。かかる有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０の初期及び後期プロモー ター、アデノウイルス若しくはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ｌａ ｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ若しくはＴＲＣ系、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより発現 が指示されるＴ７プロモーター、ラムダファージの主要オペレーター及びプロモ ーター領域、ｆｄコート蛋白質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼそ の他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター例えばＰｈ ｏ５、酵母のアルファ交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘド ロンプロモーター及び原核細胞若しくは真核細胞若しくはそれらのウイルスの遺 伝子の発現を制御することが知られた他の配列並びにこれらの種々の組合せが含 まれる。発現ベクターのデザインは、トランスフォームすべき宿主細胞の選択及 び／又は発現させることを所望する蛋白質の種類等の因子に依存し得るというこ とは理解されるべきである。一具体例において、発現ベクターは、主題のＥ６結 合蛋白質の活性を有するペプチドをコードする組換え遺伝子を、或は主題のＥ６ 結合蛋白質のアンタゴニスト型であるペプチドをコードする組換え遺伝子 を含む。かかる発現ベクターを用いて、細胞をトランスフェクトし、それにより 、ここに記載の核酸によりコードされる蛋白質又はペプチド（融合蛋白質又はペ プチドを含む）を生成することができる。 本発明の他の面は、真核生物例えば哺乳動物例えばヒトから導かれる遺伝子に よりコードされ、少なくとも１つのＥ６結合蛋白質の生物学的活性を有する主題 のＥ６結合蛋白質の組換え型に関係し、例えば、それは、本発明のＥ６−ＢＰの 少なくとも１つの活性のアンタゴニストである（天然の機能不全変異物を含む） 。用語「組換え蛋白質」は、一般に主題のＥ６結合蛋白質をコードするＤＮＡを 適当な発現ベクターに挿入し、次にそれを用いて宿主細胞をトランスフォームし て異質蛋白質を生成する組換えＤＮＡ技術により生成される本発明の蛋白質をい う。その上、語句「から導かれる」は、組換えＥ６−ＢＰをコードする組換え遺 伝子に関して、組換え蛋白質の意味の内に、本発明の自然のＥ６−ＢＰのアミノ 酸配列を、又はそれに類似のアミノ酸配列を有する蛋白質であって、生物の天然 のＥ６結合蛋白質の置換及び欠失（先端切除を含む）を含む突然変異により生成 する蛋白質を含むことを意味する。本発明により好まれる組換え蛋白質は、自然 のＥ６結合蛋白質に加えて、SEQ ID NO:８〜１４の一つに示したアミノ酸配列と 少なくとも６０％相同であり、一層好ましくは７０％相同であり、最も好ましく は８０％相同である。主題のＥ６結合蛋白質の（即ち、アゴニスト又はアンタゴ ニスト的）活性を有し且つSEQ ID NO:８〜１４の何れかの配列と少なくとも約９ ０％の、一層好ましくは少なくとも約９５％の、最も好ましくは少なくとも約９ ８〜９９％の相同性を有するポリペプチドも又、この発明の範囲内にある。 本発明は、生物から導かれた遺伝子によりコードされ、SEQ ID NO:８〜１４の 何れかのＥ６結合蛋白質に進化的に関連したアミノ酸配列を有する主題のＥ６結 合蛋白質の組換え型に関係する。かかる組換えＥ６結合蛋白質は、好ましくは、 本発明のＥ６−ＢＰの少なくとも１つの生物学的活性のアゴニスト又はアンタゴ ニストの何れかの役割の１つにて機能することができる。用語「進化的に関連し た」は、本発明の組換えＥ６結合蛋白質のアミノ酸配列に関して、自然に生じた アミノ酸配列を有するＥ６結合蛋白質、並びに、例えば組合せ突然変異誘発によ り誘導されるＥ６結合蛋白質の突然変異物をいう。本発明に好適なかかる進化的 に誘導されるＥ６結合蛋白質は、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１０ 、SEQ ID NO:１１、SEQ ID NO:１２、SEQ ID NO:１３又はSEQ ID NO:１４の何れ かに示されたアミノ酸配列と少なくとも６０％相同であり、一層好ましくは７０ ％相同であり、最も好ましくは８０％相同である。SEQ ID NO:８〜１４の何れか に示した配列と少なくとも約９０％の一層好ましくは少なくとも約９５％の最も 好ましくは少なくとも約９８〜９９％の相同性を有するポリペプチドも又、この 発明の範囲内にある。 本発明の特徴は、Ｅ６−ＢＰ^SD7蛋白質のＥ６結合モチーフの同定である。例 えば、本発明は、完全長蛋白質より操作が容易であり得るＳＤ−７蛋白質の部分 を提供する。添付の実施例に記載のように、本発明は、Ｅ６蛋白質へ結合する能 力を保持しているＳＤ−７蛋白質の部分を含むポリペプチドを提供する。かかる Ｅ６結合モチーフは、SEQ ID NO:８のＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８に対応するア ミノ酸配列を含んでよい。 従って、本発明は、ＳＤ−７蛋白質のＥ６結合モチーフを含むポリペプチドを 提供し、このポリペプチドのＳＤ−７部分は、一般式Ｘ−Ｙ−Ｚにより表すこと ができる（式中、Ｙは、SEQ ID NO:８の残基１９４〜２１８間のＥ６結合モチー フのアミノ酸配列を表し、Ｘは、存在しないか又はアミノ酸配列例えば１〜１９ ４、１〜１００、１〜７５、１〜５０若しくは１〜２５残基長の配列例えばSEQ ID NO:８の残基１〜１９４間のアミノ酸配列の全部若しくは一部分を表し（適宜 、ＹのＮ末端に直結）、そして、Ｚは、存在しないか又はアミノ酸配列例えば１ 〜９９、１〜７５、１〜５０若しくは１〜２５残基長の配列例えばSEQ ID NO:８の残基２１８〜３１７間のアミノ酸配列の全部若しくは一部分を表す（ 適宜、ＹのＣ末端に直結））。好ましくは、このポリペプチドは、ＳＤ−７ポリ ペプチド配列の約２５〜２００残基のみを含む（一層好ましくは、約２５、５０ 、７５又は１００アミノ酸残基のみを含む）。説明のための具体例において、主 題のアッセイを生成するのに用いられるポリペプチドには：Ａｌａ１９４〜ほぼ Ａｓｐ２１８に対応するＳＤ−７ポリペプチド配列；Ｍｅｔ９９〜ほぼＬｅｕ３ １７に対応するＳＤ−７ポリペプチド配列；Ｖａｌ１０７〜ほぼＡｓｐ２１８に 対応するＳＤ−７ポリペプチド配列；Ａｌａ１９４〜ほぼＧｌｕ３１６に対応す るＳＤ−７ポリペプチド配列が含まれる。 本発明は、更に、主題のＥ６結合蛋白質を生成する方法に関係する。例えば、 主題のＥ６結合蛋白質をコードするヌクレオチド配列の発現を指示する核酸ベク ターでトランスフェクトした宿主細胞を、適当な条件下で培養して、そのペプチ ドの発現を生じさせることができる。このペプチドは、細胞混合物から分泌され て、組換えＥ６−ＢＰを含む培地から単離することができる。或は、このペプチ ドは、細胞質中に保持されて、それらの細胞を採集し、溶解させてその蛋白質を 単離することができる。細胞培養は、宿主細胞、培地及び他の副生物を含む。細 胞培養のための適当な培地は、当分野で周知である。この組換えＥ６−ＢＰペプ チドは、細胞培養培地、宿主細胞、又はこれら両者から、蛋白質を精製するため の当分野で公知の方法を用いて単離することができ、該方法には、イオン交換ク ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、及びか かるペプチドに特異的な抗体を用いる免疫アフィニティー精製が含まれる。好適 具体例において、この組換えＥ６結合蛋白質は、その精製を促進するドメインを 含む融合蛋白質例えばＥ６−ＢＰ−ＧＳＴ融合蛋白質である。 この発明は、主題のＥ６結合蛋白質の少なくとも１つの組換え型を発現するよ うにトランスフェクトされた宿主細胞にも関係する。この宿主細胞は、任意の原 核又は真核細胞であってよい。従って、蛋白質の全部又は選択した部分をコード する本発明のＥ６結合蛋白質のクローニングから導かれるヌクレオチド配列を用 いて、微生物又は真核細胞プロセスにより、Ｅ６−ＢＰの組換え型を生成するこ とができる。ポリヌクレオチド配列を遺伝子構築物例えば発現ベクター中にライ ゲートして、真核（酵母、鳥、昆虫若しくは哺乳動物）又は原核（細菌細胞）宿 主中にトランスフォーム又はトランスフェクトすることは、他の周知の蛋白質例 えばｐ５３、Ｅ６、Ｅ６−ＡＰ等の生成において用いられる標準的手順である。 類似の手順又はその変法を用いて、組換えＥ６結合蛋白質又はその部分を、この 主題の発明による微生物手段又は組織培養技術により、調製することができる。 この組換えＥ６結合遺伝子は、主題のＥ６結合蛋白質又はその部分をコードす る核酸を、原核細胞、真核細胞、又はこれら両者における発現に適したベクター 中にライゲートすることにより生成することができる。主題のＥ６結合蛋白質の 組換え型の生成のための発現ベクターには、プラスミッド及びその他のベクター が含まれる。例えば、Ｅ６−ＢＰの発現に適したベクターには、次の型のプラス ミッドが含まれる：原核細胞例えば大腸菌における発現のためのｐＢＲ３２２由 来のプラスミッド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミッド、ｐＥＸ由来のプラスミッド 、ｐＢＴａｃ由来のプラスミッド及びｐＵＣ由来のプラスミッド。 酵母における組換え蛋白質の発現用に多くのベクターが存在する。例えば、Ｙ ＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２及びＹＲＰ１７は、 遺伝子構築物のS.cerevisiaeへの導入において有用なクローニング及び発現用ビ ヒクルである（例えば、Experimental Manipulation of Gene Expression，M.In ouye編、Academic Press，83頁のBroach等(1983)（参考として本明細書中に援用 する）を参照されたい）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２の存在により大腸 菌中で複製することができ、酵母の２ミクロンプラスミッドの複製デターミナン トによりS.cerevisiae中で複製することができる。更に、アンピシリン等の薬剤 耐性マーカーを利用することができる。説明のための具体例において、Ｅ６結合 蛋白質を、ｐＲＳ３０６−Ｅ６ＢＰライブラリーからの蛋白質をコードする遺伝 子（ＡＴＣＣ受理番号：７５８２７）を例えばSEQ ID NO:１〜７及び２０に基く プライマー及び／又は隣接するプラスミッド配列に基くプライマー（例えばSEQ ID NO:１５〜１７により表されるプライマー）を用いてサブクローニングするこ とにより生成した発現ベクターを用いて組換えにより生成する。 これらの好適な哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのそのベクターの増殖を促 進するための原核生物の配列及び、真核細胞中で発現される１つ以上の真核生物 転写ユニットの両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐ Ｒｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来 のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクター の例である。これらのベクターの幾つかは、原核及び真核細胞の両方での複製及 び薬物耐性選択を促進するために、細菌プラスミッド例えばｐＢＲ３２２からの 配列で修飾される。或は、ウイルス例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１ ）又はエプスタインバールウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ誘導体及びｐ２０５ ）の誘導体を、真核細胞における蛋白質の一時的発現のために利用することがで きる。プラスミッドの調製及び宿主生物のトランスフォーメーションにおいて用 いられる様々な方法が、当分野では周知である。原核細胞及び真核細胞の両方に 対する他の適当な発現系、並びに一般的組換え手順に関しては、Molecular Clon ing A Laboratory Manual,第二版、Sambrook,Fritsch及びManiatis編（Cold Spr ing Harbor Laboratory Press:1989）第１６及び１７章を参照されたい。幾つか の例においては、組換えＥ６−ＢＰをバキュロウイルス発現系により発現させる のが望ましい。かかるバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来のベクター （ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１等）、ｐＡｃＵＷ由来のベ クター（ｐＡｃＵＷ１等）及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（β−ｇａｌを 含むｐＢｌｕｅＢａｃIII等）が含まれる。 主題のＥ６結合蛋白質の１つの一部分即ち先端切除変異体の発現を所望する場 合には、開始コドン（ＡＴＧ）を発現させるべき所望の配列を含むオリゴヌクレ オチド断片に加えることが必要であろう。Ｎ末端位置のメチオニンを酵素メチオ ニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の使用により酵素的に開裂することができる ことは、当分野で周知である。ＭＡＰは、大腸菌から（Ben-Bassat等(1987)J.Ba cteriol.169:751-757）及びSalmonella typhimuriumからクローン化され、その イン・ビトロ活性が、組換え蛋白質について示された（Miller等(1987)PNAS 84: 2718-1722）。従って、Ｎ末端メチオニンの除去は、所望であれば、イン・ビボ で、ＭＡＰを生成する宿主（例えば、大腸菌又はＣＭ８９又はS.cerevisiae） 中でＥ６−ＢＰ由来のポリペプチドを発現することにより、又はイン・ビトロで 、精製したＭＡＰ（例えば、Miller等の手順、前出）の使用により達成すること ができる。 或は、このポリペプチドのコード配列を、異なるポリペプチドをコードするヌ クレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として取り込むことができる。この型の 発現系は、Ｅ６結合蛋白質の免疫原性断片を生成することが望ましい条件下で有 用であり得る。例えば、ロータウイルスのＶＰ６キャプシッド蛋白質を、Ｅ６− ＢＰポリペプチドの部分に対する免疫学的キャリアー蛋白質として用いることが できる（モノマー形態又はウイルス粒子形態の何れか）。抗体を高めるべき主題 のＥ６結合蛋白質の部分に対応する核酸配列を、後期ワクシニアウイルス構造蛋 白質のコード配列を含む融合遺伝子構築物に取り込んで、ビリオンの部分として 蛋白質Ｅ６−ＢＰの一部分を含む融合蛋白質を発現する組換えウイルスのセット を生成することができる。Ｂ型肝炎表面抗原融合蛋白質を利用する免疫原性融合 蛋白質の利用により、組換えＢ型肝炎ウイルスがこの役割においても利用し得る ことが示された。同様に、Ｅ６結合蛋白質の一部分及びポリオウイルスキャプシ ッド蛋白質を含む融合蛋白質をコードするキメラ構築物を造って、ポリペプチド 抗原のセットの免疫原性を促進することができる（例えば、ＥＰ公開Ｎｏ：０２ ５９１４９；及びEvans等(1989)Nature 339:385;Huang等(1988)J.Virol.62:3855 及びSchlienger等(1992)J.Virol.66:2を参照されたい）。 主題のＥ６結合蛋白質の所望の部分がオリゴマーの分枝リジンコア上へのペプ チドの有機合成から直接得られるペプチドベースの免疫化のための多抗原ペプチ ド系を利用して、免疫原を生成することもができる（例えば、Posnett等(1988)J BC 263:1719及びNardelli等(1992)J.Immunol.148:914を参照されたい）。主題の Ｅ６結合蛋白質の抗原決定基も又、細菌細胞により、発現させ、提供することが できる。 免疫原性を促進するための融合蛋白質の利用に加えて、融合蛋白質が蛋白質例 えば本発明のＥ６結合蛋白質の任意のものの発現をも促進し得ることは、広く認 められている。下記のように、例えば、本発明のＥ６結合蛋白質を、グルタチオ ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ融合蛋白質）として生成することができ る。かかるＧＳＴ融合蛋白質は、例えばグルタチオン誘導体化マトリックスの利 用によって、Ｅ６結合蛋白質の精製を容易にすることができる（例えば、Curren t Protocols inMolecular Biology,Ausabel等編（ニューヨーク:John Wiley & Sons,19 91）を参照されたい）。 他の具体例において、精製リーダー配列例えばＥ６結合蛋白質の所望の部分の Ｎ末端のポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂部位配列をコードする融合遺 伝子は、Ｎｉ²⁺金属樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによるポリ （Ｈｉｓ）−発現されたＥ６−ＢＰ融合蛋白質の精製を与えることができる。次 いで、この精製リーダー配列は、エンテロキナーゼでの処理により除去すること ができる（例えば、Hochuli等(1987)J.Chromatography 411:177;及びJanknecht 等PNAS 88:8972を参照されたい）。 融合遺伝子を作製する技術は、当業者に公知である。本質的に、種々のポリペ プチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の結合は、ライゲーションのための鈍 端化又は食い違い端化した末端、適当な末端を与えるための制限酵素消化、粘着 性末端の適宜の充填、望まない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処 理及び酵素によるライゲーションを用いる慣用技術によって行なわれる。他の具 体例において、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成装置を含む慣用技術によって合 成することができる。或は、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子 断片の間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行なうこ とができ、続いて、該断片をアニールさせてキメラ遺伝子配列を生成することが できる（例えば、Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等編John W iley & Sons:1992を参照されたい）。 この発明の他の面は、主題のＥ６結合蛋白質の１つの活性を有する単離された ペプチド、又は主題のＥ６−ＢＰの生物学的活性の少なくとも１つのアンタゴニ ストである単離されたペプチドに関係する。好適具体例において、Ｅ６結合蛋白 質の生物学的活性には：真核生物細胞例えば哺乳動物細胞例えばヒト細胞の増殖 ／細胞成長を調節する能力；パピローマウイルス感染（例えば、ＨＰＶ−１６、 ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１又はＨＰＶ−３３による感染）の効力に影響する能 力；細胞トランスフォーメーション（例えば、ＰＶ媒介のトランスフォーメーシ ョン例えばＰＶ媒介のトランスフォーメーション例えばハイリスクＨＰＶ媒介の トランスフォーメーション）の効力に影響する能力；細胞の不滅化（例えば、Ｐ Ｖ媒介のトランスフォーメーション例えばＨＰＶ媒介のトランスフォーメーショ ン例えばハイリスクＨＰＶ媒介の不滅化）の効力に影響する能力；ＰＶ Ｅ６蛋 白質（例えば、ＨＰＶ Ｅ６蛋白質例えばハイリスクＨＰＶ Ｅ６蛋白質）に結 合する能力が含まれる。本発明のＥ６結合蛋白質（特に、アンタゴニスト活性を 有するもの）は、例えば、内因性Ｅ６−ＢＰが誤発現される腫瘍細胞において腫 瘍成長を抑制する能力を持ち得る。主題のＥ６結合蛋白質の他の生物学的活性は 、ここに記載され又は当業者には合理的に明らかとなろう。主題のＥ６結合蛋白 質の少なくとも１つの生物学的活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列にお いて、SEQ ID NO:８〜１４の何れかに示した配列とことなってよいが、かかる差 異は、天然のＥ６結合蛋白質と同じ若しくは類似の様式で機能する改変蛋白質又 は天然のＥ６結合蛋白質の同じ若しくは類似の性質を有する改変蛋白質を生じる ものである。これらの及び他の機能的に同等のペプチドを生成するための本発明 のＥ６結合蛋白質の種々の改変をここに詳細に記載する。用語ペプチドは、ここ で用いる場合、ペプチド、蛋白質及びポリペプチドをいう。 本発明は又、単離されたＥ６結合蛋白質をも利用可能にし、それは、単離され た形態であり、或は他の細胞性若しくはウイルス性蛋白質特に通常Ｅ６結合蛋白 質に会合しているパピローマウイルス蛋白質を実質的に含まない。この発明のポ リペプチドに言及する場合、用語「他の細胞性又はウイルス性蛋白質を実質的に 含まない」（該蛋白質を、本明細書では「夾雑蛋白質」とも呼ぶ）又は「実質的 に純粋な又は精製された標品」は、２０％未満（乾重量）の夾雑蛋白質しか、好 ましくは５％未満の夾雑蛋白質しか有しないＥ６−ＢＰ標品を包含するとして定 義される。機能的形態の主題のＥ６結合蛋白質を、最初に、精製された標品とし て、ここに記載のクローン化遺伝子を用いることによって調製することができる 。「精製された」とは、ペプチド又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列をいう場合には 、示された分子が他の生物学的巨大分子例えば他の蛋白質（特にウイルス蛋白質 例えばＥ６並びに他の夾雑蛋白質）の実質的な不在の下に存在することを意味す る。用語「精製された」は、ここで用いる場合、同じ型の生物学的巨大分子の 少なくとも８０％（乾重量）一層好ましくは９５〜９９重量％、最も好ましくは 少なくとも９９．８重量％が存在することを意味する（但し、水及び他の低分子 特に５０００未満の分子量を有する分子は存在してよい）。用語「純粋な」は、 ここで用いる場合、好ましくは、上記の「精製された」と同じ数値的限定を有す る。「単離された」及び「精製された」は、自然状態の天然物質も、成分に分離 された（例えばアクリルアミドゲルにより）が純粋な（例えば夾雑蛋白質、又は クロマトグラフィー試薬例えば変性剤及びポリマー例えばアクリルアミド又はア ガロースを欠く）物質としても純粋溶液としても得られていない天然物質も包含 しない。 しかしながら、主題のポリペプチドは、製薬上許容し得るキャリアー中で与え ることもでき、種々の投与様式（全身投与及び局所投与を含む）のために配合す ることもできる。技術及び配合は、一般に、Remmington's Pharmaceutical Scie nces，Meade Publishing Co.,Easton，ペンシルベニア中に見出すことができる。典型的 具体例において、Ｅ６結合蛋白質（生物活性を有する断片例えばアンタゴニスト を含む）は、経粘膜又は経皮的送達用に与えられる。かかる投与のために、透過 すべきバリヤーに適した浸透剤を、このポリペプチドを含む配合物中で用いる。 かかる浸透剤は、当業者には公知であり、例えば経粘膜投与用には、胆汁酸塩及 びフシジン酸誘導体が含まれる。更に、デタージェントを用いて浸透を容易にす ることができる。経粘膜投与は、鼻スプレーによるか又は坐薬を用いることがで きる。局所投与のために、この発明のオリゴマーを、一般に当業者に知られてい るように、軟膏、膏薬、ゲル又はクリームに配合する。 一具体例において、Ｅ６結合モチーフを含む、ここに記載の断片等の、ＳＤ− ７由来のポリペプチドのアンタゴニスト型の精製標品を、典型的投与に適した医 薬製剤にて、パピローマウイルスにより感染され且つ／又はトランスフォームさ れた上皮組織に供給することができる。 この発明の他の面は、完全長のＥ６結合蛋白質に由来するポリペプチドに関係 する。主題のＥ６結合蛋白質の単離されたぺプチド部分例えばＥ６結合モチーフ は、かかるペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えにより生成した ペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。更に、当分野で 公知の技術例えば慣用のMerrifield固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学を用いて 断片を化学合成することができる。例えば、本発明のＥ６結合蛋白質は、所望の 長さの断片に、それらの断片を重複させることなく任意に分割することができ、 或は好ましくは、所望の長さの重複する断片に分割することができる。これらの 断片を生成し（組換えにより又は化学合成による）、試験して、Ｅ６結合蛋白質 活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能し得るこれらのペプチジル断片 をマイクロインジェクションアッセイ等によって同定することができる。説明用 具体例において、Ｅ６結合蛋白質のペプチド部分を、例えばチオレドキシン融合 蛋白質（その各々がＥ６結合蛋白質の別々の断片を含む）としての発現により、 Ｅ６結合活性並びに阻害能力について試験することができる（例えば、米国特許 第５，２７０，１８１号及び第５，２９２，６４６号；並びにＰＣＴ公開ＷＯ９ ４／０２５０２参照）。 主題のＥ６結合蛋白質の構造を、例えば、治療若しくは予防の効力又は安定性 （例えば、エキス・ビボでの棚持ち及びイン・ビボでの蛋白質分解に対する耐性 ）を増大させる目的のために改変することもできる。かかる修飾したペプチドは 、この蛋白質の天然型の少なくとも１つの活性を保持するようにデザインした場 合には、ここに一層詳細に記載したＥ６結合蛋白質の機能的同等物と考えられる 。かかる修飾ペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失又は付加により生成す ることができる。 その上、ロイシンのイソロイシン又はバリンでの単独の置換、アスパラギン酸 のグルタミン酸での単独の置換、スレオニンのセリンでの単独の置換、又は同様 のアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での置換（即ち、保存的変異）は、その 結果生じる分子の生物学的活性に大した影響を有しないであろうということを予 想するのは妥当なことである。保存的置換は、側鎖において関連したアミノ酸の ファミリー内で起きるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は、次の４つ のファミリーに分割される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２ ）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン 、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプ トファン；及び（４）非帯電の極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミ ン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプト ファン及びチロシンは、ときには、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。同 様にして、アミノ酸のレパートリーは、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミ ン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシ ン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン（セリン とスレオニンは、適宜、脂肪族ヒドロキシル化アミノ酸として別に分類される） ；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド ＝アスパラギン、グルタミン；及び（６）含硫黄＝システイン及びメチオニンと 分類することができる（例えば、Biochemistry，第二版、L.Stryer編、WH Freem an and Co.:1981を参照されたい）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的な Ｅ６−ＢＰ同族体を生じるか否かは、細胞内で、野生型Ｅ６−ＢＰと類似の様式 で応答を生じる変異体ペプチドの能力を評価することにより容易に測定すること ができる。１つより多くの置換が起きたペプチドを、同様にして容易に試験する ことができる。 この発明は、更に、今般開示する新規なＥ６結合蛋白質の組合せ変異体のセッ ト並びに先端切除変異体を生成する方法を企図し、ＰＶ Ｅ６蛋白質特にハイリ スクＨＰＶのＥ６蛋白質への結合において機能的である潜在的変異配列を同定す るのに特に有用である。かかる組合せライブラリーをスクリーニングする１つの 目的は、例えば、野生型の（「信頼できる」）蛋白質の生物学的活性のアゴニス ト又はアンタゴニストの何れかの１つとして機能するか又は新規な活性をすべて 一緒に有する新規なＥ６−ＢＰ同族体を単離することである。説明のために、Ｅ ６−ＢＰ同族体は、本発明の方法により処理して、Ｅ６に結合するが、未だパピ ローマウイルス感染、トランスフォーメーション及び／又は不滅化における自然 のままのＥ６−ＢＰの役割に対してアンタゴニストとして作用する蛋白質を与え ることができる。かかる蛋白質は、組換えＤＮＡ構築物から発現される場合には 、遺伝子治療プロトコールにおいて用いることができる。 同様に、突然変異誘発は、対応する野生型蛋白質と有意に異なる細胞内半減期 を有するＥ６−ＢＰ同族体に対して起こし得る。例えば、この変化した蛋白質を 、Ｅ６結合蛋白質の破壊又は不活性化を生じる蛋白質分解又は他の細胞プロセ スに対して一層安定にすることも不安定にすることもできる。かかるＥ６−ＢＰ 同族体及びそれらをコードする遺伝子を利用して、特定の組換えＥ６結合蛋白質 についての発現のエンベロープを、その組換え蛋白質の半減期を調節することに より変えることができる。例えば、短い半減期は、特定の組換えＥ６−ＢＰと関 連した一層一過的な生物学的効果を起こすことができ、誘導可能な発現系の部分 である場合には、細胞内の組換えＥ６−ＢＰレベルの一層厳重な制御を与えるこ とができる。上記のように、かかる蛋白質及び特にそれらの組換え核酸構築物は 、遺伝子治療プロトコールにおいて用いることができる。 この方法の説明のための具体例において、Ｅ６−ＢＰ同族体又は他の関連蛋白 質の集団についてのアミノ酸配列は、好ましくは、最高の相同性を可能にするよ うに整列される。かかる変異体の集団には、例えば、１つ以上の種からのＥ６− ＢＰ同族体を、又は同種からのものではあるが突然変異により異なっているＥ６ −ＢＰが含まれ得る。整列した配列の各位置に出現するアミノ酸を選択して組合 せ配列の縮重セットを造る。 好適具体例において、この組合せＥ６−ＢＰライブラリーは、それぞれ潜在的 Ｅ６−ＢＰ配列の少なくとも一部分を含むポリペプチドのライブラリーをコード する遺伝子の縮重ライブラリー経由で生成される。合成オリゴヌクレオチドの混 合物を、潜在的Ｅ６−ＢＰ配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、或は Ｅ６−ＢＰ配列のセットを含む一層大きい融合蛋白質のセット（例えば、ファー ジディスプレー用）として発現可能であるように、遺伝子配列中に酵素的にライ ゲートすることができる。 潜在的Ｅ６−ＢＰ同族体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生 成することのできる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化Ｄ ＮＡ合成装置にて行なうことができ、合成遺伝子は、次いで、発現のための適当 な遺伝子にライゲートされ得る。遺伝子の縮重セットの目的は、一つの混合物中 に、潜在的Ｅ６−ＢＰ配列の所望のセットをコードするすべての配列を与えるこ とである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当分野では周知である（例えば、 Narang,SA(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura等(1981)Recombinant DNA,Proc3rd C leveland Sympos.Macromolecules，AG Walton編、Amsterdam:Elsevier 273-289頁;Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等(1984)Science 198:1056;Ike等(1983)Nucleic Acid Res.11:477を参照されたい）。かかる技術 は、他の蛋白質の有向的進化において採用されてきた（例えば、scott等(1990)S cience 249:386-390;Roberts等(1992)PNAS 89:2429-2433;Devlin等(1990)Scienc e 249:404-406;Cwirla等(1990)PNAS 87:6378-6382;並びに米国特許第５，２２３ ，４０９号、第５，１９８，３４６号及び第５，０９６，８１５号を参照された い）。 或は、他の形態の突然変異誘発を利用して組合せライブラリーを生成すること ができる。例えば、Ｅ６−ＢＰ同族体（アゴニスト及びアンタゴニスト形態の両 方）を、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発等（Ruf等(1994)Biochemis try 33:1565-1572;Wang等(1994)J.Biol.Chem.269:3095-3099;Balint等(1993)Gen e 137:109-118;Grodberg等(1993)Eur.J.Biochem.218:597-601;Nagashima等(1993 )J.Biol.Chem.268:2888-2892;Lowman等(1991)Biochemistry 30:10832-10838;及 びCunningham等(1989)Science 244:1081-1085）を用いて、リンカースキャニン グ突然変異誘発（Custin等(1993)Virology193:653-660;Brown等(1992)Mol.Cell Biol.12:2644-2652;McKnight等(1982)Science 232:316）により；又は飽和突然 変異誘発（Meyers等(1986)Science 232:613）により；ＰＣＲ突然変異誘発（Leu ng等(1989)Method Cell Mol Biol 1:11-19）により；又はランダム突然変異誘発 （Miller等(1992)A Short Course in Bacterial Genetics，CSHL Press，Cold S pring Harbor，ニューヨーク;及びGreener等(1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34） により生成し、スクリーニングによりライブラリーから単離することができる。 リンカースキャニング突然変異誘発は、特に組合せセッティングにおいて、先端 切除型（生物活性有り）のＥ６結合蛋白質を同定するための魅力的な方法である 。 点突然変異により作製した組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニング する技術、及び一定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーを スクリーニングする広範囲の技術は、当分野で公知である。かかる技術は、一般 に、Ｅ６−ＢＰ同族体の組合せ突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリー の迅速なスクリーニングに適合させることができる。大きい遺伝子ライブラリー をスクリーニングするために最も広く用いられている技術には、遺伝子ライブラ リーを再生可能な発現ベクター中にクローニングすること、生成したベクターの ライブラリーを用いて適当な細胞をトランスフォームすること、及び組合せ遺伝 子を、所望の活性の検出が産物の検出された遺伝子をコードするベクターの比較 的容易な単離を促進する条件下で発現させることが含まれる。下記の説明のため のアッセイの各々は、組合せ突然変異誘発技術により造った多数の縮重Ｅ６−Ｂ Ｐ配列をスクリーニングするのに必要な高いスループットの分析に従順である。 一つのスクリーニングアッセイにおいて、候補のＥ６−ＢＰ遺伝子産物を、細 胞又はウイルス粒子の表面にディスプレーし、この遺伝子産物を介してＥ６蛋白 質例えばＨＰＶ−１６Ｅ６に結合する特定の細胞又はウイルス粒子の能力を、「 パニングアッセイ」にて検出する。例えば、細菌細胞の表面膜蛋白質の遺伝子中 に遺伝子ライブラリーをクローン化することができ、その結果生成した融合蛋白 質をパニングによって検出することができる（Ladner等、ＷＯ８８／０６６３０ ；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9:1370-1371;及びGoward等(1992)TIBS 18:136- 140）。同様にして、蛍光標識したＥ６を用いて、潜在的に機能的なＥ６−ＢＰ 同族体を評価することができる。蛍光顕微鏡下で、細胞を視覚的に調べて分離す ることができ、又は細胞の形態学が許す場合には、蛍光活性化セルソーターによ り分離することができる。 代わりの具体例においては、遺伝子ライブラリーを、融合蛋白質としてウイル ス粒子表面で発現させる。例えば、繊維状ファージ系において、外来ペプチド配 列を、感染性ファージの表面で発現させ、それにより、２つの有意の利益を与え ることができる。第１に、これらのファージは、非常に高濃度でアフィニティー マトリックスに加えることができるので、多数のファージを一度にスクリーニン グすることができる。第２に、各感染性ファージは、組合せ遺伝子産物をその表 面に示すので、もし特定のファージがアフィニティーマトリックスから低収量で 回収されたならば、そのファージを別ラウンドの感染により増幅することができ る。殆ど同一の大腸菌繊維状ファージＭ１３、ｆｄ及びｆ１の群は、最もしばし ば、ファージディスプレーライブラリーにおいて用いられ、ファージｇIII又は ｇVIIIコート蛋白質の何れかを用いて、ウイルス粒子の最終的パッケージングを 破壊することなく融合蛋白質を生成することができる（Ladner等、ＰＣＴ公開Ｗ Ｏ／０２９０９；Garrard等、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９０；Marks等(1992) J.Biol.Chem.267:16007-16010;Griffiths等(1993)EMBO J 12:725-734;Clackson 等(1991)Nature 352:624-628;及びBarbas等(1992)PNAS 89:4457-4461)。 説明のための具体例において、この組換えファージ抗体系（ＲＰＡＳ、Pharma ciaカタログ番号２７−９４００−０１）を、Ｅ６−ＢＰ組合せライブラリーの 発現及びスクリーニングにおいて使用するために簡単に改変することができる。 例えば、ＲＰＡＳキットのｐＣＡＮＴＡＢ５ファージミドは、ファージｇIIIコ ート蛋白質をコードする遺伝子を含む。Ｅ６−ＢＰ組合せ遺伝子ライブラリーは 、ｇIII融合蛋白質として発現されるようにｇIIIシグナル配列と隣接するファー ジミド中にクローン化することができる。ライゲーションの後に、このファージ ミドを用いて、コンピテントな大腸菌ＴＧ１細胞をトランスフォームする。トラ ンスフォームした細胞に、続いて、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させて 、ファージミド及びその候補のＥ６−ＢＰ遺伝子挿入物をレスキューする。その 結果生成した組換えファージは、特異的な候補のＥ６−ＢＰをコードするファー ジミドＤＮＡを含み、対応する融合コート蛋白質の１つ以上のコピーを提示する 。Ｅ６に結合することのできるファージディスプレーされた候補のＥ６−ＢＰを 、Ｅ６を用いるパニングにより選択し又は富化させる。例えば、このファージラ イブラリーを、グルタチオン固定化Ｅ６−ＧＳＴ融合蛋白質にてふるい分けし、 未結合ファージをこれらの細胞から洗い出すことができる。次いで、この結合し たファージを単離し、もしその組換えファージが野生型ｇIIIコート蛋白質の少 なくとも１コピーを発現するならば、それらは大腸菌に感染する能力を保持する であろう。従って、数回の連続的な大腸菌の再感染及びパニングは、Ｅ６−ＢＰ 同族体を大いに富化させ、該同族体はＥ６への結合能を保持し、続いて、アゴニ スト及びアンタゴニストを区別するための更なる生物学的活性についてスクリー ニングすることができる。 この発明は又、本発明のＥ６−ＢＰのパピローマウイルスＥ６蛋白質との結合 を破壊することのできる模倣物例えばペプチド又は非ペプチド剤を生成する主題 のＥ６−ＢＰ結合蛋白質のＥ６−ＢＰ結合モチーフの還元をも提供する。従って 、かかる突然変異誘発技術は、例えば、主題のＥ６結合蛋白質のＰＶ Ｅ６蛋白 質への結合に関係する蛋白質−蛋白質相互作用に関与するＥ６−ＢＰの決定基を マップするのに特に有用である。説明のために、Ｅ６の分子認識に関係する主題 のＥ６結合蛋白質の非常に重要な残基を決定して、Ｅ６−ＢＰのＥ６との結合を 競争的に阻害するＥ６−ＢＰ由来のペプチド模倣物を生成するのに利用すること ができる（例えば、「Peptide inhibitors of human papillomavirus protein b inding to retinoblastoma gene protein」欧州特許出願ＥＰ−４１２，７６２ Ａ及びＥＰ−Ｂ３１，０８０Ａを参照されたい）。例えば、スキャニング突然変 異誘発を用いてＥ６への結合に関係する特定のＥ６結合蛋白質のアミノ酸残基を マップすることにより、Ｅ６への結合においてそれらの残基を模倣し、それ故、 Ｅ６−ＢＰのＥ６への結合を阻止することができ、それにより、ＰＶ感染におけ るＥ６の機能を邪魔するペプチド模倣化合物（例えば、ジアゼピン又はイソキノ リン誘導体）を生成することができる。例えば、かかる残基の加水分解可能でな いペプチドアナログを、ベンゾジアゼピン（例えば、Freidinger等、Peptides:C hemistry and Biology，G.R.Marshall編、ESCOM Publisher:オランダ、Leiden 1988 参照）、アゼピン（例えば、Huffman等、Peptides:Chemistry and Biology，G.R .Marshall編、ESCOM Publisher:オランダ、Leiden 1988参照）、置換されたガンマラ クタム環（Garvey等Peptides:Chemistry and Biology，G.R.Marshall編、ESCOM Publisher:オランダ、Leiden 1988）、ケトーメチレンシュードペプチド（Ewenson等 (1986)J Med Chem 29:295;及びEwenson等、Peptides:Structure and Function（ Proceeding of the 9th American Peptide Symposium）Pierce Chemical Co．イリノイ 、Rockland，1985）、β−ターンジペプチドコア（Nagai等(1985)Tetrahedron Lett 26:647;及びSato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans 1:1231）、及びβ− アミノアルコール（Gordon等(1985)Biochem Biophys Res Commun 126:419;及びD ann等(1986)Biochem Biophys Res Commun 134:71）を用いて生成することができ る。 この発明の他の面は、主題Ｅ６結合蛋白質の１つと特異的に反応する抗体に関 係する。例えば本発明の活性E2結合蛋白質のｃＤＮＡ配列を基に作製した免疫原 を用いて、標準的なプロトコルに従い抗蛋白質／抗ペプチド抗血清又はモノクロ ーナル抗体を作成することができる［例えばHarlow及びLane編「抗体：実験マニ ュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）」（Cold Spring Harbor Press:19 88）参照］。マウス、ハムスター又はウサギ等の哺乳類を、免疫原の形のペプチ ド（例えば抗体反応を引き起こすことのできるＥ６結合蛋白質又は抗原断片）で 免疫化することができる。蛋白質又はペプチドに免疫原性を与える方法として、 キャリヤーとの複合又は当分野においてよく知られる他の方法が挙げられる。主 題のＥ６結合蛋白質の免疫原部分はアジュバントの存在下に投与することができ る。免疫化の経過は血漿又は血清中の抗体価を検査することでモニターすること ができる。免疫原を抗原として標準的なイライザ（ELISA）又は他のイムノアッ セイを行うことで抗体レベルを調べることができる。好ましい態様にあっては、 本発明のＥ６結合蛋白質の抗原決定基、例えばSEQ ID NO:８〜１４のいずれかに よって示される蛋白質；或いは極めて相同的なヒト蛋白質又はヒト以外の哺乳動 物蛋白質（例えば上記の配列に対し９０％の相同性、より好ましくは少なくとも ９５％の相同性を有するもの）の抗原決定基に対し、主題の抗体は免疫特異性を 有する。本発明の更に好ましい態様にあっては、抗Ｅ６−ＢＰ抗体は、例えばSE Q ID NO:８〜１４のいずれかに対し９０％未満の相同性を有する蛋白質；例えば SEq ID NO:８〜１４のいずれかに対し９５％未満の相同性を有する蛋白質、例え ばSEQ ID NO:８〜１４のいずれかに対し９８−９９％未満の相同性を有する蛋白 質と，実質的に交差反応しない（すなわち特異的に反応する）。「実質的に交差 反応しない」とは、抗体が非相同蛋白質（例えばＥ６）に対しSEQ ID NO:８〜１ ４の蛋白質に対する結合親和力の１０％未満、より好ましくは５％未満、更によ り好ましくは１％未満の結合親和力を有することを意味する。 免疫化につづいて、抗Ｅ６−ＢＰ抗血清を、所望によっては血清から分離した ポリクローナル抗Ｅ６−ＢＰ抗体を得ることができる。モノクローナル抗体は以 下のようにして産生する。免疫化した動物から抗体産生細胞（リンパ球）を採取 し、ミエローマ細胞等の不死化細胞と標準的な体細胞融合法により融合してハイ ブリドーマ細胞を産生する。このような技術は当分野においては周知のものであ り、例えばハイブリドーマ法［Kohler及びMilstein、（1975）Nature、256：495 -497］、ヒトB細胞ハイブリドーマ法［Kozbar他、（1983）Immunology Today、4 ：72］及びヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ法［Cole 他、（1985）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc．p p.77-96］が挙げられる。本発明のＥ６結合蛋白質に特異的に反応する抗体を産 生するハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーンし、そのようなハイブリド ーマ細胞を含む培養からモノクローナル抗体を分離することができる。 ここで用いられる「抗体」という語は主題のＥ６結合蛋白質の一つと特異的に 結合する抗体断片も包含する。抗体を公知の方法を用いて断片化し、抗体断片は 上記した全抗体を得る方法と同様の方法でスクリーンすることができる。例えば 、抗体をペプシンで処理してＦ（ａｂ’）２断片が得られる。得られたＦ（ａｂ ’）２断片を処理してジスルフィド架橋を無くし、Ｆａｂ’が得られる。本発明 でいう抗体は更に、抗Ｅ６−ＢＰ部分を有する二重特異性分子及びキメラ分子も 包含する。 Ｅ６−ＢＰ又はＥ６−ＢＰ変異体に対するモノクローナル及びポリクローナル 抗体（Ａｂ）、並びにＦａｂ’及びＦ（ａｂ’）２等の抗体断片を用いてＥ６− ＢＰの活動を阻害することができ、乳頭腫ウィルス感染、トランスフォーメーシ ョン及び／又は不死化における本発明の特定のE2結合蛋白質の役割についての研 究、並びにＥ６結合蛋白質の通常の細胞機能の研究を、例えば本発明の抗Ｅ６− ＢＰ抗体のマイクロインジェクションによって行うことができる。 主題のＥ６−ＢＰそれぞれの量及び発現パターンを評価する目的で、Ｅ６−Ｂ Ｐエピトープに特異的に結合する抗体を用いて組織サンプルを免疫組織化学的に 染色することができる。医療上の試験法の一部として、抗Ｅ６−ＢＰ抗体を 免疫沈降及び免疫ブロットに用いて、組織又は体液中のＥ６−ＢＰレベルを検査 及び評価し、診断を行うことができる。例えば、かかる測定はＨＰＶ感染の発症 又は進行を予測するのに便利である。同様に、個人のＥ６−ＢＰレベルをモニタ ーすることによって、そのような疾患を持つ個人の受けている治療養生法の効力 を判断することができる。Ｅ６−ＢＰのレベルは例えば脳脊髄液サンプル等の体 液中にある細胞内で、あるいは例えば生検で産生した組織内で測定することがで きる。抗Ｅ６−ＢＰ抗体を用いた診断アッセイとしては、例えば新形成又は過形 成疾患の早期診断を目的としたイムノアッセイ、サンプル中の癌細胞の有無、Ｐ Ｖ感染細胞の有無、ＰＶ形質転換細胞の有無、ＰＶ不死化細胞の有無、Ｅ６−Ｂ Ｐ遺伝子の損傷が起こった細胞の検出等が挙げられる。本発明の抗Ｅ６−ＢＰ抗 体の他の用途としては、例えばλｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ及びλ ＯＲＦ８等の発現ベクター内に作製されたｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリー ンに用いることが挙げられる。適当な読み取り枠に適当な方向で挿入されたコー ド配列を有するこの種のメッセンジャーライブラリーを用いて、融合蛋白質を産 生することができる。例えば、λｇｔ１１は、アミノ末端がβ−ガラクトシダー ゼのアミノ酸配列であり、カルボキシ末端が外来ポリペプチドである融合蛋白質 を産生する。主題のＥ６−ＢＰの抗原エピトープは、抗体を用いて、例えば抗Ｅ ６−ＢＰ抗体に感染したシャーレから作製したニトロセルロースフィルターと反 応させることによって、検出することができる。次いで、このアッセイにより数 えられたファージを感染シャーレから分離することができる。従ってヒト以外の 起源からＥ６−ＢＰの同族体を検出しクローンを得ることができ、ヒトから代替 同形体（スプライシング変異体を含む）を検出しクローンを得ることができる。 その上、あるヒト細胞系から得た主題のＥ６結合蛋白質をクローンして決定し たヌクレオチド配列を用いて、他のヒト細胞系におけるＥ６−ＢＰ同族体、並び に他の動物から得たＥ６−ＢＰ同族体を同定するのに用いることのできるプロー ブを作製することができる。例えば本発明は実質的に精製されたオリゴヌクレオ チドを含有するプローブ／プライマーも提供する。このオリゴヌクレオチドは、 SEQ ID NO:１−７のうち１つのセンス又はアンチセンス配列の、少なくとも１０ 個連続したヌクレオチド、或いは自然発生するそのヌクレオチドの突然変異体に 、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含有 する。好ましい態様にあっては、プローブ／プライマーは、検出可能にそれに付 加してなる標識群を更に包含する。標識群は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素 及び酵素補因子から選ばれる。このようなプローブは例えば、患者から得た細胞 サンプル中のＥ６−ＢＰ核酸レベルの測定、Ｅ６−ＢＰ ｍＲＮＡレベルの測定 、ゲノムＥ６−ＢＰ遺伝子が突然変異又は欠失したか否かの判断等の、形質転換 細胞の同定に用いる診断試験キットの一部として用いることができる。 更に、ヌクレオチドプローブは、主題のＥ６結合蛋白質のクローン配列から作 製することができる。これによりＥ６−ＢＰ ｍＲＮＡを有する非処理の組織及 び組織サンプルの、組織学的スクリーンが可能となる。抗Ｅ６−ＢＰ抗体を診断 に使用したのと同様に、Ｅ６−ＢＰ ｍＲＮＡ又はゲノムＥ６−ＢＰ配列に対す るプローブを、例えば新形成疾患又は過形成疾患（例えば望まれない細胞成長） として発現するであろう対立遺伝子変異の予測や治療に用いることができる。ヌ クレオチドプローブを抗Ｅ６−ＢＰ抗体イムノアッセイと組み合わせて用いるこ とで、Ｅ６結合蛋白質の発現（又は不発現）に関連する異常に関与しているであ ろう発達障害の、分子レベルでの原因決定を容易にすることができる。例えば、 Ｅ６−ＢＰ合成の変種は、Ｅ６−ＢＰをコードする配列の突然変異に由来しうる 。同様に、パビローマウイルスＥ６蛋白質によるＥ６−ＢＰの狙いを定めた破壊 （ｐ５３により生じると考えられる）を、Ｅ６結合蛋白質のＥ６封鎖から区別す ることができる（即ち、これは、Ｅ６−ＢＰの細胞性機能の改変を生じることが できる）。 例えば、本方法は、ある患者における、望ましくない細胞増殖により特徴付け られる疾患の危険性の有無を判断する方法を提供する。好ましい態様にあっては 、主題の方法は（ｉ）主題のＥ６−ＢＰの１つをコードする遺伝子の異変、又は （ｉｉ）Ｅ６−ＢＰ遺伝子の誤発現、のうち少なくとも１つにより特徴付けられ る遺伝損傷の有無を、患者（例えばヒト患者）の組織において検出することを包 含するという特徴を一般に有する。例えば、そのような遺伝子損傷は、以下のう ち少なくとも１つの存在を確認することによって検出することができる。 （ｉ）主題のＥ６−ＢＰ遺伝子からの１個以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ） かかるＥ６−ＢＰ遺伝子への１個以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）Ｅ６− ＢＰ遺伝子の１個以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）主題のＥ６−ＢＰ遺伝子 の１つの染色体の全体的な転位、（ｖ）Ｅ６−ＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写レベル における全体的な変異、（ｖｉ）Ｅ６−ＢＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写 物の非野生型スプライシングパターンの存在、及び（ｖｉｉ）Ｅ６結合蛋白質の 非野生型レベル。この発明の一つの面において、SEQ ID NO:１〜７（又はそれら の天然の変異物）のセンス若しくはアンチセンス配列、又は自然において主題の Ｅ６−ＢＰ遺伝子と結合している５’若しくは３’フランキング配列若しくはイ ントロン配列にハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列の領域を含む オリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供する。このプローブを組 織試料の核酸にさらして；このプローブの試料核酸とのハイブリダイゼーション を検出する。ある態様にあっては、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）（例えばUSP 4,683,195及び4,683,202参照）における、あるいは連絡連鎖反 応（ＬＣＲ）［例えばLandegran他、(1988)Science 241:1077-1080;Nakazawa他 、(1944)PNAS 91:360-364参照］における、プローブ／プライマーの使用を包含 する。後者は、Ｅ６−ＢＰ遺伝子内の点変異を検出するのに特に有用である。或 は、Ｅ６結合蛋白質のレベルを免疫アッセイにおいて検出することができる。 アンチセンス法（例えばアンチセンス分子のマイクロインジェクション、或い は転写物がＥ６−ＢＰ ｍＲＮＡ又は遺伝子配列に対してアンチセンスであるプ ラスミドによるトランスフェクション）を用いて、特定のＥ６結合蛋白質の内生 産生を抑制することによって、ＨＰＶを媒介して起こる事象（感染、形質転換及 び／又は不死化）における主題の各Ｅ６−ＢＰの役割を、並びに例えば細胞増殖 における新規な各Ｅ６−ＢＰの正常な細胞内機能を、解析することもできる。こ のような方法は細胞培養に用いることができるだけでなく、トランスジェニック 動物の作製にも用いることができる。 この発明の他の面は、本発明の異種Ｅ６−ＢＰ遺伝子を発現するトランスジェ ニック非ヒト動物、又はその動物の少なくとも１つの組織若しくは細胞型におい て破壊された１つ以上のゲノムＥ６−ＢＰ遺伝子を有しているトランスジェニッ ク非ヒト動物を特徴とする。例えば、Ｅ６−ＢＰ遺伝子座の破壊されたトランス ジェニックマウスを生成することができる。 他の面において、この発明は、誤発現されるＥ６−ＢＰ対立遺伝子を有する、 発達する病気のモデル動物を特徴とする。例えば、Ｅ６−ＢＰの欠失したマウス 又は１つ以上のエキソンの全部又は部分が欠失したマウスを繁殖させることがで きる。次いで、かかるモデルマウスを用いて、Ｅ６−ＢＰ遺伝子の誤発現から生 じる病気を研究することができる。 従って、本発明は、本発明のトランスジーンを含み、好ましくは（適宜ではあ るが）外因性Ｅ６結合蛋白質を１つ以上の細胞で発現させるトランスジェニック 動物に関係する。このＥ６−ＢＰトランスジーンは、その蛋白質の野生型形態を コードすることができ、又はその同族体をコードすることができる（アゴニスト 及びアンタゴニストの両者、並びにアンチセンス構築物を含む）。好適具体例に おいて、このトランスジーンの発現は、例えば所望のパターンでの発現を制御す るシス作用性配列を用いて、細胞、組織の特定のサブセット又は特定の発生ステ ージに限られる。組織特異的調節配列及び条件的調節配列を用いて、ある空間的 パターンでトランスジーンの発現を制御することができる。その上、発現の時間 的パターンを、例えば条件的組換え系又は原核生物の転写調節配列により与える ことができる。 イン・ビボで位置特異的遺伝子操作により調節することのできるトランスジー ンの発現を与える遺伝的技術は、当業者に公知である。例えば、遺伝子組換え標 的配列を触媒するレコンビナーゼの調節された発現を与える遺伝的系を用いるこ とができる。ここで用いる場合、語句「標的配列」は、レコンビナーゼにより遺 伝的に組替えられるヌクレオチド配列をいう。この標的配列は、レコンビナーゼ 認識配列と隣接しており、一般に、レコンビナーゼ活性を発現する細胞において 切り出され又は逆転される。レコンビナーゼの触媒による組換え事象は、標的配 列の組換えが主題のＥ６結合蛋白質の発現の活性化又は抑制の何れかを生じるよ うにデザインすることができる。例えば、組換えＥ６−ＢＰ遺伝子の発現を邪魔 する標的配列の切り出しを、その遺伝子の発現を活性化するようにデザインする ことができる。この蛋白質の発現の邪魔は、種々の機構例えばＥ６−ＢＰ遺伝子 のプロモーター要素又は内部停止コドンからの空間的分離により生じ得る。更に 、コード配列がレコンビナーゼ認識配列と隣接しており、初期に細胞中にプロモ ーター要素に関して３’から５’の向きでトランスフェクトされるトランスジー ンを生成することができる。かかる例においては、その標的配列の逆位が、主題 の遺伝子を、コード配列の５’末端をプロモーター要素に関してプロモーター駆 動による転写活性化を与える方向にて再方向付けをする。 説明のための具体例において、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレ コンビナーゼ系（Lakso等(1992)PNAS 89:6232-6236;Orban等(1992)PNAS 89:6861 -6865）又はSaccharomyces cerevisiaeFLPレコンビナーゼ系（O'Gorman等(1991) Science 251:1351-1355;ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６９４）の何れかを用いて、 イン・ビボで、位置特異的遺伝子組換え系を生成することができる。Ｃｒｅレコ ンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列間に位置する逆向き標的配列の位置特異的な組換え を触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅレコンビナーゼが結合する３４塩基対のヌ クレオチド反復配列であり、Ｃｒｅレコンビナーゼ媒介の遺伝子組換えに必要で ある。ｌｏｘＰ配列の向きは、Ｃｒｅレコンビナーゼが存在するときに逆向き標 的配列を切り出すか逆転させるかを決定する（Abremski等(1984)J.Biol.Chem.25 9:1509-1514）；ｌｏｘＰ配列が直列反復の向きのときには標的配列の切り出し を触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆行反復の向きのときには標的配列の逆位を触媒する 。 従って、標的配列の遺伝子組換えはＣｒｅレコンビナーゼの発現に依存する。 このレコンビナーゼの発現は、調節的制御例えば組織特異的、発生ステージ特異 的、外から加えられた剤により誘導又は抑制可能な調節制御の主体であるプロモ ーター要素により調節することができる。この調節された制御は、レコンビナー ゼ発現がこのプロモーター要素により媒介される細胞においてのみ標的配列の遺 伝子組換えを生じる。従って、この組換えＥ６−ＢＰ遺伝子の活性化発現は、レ コンビナーゼ発現の調節を介して調節することができる。 組換えＥ６結合蛋白質の発現を調節するためのｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナー ゼ系の利用は、Ｃｒｅレコンビナーゼ及び主題の蛋白質の両者をコードするトラ ンスジーンを含むトランスジェニック動物の構築を必要とする。このＣｒｅレコ ンビナーゼ及び組換えＥ６−ＢＰ遺伝子の両者を含む動物を、「二重」トランス ジェニック動物の構築によって与えることができる。かかる動物を与えるための 便利な方法は、各々トランスジーン例えばＥ６−ＢＰ遺伝子及びレコンビナーゼ 遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることである。 Ｅ６−ＢＰトランスジーンをレコンビナーゼ媒介により発現し得る形式で含む トランスジェニック動物を初期に構築することから得られる一つの利点は、主題 の蛋白質がトランスジェニック動物における発現に際して有害であろうという見 込みに由来する。かかる例において、主題のトランスジーンがすべての組織にお いてサイレントである創出動物（founder）の集団を、繁殖させて維持すること ができる。この創出動物集団の個体を、例えば１つ以上の組織でレコンビナーゼ を発現している動物と交配させることができる。従って、例えばアンタゴニスト 的Ｅ６−ＢＰトランスジーンがサイレントである創出動物集団の創成は、特定の 組織又は発生のステージにおける細胞調節の破壊が例えば致死的表現型を生じる 創出動物の子孫の研究を可能にするであろう。 類似の条件的トランスジーンを、そのトランスジーンの発現を促進するために 同時に発現されるべき原核生物蛋白質を必要とする原核生物プロモーター配列を 用いて与えることができる。典型的プロモーター及び対応するトランス作用性原 核生物蛋白質は、米国特許第４，８３３，０８０号に与えられている。更に、こ れらの条件的トランスジーンの発現は、トランス作用性蛋白質例えばレコンビナ ーゼ又は原核生物蛋白質をコードする遺伝子を組織に送達し、例えば細胞型特異 的方法で発現させる遺伝子治療様の方法により誘導することができる。この方法 により、このトランスジーンは、成体期にトランスアクチベーターの導入によっ て「入り」になるまでサイレントのままで置くことができる。 典型的具体例において、この発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、ト ランスジーンを非ヒト動物の生殖細胞系列に導入することによって生成すること ができる。種々の発生ステージの胎児の標的細胞をトランスジーンを導入するた めに用いることができる。胎児の標的細胞の発生のステージに依って、種々の方 法を用いる。接合体は、マイクロインジェクションのための最良の標的であ る。マウスにおいては、雄性前核は、１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液の再現可能な注入 を可能にする直径約２０マイクロメートルの大きさに達する。遺伝子トランスフ ァーの標的としての接合体の利用は、殆どの場合に、注入されたＤＮＡが最初の 分裂前に宿主遺伝子中に取り込まれるという点に主要な利点を有する（Brinster 等(1985)PNAS 82:4438-4442）。その結果、トランスジェニック非ヒト動物のす べての細胞は、取り込まれたトランスジーンを有することになる。これは又、一 般に、生殖細胞の５０％がそのトランスジーンを有するので、創出動物の子孫へ のトランスジーンの効率的伝達にも反映される。接合体のマイクロインジェクシ ョンは、この発明の実施においてトランスジーンを取り込むための好適方法であ る。 レトロウイルス感染も又、トランスジーンを非ヒト動物に導入するために用い ることができる。発生中の非ヒト胚をイン・ビトロで胚盤胞ステージまで培養す ることができる。この時期に、卵割球は、レトロウイルス感染の標的たり得る（ Jaenich,R．(1976)PNAS 73:1260-1264）。これらの卵割球の効率的な感染は、透 明帯を除去する酵素処理によって得られる（Manipulating the Mouse Embryo，H ogan編（Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986） 。トランスジーンを導入するために用いられるウイルスベクター系は、典型的に は、そのトランスジーンを運ぶ複製欠損レトロウイルスである（Jahner等(1985) PNAS 82:6927-6931;Van der Putten等(1985)PNAS 82:6148-6152）。トランスフ ェクションは、卵割球をウイルス産生細胞の単層上で培養することによって、容 易に且つ効率的に得られる（Van der Putten，前出;Stewart等(1987)EMBO J.6:3 83-388）。或は、感染をもっと遅いステージで行なうことができる。ウイルス又 はウイルス産生細胞を、卵割腔に注入することができる（Jahner等(1982)Nature 298:623-628）。殆どの創出動物は、取り込みがそのトランスジェニック非ヒト 動物を形成した細胞のあるサブセットにおいてのみ起きるので、トランスジーン についてモザイクである。更に、この創出動物は、一般に子孫において分離する トランスジーンの様々なレトロウイルス挿入物をゲノムの種々の位置に含むこと ができる。更に、トランスジーンを、子宮内レトロウイルス感染によって妊娠中 期の胎児の生殖細胞系列に導入することも可能である （Jahner等(1982)前出）。 トランスジーン導入のための第３の型の標的細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）であ る。ＥＳ細胞は、イン・ビトロで培養し、胎児と融合した着床前の胎児から得ら れる（Evans等(1981)Nature 292:154-156;Bradley等(1984)Nature 309:255-258; Gossler等(1986)PNAS 83:9065-9069;及びRobertson等(1986)Nature 322:445-448 ）。ＤＮＡトランスフェクションにより又はレトロウイルス媒介のトランスダク ションによって、トランスジーンをＥＳ細胞に効率的に導入することができる。 かかるトランスフォームされた細胞を、その後、非ヒト動物からの胚盤胞と合わ せることができる。これらのＥＳ細胞は、その後、胚を形成し、その結果生じた キメラ動物の生殖細胞系列に寄与する。総説としては、Jaenisch,R.(1988)Scien ce 240:1468-1474を参照されたい。 ノックアウト又は破壊トランスジェニック動物の製造方法も又、一般に知られ ている。例えば、Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Labor atory Press，ニューヨーク、Cold Spring Harbor，1986)を参照されたい。レコンビナ ーゼ依存性ノックアウトも又、例えば、標的配列を、Ｅ６−ＢＰ遺伝子の組織特 異的な及び／又は一時的制御を上記のように制御することができるように挿入す る相同組換えによって生成することができる。 この発明の更に別の面は、Ｅ６−ＢＰがその病因論に関係している細胞から生 じる増殖及び／又は分化に関係する病気を治療する方法に関係する。本発明のＥ ６−ＢＰ遺伝子構築物、Ｅ６結合模倣物及びＥ６結合アンタゴニストが治療の利 益を提供し得る様々な病理学的細胞増殖条件がある（一般的ストラテジーは、異 常な細胞増殖の阻止である）。例えば、本発明の遺伝子構築物を遺伝子治療プロ トコールの一部として用いて、Ｅ６結合蛋白質の機能を例えばこの蛋白質が誤発 現される細胞若しくはＥ６結合蛋白質の上流のトランスダクション経路が機能不 全の細胞において再構成し、又は野生型蛋白質の機能を例えば優性の負の変異物 の送達によって阻止すること等ができる。 説明のために、おそらく少なくとも部分的に本発明のＥ６結合蛋白質の機能に 依存する病理学的又は異常な成長を示す細胞型には、種々の癌並びにパピローマ ウイルス感染細胞が含まれる。 主題のＥ６結合蛋白質（例えばアゴニスト及びアンタゴニスト型）又はアンチ センス核酸の遺伝子治療用構築物の一時的利用によって、Ｅ６−ＢＰ機能のイン ・ビボでの制御が達成され得るということも明らかとなろう。この発明の一つの 面において、Ｅ６結合蛋白質の発現用構築物を、任意の生物学的に有効なキャリ アー例えばイン・ビボで細胞を組換えＥ６−ＢＰ遺伝子で有効にトランスフェク トすることのできる任意の配合物又は組成物にて投与することができる。アプロ ーチには、主題の遺伝子の、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随 伴ウイルス及び１型単純ヘルペスウイルスを含むウイルスベクター、又は組換え 細菌若しくは真核プラスミッドへの挿入が含まれる。ウイルスベクターを用いて 細胞を直接トランスフェクトすることができ；プラスミッドＤＮＡは、例えばカ チオン性リポソーム（リポフェクチン）若しくは誘導体化（例えば、抗体と結合 体化した）ポリリジン結合体、グラマシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ又は 他のかかる細胞内キャリアー、並びに遺伝子構築物の直接注射又はイン・ビボで 行なうＣａＰＯ₄沈殿の助成にて送達することができる。適当な標的細胞のトラ ンスダクションは遺伝子治療の決定的に重要な最初のステップを意味するので、 特定の遺伝子送達システムの選択は、意図される標的の表現型及び投与の経路（ 例えば局所的又は全身投与）等の因子に依存するであろうということは、認めら れよう。 主題の蛋白質の１つをコードする核酸の細胞へのイン・ビボでの導入のための 好適なアプローチは、この遺伝子産物をコードする核酸例えばｃＤＮＡを含むウ イルスベクターの利用によるものである。細胞へのウイルスベクターの感染は、 標的細胞の大集団が核酸を受けることができるという利点を有する。更に、ウイ ルスベクターにコードされる分子例えばウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡは 、ウイルスベクタ一核酸を取込んだ細胞において効率的に発現される。 レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは、一般に、外因性 遺伝子のイン・ビボトランスファー特にヒトへのトランスファーのために選択さ れる組換え遺伝子送達システムであると理解されている。これらのベクターは、 遺伝子の細胞への効率的な送達を与え、トランスファーされた核酸は、宿主の染 色体ＤＮＡ中に安定にインテグレートされる。レトロウイルスの使用のために予 め必要なことは、それらの使用の安全性を、特に細胞集団における野生型ウイル スの蔓延の可能性に関して確実にすることである。複製欠損レトロウイルスのみ を生成する特殊化された細胞系統（「パッケージング細胞」と呼ぶ）の開発は、 遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性を増大させ、欠損レトロウイルスは 、遺伝子治療目的のための遺伝子トランスファーにおける使用のためによく特性 決定されている（総説としては、Miller,A.D.(1990)Blood 76:271を参照された い）。従って、レトロウイルスコード配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の部分が 、Ｅ６結合蛋白質をコードする核酸により置き換えられた（そのレトロウイルス を複製欠損にする）組換えレトロウイルスを構築することができる。次いで、こ の複製欠損レトロウイルスを、標準的技術によりヘルパーウイルスの使用により 標的細胞に感染させるのに用いることのできるビリオン中にパッケージする。組 換えレトロウイルスを生成し及びかかるウイルスをイン・ビトロ又はイン・ビボ で細胞に感染させるためのプロトコールは、Current Protocols in Molecular B iology ，Ausubel,F.M．等（編）Greene Publishing Associates，(1989),第9.10 -9.14節及びその他の標準的実験室マニュアル中に見出すことができる。適当な レトロウイルスの例には、当業者に公知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭ が含まれる。環境栄養性レトロウイルス系及び両栄養性レトロウイルス系の両者 を調製するための適当なパッケージングウイルス株の例には、ψＣｒｉｐ、ψＣ ｒｅ、ψ２及びψＡｍが含まれる。種々の遺伝子を、イン・ビトロ及び／又はイ ン・ビボで、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、骨髄芽球、肝細胞、骨 髄細胞を含む多くの異なる細胞型に導入するためにレトロウイルスが利用されて きた（例えば、Eglitis等(1985)Science 230:1395-1398;Danos及びMulligan(198 8)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464;Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 85:3014-3018;Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6141-6145;Hube r等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8039-8043;Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad .Sci.USA 88:8377-8381;Chowdhury等(1991)Science 254:1802-1805;van Beusech em等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89:7640-7644;Kay等(1992)Human Gene The rapy 3:641-647;Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895;Hwu等(19 93)J.Immunol.150:4104-4115;米国特許 第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８ ９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／Ｏ５ ３４５；及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３を参照されたい）。 主題のＥ６−ＢＰ遺伝子のための遺伝子送達システムとしてレトロウイルスベ クターを選択する際には、殆どのレトロウイルスによる標的細胞の上首尾な感染 （従って、組換えＥ６−ＢＰ遺伝子の安定な導入）のために予め必要なことはそ れらの標的細胞が分裂していなければならないことであるということに注意する ことが重要である。一般に、この必要条件は、アンタゴニストＥ６−ＢＰ遺伝子 構築物を送達するためのレトロウイルスベクターの使用に対して障害とはならな いであろう。事実、感染におけるかかる制限は、標的細胞の周囲の組織（例えば 、トランスフォームされてない細胞）は著しく細胞分裂を受けてなく、それ故、 該組織が無反応性の抵抗性である環境において有益であり得る。例えば、パビロ ーマウイルスでトランスフォームされた細胞は、周囲のトランスフォームされて ない扁平上皮細胞よりずっと高い分裂指数を有し得る。 更に、レトロウイルスの、従って、レトロウイルスベースのベクターの感染ス ペクトルを制限することは、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージング蛋 白質を修飾することにより可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２５２３ ４、ＷＯ９４／０６９２０及びＷＯ９４／１１５２４を参照されたい）。例えば 、レトロウイルスベクターの感染スペクトルの修飾のためのストラテジーには、 細胞表面抗原に特異的な抗体をこのウイルスのｅｎｖ蛋白質に結合させること（ Roux等(1989)PNAS 86:9079-9083;Julan等(1992)J.Gen Virol 73:3251-3255:及び Goud等(1983)Virology163:251-254）；又は細胞表面のリガンドをこのウイルス のｅｎｖ蛋白質に結合させること（Neda等(1991)J Biol Chem 266:14143-14146 ）が含まれる。これらの結合は、蛋白質又は他の種類のもの（例えば、ｅｎｖ蛋 白質をアシアロ糖蛋白質に変換するラクトース）を用いる化学的架橋の形態であ ってよく、並びに融合蛋白質（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合蛋白質）を生成 することによってもよい。この技術は又、ある組織型に対する感染を制限し或は 指示するのに有用であると同時に、環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに変 換するために用いることもできる。 その上、レトロウイルス遺伝子送達の利用は、更に、そのレトロウイルスベク ターのＥ６−ＢＰ遺伝子の発現を制御する組織又は細胞特異的な転写調節配列の 利用によって促進することができる。 本発明において有用な他のウイルス遺伝子送達システムは、アデノウイルスか ら誘導されたベクターを用いる。アデノウイルスのゲノムを、それが関心ある遺 伝子産物をコードするが、通常の溶菌性ウイルス生活環において複製する能力に 関して不活性化されるように操作することができる（例えば、Berkner等(1988)B ioTechniques 6:616;Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434;及びRosenfeld等( 1992)Cell 68:143-155を参照されたい）。アデノウイルスＡｄ株５ｄ１３２４型 又は他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）から導かれた 適当なアデノウイルスベクターが当業者に周知である。組換えアデノウイルスは 、それらが分裂してない細胞には感染できない点及び気道上皮（Rosenfeld等(19 92)、前出）、内皮細胞（Lemarchand等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6482- 6486）、肝細胞（Herz及びGerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2812-2816 ）及び筋細胞（Quantin等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584）を含む 種々の細胞型への感染に用いることができる点において、ある種の環境において 有利であり得る。更に、このウイルス粒子は、比較的安定であり、精製及び濃縮 し易く、又上記のように、その感染性のスペクトルに影響を与えるように修飾す ることができる。更に、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及びその中に含まれ る外来ＤＮＡ）は、宿主のゲノム中にインテグレートされずにエピソームのまま であり、それにより、導入されたＤＮＡが宿主のゲノム中にインテグレートされ る状況（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）における挿入による突然変異誘発の結 果として生じ得る潜在的問題が回避される。その上、アデノウイルスゲノムの外 来ＤＮＡに対する運搬容量は、他の遺伝子送達用ベクターに比べて大きい（最大 で８ｋｂ）（Berkner等、前出;Haj-Ahmand及びGraham(1986)J.Virol.57:267）。 現在使用されており従って本発明に好ましい殆どの複製欠損アデノウイルスベク ターは、そのウイルスのＥ１及びＥ３遺伝子の全部又は部分を欠失しているが、 アデノウイルスの遺伝物質の８０％を保持している（例えば、Jones等(1979)Cel l 16:683;Berkner等、前出;及びGraham等 Methods in Molecular Biology，E.J.Murray編（Humana，ニュージャージー、Clifton，1 991）第７巻、109-127頁を参照されたい）。挿入されたＥ６−ＢＰ遺伝子の発現 は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）及び関連リ ーダー配列、Ｅ３プロモーター又は外来の付加されたプロモーター配列の制御下 にあってよい。 更に別の、主題のＥ６−ＢＰ遺伝子の送達に有用なウイルスベクターシステム は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複 製及び生産的生活環のためにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス又はヘルペ スウイルス等の他のウイルスを必要とする天然の欠損ウイルスである。（総説と しては、Muzyczka等Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)158:97-129を参 照されたい）。それは又、そのＤＮＡを分裂していない細胞にインテグレートさ せることができ且つ高頻度の安定なインテグレーションを示す少数のウイルスで もある（例えば、Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356;Samuls ki等(1989)J.Virol.63:3822-3828;及びMcLaughlin等(1989)J.Virol.62:1963-197 3を参照されたい）。ＡＡＶの少ない３００塩基対を含むベクターをパッケージ してインテグレートすることができる。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４ ．５ｋｂに限られている。Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260に記載 されたようなＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡを細胞に導入することができる。 ＡＡＶを用いて多様な核酸が種々の型の細胞に導入された（例えば、Hermonat等 (1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470;Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol .4:2072-2081;Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39;Tratschin等(1984)J .Virol.51:611-619;及びFlotte等(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790を参照され たい）。 遺伝子治療における応用を有し得る他のウイルスベクターシステムが、ヘルペ スウイルス、ワクシニアウイルス及び幾らかのＲＮＡウイルスから誘導された。 特に、ヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系及び他の組織の細胞における組 換えＥ６−ＢＰ遺伝子の持続性のための独特のストラテジーを提供することがで きる（Pepose等(1994)Invest Ophthal mol Vis Sci35:2662-2666）。 上記のようなウイルストランスファー方法に加えて、非ウイルス的方法を用い て、動物の組織におけるＥ６結合蛋白質の発現を引き起こすこともできる。遺伝 子トランスファーの殆どの非ウイルス的方法は、取込み及び巨大分子の細胞内輸 送のために哺乳動物細胞により用いられている正常の機構を頼みとする。好適具 体例において、本発明の非ウイルス的遺伝子送達システムは、主題のＥ６−ＢＰ 遺伝子の標的細胞による取込みのためのエンドサイトーシス経路を頼みとする。 この型の典型的な遺伝子送達システムには、リポソームから導かれたシステム、 ポリリジン結合体及び人工的ウイルスエンベロープが含まれる。 代表的具体例において、Ｅ６結合蛋白質の１つをコードする遺伝子を、陽性電 荷を表面に有するリポソーム（例えば、リポフェクチン）に捕捉することができ 且つ（適宜）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体を結合する（Mizuno等(1992) No Shinkei Geka 20:547-551;ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出 願第１０４７３８１号；及び欧州特許公開ＥＰ−Ａ−４３０７５）。例えば、パ ピローマウイルス感染した上皮細胞のリポフェクションを、パピローマウイルス に結合した抗原に対するモノクローナル抗体と結合させたリポソームを用いて行 なうことができる。 種々のアッセイ形式が十分であり且つ、本願の開示に照らして、ここに明白に 記載されていないものは、それにもかかわらず、当業者によって理解されよう。 Ｅ６−ＢＰインヒビターとして作用する能力について試験されるべき薬剤は、例 えば、細菌、酵母若しくは他の微生物により生成することができ（例えば、天然 品）、化学的に生成することができ（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、 又は組換えにより生成することができる。好適具体例において、この試験薬剤は 、有機低分子例えば約１０，０００ダルトン未満好ましくは５，０００ダルトン 未満更に好ましくは２，０ＯＯＤａ未満の分子量を有するペプチド、オリゴヌク レオチド又はそれらのアナログ以外である。 化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプ ログラムにおいて、所定期間中に検査する化合物の数を最大にするためには高ス ループットアッセイが望ましい。無細胞系で実施される精製若しくは半精製蛋白 質を用いて誘導し得るようなアッセイは、しばしば、試験化合物により媒介され る分子標的の変化の迅速な発達及び比較的容易な検出を与えるように生成す ることのできる「一次」スクリーンとして好適である。その上、試験化合物の細 胞毒性及び／又は生物学的利用能の効果は、一般に、このイン・ビトロ系では無 視することができ、それどころか、このアッセイは、分子標的に対する薬物の効 果に集中しており、それは、Ｅ６結合蛋白質とＥ６との間の結合親和性の変化又 はＥ６結合の分子標的の特性の変化において明白であり得る。従って、本発明の 典型的スクリーニングアッセイにおいて、関心のある化合物を、元々Ｅ６に結合 することのできる単離した及び精製したＥ６結合蛋白質と接触させる。次いで、 この化合物とＥ６結合蛋白質との混合物に、Ｅ６ポリペプチドを含む組成物を添 加する。Ｅ６／Ｅ６−ＢＰ複合体の検出及び定量は、Ｅ６とＥ６結合蛋白質との 間の複合体形成の阻止（又は増強）におけるこの化合物の効力を測定する手段を 提供する。この化合物の効力を、この試験化合物の種々の濃度を用いて得られた データから用量応答曲線を生成することにより評価することができる。その上、 対照用アッセイを行なって比較のための基線を与えることもできる。対照用アッ セイにおいては、単離した及び精製したＥ６をＥ６結合蛋白質を含む組成物に加 えてＥ６／Ｅ６−ＢＰ複合体の形成を試験化合物の不在にて定量する。一般に、 これらの反応物を混合する順序は変えることができ、同時に混合することができ るということは理解されよう。その上、Ｅ６は、Ｅ６結合蛋白質の何れかが結合 する他の蛋白質と替えることができる。 Ｅ６結合蛋白質と標的ポリペプチドとの複合体形成は、各種方法により検出で きる。例えば、複合体形成の調整量は、検出可能に標識化した蛋白質例えば放射 性同位元素標識（例えば³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ又は³Ｈ）、蛍光標識（例えばＦＩＴ Ｃ）又は酵素標識したＥ６結合蛋白質を用いたイムノアッセイやクロマトグラフ ィー検出によって定量化できる。 一般に、Ｅ６−ＢＰ／Ｅ６複合体を、複合体形成しなかった蛋白質の一方又は 両方から容易に分離する目的で、又アッセイの自動化をはかる目的で、Ｅ６結合 蛋白質又はＥ６ポリペプチドを固定化するのが望ましい。候補の薬剤の存在時又 は不在時に、Ｅ６のＥ６結合蛋白質への結合を、これらの反応物を含有するのに 適した任意の容器において達成することができる。１つの態様にあっては、マト リックスとの結合を可能にするドメインを加えた融合蛋白質が提供される。例え ば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｅ６−ＢＰ（ＧＳＴ／Ｅ６−ＢＰ ）融合蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical，St．Louis ，MO製）又はグルタチオン導入(derivatized)マイクロタイタープレート上に吸 着し、Ｅ６ポリペプチド、例えば³⁵Ｓ標識化したものと結合する。この混合物は 複合体形成を可能にする条件下で、例えば塩及びｐＨに関して生理的条件下で（ それより少し厳しい条件が望ましいが）、例えば４℃で、０．６Ｍ ＮａＣｌ又 はデタージェント例えば０．１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液中でインキュ ベートする。インキュベーションに次いで、ビーズを洗浄して結合しなかったＥ ６ポリペプチドを除去し、マトリックスビーズに結合した放射性同位元素標識の 量を、直接決定する（例えば、ビーズをシンチレーション下に置く）か、或いは Ｅ６−ＢＰ／Ｅ６複合体がその後解離した後の上清液中で決定する。 或は、複合体をマトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そのゲル を用いて添付の実施例に記載したように標準的な電気泳動法によってビーズ画分 中のＥ６ポリペプチドのレベルを定量できる。 蛋白質をマトリックス上に固定する他の方法も主題のアッセイに用いることが できる。例えば、Ｅ６結合蛋白質又はＥ６蛋白質の何れかを、ビオチンとストレ プトアビジンとの複合を利用して固定することができる。例えば、当分野におい て公知の方法（例えば、Pierce Chemicals，Rockford,IL製のビオチン化キッ ト）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）からビオ チン化Ｅ６−ＢＰ分子を作製することができ、ストレプトアビジンでコートした ９６ウェルプレート(Pierce Chemical製)のウェル内に固定することができる。 更にＥ６に反応するがＥ６−ＢＰ結合を邪魔しない抗体をプレートのウェルに導 入し、抗体複合によりウェル内でＥ６ポリペプチドを捕捉することができる。上 記したように、Ｅ６−ＢＰポリペプチド及び試験用化合物の調製物をプレート上 のＥ６が存在するウェル内でインキュベートし、ウェル内に捕捉したＥ６−ＢＰ ／Ｅ６複合体の量を測定することができる。上記したＧＳＴ固定化複合体を検出 する方法の他に、そのような複合体を検出する方法の例としては、Ｅ６ポリペプ チド又はＥ６−ＢＰの何れか一方と反応する抗体を用いた、複合体の免疫検出法 ；並びにこのポリペプチドの一方と関連した酵素活性の検出を利用する酵素結合 アッセイが挙げられる。後者の例において、融合蛋白質として、酵素を化学的に 複合又は作製することができる。具体的には、Ｅ６−ＢＰポリペプチドをセイヨ ウワサビペルオキシダーゼと化学的に架橋し又は遺伝子工学的に融合して、複合 体内に捕捉したＥ６−ＢＰポリペプチドの量を、例えば３，３’−ジアミノ−ベ ンザディンテラヒドロクロリド又は４−クロロ−１−ナプトール等の、上記酵素 に対する色素産生基質を用いて調べることができる。同様に、Ｅ６ポリペプチド 及びグルタチオン−Ｓ−トランフェラーゼを包含する融合蛋白質を作製し、１− クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することによって 複合体形成を定量することができる［Habig他、(1974)J Biol Chem 249:7130］ 。 複合体内に捕捉した蛋白質の1つを定量する免疫検出法を利用する工程に、蛋 白質に対する抗体、例えば抗Ｅ６又はＥ６−ＢＰ抗体の何れかを用いることがで きる。更に、複合体内の検出すべき蛋白質を「エピトープで標識付け」して、Ｅ ６ポリペプチド又はＥ６−ＢＰ配列と、対応する抗体の入手が容易な（例えば市 販されている）第２のポリペプチドとの融合蛋白質の形にすることができる。例 えば上記したＧＳＴ融合蛋白質を用いた場合、ＧＳＴ部分に対する抗体によって 結合の量を測ることもできる。他に有用なエピトープ標識として、ｃ−ｍｙｃの １０残基配列を含有するｍｙｃ−エピトープ［例えばEllison他、 (1991)J Biol Chem 266:21150-21157参照］、ｐＦＬＡＧ系（International Bio technologies,Inc.製）、ｐＥＺＺ−蛋白質Ａ系(Pharamacia，NJ製)等が挙げら れる。 薬物スクリーニングアッセイ特に下記の高スルーアウトアッセイの生成を容易 にする本発明の他の面は、Ｅ６−ＢＰ^SD7蛋白質のＥ６結合モチーフの同定であ る。例えば、本発明は、完全長蛋白質よりも操作するのが容易なＳＤ−７蛋白質 の部分を提供する。添付の実施例に記載のように、本発明は、Ｅ６蛋白質に結合 する能力を保持しているＳＤ−７蛋白質の一部分を含むポリペプチドを提供する 。かかるＥ６結合モチーフは、SEQ ID NO:８のＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８に対 応するアミノ酸配列を含むことができる。 例えば、主題のスクリーニングアッセイにおいて有用なＳＤ−７ポリペプチド フラグメントは、一般式Ｘ−Ｙ−Ｚにより表すことができ、式中ＹはSEQ ID NO: ８の残基１９４〜２１８間のＥ６結合モチーフのアミノ酸配列を表し、Ｘは、存 在しないか又はSEQ ID NO:８の残基１〜１９４間のアミノ酸配列の一部分を表し （適宜、ＹのＮ末端に直結）、そして、Ｚは、存在しないか又はSEQ ID NO:８の 残基２１８〜３１７間のアミノ酸配列の一部分を表す（適宜、ＹのＣ末端に直結 ）。好ましくは、このポリペプチドは、ＳＤ−７ポリペプチド配列の約２５〜２ ００残基のみを含む（一層好ましくは、約２５、５０、７５又は１００アミノ酸 残基のみを含む）。説明のための具体例において、主題のアッセイを生成するの に用いられるポリペプチドには：Ａｌａ１９４〜ほぼＡｓｐ２１８に対応するＳ Ｄ−７ポリペプチド配列；Ｍｅｔ９９〜ほぼＬｅｕ３１７に対応するＳＤ−７ポ リペプチド配列；Ｖａｌ１０７〜ほぼＡｓｐ２１８に対応するＳＤ−７ポリペプ チド配列；Ａｌａ１９４〜ほぼＧｌｕ３１６に対応するポリペプチド配列が含ま れる。 更に、主題のＥ６結合蛋白質を用いて、下記の実施例に述べるように［更に米 国特許第５，２８３，３１７号；Zervos他、（1933）Cell 72:223-232;Madura他 、（1993）J.Biol Chem 268:12046-12054;Bartel他、（1993）Biotechniques 1 4:920-924;及びIwabuchi他、（1993）Oncogene 8:1693-1696も参照］相互作用ト ラップアッセイを行うことができる。続いて、このアッセイを用いてＥ６蛋白 質に対するＥ６−ＢＰの結合を阻害する薬剤を検出することができる。この相互 作用トラップアッセイは、イン・ビボで、機能的な転写アクチベーター蛋白質を ２つの別個の融合蛋白質（その１つは、Ｅ６蛋白質に融合された転写アクチベー ターのＤＮＡ結合ドメインを含む）から再構成することに依存している。第２の 融合蛋白質は、主題のＥ６結合蛋白質の１つに融合された転写アクチベータード メイン（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ転写を開始することができるもの）を含む 。Ｅ６とＥ６結合蛋白質とが相互作用すれば、これらの２つの転写アクチベータ ー蛋白質のドメインがレポーター遺伝子の転写を引き起こすのに十分なだけ近く に運ばれる。別の例証的な態様にあっては、ＧＡＬ４ｄｂ−Ｅ６融合体をコード するプラスミド並びにＧＡＬ４ａｄドメインと主題のＥ６−ＢＰとの融合体をコ ードするプラスミドを同時に用いてサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ＹＰＢ２細胞を形質転換する。その上更に、その菌株は、ＧＡＬ４ 反応プロモーターが表現型標識の発現を引き起こすように形質転換される。例え ば、この菌がヒスチジン不在下で成長する能力はＨＩＳ３遺伝子の発現に依存し ている。ＨＩＳ３遺伝子がＧＡＬ４反応プロモーターの制御下に置かれた場合、 栄養要求性という表現型が発現しなければ、Ｅ６とＥ６−ＢＰとの相互作用を通 じて機能的ＧＡＬ４活性体が再構成されたことを意味する。従って、Ｅ６−ＢＰ とＥ６との相互作用を抑制する薬剤を用いると、ヒスチジン不在下では酵母菌は 育たないという結果になる。更に、表現型標識（例えばＨＩＳ３遺伝子に代わる ものとして）は、発現したときに負の選択性を提供するものであってもよく、こ の場合、Ｅ６／Ｅ６−ＢＰの相互作用を阻害する薬剤は細胞について正の成長選 択性を提供する。 その上、主題のＥ６結合蛋白質の１つが酵素活性を有する例にあっては、触媒 としての主題の酵素による基質の変換を抑制する薬剤の能力を測定する事に由来 するアッセイにより、酵素活性の抑制剤を同定することができる。 他の面において、この発明は、本発明の組換えＥ６−ＢＰ遺伝子を発現するト ランスジェニック非ヒト動物又はその動物の少なくとも１つの組織若しくは細胞 型において破壊された少なくとも１つの主題のＥ６−ＢＰ遺伝子（例えば、ヘテ ロ接合又はホモ接合）を有するトランスジェニック非ヒト動物を特徴とす る。 他の態様にあっては、本発明は、誤発現するＥ６−ＢＰ対立遺伝子を有する、 発達疾患の動物モデルを提供する。例えば、Ｅ６−ＢＰ対立遺伝子の欠失した、 或いは1個以上のＥ６−ＢＰエクソンの全部又は一部が欠失したマウスを飼育す ることができる。このようなマウスモデルを用いて、誤発現したＥ６−ＢＰ遺伝 子を原因とする疾患を解析することができる。実施例 今や、この発明を一般的に説明したので、下記の実施例により、それは、一層 容易に理解されよう（これらの実施例は、本発明のある面及び実施例の説明の目 的で含まれているだけであり、この発明を制限する意図はない）。 実施例１：パピローマウイルスＥ６蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする 遺伝子のクローニング。 ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白質と会合する蛋白質をコードする遺伝子を同定するために 、我々は、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子についての遺伝的選択を利用 する改変した２ハイブリッド系を採用した（例えば、Fields等(1989)Nature 340 :245-246;Chien等(1991)PNAS 88:9578-9582;Morrissey等(1989)J Virol 63:4422 -5;及びLamberti等(1990)EMBO J 9:1907-1913を参照されたい）。我々は、ＨＰ Ｖ−１６ Ｅ６／ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）Ｅ２ ＤＮＡ結合ドメイン （Ｅ２Ｒ）融合蛋白質（「Ｅ６−Ｅ２Ｒ」）及び４つのＥ２結合要素を含むプロ モーターにより駆動されるｌａｃＺレポーターを発現する酵母株を用いて始める ことにより、この「２ハイブリッド系」を適合させた。このＥ６−Ｅ２Ｒ融合蛋 白質は、Ｅ２結合部位に結合することができるが、レポーター遺伝子の発現を誘 導しない。次いで、この株を、ランダムにプライムされたＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡ が強いＶＰ１６転写アクチベータードメインのＣ末端側に挿入されたプラスミッ ドのライブラリー（Dalton等(1992)Cell 68:597-612）を用いてトランスフォー ムした。Ｅ６−Ｅ２Ｒと相互作用することができるか又はレポータープロモータ ーに直接結合することのできるＶＰ１６／ｃＤＮＡ融合蛋白質は、ＶＰ１６活性 化ドメインをＥ２結合部位に補充してｌａｃＺ遺伝子の発現を活性 化し、続いて、これらの酵母細胞は、Ｘ−ｇａｌプレート上で青色に染まる。 約１０⁶の独立の酵母コロニーのスクリーニングの後に、ガラクトース／ｘ− ｇａｌ上で青色になる４０コロニーを同定した。ＶＰ１６／ｃＤＮＡプラスミッ ドを、大腸菌中へのトランスフォーメーション後に回収した。これらのＶＰ−１ ６／ｃＤＮＡ遺伝子を、Ｅ６−ＢＰハイブリッド遺伝子、対照用ベクター又は最 初のキメラで用いられたＥ２遺伝子の部分の何れかと共にＥ２レポーター遺伝子 を含む新鮮な酵母に導入した。この分析の結果は、ＶＰ−１６／ｃＤＮＡの幾ら かがこのハイブリッドのＢＰＶ Ｅ２部分と相互作用することを示した（他は、 Ｅ６−Ｅ２の不在時にさえレポーター遺伝子を活性化する蛋白質をコードしたが 、９つは、再現可能に、ＨＰＶ１６ Ｅ６−Ｅ２の存在時にのみｌａｃＺの発現 を刺激することが見出された）。これらの４０コロニーの幾らかは、これらの条 件の何れにおいてもレポーター発現を活性化せず、一般に、これらは、初期スク リーニングにおける最も明るい青色のコロニーに由来した。我々は又、２０２ア ミノ酸よりなるＮ末端のＬｅｘＤＮＡ結合ドメイン及びイン・フレームのＨＰＶ １６ Ｅ６のキメラも作成した。Ｌｅｕ２遺伝子を調節する染色体ＬｅｘＡ依存 性プロモーターを有する酵母株を用いて、我々は、ロイシン欠乏培地における成 長が、すべての６つのＶＰ−１６ｃＤＮＡにより与えられ得るが、幾らかの対照 用ＶＰ−１６キメラは生存不能であることを見出した。これは、これらのｃＤＮ ＡがＨＰＶ１６ Ｅ６と相互作用することの更なる証拠を提供するものである。 これらのＥ６と特異的に相互作用したｃＤＮＡプラスミッドを、ＶＰ１６コー ド配列内で開始するプライマーを用いるＤＮＡ配列分析にかけた。これは、ｃＤ ＮＡとの融合点におけるリーディングフレームについての情報を提供する。 一般に、このプライマーを用いて、我々は、約２００〜３００ヌクレオチドのＤ ＮＡ配列を決定した。すべての場合に、１つのイン・フレームのオープンリーデ ィングフレームが同定された。我々は又、適当なプライマーを用いて、ｃＤＮＡ 挿入物の３’末端を配列決定している。３つの場合に、同じ遺伝子が２度見出さ れた。これらは、ＶＰ１６活性化ドメインとの融合点において異なったので、同 じライブラリークローンの正確な複製物ではなく、独立した単離株を 表した。 このＳＤ−７クローンは、カルボキシ末端にＨＤＥＬシグナル配列を有する２ １０アミノ酸残基のオープンリーディングフレームをコードした。ＳＤ７の５’ 部分を、ＨｅＬａラムダファージライブラリーから完全長のｃＤＮＡを単離する ためのプローブとして用いた。重複する挿入物を有する幾つかのクローンが得ら れた。これらは、合わせて２ｋｂに及ぶｃＤＮＡの回収を生じた。従って、ＳＤ −７蛋白質をコードするｃＤＮＡの完全なコピーが得られた。このＳＤ−７ｃＤ ＮＡクローンのヌクレオチド配列及び演鐸されたアミノ酸配列を、添付の配列表 （sequence listing）中に与える。カルボキシ末端のＨＤＥＬシグナル配列の他 に、Ｅ６−ＢＰのＣ’半分には、４つのＥＦハンドがある。 ＳＤ７配列（又は全ｃＤＮＡ断片）を用いる厳しい条件下でのノーザンブロッ ト分析は、試験したすべての細胞に同レベルで存在する２，０００ヌクレオチド の大きさの転写物とハイブリダイズする。更に、ＳＤ−７ｍＲＮＡレベルは、パ ピローマウイルスＥ６遺伝子によりトランスフォームされた細胞系統においてさ えも変化しない。 Ｅ６の主題のＥ６結合蛋白質とのイン・ビボでの会合を更に確かめるために、 イン・ビトロ結合アッセイを、イン・ビトロ翻訳されたＥ６及び固定化されたＧ ＳＴ−Ｅ６ＢＰを用いて行なった。例えば、我々は、ＧＳＴ−ＳＤ７及びＧＳＴ 単独が、それぞれ、陽性及び陰性対照として用いられることを観察した。ＧＳＴ −Ｅ６−ＢＰは、Ｅ６−ＡＰを用いて観察されたのに匹敵する程度にＨＰＶ１６ に結合するが、ＧＳＴ単独は、ＨＰＶ１６ Ｅ６に結合しない。 このｃＤＮＡの５’及び３’末端のＤＮＡ配列を用いて、我々は、GenBank/EM BLデータベースを、以前にクローン化され配列決定された遺伝子についてサーチ した。このコンピューターサーチは、これらのｃＤＮＡの幾つかは公知の遺伝子 に由来するが少なくとも８つ（クローンＳＤ７、８、１２、１６、２２、２８及 び３２）が新規な遺伝子であることを示した。２つは、亜鉛をＥ６ペプチドに載 せるのに関与し得ると我々が推測する潜在的な金属結合モチーフを有する。ヒト からクローン化されたものはないが、蛋白質分解機構のメンバーに関係しており 、Ｅ６／Ｅ６−ＡＰと複合体を形成し得ると我々は思う。Ｅ２キメラとして クローン化された多くのＨＰＶ１６ Ｅ６突然変異の研究からのデータは、この 相互作用に特異性があることを示した：幾つかの変異体は、幾つかのＶＰ１６ｃ ＤＮＡを用いて陽性のままであるが、他のものは陰性である。この情報は、これ らのクローンの妥当性を更に支持する。 上記のクローン各々を、Ｅ６相互作用トラップで分離した８種の新規クローン を含むｐＲＳ３０６プラスミド（「ｐＲＳ３０６−Ｅ６ＢＰ」と称する）のライ ブラリーとしてＡＴＣＣ（Rockville,ＭＤ）に１９９４年７月８日、ブタペスト 条約に基づき寄託した。ＡＴＣＣ寄託番号は７５８２７である。この寄託物を用 いれば、当業者は主題の組換えＥ６−ＢＰ遺伝子及び主題のＥ６結合蛋白質の発 現組換え体を作製することができる。例えば、本発明のＥ６結合蛋白質の各々を 、下記のプライマーを用いるＰＣＲによってＡＴＣＣ委託番号７５８２７の寄託 物から増幅することができる： （これらのプライマーが、ＶＰ−１６遺伝子の上流とｃＤＮＡ挿入物の下流にそ れぞれハイブリダイズすることによってｃＤＮＡ挿入物の増幅が開始される）。 下記プライマー はＶＰ１６遺伝子内及びＶＰ１６／ｃＤＮＡの境界近くで開始し、ＡＴＣＣ寄託 物のクローンの分離にも用いることができる。 更に、表１に示した各クローンの５‘末端（ある例では３’末端）についての 便覧を見れば、SEQ ID NO:１〜７のヌクレオチド配列に基づいたプライマー、又 はそれらプライマーの組み合わせ並びにSEQ ID NO:１５、１６及び１７のプライ マーを用いて、ＡＴＣＣ寄託物の各クローンを分離できるということは、当業者 には明白なことである。 組み換え蛋白質を産生するために、分離したクローンを発現ベクター内でサブ クローンすることができ；分離したクローンを用いてアンチセンス構造体を作製 することができ；或いは分離したクローンを用いてオリゴヌクレオチドプローブ を作製することができる。例証的な態様にあっては、主題のＡＴＣＣ寄託物の クローンそれぞれをコードする配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを作製 し、作製したプローブをサザンハイブリダイゼーションやｉｎ ｓｉｔｕハイブ リダイゼーションアッセイに用いて各Ｅ６結合蛋白質の発現パターンや量を検出 した。 加えて、ＡＴＣＣ寄託物それぞれは不活性トラップアッセイにより同定した融 合蛋白質をコードするプラスミドであるので、寄託物からのクローンを例えば薬 剤スクリーニングアッセイ或いはＥ６結合エピトープの地図作製のための突然変 異誘発アッセイとして、類似のＩＴＳにおいて直接用いることができる。 ＳＤ２−７クローンの全長ｃＤＮＡを得て配列決定を行った。 表１ ｐＲＳ３０６−Ｅ６ＢＰの便覧 細菌及び酵母株 大腸菌ＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９（８０ｌａｃＺｄｅｌｔａ Ｍ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ１ 、ｒｅｌＡ１）は、別途示さない限り、すべてのプラスミッド構築物についての トランスフォーメーションレシピエントであった。酵母株ＤＢＹ１は、ＢＧＷ１ −７ａ（ＭＡＴａ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｈｉｓ４−５１９ ａｄ ｅｌ−１００ ｕｒａ３−５２）からＴＲＰＩ遺伝子の不活性化により誘導され た。ＤＢＹ１を、２ハイブリッド系のための宿主として用いた。 プラスミッド ｐＢＹ−４中のＵＲＡ選択遺伝子を、ＳｔｕＩでの消化により不活性化し、プ ラスミッドＣＶ−１３（Morrissey等(1989)J Virol 63:4422-4425）からのＬＥ Ｕ２遺伝子と置換してｐＬ−７２を作成した。ｐＥ６Ｅ２Ｔを、ｐＫＰＨＰＶ１ ６Ｅ６Ｅ２由来のＢＰＶＥ２ＤＮＡにＣ末端で融合されたＨＰＶ−１６Ｅ６遺伝 子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をｐＹＥｐｌａｃ１１２ＧのＢａｍＨＩ及び ＳａｌＩ部位に挿入することにより構築した。ｐＹＥｐｌａｃ１１２ＧＥ２−Ｒ を、ｐＹＥｐｌａｃ１１２ＧＥ２から、ＢＰＶ−１Ｅ２活性化ドメインを含むＮ ｃｏＩ断片の欠失により作成した。 ｐＧＥＸ（Pharmacia）を、ＧＳＴ融合蛋白質の発現用に用いた。例えば、ｐ ＧＳＴＳＤ７を、ＳＤ７クローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物をｐ ＧＥＸ−３Ｔ中にライゲートすることにより構築した。ｐＧＳＴ６Ｅ６及びｐＧ ＳＴ１６Ｅ６を、ＨＰＶ６Ｅ６及びＨＰＶ１６Ｅ６オープンリーディングフレー ムのｐＧＥＸ−２Ｔ中へのライゲーションにより構築した。ＧＳＴ−Ｅ６−ＡＰ をコードするプラスミッドは、前に記載された（Huibregtse等(1993)Mol Cell B iol 13:4918-4927，1993）。ｐＳＰ６５プラスミッドを、イン・ビトロ転写／翻 訳のための遺伝子クローニング用に用いた。ｐＳＰＢＰＶＥ６、ｐＳＰ８Ｅ６及 びｐＳＰ３１Ｅ６を、ＢＰＶ−１Ｅ６、ＨＰＶ８Ｅ６及びＨＰＶ３１Ｅ６オープ ンリーディングフレームのｐＳＰ６５の適当な部位へのライゲーションにより構 築した。ｐＳＰ６Ｅ６及びｐＳＰ１６Ｅ６は、記載されている（Crook等(1991)C ell 67:547-556）。ｐＳＰ１１Ｅ６及びｐＳＰ１８Ｅ６も又記載されている（We rness等(1990)Science 248:76-79）。ｐＳＰ７は、ｐＳＰ６５中のｐＳＤ７に由 来するＥ６−ＢＰ断片を含む。 ライブラリースクリーニング すべての酵母のトランスフォーメーションを、酢酸リチウム法（Schiestl等(1 989)、Curr Genet 16:339-346）により行なった。酵母株ＤＢＹＩをｐＬ−７２ 及びｐＥ６Ｅ２Ｔでトランスフォームして、ＬＥＵ２⁺及びＴＲＰ⁺マーカーにつ いての選択下に維持した。次いで、ＤＬＥ６Ｅ２細胞を、ランダムにプライムさ れたＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡがＶＰ１６転写アクチベータードメインのＣ末端側 に挿入された酵母シャトルベクタープラスミッドのライブラリーでトランスフォ ームした。トランスフォーマントを、炭素源として２％グルコースを含有するｔ ｒｐ^-、ｕｒａ^-且つｌｅｕ^-の選択用最少培地（ＹＭＭ）上にプレートした。３ ０℃で４８〜７２時間のインキュベーションの後に、コロニーを、フィルターに て、選択用培地及び２％ガラクトースを含む新鮮なプレートに移して更に１８時 間インキュベートしてＥ６Ｅ２及びＶＰ１６／ｃＤＮＡ発現を誘導した。次いで 、これらのフィルターを、選択用培地２％ガラクトース並びにＸ−ｇａｌを含む プレートに移した。色の展開時間は、８〜２４時間に及び、その間に、青色のコ ロニーを取り出して下記のように処理した。 ＶＰ１６／ｃＤＮＡプラスミッドを、２％グルコースを含むｕｒａ^-選択用液 体ＹＭＭ中での１週間以上のインキュベーションの後に、陽性（青色）のコロニ ーから回収して、続いて、ＤＨ５α中にトランスフォームした。これらのＶＰ１ ６／ｃＤＮＡ遺伝子を、新鮮なＤＬＥ６Ｅ２又は酵母（ｐＬ−７２をｐＥ２−Ｒ （ＤＬＥ２−Ｒ）と共にを含む）に導入した。ＤＬＥ６Ｅ２においてのみ青色コ ロニーを生じてＤＬＥ２−Ｒでは青色コロニーを生じないクローンはＥ６特異的 と考えられ、それらを更に研究した。 ｃＤＮＡクローニング及び配列決定 Ｅ６結合蛋白質の完全長のコード配列を含むｃＤＮＡを得るために、ランダム にプライムした（Clontech）並びにポリｄ（Ｔ）プライムしたケラチノサイトｃ ＤＮＡライブラリー（λｇｔ１１中）を、非放射性標識ジゴキシゲニン−ｄＵＴ Ｐを用いるランダムプライマー標識キット（Boehringer Mannheim）を用いて調 製したＥ６−ＢＰの³²Ｐ標識した５’断片を用いて、厳しい条件下でスクリーニ ングした。幾つかの陽性ラムダクローンを単離して、挿入物をＳａｃＩ−Ｋｐｎ Ｉ断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋／−中にサブクローン化し又は ＰＣＲ生成物としてｐＵＣ１９中にサブクローン化した。二本鎖ＤＮＡをジデオ キシチェーンターミネーション法（Sanger等(1977)PNAS 74:5463-5467）により 、シーケナーゼ試薬（U.S.Biochemical）を用いて配列決定した。この配列のデ ータベースとの比較を、ＧＣＧ（Genetics Computer Group）ＦＡＳＴＡ プログラムを用いて行なった。 蛋白質発現及び抗体 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質を、大腸菌株Ｄ Ｈ５α又はＪＭ１０９で発現させた。１リットルの培養に１００ｍｌの静置培養 を接種して１時間成長させてから０．２ｍＭＩＰＴＧで３時間インキュベートし た。細胞を遠心分離により収穫し、５０ｍｌの低塩会合緩衝液（ＬＳＡＢ、１０ ０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０ 及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）に０．０３％ＳＤＳ、２ｍＭ ＤＴＴを加えたものに再懸濁して超音波により溶解させた。１０，０００ｇで １０分間の遠心分離の後に、上清を集めてグルタチオンセファロース（Pharmaci a）と混合した。この混合物を、４℃で２時間回転させた。次いで、ビーズを、 １０００ｇで２分間の遠心分離により集め、２０容のＬＳＡＢで３回洗って、４ ℃に保存した。 イン・ビトロ翻訳された蛋白質を、ウサギ網状赤血球溶解物翻訳系（Promega ）及び³⁵Ｓ標識したシステイン又はメチオニン（ICN）を用いて調製した。 ＧＳＴ−ＳＤ７融合蛋白質を精製してウサギへの注射に用いた。血清を集めて 免疫沈降に用いた。 イン・ビトロ結合 イン・ビトロ結合のために、約２μｇのＧＳＴ融合蛋白質を含む３０μｌのグ ルタチオンセファロースを、２〜２０μｌの³⁵Ｓ標識したイン・ビトロ翻訳され た蛋白質（ＬＳＡＢ中）と合わせた（総容積２５０μｌ）。これらの混合物を３ 時間４℃で回転させた。次いで、これらの混合物を、ＬＳＡＢで６回洗い、ＳＤ Ｓゲルローディング緩衝液中で煮沸して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電 気泳動した。ゲルを固定し、オートフルオル（Dupont）に浸し、乾燥させてKoda k XARフイルムに露出した。ゲルを、Molecular Dynamic Phosphor Imagerを用い てスキャンもした。 実施例２：Ｅ６結合モチーフの同定 結果 ＨＰＶ１６Ｅ６と相互作用するＳＤ−７の領域を決定するために、３つの型の 欠失をＳＤ−７の最初の単離株（即ち、ＳＤ−７のＣ末端２１０アミノ酸断片） に、Ｎ末端、Ｃ末端及び内部にイン・フレームで導入した。これらを、ＤＮＡ断 片を抜き出すのに便利な制限部位を用いるか又はＰＣＲ生成物を用いて構築して 欠失又は部分的ｃＤＮＡを生成した。変異した蛋白質を、大腸菌中でＧＳＴ融合 物として合成した。等量のＧＳＴ−ＳＤ−７融合蛋白質を、イン・ビトロで翻訳 された³⁵Ｓで標識したＨＰＶ１６Ｅ６と会合する能力についてアッセイした。図 ２は、これらの結果の図式表示を示している。これらの研究は、アミノ酸残基１ ９４〜２１８の領域がＨＰＶ−１６Ｅ６との相互作用に決定的に重要であるとい うことを示した。この領域を含む如何なる構築物もＥ６に結合することができた が、この領域を有しない変異体は結合することができなかった。従って、このア ミノ酸残基１９４〜２１８の領域は、Ｅ６結合のための部位を含んでいるらしい 。この領域の外側のアミノ酸は、相互作用に寄与し得る（それらの欠失変異体は 、いずれも、元々のＧＳＴ−ＳＤ−７程には有効に結合しないので）。このＥ６ 結合モチーフは、ＳＤ−７中の第４のＥＦハンド内に入り、すべての推定のルー プ配列及びアルファらせん配列の両側の少しのアミノ酸配列を含む。 これらの結果を確かめるために、我々は、第４のＥＦハンド（ＧＳＴＳＤ７Ｍ ）由来の２５アミノ酸のみのＥ６結合モチーフ（アミノ酸残基１９４〜２１８） を含む更なるＧＳＴ融合物を工作してそれをイン・ビトロ結合アッセイで試験し た。我々は又、Ｅ６ＢＰの元の単離株からの第４のＥＦハンド（ＧＳＴＳＤ７ｄ １Ｍ、ｄ１１９４及び２１７）の欠失をも作成した。図３に示すように、ＧＳＴ ＳＤ７Ｍは、効率的にＨＰＶ−１６Ｅ６に結合するが、ＧＳＴＳＤ７ｄ１Ｍは結 合しない。予想されるように、３６アミノ酸残基のＥＦハンドの完全な第４の反 復を含むＳＤ−７部分（ＧＳＴＳＤ７ＥＦ４）は、ＨＰＶ−１６Ｅ６に結合する 。対照として、３６アミノ酸残基のＥＦハンドドメインの第５の反復を含むＧＳ Ｔ融合蛋白質（ＧＳＴＳＤ７ＥＦ５）は、結合しない。 材料及び方法 プラスミッド。ＧＳＴ−Ｅ６Ｂ融合蛋白質をコードするプラスミッド（ｐＧＳＴ ＳＤ７）、ｐＶＰ１６：Ｅ６ＢＰ、ｐ１６Ｅ６：Ｅ２Ｒ及びｐＬ７２は、前に記 載された（Science 269:529-531）。改変されたｐＧＥＸ２Ｔ（Pharmacia）は、 ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＣｌａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩを融合点に含む。改変さ れたｐＧＥＸ３Ｘ（Pharmacia）は、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＣｌａＩ、Ｓｐｅ Ｉ、ＸｂａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩを融合点に含む。プラスミッ ドｐＳＰ１６Ｅ６及びｐＰｒｏｐ５３ＳＰ６５は、Karen Vousden（Cell 67:547 -556）から得た。 変異体の構築。ＧＳＴ−Ｅ６ＢＰ欠失体、Ｎ、Ｎ１、Ｎ２、ｄ１Ｍ１及びｄ１Ｍ ２のために、制限部位を利用して、ｐＧＳＴＳＤ７から部分的コード配列を欠失 させた。変異体ｄ１Ｍを、次のプライマーを用いるｐＧＳＴＳＤ７のＰＣＲ増幅 により造った：ＧＳＴ５’プライマーCGATCGGGATCCGCTAGCATGTCCCCTATACTAGGT（ SEQ ID NO:18）及びGCGGGATCCTCTTGAATGACAAATTCCG（SEQ ID NO:19）。この断片 をＭｓｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、次いで、ｐＧＳＴＳＤ７中のＭｓｃＩ−Ｂ ａｍＨＩ断片を置換するのに用いた。ＧＳＴ−Ｅ６ＢＰ変異体ＣをｐＧＳＴＳＤ ７由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片のｐＧＥＸ１（Pharmacia）のＢａｍＨＩ 及びＥｃｏＲＩ部位への挿入により構築した。ｐＧＳＴＳＤ７のＨｉｎｄＩＩＩ −ＸｈｏＩ断片を改変ｐＧＥＸ２Ｔに挿入してＧＳＴ−Ｅ６ＢＰ変異体Ｃ１を造 った。 変異体ＥＦ４を、プライマーGCGGGATCCTGACGGAATTTGTCATTCAAG（SEQ ID NO:20 ）及び ATTCTCGAGCTAATTTGCAGTTGGGTCCCACC（SEQ ID NO:21）を用いるｐＧＴＳＤ７のＰ ＣＲ増幅により造り；ＥＦ５を、プライマー GCGGGATCCTGATACTTGTTGAGAAAGACAG（SEQ ID NO:22）及び ATTCTCGAGCTAAATGCCCTGATTATTAGG（SEQ ID NO:23）を用いるｐＧＳＴＳＤ７のＰ ＣＲ増幅により造った。これらの断片を、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩを用いてデザ インし、改変ｐＧＥＸ３Ｘ中に挿入した。 蛋白質発現。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質を、 大腸菌株ＤＨ５α又はＪＭ１０９中で発現させた。１リットルの培養に１００ｍ ｌの静置培養を接種して１時間成長させてから０．２ｍＭ ＩＰＴＧで３時間誘 導した。。細胞を遠心分離により収穫し、５０ｍｌの低塩会合緩衝液（ＬＳＡＢ 、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ −４０及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）に０．０３％ＳＤＳ、 ２ｍＭ ＤＴＴを加えたものに再懸濁して超音波により溶解させた。１０，００ ０ｇで１０分間の遠心分離の後に、上清を集めてグルタチオンセファロース（Ph armacia）と混合した。この混合物を、４℃で２時間回転させた。次いで、ビー ズを、１０００ｇで２分間の遠心分離により集め、２０容のＬＳＡＢで３回洗っ て、４℃に保存した。 イン・ビトロ翻訳されたＥ６蛋白質を、ウサギ網状赤血球溶解物翻訳系(Prome ga)及び³⁵Ｓ標識したシステイン又はメチオニン（ICN）を用いて調製した。 イン・ビトロ結合。イン・ビトロ結合のために、約２μｇのＧＳＴ融合蛋白質を 含む３０μｌのグルタチオンセファロースを、２〜２０μｌの³⁵Ｓ標識したイン ・ビトロ翻訳された蛋白質（ＬＳＡＢ中）と合わせた（総容積２５０μｌ）。こ れらの混合物を３時間４℃で回転させた。次いで、これらの混合物を、ＬＳＡＢ で６回洗い、ＳＤＳゲルローディング緩衝液中で煮沸して、ＳＤＳポリアクリル アミドゲル上で電気泳動した。ゲルを固定し、乾燥させて、Molecular Imager（ Bio-Rad）によりスキャンした。 上で引用した参考文献及び刊行物のすべてを、参考として本明細書中に援用す る。 同等物 当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認 識し、常例的実験を用いて確認することができるであろう。かかる同等物は、後 記の請求の範囲に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドの実質的に純粋な標品。 ２．ポリペプチドがＥ６結合モチーフに対応するアミノ酸配列を含む、請求項１ に記載の標品。 ３．ポリペプチドが完全長のＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の２５〜２００アミノ酸残基 を含む、請求項２に記載の標品。 ４．ポリペプチドが完全長のＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の２５〜１００アミノ酸残基 を含む、請求項２に記載の標品。 ５．ポリペプチドがSEQ ID NO:８のＭｅｔ９９〜Ｌｅｕ３１７に対応するアミノ 酸配列を含む、請求項２に記載の標品。 ６．Ｅ６結合モチーフがSEQ ID NO:８のＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８又はそれに 相同な配列を含む、請求項２に記載の標品。 ７．ポリペプチドが２，５００〜７，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、 請求項１に記載の標品。 ８．ポリペプチドが２，７５０〜５，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、 請求項１に記載の標品。 ９．ポリペプチドが約３，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１に記載の 標品。 １０．一般式Ｘ−Ｙ−Ｚにより表されるキメラポリペプチド（式中、Ｙは、少な くともSEQ ID NO:８の残基１９４〜２１８を含むＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチド配 列又はそれに相同な蛋白質の対応するＥ６結合モチーフを表し、Ｘ及びＺは、別 々に、存在しないか又はＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質に無関係のアミノ酸配列を有する ポリペプチドを表す）。 １１．ＹがSEQ ID NO:８のＭｅｔ〜Ｌｅｕ３１７に対応するアミノ酸配列を含む 、請求項１０に記載のポリペプチド。 １２．Ｙが本質的にＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の２５〜１００アミノ酸残基断片より なる、請求項１０に記載のポリペプチド。 １３．Ｙが本質的にＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の２５〜５０アミノ酸残基断片よりな る、請求項１０に記載のポリペプチド。 １４．ポリペプチドが２，７５０〜５，０００ダルトンの範囲の分子量を有する 、請求項１０に記載のポリペプチド。 １５．ポリペプチドが約３０００ダルトンの分子量を有する、請求項１０に記載 のポリペプチド。 １６．SEQ ID NO:８のＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８に対応するＥ６結合モチーフ を含む組換えポリペプチド。 １７．組換えポリペプチドがパビローマウイルスＥ６蛋白質に結合する、請求項 １４に記載の組換えポリペプチド。 １８．組換えポリペプチドがSEQ ID NO:８のＭｅｔ９９〜Ｌｅｕ３１７に対応す るアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。 １９．組換えポリペプチドが融合蛋白質である、請求項１４に記載の組換えポリ ペプチド。 ２０．組換えポリペプチドが本質的にＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の２５〜１００アミ ノ酸残基断片よりなる、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。 ２１．組換えポリペプチドが本質的にＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の２５〜５０アミノ 酸残基断片よりなる、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。 ２２．組換えポリペプチドが２，５００〜７，０００ダルトンの範囲の分子量を 有する、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。 ２３．SEQ ID NO：１に示した核酸配列に厳しい条件下でハイブリダイズする核 酸によりコードされる単離された又は組換えＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドであっ て、Ｅ６結合モチーフを含む該ポリペプチド。 ２４．哺乳動物起源のＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドをコードする単離された核酸 であって、SEQ ID NO:１により示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする ヌクレオチド配列又はそれに相補的な配列を含む上記の核酸。 ２５．Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドがＥ６結合モチーフに対応するアミノ酸配列 を含む、請求項２４に記載の核酸。 ２６．Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドが完全長Ｅ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の２５〜２０ ０アミノ酸残基を含む、請求項２４に記載の核酸。 ２７．Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドが完全長Ｅ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の２５〜１０ ０アミノ酸残基を含む、請求項２４に記載の核酸。 ２８．Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドがSEQ ID NO:８のＭｅｔ９９〜Ｌｅｕ３１７ に対応するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の核酸。 ２９．SEQ ID NO:８のＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８又はそれに相同な配列を含む 、請求項２５に記載の核酸。 ３０．Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドが２，５００〜７，０００ダルトンの範囲の 分子量を有する、請求項２４に記載の核酸。 ３１．Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドが一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｙは、少なくと もSEQ ID NO:８の残基１９４〜２１８を含むＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチド配列又 はそれに相同な蛋白質の対応するＥ６結合モチーフを表し、Ｘ及びＺは、別々に 、存在しないか又はＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質に無関係のアミノ酸配列を有するポリ ペプチドを表す）により表されるキメラポリペプチドである、請求項２４に記載 の核酸。 ３２．核酸が、Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドを組換えにより生成するための発現 ベクターの部分として与えられる、請求項２４に記載の核酸。 ３３．SEQ ID NO:１に示されたＥ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチド又はそれに相同な配 列をコードする単離された核酸。 ３４．Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチド配列が、SEQ ID NO:８の少なくとも残基１９ ４〜２１８又はそれらに相同な蛋白質の対応するＥ６結合モチーフを含む、請求 項３３に記載の核酸。 ３５．SEQ ID NO:１により表されるＥ６−ＢＰ^SD-7核酸又はそれに相補的な配列 に厳しい条件下で選択的にハイブリダイズする単離された核酸であって、該プロ ーブがＥ６−ＢＰ^SD-7核酸配列を特異的に検出することができる、上記の単離さ れた核酸。 ３６．核酸が標識されている、請求項３５に記載の核酸プローブ。 ３７．標識を、放射性標識、蛍光標識、酵素標識及び結合対メンバーよりなる群 から選択する、請求項３６に記載の標識された核酸プローブ。 ３８．請求項３２に記載のベクターを用いてトランスフェクトされた宿主 細胞。 ３９．試験化合物を、Ｅ６−ＢＰ^SD-7ポリペプチドのパピローマウイルスＥ６蛋 白質との結合の調節についてスクリーニングするためのアッセイであって、下記 を含む該アッセイ： ｉ． Ｅ６蛋白質、Ｅ６結合蛋白質及び試験化合物を含む反応混合物を形成し（ このＥ６結合蛋白質は、SEQ ID NO:８のＡｌａ１９４〜Ａｓｐ２１８に対応する Ｅ６結合モチーフを含む）；そして ii． Ｅ６蛋白質及び細胞性標的蛋白質を含む複合体の形成を検出し、試験化合 物の存在下における複合体の形成の統計的に有意の変化は、Ｅ６とＥ６結合蛋白 質との間の相互作用の調節を示す。 ４０．反応混合物が細胞溶解物である、請求項３９に記載の方法。 ４１．反応混合物が無細胞反応混合物である、請求項３９に記載の方法。 ４２．反応混合物が２ハイブリッドアッセイである、請求項３９に記載の方法。 ４３．Ｅ６結合蛋白質が組換え蛋白質である、請求項３９に記載の方法。 ４４．Ｅ６結合蛋白質及びＥ６蛋白質の少なくとも１つが融合蛋白質である、請 求項３９に記載の方法。 ４５．製薬上許容し得るキャリアー及び請求項１に記載のポリペプチドを真核細 胞の望ましくない増殖又は分化を阻止するのに十分な量で含む医薬製剤。 ４６．製剤がパピローマウイルス感染した又はトランスフォームされた上皮細胞 への局所適用に適している、請求項４５に記載の医薬製剤。 ４７．パピローマウイルス感染を有する動物を治療する方法であって、ウイルス 性Ｅ６蛋白質とSEQ ID NO:８により示された細胞性Ｅ６−ＢＰ^SD-7蛋白質との間 の相互作用を破壊することのできる薬剤の治療上有効な量を投与することを含む 、上記の方法。 ４８．薬剤が、Ｅ６結合モチーフを含み且つＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質によるＥ６へ の結合を阻止するＥ６−ＢＰ^SD-7蛋白質の断片である、請求項４７に記載の方法 。