JPH09508263A - ユビキチン結合性酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｐ５３、ｐ２７、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ＭＡＴα２またはサイクリンのような、細胞−周期調節タンパク質のユビキチン−媒介分解を阻害することができる候補薬剤を同定するための、系統的かつ実際的方法を提供するドラッグスクリーニングアッセイに関する。本発明はさらに、新規なユビキチン−結合性酵素に関し、ならびにさらにそれに関連する使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ユビキチン結合性酵素 発明の背景 ユビキチン−媒介タンパク質溶解系は、真核細胞中の細胞内タンパク質の選択 的な制御された分解に関する主経路である。細胞中の様々なタンパク質標的のユ ビキチン修飾は、遺伝子発現の調節、細胞−周期の調節、細胞表面レセプターの 修飾、リボソームの生物発生およびＤＮＡ修復のような多くの基本的な細胞機能 に重要であると思われる。ユビキチン−媒介系の１つの主要な機能は、細胞タン パク質の半減期を制御することである。様々なタンパク質の半減期は数分から数 日の範囲であり、そして細胞の種類、栄養および環境的条件、ならびに細胞−周 期の段階にかなり依存する。 恐らくユビキチン−依存性プロテオソームの作用を通して、選択的な分解を受 けている標的タンパク質は、ユビキチンのＣ−末端グリシル残基と基質タンパク 質の特異的なリシル残基との間のイソペプチド結合の形成を介してユビキチンで 共有的に標識されている。この工程は、ユビキチン−活性化酵素（Ｅ１）および ユビキチン−結合性酵素（Ｅ２）によって触媒され、そして場合によって補助基 質である認識タンパク質（Ｅ３ｓ）も必要であるかもしれない。第一のユビキチ ン鎖の連結後、ユビキチンの更なる分子がすでに結合したリシン側鎖の部分に付 いて、分枝した多−ユビキチン鎖を形成する。 ユビキチンのタンパク質基質への結合は、多−段階工程である。最初のＡＴＰ 要求段階では、チオエステルがユビキチンのＣ−末端とＥ１酵素の内部システイ ン残基との間に形成される。活性化されたユビキチン は次に数種のＥ２酵素の１つの特異的なシステインに転移される。最後にこれら のＥ２酵素がユビキチンをタンパク質基質に渡す。基質はユビキチン−結合性酵 素または結合している基質認識タンパク質、Ｅ３タンパク質（ユビキチンリガー ゼとしても知られている）のいずれかにより直接的に、認識される。 ユビキチンはそれ自体がユビキチン化の基質である。ユビキチン−結合性酵素 および基質の性質に依存して、ユビキチンの特異的なリシン残基が、さらにユビ キチン化のアクセプター部位として使用される。これは直線の多−ユビキチン鎖 （ユビキチンの単一リシン残基が使用されるとき）、または多−ユビキチン“ツ リー(tree)”（ユビキチンの２つ以上のリシン残基が使用されるとき）のいずれ かを導くことができる。単一のユビキチン部分の基質への付加は分解に十分であ るが、多−ユビキチン化(multi-ubiquitination)がほとんどの場合に必要とされ るようである。 細胞−周期の進行を制御する多くのタンパク質が短命である。例えば、発癌遺 伝子および抗−発癌タンパク質の調節は、タンパク質発現の定常−状態レベルの 決定において重要な役割を果たし、そしてタンパク質分解における変化は転写お よび／または翻訳における変化のように、細胞の増殖阻止または場合によっては 細胞の形質転換を引き起こす。 例えば、ｐ５３タンパク質は哺乳類細胞成長の鍵となるレギュレーターであり 、そしてその遺伝子は広範なヒト腫瘍中で突然変異することが多い(Hollsteinら 、(1991)Science 253:49-53)。さらに、多くのＤＮＡ腫瘍ウイルスがｐ５３を不 活性化するウイルス抗原をコードする(例えば、Vogelsteinら、(1992)Cell 70:5 23-526を参照にされたい)。Ｈ ＰＶ−１６および−１８のような高危険性ヒトパピローマウイルスは、頚部癌腫 の病因に深くかかわっている(zur Hansenら、(1991)Science 254:1167-1173)。 これらのウイルスは２つの形質転換タンパク質Ｅ６およびＥ７をコードし、これ らはそれぞれ細胞成長レギュレーターｐ５３およびｐＲｂを標的とする。Ｅ６に よるｐ５３の不活性化様式は、明らかにユビキチン−依存性経路により媒介され る。ウイルスＥ６および細胞性Ｅ６−結合タンパク質（Ｅ６ＡＰ）は組合わさっ てｐ５３のユビキチン化を刺激し、すなわちｐ５３の分解を標的とする(Scheffn erら、(1990)Cell 63:1129-1136)。この反応において、Ｅ６およびＥ６ＡＰはユ ビキチンリガーゼまたはＥ３−様活性を提供すると考えられる(Scheffnerら、(1 993)Cell 75:495-505)。しかし、ｐ５３ユビキチン化に関与するユビキチン−結 合性酵素（Ｅ２）は、これまでに特性が明らかにされていない。 発明の要約 本発明は新規ユビキチン結合性酵素(今後UBC's、例えばUbCE'sまたはrapUBC) の知見に関する。 本発明の１つの観点は、真核細胞、特にヒト細胞および特定の酵母細胞中の新 規ユビキチン結合性酵素の知見に関する(今後“UbCE”と呼ぶ)。ヒト細胞中で、 この酵素は細胞チェック調節タンパク質(cell check regulatory protein)、例 えばｐ５３のユビキチン化を媒介するように機能でき、したがって細胞周期の進 行、例えば細胞成長の調節に関与する。 本発明の別の観点では、ヒト細胞中の新規ユビキチン結合性酵素(rapUBC)の知 見に関し、これはこの酵素のFKBP/ラパマイシン複合体に結合する能力に基づき 見いだされた。この酵素は細胞チェック調節タンパク 質、例えばｐ５３のユビキチン化を媒介するように機能でき、したがって真核細 胞周期の進行、例えば細胞成長の調節に関与する。 本発明の別の観点は、実質的に純粋なヒトUbCEポリペプチド(“hUbCE”)また はその断片の調製が特徴であり、これはユビキチン結合性酵素として機能できる 。好適な態様において；ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも ９０％相同的なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは配列番号２のアミノ酸 配列に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは配列 番号２のアミノ酸配列に少なくとも９７％相同的なアミノ酸配列を有し：このポ リペプチドは配列番号２のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。好適な 態様では、この断片は配列番号２の少なくとも５個の連続的アミノ酸残基を含ん で成り；この断片は配列番号２の少なくとも２０個の連続的アミノ酸残基を含ん で成り；この断片は配列番号２の少なくとも５０個の連続的アミノ酸残基を含ん で成る。好適な態様では、この断片は少なくともアミノ酸残基Cys-107からMet-1 47の部分、例えば５個のアミノ酸残基、例えば１５個のアミノ酸残基、例えば２ ５個のアミノ酸残基を含んで成る。 本発明の別の観点では、実質的に純粋なカンジダ(Candida)UbCEポリペプチド( “caUbCE”)またはその断片の調製が特徴であり、これはユビキチン結合性酵素 として機能できる。好適な態様において；ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸 配列に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは配列 番号４のアミノ酸配列に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列を有し；このポ リペプチドは配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも９７％相同的なアミノ酸配 列を有し；このポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列 を有する。 好適な態様では、この断片は配列番号４の少なくとも５個の連続的アミノ酸残基 を含んで成り；この断片は配列番号４の少なくとも２０個の連続的アミノ酸残基 を含んで成り；この断片は配列番号４の少なくとも５０個の連続的アミノ酸残基 を含んで成る。好適な態様では、この断片は少なくともアミノ酸残基Cys-107か らVal-147の部分、例えば５個のアミノ酸残基、例えば１５個のアミノ酸残基、 例えば２５個のアミノ酸残基を含んで成る。 本発明の別の観点では、実質的に純粋なシゾサッカロミセス(Schizosaccharom yces ）UbCEポリペプチド(“spUbCE”)またはその断片の調製が特徴であり、これ はユビキチン結合性酵素として機能できる。好適な態様において；ポリペプチド は配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有し； このポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも９５％相同的なアミ ノ酸配列を有し；このポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも９ ７％相同的なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは配列番号６の配列と同一 のアミノ酸配列を有する。好適な態様では、この断片は配列番号６の少なくとも ５個の連続的アミノ酸残基を含んで成り；この断片は配列番号６の少なくとも２ ０個の連続的アミノ酸残基を含んで成り；この断片は配列番号６の少なくとも５ ０個の連続的アミノ酸残基を含んで成る。好適な態様では、この断片は少なくと もアミノ酸残基Cys-107からIle-147の部分、例えば５個アミノ酸残基、例えば１ ５個アミノ酸残基、例えば２５個アミノ酸残基を含んで成る。 本発明の別の観点では、実質的に純粋なヒトUBCポリペプチド(“rapUBC”)ま たはその断片の調製が特徴であり、これはユビキチン結合性酵素 として機能できる。好適な態様において；ポリペプチドは配列番号１３のアミノ 酸配列に少なくとも90％相同的なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは配列 番号１３のアミノ酸配列に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列を有し；この ポリペプチドは配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも９７％相同的なアミノ 酸配列を有し；このポリペプチドは配列番号１３のアミノ酸配列と同一のアミノ 酸配列を有する。好適な態様では、この断片は配列番号１３の少なくとも５個の 連続的アミノ酸残基を含んで成り；この断片は配列番号１３の少なくとも２０個 の連続的アミノ酸残基を含んで成り；この断片は配列番号１３の少なくとも５０ 個の連続的アミノ酸残基を含んで成る。 本発明の別の観点は、細胞−周期調節のアゴニストまたは細胞−周期調節のア ンタゴニストのいずれか１つとして機能するhUbCEポリペプチドが特徴である。 好適な態様ではhUbCEポリペプチドは、例えば正常細胞中、例えば正常な増殖細 胞中、例えばウイルスが感染した細胞中、例えばパピローマウイルスが感染した 細胞中、例えばＨＰＶ−ウイルスが感染した細胞中、例えばＨＰＶ−１６、ＨＰ Ｖ−１８、ＨＰＶ−３１またはＨＰＶ３３感染細胞中、例えばパピローマウイル スＥ６タンパク質を発現している細胞中、例えば形質転換した細胞中、例えば癌 性細胞中で；細胞タンパク質、例えば細胞−周期調節タンパク質、例えばｐ５３ のユビキチン化を媒介する能力を有し；細胞タンパク質、例えば細胞−周期調節 タンパク質、例えばｐ５３のユビキチン−依存性分解を媒介する能力を有し；細 胞−周期調節タンパク質、例えば細胞−周期チェックポイントタンパク質、例え ばｐ５３の細胞の半減期に影響を与える能力を有する。生物活性はさらに、ユビ キチンを結合そして共役する能力、 ならびに結合そしてユビキチンをＥ６ＡＰに転移させる能力も含む。 本発明の別の観点は、細胞−周期調節のアゴニストまたは細胞−周期調節のア ンタゴニストのいずれか１つとして機能するrapUBCポリペプチドが特徴である。 好適な態様ではrapUBCポリペプチドは、例えば正常細胞中、例えば癌性細胞中、 FKBP/ラパマイシン複合体を結合する能力、細胞性タンパク質、例えば細胞−周 期調節タンパク質、例えばｐ５３またはｐ２７のユビキチン化を媒介する能力； 細胞性タンパク質、例えば細胞−周期調節タンパク質、例えばｐ５３のユビキチ ン−依存性分解を媒介する能力；細胞−周期調節タンパク質、例えば細胞−周期 チェックポイントタンパク質、例えばｐ５３の細胞性半減期に影響を及ぼす能力 を有する。ラパマイシンが細胞−周期でＧ１期中に遮断すると、恐らく本rapUBC 酵素の生物活性の範囲に、特定の細胞周期調節タンパク質、特に比較的短命のタ ンパク質(例えば、30分から2時間のオーダーの半減期を有するタンパク質)の半 減期の制御が含まれるのだろう。例えば本rapUBCは、例えばｐ５３、ｐ２７、ｍ ｙｃおよび／またはサイクリンのユビキチン化を媒介する能力を有し、それゆえ に増殖している細胞中の細胞−周期調節タンパク質の細胞性半減期に影響を及ぼ す。rapUBCのFKBP/ラパマイシン複合体への結合は、酵素をその基質タンパク質 から隔離する。したがってラパマイシンは、細胞性ｐ５３レベルが上昇して次に Ｇ１期の進行を阻害する様式でｐ５３のユビキチン−媒介分解を妨害することが できる。 本発明のさらに別の観点は、UBCポリペプチドまたはその断片を免疫原性調製 物中に含んで成る免疫原に関し、免疫原はUBCポリペプチドに特異的な免疫反応 ；例えば体液性反応、例えば抗体反応；例えば細胞性 反応を引き出すことができる。 さらに本発明の観点は、UBC免疫原のエピトープと特異的に反応する（例えばr apUBCとの反応性、例えばhUbCEとの反応性、例えばcaUbCとの反応性、例えばspU bCEとの反応性）抗体調製物が特徴である。 本発明の別の観点は、組換えhUbCEポリペプチドまたはその断片が特徴であり 、好ましくは配列番号２に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列；配列番号２ に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列；配列番号２に少なくとも９７％相同 的なアミノ酸配列を有する。好適な態様では、組換えhUbCEタンパク質は、細胞 周期調節のアゴニストまたは細胞周期調節のアンタゴニストのいずれか1つとし て機能する。より好適な態様では、例えば正常細胞中、例えば正常な増殖細胞中 、例えばウイルスが感染した細胞中、例えばパピローマウイルスが感染した細胞 中、例えばＨＰＶ−ウイルスが感染した細胞中、例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ− １８、ＨＰＶ−３１またはＨＰＶ３３感染細胞中、例えばパピローマウイルスＥ ６タンパク質を発現している細胞中、例えば形質転換した細胞中、例えば癌性細 胞中で；hUbCEポリペプチドは細胞タンパク質、例えば細胞−周期調節タンパク 質、例えばｐ５３のユビキチン化を媒介し；hUbCEポリペプチドは細胞タンパク 質、例えば細胞−周期調節タンパク質、例えばｐ５３のユビキチン−依存性分解 を媒介し；hUbCEポリペプチドは細胞−タンパク質、例えば細胞−周期調節タン パク質、例えば細胞−周期チェックポイントタンパク質、例えばｐ５３の細胞性 半減期に影響を与える。 本発明の別の観点は、組換えcaUbCEポリペプチドまたはその断片が特徴であり 、好ましくは配列番号４に少なくとも９０％相同的なアミノ酸 配列；配列番号４に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列；配列番号４に少な くとも９７％相同的なアミノ酸配列を有する。好適な態様では、組換えcaUbCEタ ンパク質は、細胞周期調節のアゴニストまたは細胞周期調節のアンタゴニストの いずれか1つとして機能する。より好適な態様では、caUbCEポリペプチドはカン ジタ(candida)細胞の細胞性タンパク質のユビキチン化を媒介する。 本発明の別の観点は、組換えspUbCEポリペプチドまたはその断片が特徴であり 、好ましくは配列番号６に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列；配列番号６ に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列；配列番号６に少なくとも９７％相同 的なアミノ酸配列を有する。好適な態様では、組換えspUbCEタンパク質は、細胞 周期調節のアゴニストまたは細胞周期調節のアンタゴニストのいずれか1つとし て機能する。より好適な態様では、spUbCEポリペプチドはシゾサッカロミセス(S chizosaccharomyces )細胞の細胞性タンパク質のユビキチン化を媒介する。 本発明の別の観点は、組換えrapUBCポリペプチドまたはその断片が特徴であり 、好ましくは配列番号１３に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列；配列番号 １３に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列；配列番号１３に少なくとも９７ ％相同的なアミノ酸配列を有する。好適な態様では、組換えrapUBCタンパク質は 、細胞周期調節のアゴニストまたは細胞周期調節のアンタゴニストのいずれか1 つとして機能する。より好適な態様では、例えば正常細胞中、例えば癌性細胞中 で、rapUBCポリペプチドは細胞タンパク質、例えば細胞-周期調節タンパク質、 ｐ５３のユビキチン化を媒介し；rapUBCポリペプチドは細胞タンパク質、例えば 細胞−周期調節タンパク質、例えばｐ５３のユビキチン−依存性分解を 媒介し；rapUBCポリペプチドは細胞−周期調節タンパク質、例えば細胞−周期チ ェックポイントタンパク質、例えばｐ５３の細胞性−半減期に影響を与える。 さらに別の好適態様では、組換えＵＢＣタンパク質は、さらに配列番号２、４ 、６または１３のタンパク質に関連しないタンパク質に由来するアミノ酸配列を 有する第二ポリペプチド部分を含んで成る融合タンパク質である。そのような融 合タンパク質は２−ハイブリッドアッセイにおいて機能的であることができる。 本発明の別の観点は、配列番号２と少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を 有するhUbCEポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質的に純粋 な核酸またはその断片を提供する。より好適な態様において；核酸は配列番号２ に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列を有るタンパク質をコードし；そして より好ましくは配列番号２に少なくとも９７％相同的である。この核酸は好まし くは：例えば正常細胞中、例えば正常な増殖細胞中、例えばウイルスが感染した 細胞中、例えばパピローマウイルスが感染した細胞中、例えばＨＰＶ−感染細胞 中、例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１またはＨＰＶ３３感染細 胞中、例えばパピローマウイルスＥ６タンパク質を発現している細胞中、例えば 形質転換した細胞中、例えば癌性細胞中で、細胞タンパク質、例えば細胞−周期 調節タンパク質、例えばｐ５３のユビキチン化を媒介するhUbCEポリペプチドを コードし；細胞−周期調節タンパク質、例えば細胞-周期チェックポイントタン パク質、例えばｐ５３の細胞性半減期に影響を及ぼすhUbCEポリペプチドをコー ドする。 本発明の別の観点は、配列番号４と少なくとも９０％相同的なアミノ 酸配列を有するcaUbCEポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質 的に純粋な核酸またはその断片を提供する。より好適な態様において；核酸は配 列番号４に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列を有るタンパク質をコードし ；そしてより好ましくは配列番号４に少なくとも９７％相同的である。 本発明の別の観点は、配列番号４と少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を 有するspUbCEポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質的に純粋 な核酸またはその断片を提供する。より好適な態様において；核酸は配列番号４ に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列を有るタンパク質をコードし；そして より好ましくは配列番号４に少なくとも９７％相同的である。 本発明の別の観点は、配列番号１３と少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列 を有するrapUBCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質的に純 粋な核酸またはその断片を提供する。より好適な態様において；核酸は配列番号 １３に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列を有るタンパク質をコードし；そ してより好ましくは配列番号１３に少なくとも９７％相同的である。この核酸は 好ましくは：例えば正常細胞中、例えば癌性細胞中で、細胞タンパク質、例えば 細胞−周期調節タンパク質、例えばｐ５３のユビキチン化を媒介するrapUBCポリ ペプチドをコードし；細胞タンパク質、例えばｐ５３のユビキチン−依存性分解 を媒介するrapUBCポリペプチドをコードし；細胞−周期調節タンパク質、例えば 細胞-周期チェックポイントタンパク質、例えばｐ５３の細胞性半減期に影響を 及ぼすrapUBCポリペプチドをコードする。 さらに一層好適な態様では、本発明のＵＢＣポリペプチドをコードす る核酸、またはその断片は、ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５ま たは１２の１つの少なくとも１２個の連続的ヌクレオチド；より好ましくは該配 列の少なくとも２０個の連続的ヌクレオチド；さらに好ましくは少なくとも４０ 個の連続的ヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする。さらに 一層好適な態様では、UbCEコード核酸は、配列番号２、４、または６の残基１０ ７と１４７との間の少なくとも４個の連続的アミノ酸、好ましくは少なくとも１ ０個の連続的アミノ酸残基、そしてさらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ 酸残基をコードするサブ配列に対応する核酸プローブとハイブリダイズする。さ らに一層好適な態様では、この核酸はCys-107からCys-111を含むhUbCEポリペプ チドをコードする。 さらに、一定の好適態様では、ＵＢＣコード核酸は、ＵＢＣ遺伝子配列を発現 ベクターとして使用するのに適するようにするために、ＵＢＣ遺伝子配列に操作 可能に連結した転写調節配列、例えば少なくとも１つの転写プロモーターまたは 転写エンハンサー配列を含んで成る。１つの態様では、ＵＢＣ遺伝子はセンス構 築物として提供される。別の態様では、ＵＢＣ遺伝子はアンチ−センス構築物と して提供される。 本発明は、例えば例えばヒトに由来するヘテロロガスなhUbCEまたはrapUBC遺 伝子を発現するか、あるいはそれらが所有する問題のヒト遺伝子の相同物の誤発 現する(例えば、マウスhUbCEまたはrapUBCの発現が破壊されている)、いずれか であるトランスジェニック非−ヒト動物マ（例えばウスが）特徴である。そのよ うなトランスジェニック動物は、突然変異した、または誤−発現したhUbCEまた はrapUBC対立遺伝子を含んで成る細胞性疾患の研究のための動物モデルとして役 立つ。 また本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んで成るプローブ ／プライマーも提供し、ここでオリゴヌクレオチドはストリンジェントな条件下 で、配列番号１または配列番号１２のセンスまたはアンチセンス配列の少なくと も１０個の連結ヌクレオチドまたは天然に存在するその突然変異体とハイブリダ イズするヌクレオチド配列の領域を含んで成る。好適な態様では、プローブ／プ ライマーはさらに、それに付いた標識基を含んで成り、そして例えばその標識基 は放射性同位体、蛍光化合物、酵素および酵素コファクターから選択されて検出 されることができる。そのようなプローブは、例えば患者から単離された細胞試 料中のhUbCEまたはrapUBC核酸のレベルを測定する；例えば細胞中のhUbCEまたは rapUBC mRNAレベルを測定する；例えばゲノムhUbCEまたはrapUBC遺伝子が突然変 異しているか、または欠失しているかを決定するために、形質転換した細胞を同 定するための診断試験キットの一部として使用できる。 また本発明は、野生型ｐ５３機能の欠失が特徴の望ましくない細胞増殖を有す る動物を治療する方法を提供し、この方法は本hUbCEまたはrapUBCタンパク質の ユビキチン結合活性を阻害できる治療に有効量の薬剤投与を含んで成る。 本発明はまた、望ましくない真菌感染を持つ動物を治療する方法を提供し、こ の方法は実質的にhUbCEタンパク質を阻害することなく、本caUbCEタンパク質ま たはspUBCタンパク質のような真菌のユビキチン−結合性酵素のユビキチン−結 合活性を阻害できる、治療に有効量の薬剤投与を含んで成る。 本発明の別の観点は、個体（例えばヒト患者）が望ましくない細胞増 殖が特徴である疾患に対して危険性があるかどうかを決定する方法を提供し、こ の方法は個体の組織中に少なくとも１つの（ｉ）配列番号２もしくは配列番号１ ３により表されるタンパク質をコードする遺伝子またはその相同物の突然変異； あるいは（ii）hUbCEまたはrapUBC遺伝子の誤−発現を特徴とする遺伝子損傷の 存在、また不在を検出することを含んで成る。好適な態様では、遺伝子損傷の検 出は、遺伝子由来の１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失の存在、遺 伝子への１つ以上のヌクレオチド付加、遺伝子の１つ以上のヌクレオチド置換、 遺伝子の大まかな染色体再配置、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルの大 まかな変化、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非−野生型スプライシングパ ターン、あるいはタンパク質の非−野生型レベルの存在を確認することを含んで 成る。例えば、遺伝子損傷の検出は、（ｉ）配列番号１もしくは配列番号１２、 またはその天然に存在する突然変異体のセンスまたはアンチセンス配列、あるい は遺伝子に自然に結合している５’または３’フランキング配列にハイブリダイ ズするヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含んで成るプローブ ／プライマー提供し；（ii）プローブ／プライマーを組織の核酸に暴露し；そし て（iii）プローブ／プライマーの核酸へのハイブリダイゼーションにより、遺 伝子損傷の存在または不在を検出することを含んで成ることができ；例えばここ で損傷の検出は、hUbCEまたはrapUBC遺伝子のヌクレオチド配列、場合によって はフランキング核酸配列を定めるためのプローブ／プライマーの使用を含んで成 り；例えばここで損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）におけるプロー ブ／プライマーの使用を含んで成り；例えばここで損傷の検出は、ライゲーショ ン連鎖反応（ＬＣＲ）における プローブ／プライマーの使用を含んで成る。別の態様では、タンパク質レベルを イムノアッセイで検出する。 また本発明は、ｐ５３、ｐ２７、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ＭＡＴα２またはサイクリ ンのような細胞−周期調節タンパク質のユビキチン−媒介分解を阻害できる候補 薬剤の系統的かつ実際的同定法を提供する。本発明の１つの観点は、細胞−周期 調節タンパク質のユビキチン−媒介タンパク質溶解のインヒビターを同定する方 法に関し、該方法は（ｉ）標的タンパク質のユビキチン化を促進する条件下で、 調節タンパク質およびユビキチンを含むユビキチン結合系を提供し、そして（ii ）この系にもたらされた本タンパク質のユビキチン化のレベルを、候補薬剤の存 在または不在下で測定することによる。ユビキチン結合のレベルの低下は、候補 薬剤の阻害活性を示している。調節タンパク質のユビキチン化のレベルは、実際 のタンパク質濃度を決定すること；形成したユビキチン結合物により測定される か；あるいはこのタンパク質のタンパク質溶解的分解を含む、ユビキチン化によ り影響を受けた本タンパク質の他の性質を検出することにより示される。特定の 態様では、本アッセイは調節タンパク質をユビキチン−媒介タンパク質溶解経路 の少なくとも一部を通すことができる細胞のような、インビボユビキチン−結合 系を含んで成る。他の態様では、本アッセイは、中で少なくともユビキチンを調 節タンパク質へ転移させる能力が構成される再構成されたタンパク質混合物を含 んで成るインビトロユビキチン−−結合系を含んで成る。さらに、本アッセイは 、タンパク質のタンパク質溶解を強化あるいは変化させることにより、感染細胞 中の調節タンパク質のレベルに影響を与える、高−危険度ＨＰＶｓのＥ６タンパ ク質のようなウイルス発癌タンパク質を含む、 ユビキチン−媒介分解のレベルに影響する補助タンパク質を含んで成ることがで きる。 さらに本発明の別の観点は、本ＵＢＣタンパク質の三次元分子モデル、および ユビキチン結合性酵素の少なくとも１つの生物活性を阻害できる薬剤を設計する ためのテンプレートとしてのその使用に関する。好適な態様では、この分子モデ ルは合理的なドラッグデザインによりファマコフォア(pharmacophore)を設計す るために使用でき；それは例えば、本hUbCEまたはrapUBCタンパク質とユビキチ ンの任意の１つ、Ｅ１酵素、Ｅ６またはＥ６ＡＰのようなＥ３タンパク質（１つ または複数）、あるいはｐ５３のような、酵素の下流標的との結合を阻害するこ とができる薬剤である。 例えば、本発明の１つの観点は、分子モデリングにより本ユビキチン−結合性 酵素のインヒビターを同定するための方法に関する。一般的に、この方法は活性 部位のような酵素の分子モデル、ならびに候補薬剤の分子モデルを提供すること を含んで成る。薬剤モデルはＵＢＣモデルとドッキングし、そしてドッキングし たモデルの結合基準、例えば静電的相互作用、水素結合、疎水的相互作用、脱溶 媒和効果、リガンドおよび酵素の共同的挙動が決定される。特定の候補薬剤の結 合基準に基づき、本ＵＢＣのインヒビターである候補薬剤の可能性を決定できる 。すなわち本方法は、候補薬剤を設計するために使用でき、これは例えば化学合 成により、または市販されているものから得られたとき、候補薬剤の実際の阻害 活性を決定するために、本発明のヒトユビキチン−結合性酵素を用いたアッセイ に提供され得る。好適な態様では、hUbCEモデルはアミノ酸残基Cys-85、Leu-86 、Asp-87、Ile-88、Arg-90、Ser-91、Leu-109、A sn-114、Asp-116およびAsp-117を含み、これらの残基の原子配位は、300°Kで、 全ＲＭＳを第２図に表す原子配位の２Å以内に有し、より好ましくは全ＲＭＳを １Å内に、最も好ましくは全ＲＭＳを0.5Å以内に有する。さらに、hUbCEモデル は配列番号２のArg-5からMet-147のアミノ酸残基を含むことができる。好適な態 様では、これら各残基のＣ-α炭素に関する原子配位は、300°Kで、全ＲＭＳを 第１図に示すＣ-α炭素配位の２Å内に有し、より好ましくは全ＲＭＳを１Å内 に、最も好ましくは全ＲＭＳを0.5Å以内に有する。さらにhUbCEモデルは、配列 番号２のArg-5からMet-147の各アミノ酸残基に関する原子配位を含むことができ る。好適態様では、これら各残基の原子配位は、300°Kで、全ＲＭＳを第１図に 表すようなＣ-α原子配位の２Å以内に、さらに好ましくは全ＲＭＳを１Å以内 、最も好ましくは全ＲＭＳを0.5Å以内に有する。 さらに本発明の観点は、入手可能な電気的記憶手段、例えばＲＡＭまたはＲＯ Ｍ記憶、磁気ディスクデバイス、光保存デバイスに関し、その中にＵＢＣ酵素の 分子モデルの原子配位の入手可能な電気的表示が保存されている。好適な態様で は、hUbCEモデルはアミノ酸残基Cys-85、Leu-86、Asp-87、Ile-88、Arg-90、Ser -91、Leu-109、Asn-114、Asp-116およびAsp-117を含んで成り、これらの残基の 原子配位は、300°Kで、全ＲＭＳを第２図に表す原子配位の２Å以内に有する。 別の態様では、ヒトユビキチン−結合性酵素モデルは配列番号２のアミノ酸残基 Arg-5からMet-147を含んで成り、残基の原子配位は、300°Kで、全ＲＭＳを第１ 図に示す原子配位の２Å以内に有する。 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明ら かになるだろう。 本発明の実施には、特に言及しないかぎり、細胞生物学、細胞培養、分子生物 学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技 術を採用し、これらは当該技術分野の中にある。そのような技術は豊富に文献に 記載されている。例えば、モレキュラークローニング ア ラボラトリーマニュア ル(Molecular Cloning A Laboratory Manual)第２版、Sambrook、Fritschおよび Maniatis編集(コールドスプリングハーバーラボラトリー出版:1989:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)第ＩおよびII巻 （D.N.Glover編集、1985）；オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthes is )(M.J.Gait編集、1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号明細書；核酸ハイ ブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames & S.J.Higgins編 集、1984)；転写および翻訳(Transcription And Translation)(B.D.Hames & S.J .Higgins編集、1984)；動物細胞培養（Culture of Animal Cells）(R.I.Freshne y,Alan R.Liss社、1987)；固定化細胞および酵素(Immobilized Cell And Enzyme s )(IRL出版、1986)；B.Perbal、分子クローニングの実践ガイド(A Practical Gu ide To Molecular Cloning )(1984)；論文 Methods in Enzymology（アカデミッ ク出版、N.Y.）；動物細胞のための遺伝子転移ベクター(Gene Transfer Vector For Mammalian Cell )(J.H.MillerおよびM.P.Calos編集、1987、コールドスプリ ングハーバーラボラトリー)；Methods in Enzymology、第154および155巻(Wuら 編集)、細胞および分子生物学における免疫化学的方法(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology )(MayerおよびWalker編集、アカデミック出版 、ロンドン、1987)；実験免疫学のハンドブック(Handbook Of Experimental Imm unology )、第Ｉ−IV巻(D.M. WeirおよびC.C.Blackwell編集、1986);マウス胚の操作(Manuipulating the Mous e Embryo )(コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリング ハーバー、N.Y.1986)。 図面の簡単な説明 第１図は、標準的ブルックヘブンタンパク質データバンク（pdb）フォーマッ トにおける、配列番号２のArg-5からMet-147に関する原子配位である。 第２図は、hUbCEの活性部位の残基を説明する枝図である。 第３図は、標準的ブルックヘブンタンパク質データバンク（pdb）フォーマッ トにおける、配列番号２のCys-85、Leu-86、Asp-87、Ile-88、Arg-90、Ser-91、 Leu-109、Asn-114、Asp-116およびAsp-117に関する原子配位である。 第５図は、hUbCE（“ヒト”）、spUbCE(“S ポンベ”)およびcaUbCE(“C アル ビカンス”)の整列した配列である。 第４図は、ドラッグデザインのＧＲＯＷ法操作の概略図である。部位および第 二配位ファイルおよびコマンドファイルは使用者によりＧＲＯＷ法に提供される 。成長は樹状法により視覚化され、この中で各ライブラリーテンプレートがシー ド（Ａ）に付加され、そして次に得点機能により評価される（例えば結合基準） 。生成した構築物の中で、最高点（例えば１０）の構築物の数を次のレベル（Ｂ ）に維持する。各々の保存されたモノペプチド／シード構築物に、全てのライブ ラリーテンプレートを付加し、これに再度得点をつける（Ｃ）。選別した後（Ｄ ）、特別なペプチド長に到達するまで（Ｆ）方法を繰り返す（Ｅ）。この樹状図 で、丸印はさらなる成長のために選択された（最高の結合基準評価に 基づく）これらの節点を表す。丸印を付していない節点は、取り除かれる。水平 の点はすべてのテンプレート付加（例えば一連の他の員）をわたって連続を示し 、そして垂直の点は木の成長の反復工程を表している。 第６図は、インビトロユビキチン化反応におけるｐ５３のhUbCE依存性ユビキ チン化を説明する。レーン６に表す完全なユビキチン化反応は、Ｅ１、hUbCE、 Ｅ６、Ｅ６ＡＰ、ｐ５３およびユビキチンを含んだ。レーン１−５では以下のよ うに変化させた：レーン１、Ｅ６無し、レーン２、Ｅ６ＡＰ無し、レーン３、hU bCEの代わりにＵＢＣ２、レーン４、Ｅ１無し、レーン５、ユビキチン無し。レ ーン７は野生型hUbCEを突然変異体hUbCE(Cys85→Ser)に交換する。 第７Ａ図は、Ｅ６ＡＰのユビキチン化を表す。ビオチン化ユビキチンを含むユ ビキチン化反応に、精製したタンパク質を使用した。レーン１、ユビキチン、レ ーン２、Ｅ１、ユビキチンおよびhUbCE、レーン３、Ｅ１、ユビキチンhUbCEおよ びＥ６ＡＰ、レーン４、Ｅ１、ユビキチン、hUbCE、Ｅ６ＡＰおよびＥ６、レー ン５、Ｅ１、hUbCE、Ｅ６ＡＰおよびＥ６、レーン６、ユビキチン、hUbCEおよび Ｅ６ＡＰ、レーン７、Ｅ１、ユビキチンおよびＥ６ＡＰ、レーン８、ユビキチン およびＥ６ＡＰ。 第７Ｂ図は、Ｅ６ＡＰのhUbCE−特異的ユビキチン化を示す。すべてのレーン はＥ１およびユビキチンに加えて以下のものを含んだ：レーン１、無し、レーン ２、hUbCE、レーン３、hUbCEおよびＥ６ＡＰ、レーン４、GST.UBC8、レーン５、 GST.UBC8およびＥ６ＡＰ、レーン６、GST.UBC2、レーン７、GST.UBC2およびＥ６ ＡＰ、レーン８、GST.epiUBC、レーン９、GST.epiUBCおよびＥ６ＡＰ。 第８図は、同時注入実験におけるＥ６刺激ｐ５３分解の阻害度を表す。 この示したＤＮＡをｐＸ．Ｅ６と共に注入した。Ｅ６刺激ｐ５３分解の阻害レベ ルは、少なくとも２回の別個の実験において、実験点あたり約１５０個の注入細 胞の分析から引き出す。 図１９は、マルチクローニング領域に、ＴＫプロモーターの上流に位置する３ または６個の一列に並んで配置された結合部位のいずれか（ｐ５３、ｍｙｃまた はｓＰ１結合部位のいずれか）を持つＴＫプロモーター配列を含むSalＩからBam HＩ断片を付加することにより、ｐＧＬ２−基本ベクター(プロメガ：promega、 カタログ番号E1641)から構築した例示的ルシフェラーゼレポーター構築物を表す 。 発明の詳細な記述 ユビキチン系は広範な細胞の現象に必須であり、そして成長調節、代謝調節、 組織分化および発生ならびに細胞−周期の進行を含む多くの生物学的調節メカニ ズムの成分である。 本発明は、細胞周期の進行の調節に関与するユビキチン−結合性酵素(UBC's) の発見に関する。 本発明の１つの観点は、ユビキチン−結合性酵素(“UbCE”)に関連する一族の 発見に関する。特にこの族の員が様々な真核細胞源からクローン化され、そして それには例えばヒトユビキチン−結合性酵素(“hUbCE”)、シー．アルビカン(C. albican )ユビキチン−結合性酵素(“caUbCE”)およびエス．ポンベ(S.pombe)ユ ビキチン−結合性酵素(“spUbCE”)を含む。ヒトhUbCE、シー．アルビカン(C.al bican )UbCEおよびエス．ポンベ(S.pombe)UbCEコーディング配列は、それぞれ配 列番号１、３および５に与えられている。対応するアミノ酸配列は、配列番号２ 、４および６に表される。 本発明の別の観点は、新規ヒトユビキチン−結合性酵素(”rapUBC”)の知見に 関する。rapUBCはそのFKBP／ラパマイシン複合体に結合できる能力に基づきクロ ーン化された。ヒトrapUBCコーディング配列は、配列番号１２に与えられている 。対応するアミノ酸配列は、配列番号１３に表される。 本発明のUBCE（例えばUbCEおよびrapUBC）タンパク質の生物学的活性は、遺伝 子発現の調節、細胞−周期の調節、細胞表面レセプターの修飾、リボソームの生 物発生およびＤＮＡ修復のような多くの基本的な細胞機能に明らかに重要である 。ユビキチン−媒介系におけるこれら酵素の外観上の機能は、様々なタンパク質 の細胞性半減期を制御することである。例えば実施例に示すように、hUbCEは細 胞−周期調節タンパク質、特にｐ５３のユビキチン−媒介不活性化に深くかかわ っている。一般的に知られているように、ｐ５３はＤＮＡ傷害の感知、またはス トレスに対する細胞性の応答の調節において、重要な役割を果たす。さらにｐ５ ３遺伝子中の損傷は広範な様々な増殖性疾患と関連することが示された。結局、 本発明はｐ５３の細胞の半減期を調節し、それにより例えば増殖性、細胞死なら びに化学療法およびＤＮＡ傷害源に対する感受性をモジュレートするために、有 力な分子標的、例えばhUbCEを同定することである。 したがって、本発明は例えば細胞の腫瘍形成性形質転換、または他の過形成的 もしくは新生物的形質転換過程から生じる増殖性疾患を検出および治療するため の、診断的および治療的アッセイ、試薬およびキットを利用できるようにする。 例えば本発明は形質転換した細胞を同定するために、複合体形成、および／また はhUbCEもしくはrapUBC発現レベルの変化、および／またはhUbCEもしくはrapUBC −遺伝子欠失または突然 変異を検出するための、抗体および核酸のような試薬を利用できるようにする。 さらに本発明は、本ＵＢＣタンパク質をコードする組換え遺伝子構築物を使用す る遺伝子治療により、またはＵＢＣと他の細胞性タンパク質との間の相互作用を 阻害または強化するペプチドミメティックス(peptidomimetics)を提供すること により、あるいは酵素の触媒活性の阻害剤を提供することにより、広範な異常な 細胞増殖状態の治療法を提供する。そのような方法はインビトロで細胞の形質転 換を調節するような、細胞および組織培養で使用することもできる。 同様に、本発明は酵母／真菌感染の検出および治療のための診断および治療も 可能とし、ここでそのような感染は動物（例えばヒト）あるいは非−生物体（例 えば食料または医学装置）で起こる。例えば、酵母の成長、接合および増殖に関 与するタンパク質の調節において、もし本UbCE、すなわちcaUbCEおよびspUbCEの 明らかな役割が与えられれば、本ユビキチン結合性酵素のインヒビターを、真菌 感染症を治療するために殺菌剤として、あるいは食料保存剤として使用できる。 便宜上、明細書、実施例および添付の請求の範囲で使用する特定の用語をここ に集める。 本発明で使用するように、用語“核酸”とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、お よび適当な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを言う。この 用語は、均等物として、ヌクレオチド類似体から作成されたＲＮＡまたはＤＮＡ のいずれかの類似体、そして記載された態様に応用できるように、一本（センス またはアンチセンス）あるいは二本−鎖ポリヌクレオチドを含むと理解される。 本発明で使用するように、用語“遺伝子”、“組換え遺伝子”および “遺伝子構築物”とは、本発明のUBCポリペプチドをコードする読み取り枠（エ キソンおよび（場合によっては）イントロン配列の両方も含む）を含んで成る核 酸を言う。好適な態様では、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。例示的な組換え 遺伝子は、配列番号２に表されるhUbCEタンパク質、配列番号４に表されるcaUbC Eタンパク質、配列番号６に表されるspUbCEタンパク質、または配列番号１３に 表されるrapUBCタンパク質の全部または触媒的に活性な部分をコードする核酸を 含む。用語“イントロン”は、タンパク質には翻訳されず、そして遺伝子にエキ ソン間に見いだされる上記UBC−遺伝子中に存在するＤＮＡ配列を言う。 用語“トランスフェクション”とは核酸−媒介遺伝子転移により、核酸、例え ば発現ベクターの受容細胞中への導入を言う。本発明で使用する“形質転換”と は、外来核酸の細胞性取り込みの結果として細胞の遺伝子型が変化するプロセス を言い、そして例えば形質転換した細胞は本ＵＢＣタンパク質の１つの組換え形 態を発現する。 “細胞”または“細胞培養”あるいは“組換え宿主細胞”または“宿主細胞” とは、本内容から明らかにしばしば互換的に使用される。これらの用語は本発明 のユビキチン−結合性酵素を発現する、直接の主題の細胞を含み、そしてもちろ ん、その子孫を含む。突然変異または環境の差異から、全ての子孫が親細胞に全 く同一ではないと考えられる。しかしそのように変化した子孫は、子孫が元の形 質転換した細胞に付与されものに匹敵する特徴を保持するかぎり、これらの用語 に含まれる。本発明の場合には、そのような特徴は組換えＵＢＣ−タンパク質を 生産する能力である。 本明細書に使用する用語“ベクター”は、別の核酸をそれが連結され るところへ移動させることができる核酸分子を言う。用語”発現ベクター”は、 ベクターにより運ばれるそれらの各組換え遺伝子によりコードされる本タンパク 質を合成できるプラスミド、コスミドまたはファージを含む。好適なベクターは 、自律的に複製でき、そして／それに連結された核酸を発現できるものである。 本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドが最も一 般的に使用されるベクターの形態であるので互換的に使用される。さらに、本発 明は均等の機能を果たし、そして当該技術分野でこれまでに知られている発現ベ クターの他の形態を含むものとする。 “転写調節配列”は、開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーター、なら びにポリアデニレーション部位（これらはそれらが操作可能に連結しているタン パク質コーディング配列の転写を誘導または制御する）のようなＤＮＡ配列を言 うために、本明細書全体で使用する。好適な態様では、組換えＵＢＣ−遺伝子の 転写は、発現が意図される細胞型中で組換え遺伝子の発現を制御する、プロモー ター配列（または他の転写調節配列）の制御下である。組換え遺伝子は、天然に 存在調節タンパク質の形態の転写を制御する配列と同一の、または異なる転写調 節配列の制御下であることがてきる。 用語“組織−特異的プロモーター”は、プロモーターとして役立つＤＮＡであ り、すなわちプロモーターに操作可能に連結された選択ＤＮＡ配列の発現を調節 し、そして上皮線状の細胞（例えば頚部扁平上皮細胞）のような組織の特別な細 胞中で、選択したＤＮＡ配列の発現を行う。上皮−特異的プロモーターの説明的 態様において、例えばパピローマウイルスのような特定のパピローマウイルス- 媒介疾患の病因に必要なp53の 分解を阻害するために、あるいは上皮組織だけに本ユビキチン−結合性酵素のア ンチセンス構築物の発現を支配するために、遺伝子構築物は遺伝子治療の一部と して使用され、例えば優性陰性hUbCEまたはrapUBC突然変異をコードする遺伝子 を運ぶことができる。この用語はまた、いわゆる“リーキー(leaky)”プロモー ターもカバーし、これは選択したＤＮＡの主に１つの組織中での発現を調節する が、他の組織中での発現も引き起こす。 本明細書で使用するように、“トランスジェニック動物”は任意の動物、好ま しくは非−ヒト哺乳類であり、動物のその１つ以上の細胞が、当該技術分野で周 知のトランスジェニック法などでヒトの介在により導入されたヘテロロガスな核 酸を含む。核酸は細胞中に、マイクロインジェクションにより、または組換えウ イルスを用いた感染によるような計画的な遺伝子操作法で細胞の前駆体中に導入 することにより、直接または間接的に導入される。用語遺伝子操作は、古典的な 交配−育種またはインビトロ受精を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入を対 象とする。この分子は染色体に組み込まれることができ、または染色体外複製Ｄ ＮＡであってもよい。本明細書に記載する典型的なトランスジェニック動物では 、トランス遺伝子はアゴニストまたはアンタゴニスト形態のいずれかの本ＵＢＣ タンパク質の組換え形態を発現する細胞、あるいは細胞中の内因性のＵＢＣ遺伝 子が破壊されている細胞を生じる。しかし、組換えＵＢＣ遺伝子がサイレントで あるトランスジェニック動物も意図するとこるであり、例えば以下に記載するＦ ＬＰまたはＣＲＥレコンビナーゼ依存性構築物である。本発明の“非−ヒト動物 ”とは、齧歯類、非−ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、両生類、爬虫類のよう な脊椎動物 を含む。好適な非−ヒト動物は、ラットおよびマウスを含む齧歯族から選択され 、そして最も好ましくはマウスである。用語“キメラ動物”は、動物中の全てで はないがいくつかの細胞中に組換え遺伝子が見いだされる、あるいは組換え体が 発現される動物を言うものとして本明細書では使用する。用語“組織−特異的キ メラ動物”は、いくつかの組織中で、しかし他ではない組換えＵＢＣが存在し、 かつ／または発現されることを指す。 本明細書で使用する“トランス遺伝子”という用語は、核酸配列（例えばＵＢ Ｃポリペプチドをコードする）を意味し、これは導入されたトランスジェニック 動物または細胞に一部または全くヘテロロガス、すなわち外来であるか、あるい は導入されるトランスジェニック動物または細胞の内因性遺伝子にホモルガスで あるが、挿入される（例えば天然の遺伝子の挿入部位とは異なる位置に挿入され る、あるいはその挿入がノックアウトを生じる）細胞のゲノムを変化させるよう に動物のゲノムに挿入されるように設計されるか、あるいは挿入されている。ト ランス遺伝子は、選択した核酸の最適な発現に必要となる１つ以上の転写調節配 列およびイントロンのような任意の他の核酸を含むことができる。 “相同性”とは２つのペプチドまたは２つの核酸分子間の配列類似性を言う。 相同性は比較するために整列しうる各配列中の位置を比較することにより決定で きる。比較する配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められているとき、 その分子はその位置で相同的である。配列間の相同性の程度は、そろっている数 または配列により共有される相同的な位置数の関数である。 本ユビキチン−結合性酵素をコードする核酸配列に関して、用語“進 化的に関連している”とは、天然に存在する突然変異体を含む生物に自然に生じ た核酸配列を言う。またこの用語は、天然に存在する酵素から生じたものである が、突然変異（例えば以下に記載する複合突然変異誘発(combinational mutagen esis)により変化し、それでもなお少なくとも１つのＵＢＣタンパク質の活性を 有するポリペプチドをコードする核酸配列を言う。 以下に記載するように、本発明の１つの観点は、本ＵＢＣタンパク質の１つを コードするヌクレオチド配列、ＵＢＣタンパク質の少なくとも１つの生物活性を 有するポリペプチドをコードするその断片、および／またはそのような核酸の均 等物を含んで成る単離された核酸に関する。本明細書で使用する用語“核酸”は 、そのような断片および均等物も含むことを意図する。用語“均等物”とは、本 明細書に記載するようなユビキチン−結合性酵素活性を有する機能的に均等なＵ ＢＣタンパク質、または機能的に均等なペプチドをコードするヌクレオチド配列 含むと考える。均等なヌクレオチド配列は、対立遺伝子変異体のような１つ以上 のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列を含み；そしてまた、遺 伝子コードの縮重により配列番号１に示すhUbCE遺伝子、配列番号３に示されるc aUbCE遺伝子、配列番号５に示されるspUbCE遺伝子、配列番号１２に示されるrap UBC遺伝子をコードするヌクレオチド配列とは異なる配列も含む。均等物は、ス トリンジェントな条件下(すなわち、約１Ｍの塩中で形成したＤＮＡ二重鎖の融 点(T_m)未満の約20-27℃に等しい)で、少なくとも配列番号１、３、５または１２ の１つに表すヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。 １つの態様では、均等物はさらに配列番号１、３、５または１２に示す任意のヌ クレオチド配列に由来し、そして進化的に関連する核酸を含む。 ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸に関して、本明細書で使用する用語“単離さ れた”とは、天然の巨大分子源中に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞ れ分離された分子を言う。例えば、本ＵＢＣ−タンパク質の１つをコードする単 離された核酸は、好ましくはゲノムＤＮＡ中のＵＢＣ遺伝子を天然に直ぐに挟む １０キロベース（ｋｂ）以下の核酸、さらに好ましくはそのような天然のフラン キング配列の５ｋｂ以下、そして最も好ましくはそのような天然のフランキング 配列の1.5ｋｂ未満を含む。また本明細書の単離されたという用語は、組換えＤ ＮＡ法で生産されたときに実質的に細胞物質またはが培養培地を含まない、ある いは化学的に合成されたときに前駆体または他の化学品を含まない、核酸または ペプチドを言う。さらに“単離された核酸”は断片として天然には存在しない、 そして自然な状態では見いだされない核酸断片を含むことを意味する。 本明細書で言う、ユビキチン−結合性酵素（ＵＢＣ）活性を有するようなポリ ペプチド、例えばＵＢＣアゴニストは、配列番号：２，４，６，または１３の任 意の１つに示されるアミノ酸配列と同一または相同的であるアミノ酸配列を有し 、そしてユビキチンのＣ−末端カルボキシル基にチオールエステル付加を形成で き、そしてイソペプチド結合を形成することにより受容体タンパク質中のε-ア ミノ基にユビキチンを転移させることができると考えられる。本ＵＢＣタンパク 質の生物学的活性は、構成的または条件付の短命なタンパク質ならびに異常なタ ンパク質の選択的タンパク質溶解に関する経路への参加を含む。本ＵＢＣタンパ ク質のアンタゴニスト形態は、配列番号２、４、６または１３に表されるＵ ＢＣタンパク質または野生型タンパク質の断片と相同的であるが同一ではなく、 これは天然に存在するユビキチン−結合性酵素の形態によるユビキチンの転移を 阻害する。例えば以下に記載するように、酵素の活性部位での突然変異(例えばC ys-85)は、タンパク質の野生型形態の作用を拮抗する本UbCEの優性陰性形態を生 成できる。 特にhUbCEタンパク質活性を有すると言われるポリペプチドは、配列番号２に 表すヒトユビキチン−結合性酵素のアミノ酸配列の全部または一部に対応するア ミノ酸配列を有するペプチドとして定義され、そして少なくしも１つのhUbCEタ ンパク質の生物活性を有し：その活性は、例えば正常細胞中、例えば正常な増殖 細胞中、例えばウイルスが感染した細胞中、例えばパピローマウイルスが感染し た細胞中、例えばＨＰＶ−ウイルスが感染した細胞中、例えばＨＰＶ−１６、Ｈ ＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１またはＨＰＶ３３感染細胞中、例えばパピローマウイ ルスＥ６タンパク質を発現している細胞中、例えば形質転換した細胞中、例えば 癌性細胞中で、細胞タンパク質、例えば細胞−周期調節タンパク質、例えばｐ５ ３のユビキチン化を媒介する能力；細胞タンパク質、例えば細胞−周期調節タン パク質、例えばｐ５３のユビキチン−依存性分解を媒介する能力；細胞−周期調 節タンパク質、例えば細胞−周期チェックポイントタンパク質、例えばｐ５３の 細胞性半減期に影響を与える能力である。本hUbCEタンパク質の他の生物活性は 本明細書に記載されるか、または当業者には理論的に明らかである。 特にrapUBCタンパク質活性を有すると言われるポリペプチドは、配列番号１３ に表すヒトユビキチン−結合性酵素のアミノ酸配列の全部または一部に対応する アミノ酸配列を有するペプチドとして定義され、そし て少なくしも１つのrapUBCタンパク質の生物活性を有し：その活性は、例えば正 常細胞中、例えば癌性細胞中で、FKBP／ラパマイシン複合体と結合する能力、細 胞タンパク質、例えば細胞−周期調節タンパク質、例えばｐ５３のユビキチン化 を媒介する能力；細胞タンパク質、例えば細胞−周期調節タンパク質、例えばｐ ５３のユビキチン−依存性分解を媒介する能力；細胞−周期調節タンパク質、例 えば細胞−周期チェックポイントタンパク質、例えばｐ５３の細胞性半減期に影 響を与える能力である。ラパマイシンがＧ１期中に細胞−周期に遮断を起こすな らば、本rapUBC酵素の生物活性の範囲は特定の細胞周期調節タンパク質、特に比 較的短命なタンパク質(例えば、３０分から２時間のオーダーの半減期を有する タンパク質)の半減期の制御の含むと考えられる。例えば、本rapUBCは、例えば ｐ５３、ｍｙｃ、ｐ２７および／またはサイクリンのユビキチン化を媒介でき、 そしてそれゆえに増殖している細胞中の細胞−周期調節タンパク質の半減期に影 響を及ぼすことができる。rapUBCのFKBP／ラパマイシン複合体への結合は、酵素 をその基質タンパク質から隔離することができる。したがってラパマイシンは、 細胞性ｐ５３レベルの上昇を引き起こし、そして次にＧ１期の進行を阻害する様 式で、ｐ５３のユビキチン−媒介分解に影響を及ぼすことができる。 さらに特別な環境下では、本ＵＢＣタンパク質の生物活性のサブセットだけの アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである、本タンパク質の天然に存在 する形態の相同物を提供することが有利であると一般的に考えられる。すなわち 、相同物の限定機能を処理することにより特別な生物効果を現すことができ、そ してこのタンパク質の全生物活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストを用 いた処理に比して、より少 ない副作用をもつ。例えば、実質的に他の細胞タンパク質のユビキチン化を妨害 する事なく、ｐ５３のユビキチン経路中の他のタンパク質に結合し、そして阻害 活性化するhUbCEおよびrapUBC相同物を生成できる。 １つの態様では、本発明の核酸はヒトＵＢＣタンパク質のアゴニストまたはア ンタゴニストのいずれかであるポリペプチドをコードし、そして配列番号２によ り表されるアミノ酸配列を含んで成る。好適な核酸はhUbCEタンパク質活性を有 するペプチドをコードし、あるいはそのアンタゴニストであり、そして配列番号 ２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％相同的、より好ましくは９５％相同的 、そして最も好ましくは９７％相同的である。hUbCEタンパク質のアゴニストま たはアンタゴニスト形態をコードし、配列番号２に示す配列と少なくとも約９８ −９９％の相同性を有する核酸も本発明の範囲である。好ましくは核酸は配列番 号１に表すhUbCEタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を 含んで成るｃＤＮＡ分子である。配列番号１に示すｃＤＮＡ分子の好適な部分は 、分子のコーディング領域を含む。 別の態様では、本発明の核酸はカンジダ(Candida)UbCEタンパク質、例えばシ ー．アルビカン(C.albican)UbCEのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれか であるポリペプチドをコードし、そして配列番号４により表されるアミノ酸配列 を含んで成る。好適な核酸はcaUbCEタンパク質活性を有するペプチドをコードし 、あるいはそのアンタゴニストであり、そして配列番号４に示すアミノ酸配列と 少なくとも９０％相同的、より好ましくは９５％相同的、そして最も好ましくは ９７％相同的である。caUbCEタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト形態 をコードし、配列番号４に示す配列と少なくとも約９８−９９％の相同性を有す る核酸も、本発明の範囲である。好ましくは核酸は配列番号３に表すcaUbCEタン パク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含んで成るｃＤＮＡ分 子である。配列番号３に示すｃＤＮＡ分子の好適な部分は、分子のコーディング 領域を含む。本発明は緊密に関連している他のカンジダ(Candida)、例えばカン ジダ ステラトイデア(Candida stellatoidea)種、カンジダ トロピカリス(Candi da tropicalis)種、カンジダ パラプシロシス(Candida parapsilosis)種、カン ジダ クルセイ(Candida krusei)種、カンジダ シュードトロピカリス(Candida p seudotropicalis )種、カンジダ クイラーモンディー(Candida quillermondii)種 またはカンジダ ルゴサ(Candida rugosa)種の相同物(オーソログ)も含む。 さらに別の態様では、本発明の核酸はシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyc es )UbCEタンパク質、例えばエス．ポンベ(S.pnmbe)UbCEのアゴニストまたはアン タゴニストのいずれかであるポリペプチドをコードし、そして配列番号６により 表されるアミノ酸配列を含んで成る。好適な核酸はspUbCEタンパク質活性を有す るペプチドをコードし、あるいはそのアンタゴニストであり、そして配列番号６ に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％相同的、より好ましくは９５％相同的、 そして最も好ましくは９７％相同的である。spUbCEタンパク質のアゴニストまた はアンタゴニスト形態をコードし、配列番号６に示す配列と少なくとも約９８− ９９％の相同性を有する核酸も本発明の範囲である。好ましくは核酸は配列番号 ５に表すspUbCEタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含 んで成るｃＤＮＡ分子である。配列番号５に示すｃＤＮＡ分子の好適な部分は、 分子のコーディング領域を含む。 さらに別の態様では、本発明の核酸はヒトＵＢＣタンパク質のアゴニストまた はアンタゴニストのいずれかであるポリペプチドをコードし、そして配列番号１ ３により表されるアミノ酸配列を含んで成る。好適な核酸はrapUBCタンパク質活 性を有するペプチドをコードし、あるいはそのアンタゴニストであり、そして配 列番号１３に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％相同的、より好ましくは９５ ％相同的、そして最も好ましくは９７％相同的である。rapUBCタンパク質のアゴ ニストまたはアンタゴニスト形態をコードし、配列番号１３に示す配列と少なく とも約９８−９９％の相同性を有する核酸も本発明の範囲である。好ましくは核 酸は配列番号１２に表すrapUBCタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少な くとも一部を含んで成るｃＤＮＡ分子である。配列番号１２に示すｃＤＮＡ分子 の好適な部分は、分子のコーディング領域を含む。 本発明の別の観点は、高または低ストリンジェンシー条件下で、配列番号２、 ４、６または１３の１つ示すアミノ酸配列の全部または一部を有するペプチドを コードする核酸にハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼー ションを促進する適当なストリンジェンシー条件（例えば約45℃で6.0×塩化ナ トリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）、続いて50℃で2.0×SSCの洗浄）は、当 業者には周知であるか、あるいは分子生物学の現在の手法(Current Protocils i n Molecular Biology ) ジョン ウィリー アンドサンズ(John Wiley & Sons)、N.Y.(1989)、6.3.1-6.3 .6に見いだすことができる。例えば、洗浄工程の塩濃度は50℃で約2.0×SSCの低 ストリンジェンシーから50℃で約0.2×SSCの高ストリンジェンシーで選択できる 。さらに、洗浄工程の温度は約22℃の室温の低ストリンジェンシー条件から、約 65℃の高ストリンジェンシーに上昇 させることができる。 遺伝子コードの縮重のために配列番号１、３、５または１２に示されるヌクレ オチド配列とは異なる配列の単離核酸も、本発明の範囲内にある。そのような核 酸は機能的に均等なペプチド（すなわち、ＵＢＣタンパク質の生物活性を有する ペプチド）をコードできるが、配列は遺伝子コードの縮重のために配列番号１、 ３、５または１２に示される配列とは異なる。例えば、多くのアミノ酸が２つ以 上のトリプレットで指定される。同じアミノ酸または同義（例えば、ＣＡＵおよ びＣＡＣはヒスチジンについて同義である）を特定するコドンは、本ＵＢＣタン パク質のアミノ酸配列に影響しない“サイレント”突然変異を生じることができ る。しかし、本hUbCEまたはrapUBCタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらす ＤＮＡ配列多形性は、ヒト患者に次々と存在するだろうと予想される。当業者は 、例えばhUbCEまたはrapUBCタンパク質の活性を有するペプチドをコードする核 酸の１つ以上のヌクレオチド中のこれらの変異（ヌクレオチドの最高３−４％） は、自然な対立遺伝子変異体により個体中に存在しうると考えられる。任意の、 そしてすべてのそのようなヌクレオチド変異、および生じるアミノ酸多形は本発 明の範囲である。 １つの本ユビキチン−結合性酵素の活性部分をコードする核酸の断片も、本発 明の範囲内である。本明細書にて使用するように、ＵＢＣタンパク質の活性部分 をコードする核酸の断片は、タンパク質の全アミノ酸範囲をコードするヌクレオ チド配列よりは少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるが、天然に 存在する酵素の形態についてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するペプ チドをコードするヌクレオチド配列を言う。 本発明の範囲内の核酸断片は、ＵＢＣ相同物を検出するためのスクリーニング 法に使用するために、高または低ストリンジェンシー条件下で他の種に由来する 核酸とハイブリダイズできるものも含む。 本発明の範囲内の核酸は、リンカー配列、修飾制限エンドヌクレアーゼ部位、 および本UbCEユビキチン−結合性酵素の少なくとも１つの生物活性を有する組換 えペプチドの分子クローニング、発現または精製に有用な他の配列も含んでよい 。好適な態様では、核酸断片は配列番号１のヌクレオチド残基３１９から４４１ に表される核酸配列の少なくとも一部(アミノ酸残基Cys-107からMet-147に対応 する)を含んで成る。好適な態様では、核酸はCys-107からCys-111、そしてより 好ましくはCys-107からAsp-117を含むhUbCEポリペプチドをコードする。第２図 に説明するように、Cys-107からAsp-111からの特定の残基が、hUbCEのユビキチ ン−結合部位の重要な員である。対応してcaUbCEまたはspUbCEは好ましくはそれ ぞれ、Cys-107からVal-147、そしてCys-107からIle-107を含む。 以下に説明する実施例で示すように、本ユビキチン−結合性酵素の活性を有す るペプチドをコードする核酸は、任意の数の真核細胞に存在するｍＲＮＡまたは ゲノムＤＮＡから、本明細書に記載の手法ならびに一般的に当該技術分野で知ら れている方法に従い得ることができる。ヒトＵＢＣタンパク質の１つの相同物を コードするｃＤＮＡは、例えば細胞、例えば哺乳類細胞に由来する全ｍＲＮＡを 単離することにより得られる。二重鎖ＤＮＡを次に全ｍＲＮＡから調製し、そし て続いて多くの周知技術の１つを使用して適当なプラスミドまたはハキクテリオ ファージベクター中に挿入する。ＵＢＣタンパク質をコードする遺伝子も、確立 されたポリメラーゼ連鎖反応法を使用して、本明細書に提供したヌクレオチ ド配列情報に従いクローン化できる。 本発明の別の観点は、単離核酸を“アンチセンス”療法で使用することに関す る。本明細書で使用する、“アンチセンス”療法とは、例えば転写及び／翻訳を 阻害することによりそのタンパク質の発現を阻害するように、ＵＢＣタンパク質 をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと、細胞条件下で特異的 にハイブリダイズ（例えば、結合）するオリゴヌクレオチドプローブまたはその 誘導体を投与あるいはin ｓitu生成することを言う。この結合は、従来の塩基対 相捕性により、あるいは例えばＤＮＡ二重鎖の場合には、ダブルヘリックスの主 溝中の特異的な相互作用を介するものであってよい。一般的に“アンチセンス” 療法は、当該技術分野で広く使用されている技術範囲を言い、そしてオリゴヌク レオチド配列への特異的結合に依存する任意の療法を含む。 本発明のアンチセンス構築物は、細胞中で転写された時に、例えば配列番号１ に表すヒトhUbCEまたは配列番号１２に表すrapUBC遺伝子のような本ＵＢＣ-タン パク質の1つをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも独特な部分と相補的なＲＮ Ａを生産する、発現プラスミドとして送達されることができる。あるいはアンチ センス構築物はex vivoで生産され、そして細胞中に導入された時にＵＢＣタン パク質の１つをコードするｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズ することにより、発現の阻害を引き起こすオリゴヌクレオチドプローブであるこ とができる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは内因のヌク レアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに対し て耐性であるようにモディファイされ、したがってin vivoで安定である。アン チセンスオリゴヌクレオチドとして使用される核酸分子の 例は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネー ト類似体である(米国特許第5,176,996号:同第5,264,564号;および同第5,256,775 号明細書も参照にされたい)。さらに、アンチセンス療法に有用なオリゴマーの 構築に関する一般的方法、例えばKrolら、(1988)Biotechniques 6:958-976;およ びSteinら、(1988)Cancer Rec 48:2659-2668も参考にした。 したがって、本発明の修飾されたオリゴマーは治療、診断および研究目的に有 用である。治療的応用では、一般的にアンチセンス療法に適するように使用され る。そのような治療のために、本発明のオリゴマーは、全身性および局所的また は局部的投与を含む、様々な投与経路のために配合されることができる。方法お よび配合は一般的に、レミングトンの薬科学(Remmington's Pharmaceutical Sci ence )、ミーデ出版社(Meade Publishing Co.)、イーストン、ペンシルバニア州 に見いだされる。全身性投与のために、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下注射 を含む注射が好ましく、本発明のオリゴマーを好ましくはハンクス溶液またはリ ンガー溶液のような生理的に適合性のある緩衝液中に配合することができる。さ らにオリゴマーは固体状態に配合され、そして使用直前に再溶解または懸濁され る。凍結乾燥状態も含む。 全身性投与は、トランスムコサル(transmucosal)または経皮的手段により、あ るいは化合物を経口的に投与することができる。トランスムコサルまたは経皮的 投与のために、配合中に浸透に対する障害として適当な浸透剤を使用する。その ような浸透剤は、一般的に当該技術分野で周知であり、そして例えば、トランス ムコサル投与用には胆汁酸およびフシジン酸誘導体である。さらに浸透し易くす るために界面活性剤を使 用できる。トランスムコサル投与は点鼻スプレーを介して、または坐薬を使用し てもよい。経口投与用に、オリゴマーは従来の経口投与形態、例えばカプセル、 錠剤および強壮剤中に配合される。局所的投与用に、本発明のオリゴマーは軟膏 、膏薬、ゲルまたはクリーム中に当該技術分野で一般的に知られているように配 合される。 さらに治療に使用するために、本発明のオリゴマーは特異的に結合する標的Ｄ ＮＡまたはＲＮＡの存在または不在を検出するための診断薬として使用できる。 そのような診断試験は、以下でさらに詳細に記載する。 本発明はまた、少なくとも１つの転写調節配列に操作可能に連結した本ＵＢＣ タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。操作可能に連結し たとは、核酸によりコードされる酵素の発現が可能となり、そしてその発現が、 例えば転写調節配列により構成的に、または誘導可能に制御されるように、核酸 が転写調節配列に連結されていることを意味するものとする。調節配列は技術的 に認識されている。したがって調節配列はという用語は、プロモーター、エンハ ンサーおよび他の発現制御要素を含む。そのような調節配列はGoddel；遺伝子発 現法（Gene Expression Technology）：Methods in Enzymology 185、アカデミ ック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州(1990)に記載されている。 例えば、広範の様々な発現制御配列（配列に操作可能に連結したＤＮＡ配列の 発現を制御する配列）を、本発明のＵＢＣタンパク質をコードするＤＮＡ配列を 発現するためにこれらベクターに使用できる。そのような有用な発現制御配列は 、例えばＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイト メガロウイルスの極めて初期のプロモーター、lac系、trp系、ＴＡＣまたはＴＲ Ｃ系、Ｔ７ ＲＮＡポリメ ラーゼによりその発現が支配されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主オペ レーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制限領域、３−ホス ホグリセリン酸キナーゼまたは他のグリコール酸酵素のプロモーター、酸性ホス ファターゼ(例えばPho5)のプロモーター、酵母アルファ-交配因子のプロモータ ー、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター、および原核または真核細 胞またはウイルスの遺伝子発現を制御すると知られている他の配列、ならびにそ の様々な組み合わせを含む。発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の 選択および／または発現を所望するタンパク質の種類のような因子に依存すると 考えるべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのようなコピー数を制御す る能力、およびベクターによりコードされる任意の他のタンパク質の発現（抗生 物質マーカーのような）も考慮すべきである。 １つの態様では、発現ベクターは本hUbCEタンパク質(例えば組換えhUbCEタン パク質)の１つをコードするＤＮＡを含む。rapUBCタンパク質の組換え形態を生 成する同様な発現ベクターも意図する。そのような発現ベクターは細胞をトラン スフェクトし、それにより本明細書に記載される核酸によりコードされる融合タ ンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを生産させるために使 用できる。 さらにhUbCEまたはrapUBC-発現ベクターは、hUbCEまたはrapUBCが誤発現され る哺乳類細胞中で、hUbCEまたはrapUBC機能を再構成するために、あるいは天然 に存在するhUbCEまたはrapUBCのアンタゴニスト、あるいは細胞周期調節タンパ ク質のhUbCEまたはrapUBC-媒介分解を阻害するようなアンチセンス構築物を提供 するために、遺伝子療法の一部として使用することができる。例えば、本hUbCE またはrapUBC-タンパク質の 発現構築物は、生物的に有効なキャリアー中（例えば組換えhUbCEまたはrapUBC- 遺伝子で細胞を効率的にインビボトランスフェクションすることができる任意の 配合物または組成物）で投与することができる。方法には、本遺伝子を組換えレ トロウイルス、アデノウイルス、アデノ−伴生ウイルスおよび単純ヘルペスウイ ルス１型を含むウイルスベクター、または組換え細菌もしくは真核プラスミド中 への挿入を含む。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフェクトするために使 用でき；プラスミドＤＮＡを、例えばカチオン性リポソーム（リポフェクチン） 、あるいは誘導化されて（例えば抗体結合）、ポリリシン結合、グラミシジンＳ 、合成ウイルスエンベロップあるいは他のそのような細胞性キャリアーの援助に より送達できるか、ならびに遺伝子構築物の直接的な注入またはCaPO₄沈殿をイ ンビボで行うことにより送達できる。適当な標的細胞への遺伝子導入が遺伝療法 の重大な第一段階と考えられるので、特定の遺伝子送達システムの選択は、意図 する標的の表現型および投与経路（例えば局部または全身）のような因子に依存 するだろう。 本タンパク質の１つをコードする核酸の、細胞への好適なインビボ導入方法は 、遺伝子産物をコードする核酸（例えばｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターの使 用による。ウイルスベクターを用いた細胞の感染は、標的細胞の大部分が核酸を 受容できるという利点を有する。さらにウイルスベクター中にコードされた分子 は（例えばウイルスベクター中に含まれるｃＤＮＡによる）、ウイルスベクター 核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現する。 レトロウイルスベクターおよびアデノ−伴生ウイルスベクターは、一般的に外 因遺伝子をインビボ転移、特にヒト中へ転移するために選択さ れる組換え遺伝子送達システムであると考えられている。これらのベクターは細 胞中への遺伝子の効率的な送達を提供し、そして転移した核酸は宿主の染色体Ｄ ＮＡに安定に組み込まれる。レトロウイルスの使用に関する主な必要条件は、そ れらの使用の安全性を確保することであり、特に野生型ウイルスが細胞群中で伝 播する可能性に関する。複製−欠陥レトロウイルスだけを生成する特殊化された 細胞系（“パッケージング細胞”と呼ぶ）の開発は、遺伝子療法のためのレトロ ウイルスの利用性を増大させ、そして欠陥レトロウイルスは遺伝子療法を目的と した遺伝子転移における使用に関して、特性がよく知られている(Miller,A.D.(1 990)Blood 76:271)。したがって組換えレトロウイルスは、中のレトロウイルス コーディング配列(gag、pol、env)が本hUbCEまたはrapUBC-タンパク質の１つを コードする核酸に置き換えられて、レトロウイルスの複製を欠失するように構築 できる。複製欠陥レトロウイルスを次に、標準的方法によりヘルパーウイルスの 使用を介して標的細胞を感染させるために使用できるビリオン中にパッケージン グする。組換えレトロウイルスの生成法、およびそのようなウイルスでの細胞の インビトロまたはインビボ感染法は、分子生物学の現在の手法（Current Protoc ols in Molecular Biology ）Ausubel,F.M.ら、（編集）グリーンパブリッシング アソシエイツ(Green Publishing Associates、(1989)、Science 9.10-9.14およ び他の標準的実験書に見いだすことができる。適当なレトロウイルスの例は、pL J、pZIP、pWEおよびpEMを含み、これらは当業者に周知である。エコトロピック( ecotropic)およびアンホトロピッツク(amphotropic)な両方のレトロウイルス系 を調製するための適当なパッケージングウイルス系の例は、ψCrip、ψcre、ψ ２およびψAmを含む。レ トロウイルスは様々な遺伝子を、インビトロおよび／またはインビボで神経細胞 、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの様 々な細胞中に導入するために使用された(例えば、Eglitisら、(1985)Science 23 0:1395-1398:DanosおよびMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464 ;Wilsonら、(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018;Armentanoら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145;Huberら、(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.US A 88:8039-8043;Ferryら、(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381;Chowdh uryら、(1991)Science 254:1802-1805;van Beusechemら、(1992)Proc.Natl.Acad .Sci.USA 89:7640-7644;Kayら、(1992)Human Gene Therapy 3:641-647;Daiら、( 1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895;Hwuら、(1993)J.Immunol.150:41 04-4115;米国特許第号4,868,116号;同第4,980,286明細書;国際公開第89/07136号 明細書;同第89/02468号明細書;同第89/05345号明細書;および同第92/07573号明 細書を参照にされたい)。 さらに、レトロウイルスの感染範囲、そして結局はレトロウイルスを基本とし たベクターの感染範囲を、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタン パク質をモディファイすることにより制限できることが示された(例えば国際公 開第93/25234号;同第94/06920号;同第94/11524号明細書を参照にされたい)。例 えば、レトロウイルスベクターの感染範囲をモディファイするための方法は；細 胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスenvタンパク質にカップリングする(Rouxら 、(1989)PNAS 86:9079-9083;Julanら、(1992)J.Gen Virol 73:3251-3255;および Goudら、(1983)Virology 163:251-254);または細胞表面リガンドをウイルスenv タンパク質にカップリングする(Nedaら、(1991)J.Biol.Chem 266:1414 3-14146)。カップリングは、タンパク質または他の種々（例えば、envタンパク 質をアシアログリコプロテインに転換させるためのラクトース）との化学的な架 橋結合状態、ならびに融合タンパク質(例えば一本鎖抗体／env融合タンパク質) によることができる。この方法は特定の組織型への感染を制限、あるいはそうで はなく支配するために有用である一方、エクトトロピックなベクターをアンホト ロピックなベクターに転換するためにも使用できる。 さらにレトロウイルス遺伝子送達の使用は、レトロウイルスベクターのhUbCE またはrapUbCE遺伝子発現を制御する、組織または細胞−特異的転写調節配列に よりさらに強化されることができる。 本発明に有用な別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス−由来ベクター を利用する。アデノウイルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコードするが、正 常な溶菌ウイルス生活環の複製と言う点では不活性であるように操作されること ができる(例えば、Berknerら、(1988)BioTechniques 6:616;Rosenfeldら、(1991 )Science 252:431-434;およびRosenfeldら、(1992)Cell 68:143-155)。アデノウ イルスAd5 d1324株または他のアデノウイルス株(例えばAd2、Ad3、Ad7等)由来の 適当なアデノウイルスベクターは、当業者に周知のものである。組換えアデノウ イルスは、分割している細胞に感染できない特定の状況で有利であり得、そして 気管上皮(Rosenfeldら、(1992)同上)、内皮細胞(Lemarchandら、(1992)Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 89:6482-6486)、肝細胞(HerzおよびGerard(1993)Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 90:2812-2816)および筋肉細胞(Quantinら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 89:2581-2584)を含む様々な種類の細胞を感染させるために使用できる。 さらにウイルス粒子は、 精製および濃縮に対し比較的安定かつ扱い易く、そして上記のように、感染性の 範囲に影響するようにモディファイできる。加えて、導入されたアデノウイルス ＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組み込ま れないが、エピソームに留まり、これにより導入したＤＮＡが宿主ゲノム（例え ばレトロウイルスＤＮＡ）中に組み込まれるような状況の挿入的突然変異誘発(i nsertional mutagenesis)の結果として生じ得る潜在的問題を回避する。さらに 、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ運搬能力は、他の遺伝子送達ベクターに比 べて大きい（最高８キロベース）(Berknerら、同上;Haj-AhmandおよびGraham（1 986）J.Virol.57:267)。ほとんど複製−欠陥アデノウイルスベクターが現在使用 されており、したがって本発明は、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または 一部が欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の多くても８０％を保持するも のが好ましい(例えば、Jonesら、(1979)Cell 16:683;Berknerら、同上;およびGr ahamら、分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）E.J．Murray編集 、（ヒューマナ:Humana、クリフトン、ニュージャージー州、1991）第７巻、第1 09-127頁を参照にされたい)。挿入したhUbCEまたはrapUBC-遺伝子の発現は、例 えばＥ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター(major late Promoter:MLP)お よび付随するリーダー配列、Ｅ３プロモーターまたは外因性の付加プロモーター 配列の制御下であることができる。 本hUbCEまたはrapUBC-遺伝子の送達に有用な別のウイルスベクター系は、アデ ノ−伴生ウイルス（ＡＶＶ）である。アデノ−伴生ウイルスは天然に存在する欠 陥ウイルスであり、効率的な複製および生産的な生活環のために、ヘルパーウイ ルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウ イルスのような別のウイルスが必要である(Muzyczkaら、Curr.Topics in Micro. and Immunol .(1992)158:97-129を参照にされたい)。これもそのＤＮＡを非分割 細胞中に組み込み、そして高頻度の安定な組み込みを表すことができる数少ない ウイルスノ１つである(例えばFlotteら、（1992）Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7 :349-356;Samulskiら、(1989)J.Virol.63:3822-3828;およびMcLaughlinら、(198 9)J.Virol.62:1963-1973を参照にされたい)。ＡＶＶの少なくとも３００塩基対 を含むベクターをパッケージし、そして組み込むことができる。外来ＤＮＡ用の 空間は約4.5kbに限られている。Tratshinら、(1985)Mol.Cell.Biol.5::3251-326 0に記載されているＡＶＶベクターは、ＤＮＡを細胞に導入するために使用でき る。ＡＶＶを使用して、様々な核酸が様々な細胞型に導入された(例えば、Hermo natら、(1984)P.A.N.S.USA 81:6466-6470:Tratshinら、(1985)Mol.Cell.Biol.4: 2072-2081;Wondisfordら、(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39;Tratshinら、(1984)J .Virol .51:611-619;およびFlotteら、(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790を参照 にされたい)。 遺伝子治療における応用を有することができる他のウイルスベクター系は、ヘ ルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびいくつかのＲＮＡウイルスに由来し た。特にヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系および眼内組織の細胞中の組 換えhUbCEまたはrapUBC-遺伝子の持続性について、独特の方法を提供することが できる(Peposeら、(1994)Invest Opthalmol Vis Sci 35:2662-2666)。 上記に説明したようなウイルス転移法に加えて、非-ウイルス法も動物組織中 にhUbCEまたはrapUBC-タンパク質、あるいはhUbCEまたはrapUBCアンチセンス分 子の発現を引き起こすために使用できる。遺伝子転移 のほとんどの非ウイルス法は、巨大分子を取り込みおよび細胞内輸送のために哺 乳類細胞により使用される通常のメカニズムに依存する。好適な態様では、本発 明の非−ウイルス遺伝子送達系は、標的細胞による本hUbCEまたはrapUBC-遺伝子 の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依存する。この種類の例示的な遺 伝子送達系は、リポソーム送達系、ポリ−リシン結合物および合成ウイルスエン ベロップを含む。 各態様において、本ユビキチン−結合性酵素の１つをコードする遺伝子は、表 面に正電荷をもつリポソーム（例えばリポフェクチン）中に封入され、これは（ 場合によっては）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体で標識してもよい(Mizun oら、(1992)脳神経外科20:547-551:国際公開91/06309;日本国特許出願第1047381 号明細書;および欧州特許出願公開第A-43075号明細書)。例えば、上皮細胞に感 染したパピローマ−ウイルスのリポフェクチンは、例えば扁平上皮細胞に対する モノクローナル抗体で標識したリポソームを使用して行うことができる。 同様に、遺伝子送達系は抗体またはポリ−リシンのような遺伝子結合剤と架橋 結合した細胞表面リガンドを含んで成る（例えば、国際公開第93/04701号、同第 92/22635号、同第92/20316号、同第92/19749号および同第92/06180号明細書を参 照にされたい）。例えば、本ＵＢＣ−遺伝子構築物は、ポリカチオン(例えばポ リリシン、米国特許第5,166,320号明細書を参照にされたい)に結合したＨＰＶウ イルスコートタンパク質を含んで成る可溶性ポリヌクレオチドキャリアーを使用 して、ＨＰＶ−感染扁平上皮細胞をインビボでトランスフェクトするために使用 できる。エンドサイトーシスを介した本核酸構築物の効率的な送達は、エンドソ ーム構造からの遺伝子の逸脱を増強させる薬剤を使用して向上させるこ とができると考えられる。例えば、全アデノウイルスまたはインフルエンザＨＡ 遺伝子産物のフソージェニック(fusogenic)ペプチドは、ＤＮＡ−含有エンドソ ームの効率的破壊を誘導するための送達系の一部として使用できる(Mulliganら 、(1993)Science 260-926;Wangerら、(1992)PNAS 89:7934;およびChristianoら 、(1993)PNAS 90:2122)。 臨床的状況では、遺伝子送達系は多くの任意の方法により患者中に導入される ことができ、各方法は当該技術分野で周知である。例えば、遺伝子送達系の製薬 学的組成物は、例えば静脈注射により全身に導入され、そして標的細胞中の特異 的遺伝子導入が、遺伝子送達媒介物により提供されるトランスフェクションの特 異性から優勢的に起こり、転写性の調節配列による細胞−型または組織−型発現 が遺伝子またはその組み合わせの発現を制御する。別の態様では、組換え遺伝子 の最初の送達は、導入が動物の極めて局部により限られている。例えば遺伝子送 達媒介物はカテーテル(米国特許第5,328,470号明細書)により、または定位注入( 例えばChenら、(1994)PNAS 91:3054-3057)による。 さらに製薬学的組成物は本質的に、許容し得る希釈剤中の遺伝子送達系を含む ことができるか、あるいは遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている遅延放出トマ リックスを含むことができる。代わりに、完全な遺伝子送達系が組み換え細胞、 例えばレトロウィルスパッケージからそのまま生産されることができる場合、製 薬学的組成物は、遺伝子送達系を生産する１つ又はそれ以上の細胞を含むことが できる。後者の場合、例えば再装填可能（ｒｅｃｈａｒｇｅａｂｌｅ）又は生物 分解可能な装置により、ウィルスパッケージング細胞を導入する方法を提供する ことができる。そのような体内埋植物の形成は一般に当該技術分野において既知 である。例えばＣｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｅｄｉｃ ａｌ ＆ Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｅｄ．ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｗｉ ｌｌｉａｍｓ（ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９０）； Ｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，８８３，６６６号；Ａｅｂｉｓｃｈｅ ｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８９２，５３８号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅ ｔ ａｌ．米国特許第５，１０６，６２７号；Ｌｉｍ 米国特許第４，３９１， ９０９号；Ｓｅｆｔｏｎ 米国特許第４，３５３，８８８号；及びＡｅｂｉｓｃ ｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １２：５０−５ ５を参照されたい。 本発明は、本ＵＢＣタンパク質の組み換え形態を発言するようにトランスフェ クション又は形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞はいずれの原核又は 真核細胞であることもできる。例えば本発明のｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣポリ ペプチドは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのバクテリア細胞、昆虫細胞（バク ロウィルス）、酵母又は哺乳類細胞において発現されることができる。他の適し た宿主細胞は当該技術分野における熟練者に既知である。 「組み換えタンパク質」という用語は、組み換えＤＮＡ法により製造される本 発明のタンパク質を言い、その方法では一般にＵＢＣタンパク質をコードするＤ ＮＡが適した発現ベクター中に挿入され、今度はそれが宿主細胞の形質転換に用 いられて異種タンパク質が生産される。さらに組み換えＵＢＣをコードする組み 換え遺伝子に関する「から誘導されるる（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という 句は、本来のＵＢＣ、例えばｈＵｂＣＥ、ｃａＵｂＣＥ、ｓｐＵｂＣＥ又はｒａ ｐＵＢＣのアミノ 酸配列、あるいはタンパク質の自然に存在する形態の置換及び欠失を含む突然変 異により生成される、それと類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を「組み換 えタンパク質」の意味内に含むことを示す。本来のタンパク質に加え、本発明に おいて好ましい組み換えタンパク質は、配列番号：２、４、６又は１３の１つに 示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％相同、より好ましくは９５％相同、最 も好ましくは９７％相同である。ＵＢＣタンパク質の活性を有する、又はそれに 対して拮抗的であり、配列番号：２、４、６又は１３に示される配列と少なくと も約９０％、より好ましくは約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９ ％相同であるポリペプチドも本発明の範囲内であ。 本発明はさらに、他の非−ヒト哺乳類、例えばマウス、ウサギもしくはブタか ら誘導される遺伝子によりコードされ、ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣタンパク質 に進化的に関連するアミノ酸配列を有する組み換えＵＢＣ同族体にも関する。上 記の通り、そのような組み換えＵＢＣ又はｒａｐＵＢＣタンパク質は、ｈＵｂＣ Ｅ又はｒａｐＵＢＣの少なくとも１つの生物学的活性の作用薬（アゴニスト）又 は拮抗薬（アンタゴニスト）のいずれかの役割において機能することができるの が好ましい。上記の「進化的に関連する」という用語は、自然に生じた、あるい は例えば組み合わせ突然変異誘発又は走査突然変異誘発による突然変異により誘 導されるアミノ酸配列を有するが、そのタンパク質が配列番号：２に示されるｈ ＵｂＣＥタンパク質又は配列番号：１３に示されるｒａｐＵＢＣタンパク質のい ずれかに相同であるユビキチン−結合性酵素を言う。 本発明はさらに本タンパク質の製造法に関する。例えば本ＵＢＣタンパク質の １つをコードする発現ベクターでトランスフェクションされた 宿主細胞を適した条件下で培養し、ポリペプチドの発現を起こさせることができ る。ペプチドは分泌され（例えば組み換え的に加えられるシグナル配列を介して ）、細胞及び分泌タンパク質を含む培地の混合物から単離されることができる。 別の場合、ペプチドはおそらく細胞質に保持されるのが自然に起こる形態である ので、ペプチドを細胞質に保持し、細胞を収穫し、細胞溶解させ、タンパク質を 単離することができる。細胞培養物は宿主細胞、培地及び他の副生成物を含む。 細胞培養のための適した培地は当該技術分野において周知である。本ＵＢＣポリ ペプチド類は、イオン−交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー 、限外濾過、電気泳動及びタンパク質に対して誘起された抗体類を用いるイムノ アフィニティー精製を含むタンパク質の精製のための当該技術分野において既知 の方法を用い、細胞培養培地、宿主細胞又は両方から単離することができる。好 ましい実施態様の場合、ＵＢＣタンパク質はその精製を容易にするドメインを含 む融合タンパク質、例えば以下に説明されるｈＵｂＣＥ−ＧＳＴ融合タンパク質 である。 かくしてタンパク質の全体又は選ばれた部分をコードする、本発明のＵＢＣタ ンパク質のクローニングから誘導されるヌクレオチド配列を用い、微生物又は真 核細胞法を介して酵素の組み換え形態を製造することができる。ポリヌクレオチ ド配列を遺伝子構築物、例えば発現ベクター中に連結し、真核（酵母、トリ、昆 虫もしくは哺乳類）又は原核（バクテリア細胞）のいずれかの宿主中に形質転換 又はトランスフェクションすることが、他の周知のタンパク質、例えばｐ５３、 Ｃ−ｍｙｃ、サイクリン類、ｃｄｋｓなどの製造に用いられる標準的方法である 。類似の方法又はそれらの修正法を、本発明の微生物手段又は組織培養法により 組み換えタンパク質又はそれらの部分を製造するために用いることができる。 組み換えタンパク質はクローニングされた遺伝子又はそれらの一部を、原核細 胞、真核細胞又は両方における発現に適したベクター中に連結することにより製 造することができる。組み換えＵＢＣの製造のための発現伝達体にはプラスミド 及び他のベクターが含まれる。例えば本タンパク質の発現に適したベクターには ：Ｅ．コリなどの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２−誘導プラスミド 、ｐＥＭＢＬ−誘導プラスミド、ｐＥＸ−誘導プラスミド、ｐＢＴａｃ−誘導プ ラスミド及びｐＵＣ−誘導プラスミドの型のプラスミドが含まれる。 酵母における組み換えタンパク質の発現のために複数のベクターが存在する。 例えばＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２及びＹＲＰ １７はＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中への遺伝子構築物の導 入において有用なクローニング及び発現伝達体である（例えば引用することによ り本明細書の内容となるＢｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）ｉｎ Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ，ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐ．８ ３を参照されたい）。これらのベクターはｐＢＲ３２２オリの存在の故にＥ．コ リにおいて、ならびに酵母２ミクロンプラスミドの複製決定因子の故にＳ．セレ ビシアエにおいて複製することができる。さらにアンピシリンなどの薬剤耐性マ ーカーを用いることができる。 好ましい哺乳類発現ベクターは、バクテリアにおけるベクターの増殖を容易に するための原核配列、ならびに真核細胞において発現される１ つ又はそれ以上の真核転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮ ＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２− ｄｈｆｒ、ｐＴＫ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ 及びｐＨｙｇ誘導ベクターが真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳類発 現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核及び真核細胞の両 方における複製及び薬剤耐性選択を容易にするためにバクテリアプラスミド、例 えばｐＢＲ３２２からの配列で修正される。別の場合、ウシ乳頭腫ウィルス（Ｂ ＰＶ−１）又はエプスタイン・バールウィルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ−誘導及 びｐ２０５）などのウィルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の遷移的 発現に用いることができる。プラスミドの製造及び宿主生物の形質転換に用いら れる種々の方法が当該技術分野において周知である。原核及び真核細胞の両方の ための他の適した発現系、ならびに一般的組み換え法に関し、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉ ｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ ｓ：１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ１６ ａｎｄ １７を参照されたい。 いくつかの場合にはバクロウィルス発現系を用いることにより組み換えＵＢｃ を発現するのが望ましいことがあり得る。そのようなバクロウィルス発現系の例 にはｐＶＬ−誘導ベクター（例えばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ ９４１）、ｐＡｃＵＷ−誘導ベクター（例えばｐＡｃＵＷ１）、ならびにｐＢｌ ｕｅＢａｃ−誘導ベクター（例えばβ−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ）が 含まれる。 ユビキチン−結合性酵素の一部、すなわち切り取り（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ） 突然変異体の発現が望まれている場合、発現されるべき所望の配列を含むオリゴ ヌクレオチドフラグメントに開始コドン（ＡＴＧ）を付加する必要があり得る。 Ｎ−末端位置におけるメチオニンを酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ ）の使用により酵素的に切断できることは、当該技術分野において周知である。 ＭＡＰはＥ．コリ（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７５７）及びサルモネラ・チフィリウム（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からクローニングされ、その試 験管内活性が組み換えタンパク質上で示された（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（ １９８７）ＰＮＡＳ ８４：２７１８−１７２２）。従って必要ならＮ−末端メ チオニンの除去を、ＭＡＰを生産する宿主（例えばＥ．コリ又はＣＭ８９又はＳ ．セレビシアエ）におけるＵＢＣ−誘導ポリペプチドの発現により生体内で、あ るいは精製ＭＡＰの使用により（例えばＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．の方法）試 験管内で行うことができる。 別の場合、ポリペプチドのコード配列を種々のポリペプチドをコードするヌク レオチド配列を含む融合遺伝子の一部として挿入することができる。この型の発 現系は、ＵＢＣタンパク質の免疫原性フラグメントを製造することが望まれてい る条件下で有用であり得る。典型的実施態様の場合、ロータウィルスのＶＰ６キ ャプシドタンパク質をモノマー形態で、又はウィルス粒子の形態で、ｈＵｂＣＥ 又はｒａｐＵＢＣポリペプチドの一部のための免疫原性担体タンパク質として用 いることができる。それに対して抗体が誘起されるべきｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵ ＢＣタンパク質の部分に対応する核酸配列を、後期（ｌａｔｅ）ワクシニアウィ ル ス構造タンパク質に関するコード配列を含む融合遺伝子構築物中に挿入し、ビリ オンの一部としてタンパク質ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣの一部を含む融合タン パク質を発現する１組の組み換えウィルスを製造することができる。Ｂ型肝炎表 面抗原融合タンパク質を利用する免疫原性融合タンパク質を用い、組み換えＢ型 肝炎ビリオンをこの役割に十分に利用できることが示された。同様に、ＵＢＣタ ンパク質の一部及びポリオウィルスキャプシドタンパク質を含む融合タンパク質 をコードするキメラ構築物を創造し、そのポリペプチド抗原の組の免疫原性を強 化することができる（例えばヨーロッパ特許出願公開番号０２５９１４９号；な らびにＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３８５５；及び Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２を 参照されたい）。 ペプチドに基づく免疫化のための複数抗原ペプチド系も利用することができ、 その場合はＵＢＣタンパク質の所望の部分を、オリゴマー的分枝リシンコア上へ のペプチドの有機化学的合成から直接得る（例えばＰｏｓｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：１７１９及びＮａｒｄｅｌｌ ｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：９１４を参照され たい）。ＵＢＣタンパク質の抗原決定基もバクテリア細胞により発現され、与え られることができる。 免疫原性の強化のための融合タンパク質の利用に加え、融合タンパク質が本発 明のＵＢＣタンパク質などのタンパク質の発現を容易にすることもできることが 広く認識されている。例えば以下に記載する通り、ｈ ＵｂＣＥタンパク質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タ ンパク質として生成することができる。そのようなＧＳＴ融合タンパク質は、例 えばグルタチオン−誘導マトリックスの使用などにより、ｈＵｂＣＥタンパク質 の精製を可能にすることができる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ＮＹ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｓｍｉｔ ｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１；及びＫａｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０：３５１を参照されたい）。別の実施態様 の場合、ｈＵｂＣＥタンパク質の所望の部分のＮ−末端においてポリ−（Ｈｉｓ ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列（ｐｕｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ²⁺ 金属樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、発現されたｈＵ ｂＣＥ−融合タンパク質の精製を可能にする。それからエンテロキナーゼを用い た処理により精製リーダー配列を続いて除去することができる（例えばＨｏｃｈ ｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１ ：１７７；及びＪａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８８：８９７２を 参照されたい）。類似の構築物をｒａｐＵＢＣ、ｃａＵｂＣＥ又はｓｐＵｂＣＥ の発現のために生成することができる。 融合遺伝子を作るための方法は周知である。本質的に種々のポリペプチド配列 をコードする種々のＤＮＡフラグメントの結合が従来の方法に従い、連結のため の平滑−末端化又はスタッガー−末端化末端、適した末端を与えるための酵素消 化、適宜の付着末端の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ −ｉｎ）、望ましくない結合を避けるためのアルカリ性ホスファターゼ処理、及 び酵素的連結を用いて行われる。別の実施態様の場合、自動化ＤＮＡ合成機を含 む従来の方法により融合遺伝子を合成することができる。別の場合、２つの連続 的遺伝子フラグメントの間の相補的張り出し（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を生じさせ るアンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことがで き、それを続いてアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生成することができる（ 例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。 これらの、及び他の機能的に同等のペプチドの製造のためのｈＵｂＣＥタンパ ク質の種々の修飾を本明細書において詳細に説明する。同様に作用形態及び拮抗 形態の両方を含む本ｒａｐＵＢＣ、ｃａＵＢＣ及びｓｐＵＢＣポリペプチドの同 族体が意図されている。本明細書で用いられるペプチドという用語は、ペプチド 、タンパク質及びポリペプチドを言う。 本発明は又、他の細胞外タンパク質、特に細胞環境におけるユビキチン−結合 性酵素に通常伴うユビキチン−結合性系の他のタンパク質（すなわち他のＥ１又 はＥ２酵素、ならびにＥ３酵素又はユビキチン）から単離された、又は他の方法 で実質的にそれらが除去された単離ＵＢＣタンパク質を入手できるようにする。 「実質的に他の細胞外タンパク質が除去された」（本明細書で「汚染タンパク質 」とも言われる）という用語は、２０％未満（乾燥重量により）の汚染タンパク 質を含む、好ましくは５％未満の汚染タンパク質を含む本ＵＢＣタンパク質の製 造を意図 するとして定義される。機能的形態の本ＵＢＣタンパク質は、本明細書に記載の クローニングされた遺伝子を用いることにより精製試料として始めて製造するこ とができる。「精製された」はペプチド又はＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を言う場 合、示されている分子が他の生物学的巨大分子、例えば他のタンパク質（特にユ ビキチン系の他の酵素、例えば他のＥ１もしくはＥ２タンパク質、ならびに他の 汚染タンパク質）の実質的不在の状態で存在することを意味する。本明細書で用 いられる「精製された」という用語は少なくとも８０乾燥重量％、より好ましく は９５〜９９重量％の範囲、最も好ましくは少なくとも９９．８重量％の同じ型 の生物学的巨大分子が存在することを意味する（しかし水、緩衝液及び他の小分 子、特に５０００未満の分子量を有する分子は存在することができる）。本明細 書で用いられる「純粋な」という用語は、すぐ上の「精製された」と同じ数的制 限を有するのが好ましい。「単離された」及び「精製された」は、本来の状態の 自然の材料、あるいは成分に分離されたが（例えばアクリルアミドゲルにおいて ）純粋な（例えば汚染タンパク質又はクロマトグラフィー試薬、例えば変性剤及 びポリマー類、例えばアクリルアミド又はアガロースを含まない）物質又は溶液 としては得られていない自然の材料を意図していない。 本明細書に記載のＵＢＣタンパク質の活性を有する、あるいは自然に存在する 形態のＵＢＣタンパク質の拮抗薬として機能することができる単離ペプチドも、 そのようなペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組み換えによ り製造されるペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。さら に従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃもしくはｔ−Ｂｏｃ化学などの当 該技術分野において既知の 方法を用いてフラグメントを化学的に合成することができる。例えばｈＵｂＣＥ タンパク質をフラグメントのオーバーラップのない所望の長さのフラグメントに 任意に分けることができ、あるいは好ましくはオーバーラップする所望の長さの フラグメントに分けることができる。フラグメントを製造し（組み換えにより、 又は化学的合成により）、試験してｈＵｂＣＥタンパク質活性を有するペプチド を同定する、あるいは別の場合拮抗薬を同定することができる。ｒａｐＵＢＣ、 ｃａＵｂＣＥ及びｓｏＵｂＣＥタンパク質の同様の操作を行うことができる。 さらに治療的又は予防的効果、あるいは安定性（例えば生体外における保存寿 命及び生体内におけるタンパク質分解に対する抵抗性）の強化などの目的のため に、ＵＢＣポリペプチドの構造を修飾することもできる。そのような修飾ペプチ ドは、本明細書において定義されるＵＢＣタンパク質の活性を有する、又はそれ に拮抗するペプチドの機能的同等物と考えられる。アミノ酸配列が、例えばアミ ノ酸置換、欠失又は付加により改変された修飾ポリペプチドを製造することがで きる。 例えばイソロイシン又はバリンを用いたロイシンの、グルタメートを用いたア スパルテートの、セリンを用いたトレオニンの隔離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ） 置換、あるいは構造的に関連するアミノ酸を用いたアミノ酸の類似の置換（すな わち保存的突然変異）が、得られる分子の生物学的活性に大きな影響を持たない ことを予想するのは合理的である。同類置換は、それらの側鎖が関連しているア ミノ酸の群内で起こる置換である。遺伝子によりコードされるアミノ酸は４つの 群：（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート；（２）塩基性：リシン、アル ギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ ン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４ ）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、ト レオニン、チロシンに分けることができる。フェニルアラニン、トリプトファン 及びチロシンは芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。同様にアミ ノ酸のレパートリーを（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート；（２）塩基 性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バ リン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トリオニン、場合によりセリン及びト レオニンは脂肪族−ヒドロキシルとして別に分類される；（４）芳香族＝フェニ ルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタ ミン；ならびに（６）硫黄−含有＝システイン及びメチオニンと分類することが できる。（例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒ ｙｅｒ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．：１９８１を参照されたい）。 ペプチドのアミノ酸配列における変化が機能的ＵＢＣ同族体を生ずるか否かは、 変異ペプチドの、例えば野生−型ＵＢＣと類似のやり方でユビキチン化を媒介す る能力を評価することにより容易に決定することができる。１つより多い置換が 起こったペプチドを同じ方法で容易に試験することができる。 本発明は本ＵＢＣタンパク質の組み合わせ突然変異体の組、ならびに切り取り 及びフラグメント化突然変異体を生成するための方法も含み、それは細胞タンパ ク質のユビキチン化において機能的である可能性のある変異配列の同定のために 有用である。そのような組み合わせライブラリをスクリーニングするための１つ の目的は、例えば野生−型（「基準」）ＵＢＣ活性の拮抗薬として作用する新規 なＵＢＣ同族体、例えばｐ５ ３ユビキチン化を阻害するｈＵｂＣＥ同族体、あるいは別の場合新規な活性を全 部一緒に有する新規なＵＢＣ同族体を単離することである。そのようなタンパク 質は組み換えＤＮＡ構築物から発現されると、遺伝子療法案において用いること ができる。 同様に、突然変異誘発は対応する野生−型タンパク質と劇的に異なる細胞内半 減期を有するＵＢＣ同族体を生じ得る。例えば改変タンパク質をタンパク質分解 、あるいは自然に存在する形態の本ｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣタンパク質 の破壊、又は他の場合、不活性化を生ずる他の細胞過程に対し、より安定に、又 はより不安定にすることができる。そのようなｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣ 同族体（作用薬又は拮抗薬同族体）、及びそれらをコードする遺伝子を用い、タ ンパク質の半減期を調節することにより組み換えｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢ Ｃ発現のエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を改変することができる。例えば組 み換えｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣの場合の短い半減期は、その同族体に伴 うより遷移的な生物学的効果を生ずることができ、誘導可能な発現系の一部の場 合、細胞内における組み換えｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣ量のより厳格な制 御を可能にする。上記の通り、そのようなタンパク質、及び特にそれらの組み換 え核酸構築物は、遺伝子治療案において用いることができる。 この方法の１つの側面の場合、ＵＢＣ同族体又は他の関連タンパク質の集団に 関するアミノ酸配列を、好ましくは可能な限り高い相同性を促進するように並べ る。そのような変異体の集団は、例えば１つ又はそれ以上の種からのｈＵｂＣＥ もしくはｒａｐＵＢＣ同族体、あるいは同じ種からであるが突然変異の故に異な るＵＢＣ同族体を含むことができる。 並べられる配列の各位置において現れるアミノ酸は、組み合わせ配列の縮重組を 創造するように選ばれる。例えば添付の配列表（図５も参照されたい）に示され るｈＵｂＣＥ、ｃａＵｂＣＥ及びｓｐＵｂＣＥ配列の整列は、一般式： ［式中、Ｘａａ（１）はＡｌａ又はＳｅｒを示し；Ｘａａ（２）はＨｉｓ又はＡ ｓｎを示し；Ｘａａ（３）はＬｙｓ又はＡｒｇを示し；Ｘａａ（４）はＡｌａ、 Ｓｅｒ又はＡｓｎを示し；Ｘａａ（５）はＧｌｙ又はＡｌａを示し；Ｘａａ（６ ）はＡｒｇ又はＬｙｓを示し；Ｘａａ（７）はＡｌａ又はＳｅｒを示し；Ｘａａ （８）はＧｌｎ又はＳｅｒを示し；Ｘａａ（９）はＬｅｕ又はＭｅｔを示し；Ｘ ａａ（１０）はＰｈｅ又はＴｙｒを示し；Ｘａａ（１１）はＳｅｒ又はＴｈｒを 示し；Ｘａａ（１２）はＧｌｎ又はＡｌａを示し；Ｘａａ（１３）はＳｅｒ又は Ｔｈｒを示し；Ｘａａ（１４）はＬｅｕ又はＰｈｅを示し；Ｘａａ（１５）はＶ ａｌ又はＩｌｅを示し；Ｘａａ（１６）はＡｌａ又はＡｓｎを示し；Ｘａａ（１ ７）はＬｅｕ又はＰｈｅを示し；Ｘａａ（１８）はＡｒｇ又はＬｙｓを示し；Ｘ ａａ（１９）はＳｅｒ又はＡｓｎを示し；Ｘａａ（２ ０）はＡｒｇ又はＬｙｓを示し；Ｘａａ（２１）はＳｅｒ又はＡｓｐを示し；Ｘ ａａ（２２）はＴｈｒ又はＣｙｓを示し；Ｘａａ（２３）はＡｌａ又はＰｒｏを 示し；Ｘａａ（２４）はＡｒｇ又はＨｉｓを示し；Ｘａａ（２５）はＶａｌ又は Ｉｌｅを示し；Ｘａａ（２６）はＬｙｓ又はＧｌｎを示し；Ｘａａ（２７）はＴ ｈｒ又はＧｌｎを示し；Ｘａａ（２８）はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＧｌｕを示し；Ｘ ａａ（２９）はＡｒｇ又はＬｙｓを示し；Ｘａａ（３０）はＡｓｎ又はＧｌｎを 示し；Ｘａａ（３１）はＡｌａ、Ｌｅｕ又はＡｒｇを示し；Ｘａａ（３２）はＩ ｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒを示し；Ｘａａ（３３）はＡｒｇ又はＬｙｓを示し；Ｘ ａａ（３４）はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＧｌｎを示し；Ｘａａ（３５）はＶａｌ、Ｉ ｌｅ又はＭｅｔを示す］ により示されるＵｂＣＥタンパク質の縮重ライブラリの形成に用いることができ る。 ライブラリをさらに拡張するために、ＵｂＣＥのそれぞれに現れる残基と同じ 「群」のものである他のアミノ酸残基を含むことにより、縮重位置（Ｘａａ）の それぞれをさらに縮重させることができ、例えばＸａａ（１）はＧｌｙ、Ａｌａ 、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ（例えば脂肪族）であることがで き、Ｘａａ（２２）はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ又はＭｅｔ（脂肪族−カルボキシ ル及び硫黄−含有）などであることができる。別の場合、例えばアミノ酸側鎖の 電荷又は極性にかかわらずに等立体的（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）置換を行うことが できる。例えばＩｌｅ、Ａｓｎ及びＭｅｔの側鎖はそれぞれＬｅｕと大体同じ立 体的空間を占め、ＴｙｒはＰｈｅに関して等立体的であるので、Ｘａａ（１７） はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＴｙｒである ことができる。同様に縮合がヒト及び酵母同族体から保存されている場合、縮重 ライブラリはその位置において、例えばヒトＵｂＣＥに存在するアミノ酸残基の みを含むことができる。例えばＸａａ（３）はｈＵｂＣＥ及びｃａＵｂＣＥにお いてはリシンであり、ｓｐＵｂＣＥにおいてはアルギニンである。同等物として のヒトＵｂＣＥの保存的突然変異を排除するライブラリの場合、Ｘａａ（３）は Ｌｙｓである。 好ましい実施態様の場合、組み合わせＵＢＣライブラリは、それぞれＵＢＣ配 列の可能性のある配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリをコー ドする遺伝子の縮重ライブラリを用いて製造される。合成オリゴヌクレオチドの 混合物を、ＵＢＣ配列の可能性のある配列の縮重組が各ポリペプチドとして、あ るいは別の場合、ＵＢＣ配列の組をそこに含むもっと大きな融合タンパク質の組 として（例えばファージディスプレー（ｐｈａｒｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）のため に）発現されるように、遺伝子配列中に酵素的に連結する。 ＵＢＣ同族体の可能性のある同族体のライブラリを縮重オリゴヌクレオチド配 列から形成する多くの方法がある。自動化ＤＮＡ合成機において縮重遺伝子配列 の化学的合成を行い、次いで合成遺伝子を発現のために適した遺伝子中に連結す ることができる。遺伝子の縮重組の目的は、ＵＢＣ配列の可能性のある配列の所 望の組をコードする配列のすべてを１つの混合物において与えることである。縮 重オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野において周知である（例えばＮａｒ ａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ ３ｒ ｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓ，ｅｄ．ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃ ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。そのような方法 は他のタンパク質の方向付けられた進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏ ｎ）において用いられてきた（例えばＳｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９ ９２）ＰＮＡＳ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１ ９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ ．（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５， ２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号及び第５，０９６，８１５号を参照 されたい）。 点突然変異によりつくれらる組み合わせライブラリの遺伝子産物のスクリーニ ングのため、及びある種の性質を有する遺伝子産物に関するｃＤＮＡライブラリ のスクリーニングのための広範囲の方法が当該技術分野において既知である。そ のような方法は一般に、ＵＢＣ同族体の組み合わせ突然変異誘発により形成され る遺伝子ライブラリの急速スクリーニングに適応させることができるであろう。 大きな遺伝子ライブラリのスクリーニングのための最も広く用いられる方法は典 型的に、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクター中にクローニングし、得ら れるベクターのライブラリを用いて適した細胞を形質転換し、所望の活性の検出 が、検出された産物の遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離 を促進する条件下で組み合わせ遺伝子を発現させることを含む。以下に記載する 典型的アッセイのそれぞれは、多数の、例えば組み合わせ突然変異誘発法により 創造される縮重ＵＢＣ配列をスクリーニングするのに必要な高処理量分析を与え る。 １つの典型的スクリーニングアッセイの場合、ｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢ Ｃ遺伝子候補の産物を細胞又はウィルス粒子の表面上に現し、特定の細胞又はウ ィルス粒子がこの遺伝子産物を介してユビキチン経路の他の成分、例えばＥ１も しくはＥ３タンパク質（例えばＥ６ＡＰもしくはＥ６ＡＰ複合体）、ユビキチン 、又は細胞周期調節タンパク質に結合する能力を「パンニングアッセイ（ｐａｎ ｎｉｎｇ ａｓｓａｙ）」において検出する。例えば遺伝子ライブラリをバクテ リア細胞の表面膜タンパク質に関する遺伝子中にクローニングし、得られる融合 タンパク質をパンニングにより検出することができる（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａ ｌ．，ＷＯ ８８／０６６３０；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７１；及びＧｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＴＩＢＳ １８：１３６−１４０）。同様の方法で、ｈＵｂ ＣＥ又はｒａｐＵＢＣに結合する蛍光標識分子を用い、機能性ｈＵｂＣＥ又はｒ ａｐＵＢＣ同族体の可能性のある同族体に関して印を付けることができる。細胞 を視覚により調べ、蛍光顕微鏡下で分離するか、あるいは細胞の形態が許す場合 は蛍光活性化細胞選別機により分離することができる。 別の実施態様の場合、遺伝子ライブラリをウィルス粒子の表面上の融合タンパ ク質として発現させる。例えば繊維状ファージ系において、異種ペプチド配列を 感染性ファージの表面上で発現させ、それにより２つ の有意な利益を与えることができる。第１に、これらのファージは非常に高い濃 度でアフィニティーマトリックスに適用することができるので、１回で多数のフ ァージをスクリーニングすることができる。第２に、各感染性ファージはその表 面上に組み合わせ遺伝子産物を現すので、特定のファージがアフィニティーマト リックスから低収率で回収されたら、ファージをもう１回の感染により増幅する ことができる。ファージｇＩＩＩ又はｇＶＩＩＩコートタンパク質のいずれかを 用いてウィルス粒子の究極的パッケージングを崩壊させずに融合タンパク質を生 成できるので、ほとんど同じＥ．コリ繊維状ファージ、Ｍ１３、ｆｄ及びｆ１の 群は、ファージディスプレーライブラリにおいて最も多く用いられる（Ｌａｄｎ ｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開第（ＰＣＴ公開ＷＯ）９０／０２９０９号；Ｇａｒ ｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０９６９０号；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６ ０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２： ７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡ Ｓ ８９：４４５７−４４６１）。 典型的な実施態様の場合、ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ組み合わせライブラリ の発現及びスクリーニングにおいて用いるために、組み換えファージ抗体系（Ｒ ＰＡＳ、Ｐｈａｒｍａｃｉａカタログ番号２７−９４００−０１）を容易に修正 することができる。例えばＲＰＡＳキットのｐＣＡＮＴＡＢ５ファージミドは、 ファージｇＩＩＩコートタンパク質をコードする遺伝子を含む。ｈＵｂＣＥ又は ｒａｐＵＢＣ組み合わせ遺伝 子ライブラリをｇＩＩＩシグナル配列に隣接するファージミド中に、それがｇＩ ＩＩ融合タンパク質として発現されるようにクローニングすることができる。連 結の後、ファージミドを用いて受容性Ｅ．コリＴＧ１細胞を形質転換する。形質 転換された細胞を、続いてＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに感染させ、ファージ ミド及びそのｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ遺伝子候補挿入片を救い出す。得られ る組み換えファージは、特定のｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ候補をコードするフ ァージミドＤＮＡを含み、対応する融合コートタンパク質の１つ又はそれ以上の コピーを現す。ファージにより現され、特定の標的タンパク質、例えばＥ１酵素 、Ｅ３タンパク質（すなわちＥ６もしくはＥ６−ＡＰ）、あるいは特定の調節タ ンパク質（例えばｐ５３もしくはｐ２７）に結合することができるｈＵｂＣＥ又 はｒａｐＵＢＣ候補をパンニングにより選択するか、又は濃縮する。例えばファ ージライブラリをグルタチオン固定化ｐ５３−ＧＳＴ融合タンパク質又はＥ６− ＧＳＴもしくはＥ６−ＡＰ−ＧＳＴ融合タンパク質上で左右に動かし（ｐａｎｎ ｅｄ）、非結合ファージを細胞から洗い出すことができる。次いで結合ファージ を単離し、組み換えファージが野生型ｇＩＩＩコートタンパク質の少なくとも１ つのコピーを発現したら、それらはＥ．コリに感染する能力を保持している。か くして連続的再感染及びパンニングを用い、野生−型酵素の正常な標的と相互作 用する能力をいくらか保持しているＵＢＣ同族体を大きく濃縮することができ、 それを作用薬と拮抗薬を区別するために、さらに生物学的活性に関してスクリー ニングすることができる。典型的実施態様の場合、連続的パンニング段階におい て２種又はそれ以上の標的タンパク質を用いることにより、ファージディスプレ ーライブラリを、自然に存在 するＵＢＣの正常な細胞機能の拮抗薬候補であるｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ同 族体の単離に用いることができる。例えばライブラリからの、例えば乳頭腫ウィ ルスＥ６タンパク質又は細胞Ｅ６−ＡＰタンパク質に結合する能力を保持してい るが、ｐ５３に結合することができない変異体の単離はｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵ ＢＣ同族体の１組を与え、そのいくつかは対応する野生−型酵素のｐ５３のユビ キチン化を媒介する能力に拮抗することができる。 さらに別の典型的実施態様の場合、０８／１７６，９３７出願に記載のｐ５３ −依存性レポーター構築物を用い、ｐ５３野生−型ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ の分解を阻害することによりレポーター遺伝子の発現を強化するそれらの能力を 介して拮抗薬を同定することができる。かくしてレポーター遺伝子の発現の検出 により組み合わせライブラリをスクリーニングし、さらなる操作のために適した クローンを単離することができる。 他の形態の突然変異誘発を用いて本ＵＢＣタンパク質から組み合わせライブラ リを形成することもできる。例えばアラニン走査突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などを用いたスクリーニング（ Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５ −１５７２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕ ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８ ９２；Ｌａｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ ０：１０８３２−１０８３８；及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９ ８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）により、リンカー走査突 然変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９ ３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１ ９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）により；飽和突然変異誘発（Ｍｅｙ ｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）により； ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃ ｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １：１１−１９）により；あるいはランダム突然変 異誘発（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓ ｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；及びＧｒｅｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ ．（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３ ４）によりライブラリから例えばｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ同族体（作用薬及 び拮抗薬形態の両方）を生成し、単離することができる。 本発明の重要な目的はＵＢＣタンパク質の、究極的に他の細胞及び／又はウィ ルスタンパク質とのＵＢＣの結合を崩壊させることができるＵＢＣ擬似物、例え ばペプチド又は非−ペプチド剤の生成に用いることができる小さい機能的単位へ の縮小を提供することである。かくして本明細書に記載のような突然変異誘発法 は、例えばユビキチン−結合性系の他のタンパク質（細胞性及びウィルス性の両 方）、ならびに標的タンパ ク質自身（例えば細胞周期調節タンパク質）への本ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ の結合に含まれるタンパク質−タンパク質相互作用に関与するｈＵｂＣＥ又はｒ ａｐＵＢＣタンパク質の決定基のマッピングに特に有用である。例えばＥ６及び ／又はＥ６−ＡＰの分子認識に含まれるｈＵｂＣＥの決定的残基を決定し、競合 的にｈＵｂＣＥ結合を阻害するｈＵｂＣＥ−誘導ペプチド擬似物を生成するため に用いることができる。例えばＥ６ＡＰの結合に含まれるｈＵｂＣＥのアミノ酸 残基のマッピングに走査突然変異誘発を用いることにより、Ｅ６ＡＰへの結合に おけるこれらの残基を模し、従ってｈＵｂＣＥのＥ６ＡＰへの結合を阻害し、ｐ ５３の細胞半減期の調節におけるＥ６ＡＰの機能を妨害することができるペプチ ド擬似化合物を生成することができる。例えばそのような残基の加水分解−不可 能ペプチド類似体を、ベンゾジアゼピン（例えばＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｌｅ ｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照されたい）、アゼピン（例 えばＨｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｅｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯ Ｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を 参照されたい）、置換ガンマラクタム環（Ｇａｒｖｙ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅ ｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒ ｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔ ｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８）、ケト−メチレンプソイドペプチド（Ｅｗｅｎｓ ｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８ ６）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐ ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｅ ｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋ ｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５）、β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；及びＳ ａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒ ａｎｓ １：１２３１）、ならびにβ−アミノアルコール類（Ｇｏｒｄｏｎ ｅ ｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕ ｎ １２６：４１９；及びＤａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）を用いて生成するこ とができる。そのようなペプチド擬似物は、例えばｐ５３の破壊におけるｈＵｂ ＣＥの作用を妨げる薬剤として働くことができる。さらにタンパク質−タンパク 質相互作用に関するそのようなデータは、以下に記載するｈＵｂＣＥの分子模型 と結合させ、この相互作用の擬似物の理論的設計において用いることができる。 同様の方法で、例えば抗−真菌剤の生成において有用であり得るｃａＵｂＣＥ及 びｓｐＵｂＣＥのペプチド擬似物を誘導することができる。 本発明の他の側面は、本ＵＢＣタンパク質と特異的に反応性である抗体に関す る。例えば本発明のｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣタンパク質から誘導される免疫 原を用いることにより、標準的案により抗−タンパク質／抗−ペプチド抗血清又 はモノクローナル抗体を作ることができる（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎ ｕａｌ ｅｄ．ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８を参照されたい）。マウス、ハムスタ ー又はウサギなどの哺乳類をペプチド（例えば全ＵＢＣタンパク質又は抗体応答 を引き出すことができる抗原性フラグメント）の免疫原形態を用いて免疫化する ことができる。タンパク質またペプチドに免疫原性を与える方法は、担体への結 合性又は当該技術分野において周知の他の方法を含む。本ＵＢＣタンパク質の免 疫原部分をアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血 漿又は血清における抗体力価の検出により監視することができる。免疫原を抗原 として標準的ＥＬＩＳＡ又は他の免疫アッセイを用い、抗体の量を評価すること ができる。好ましい実施態様の場合、本抗体はｈＵｂＣＥ抗原決定基、例えば配 列番号２により示されるタンパク質、あるいは密接に関連するヒト又は非−ヒト 哺乳類同族体（例えば配列番号２に９０パーセント相同、好ましくは少なくとも ９５パーセント相同、最も好ましくは配列番号２に少なくとも９７パーセント相 同）の抗原決定基に関して免疫特異的である。本発明に関するさらに別の好まし い実施態様の場合、抗−ｈＵｂＣＥ抗体は、例えば配列番号２との相同性が９０ パーセント未満である；例えば配列番号２との相同性が９５パーセント未満であ る；例えば配列番号２との相同性が９８〜９９パーセント未満であるタンパク質 と実質的に交差反応しない。「実質的に交差反応しない」は：抗体が有する非− 相同Ｅ２酵素に関する結合アフィニティーが、配列番号２のタンパク質に関する その抗体の結合アフィニティーの１０パーセント未満、より好ましくは５パーセ ント未満、最も好ましくは約１〜２パーセント未満である；抗体が配列番号２に 非−相同であるタンパク質に 特異的に結合しないことを意味する。本ｃａＵｂＣＥ、ｓｐＵｂＣＥ及びｒａｐ ＵＢＣタンパク質に対する好ましい抗体は類似の基準を有し、例えばｃａＵｂＣ Ｅ、ｓｐＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣに関して特異的な抗体は、それぞれ配列番号 ４、６又は１３との高い配列相同性を共有しないタンパク質に特異的に結合しな い。 免疫化に続き、本ＵＢＣ類の１つ又はそれ以上と選択的に反応性の抗血清を得 ることができ、必要ならポリクローナル抗−ＵＢＣ抗体を血清から単離すること ができる。モノクローナル抗体の製造のために、抗体生産細胞（リンパ球）を免 疫化動物から収穫し、標準的体細胞融合法を用いて骨髄腫細胞などの不感化細胞 と融合させ、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような方法は当該技 術分野において周知であり、例えばハイブリドーマ法(最初にＫｏｈｌｅｒ ａ ｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，(１９７５)Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７に より開発)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．，（１ ９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、及びヒトモノクロー ナル抗体の製造のためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃ ｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６） を含む。ハイブリドーマ細胞を本タンパク質と特異的に反応性の抗体の生産に関 して免疫化学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体をそのようなハイブリ ドーマ細胞を含む培養物から単離することができる。 本発明で用いられる抗体という用語は、本発明のＵＢＣタンパク質とやはり特 異的に反応性であるそれらのフラグメントを含むものとする。 抗体を従来の方法を用いてフラグメント化し、フラグメントを全抗体に関して上 記で説明した方法と同じ方法で有用性に関してスクリーニングすることができる 。例えばＦ(ａｂ')₂フラグメントを、抗体をペプシンで処理することにより生成 することができる。得られるＦ(ａｂ')₂フラグメントを処理してジスルフィド架 橋を還元し、Ｆａｂ’フラグメントを製造することができる。本発明の抗体はさ らに、抗−ＵＢＣ部分を有する二重特異性及びキメラ分子を含むものとする。 本ユビキチン結合性系に対して方向付けられたモノクローナル及びポリクロー ナル抗体（Ａｂ）の両方、ならびにＦａｂ’及びＦ(ａｂ')₂などの抗体フラグメ ントは、酵素の作用を阻害する専門化学品として用いることができ、例えば抗− ＵＢＣ抗体の微量注入により本ＵＢＣが阻害された場合の例えば細胞周期又は細 胞増殖の研究を可能にする。 ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣエピトープに特異的に結合する抗体は、ｈＵｂＣ Ｅ又はｒａｐＵＢＣの存在量及びその発現のパターンの評価のために、組織試料 の免疫組織化学的染色において用いることもできる。抗−ｈＵｂＣＥ又は抗−ｒ ａｐＵＢＣ抗体は、臨床試験法の一部として組織又は体液におけるｈＵｂＣＥ又 はｒａｐＵＢＣの検出及びその量の評価のために、免疫−沈降及び免疫−ブロッ ティングにおいて診断的に用いることができる。例えばそのような測定は、腫瘍 の発生又は進行の予測的評価において有用であり得る。同様に、患者におけるｈ ＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ量を監視できることは、その障害に悩む患者のために 与えられる処置法の有効性の決定を可能にする。本ＵＢＣのそれぞれの量は、体 液から単離される細胞において、例えば脳脊髄液又は血液の試料において測定す ることができ、あるいは生検により与えられるような 組織において測定することができる。抗−ｈＵｂＣＥ又は抗−ｒａｐＵＢＣ抗体 を用いる診断的アッセイは、例えば腫瘍性もしくは増殖性障害、例えば試料にお ける癌細胞の存在の早期診断における補助のために、例えばｈＵｂＣＥ又はｒａ ｐＵＢＣ遺伝子の損傷が起きている細胞の検出のために設計されるイムノアッセ イを含むことができる。 抗−ＵＢＣ抗体の他の用途は、λｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ及び λＯＲＦ８などの発現ベクター中に構築されるｃＤＮＡライブラリの免疫学的ス クリーニングにおいてである。コード配列が正しい読み取り枠及び配向で挿入さ れたこの型のメッセンジャーライブラリは、融合タンパク質を生産することがで きる。例えばλｇｔ１１は、アミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列か ら成り、そのカルボキシ末端が異種ポリペプチドから成る融合タンパク質を生産 するであろう。次いで抗体を用い、ＵＢＣの抗原性エピトープを、例えば抗−Ｕ ＢＣ抗体を用いて感染プレートから持ち上げられる反応ニトロセルロースフィル ターとして検出することができる。このアッセイにより印をつけられたファージ を、次いで感染プレートから単離することができる。かくしてｈＵｂＣＥ又はｒ ａｐＵＢＣ同族体の存在を検出し、他のヒト源からクローニングし、例えば密接 に相同性の他のヒトイソ型を同定する、ならびに他の哺乳類におけるｈＵｂＣＥ 又はｒａｐＵＢＣ同族体を同定することができる。 さらに、ヒト細胞系からの本ｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣのクローニング から決定されるヌクレオチド配列は、他のヒト細胞−型、特に癌、あるいは他の 形質転換された、又は不朽化された細胞におけるｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢ Ｃ同族体、ならびに他の非−ヒト哺乳類から のｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣ同族体の同定において用いるために設計され るプローブの生成を可能にする。酵母ＵｂＣＥ配列、ｃａＵｂＣＥ及びｓｐＵｂ ＣＥに基づくプローブを生成することができ、表現型真菌感染の同定に用いるこ とができる。 さらに、クローニングされたｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣタンパク質の配列か ら、無損傷の組織及び組織試料のｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ ｍＲＮＡの存在 に関する組織学的スクリーニングを可能にするヌクレオチドプローブを生成する ことができる。抗−ｈＵｂＣＥ又は抗−ｒａｐＵＢＣ抗体の診断的利用と同様に 、ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ ｍＲＮＡに、あるいはゲノムｈＵｂＣＥ又はｒ ａｐＵＢＣ配列に向けられたプローブの利用を、例えば腫瘍性又は増殖性障害（ 例えば望ましくない細胞成長）において発現し得る対立遺伝子突然変異の予測的 及び治療的評価の両方に用いることができる。ヌクレオチドプローブは、抗−ｈ ＵｂＣＥ又は抗−ｒａｐＵＢＣ抗体イムノアッセイと結合して用いられ、ｈＵｂ ＣＥ又はｒａｐＵＢＣタンパク質の発現（又はその欠如）に伴ういくつかの異常 を含み得る発育障害に関する、分子に基づく決定を助けて容易にすることができ る。例えばｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ合成における変動をｈＵｂＣＥ又はｒａ ｐＵＢＣコード配列における突然変異と区別することができる。 例えば本方法は、患者が望ましくない細胞増殖を特徴とする障害の危険にある か否かの決定の方法を提供する。好ましい実施態様の場合、本方法は一般に、（ ｉ）ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣをコードする遺伝子の突然変異、あるいは（ｉ ｉ）ＵＢＣ遺伝子の誤−発現の少なくとも１つを特徴とする遺伝的障害の存在又 は不在の、患者（例えばヒト患者） の組織における検出を含むことにより特徴付けられ得る。例えばそのような遺伝 的障害は、（ｉ）ＵＢＣ遺伝子からの１つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失、 （ｉｉ）ＵＢＣ遺伝子への１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ） ＵＢＣ遺伝子の１つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ｈＵｂＣＥ又 はｒａｐＵＢＣ遺伝子の全体的染色体転移（ｇｒｏｓｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）、（ｖ）ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ遺伝子 のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける全体的改変、（ｖｉ）ｈＵｂＣ Ｅ又はｒａｐＵＢＣ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非−野生型スプライ シングパターンの存在、及び（ｖｉｉ）ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣタンパク質 の非−野生型量の少なくとも１つの存在を突き止めることにより検出することが できる。本発明の１つの側面において、配列番号：１又は配列番号：１２のセン ス又はアンチセンス配列、あるいは自然に存在するこれらの突然変異体、あるい は５’又は３’フランキング配列、あるいはｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣ遺 伝子に自然に伴うイントロン配列にハイブリッド形成することができるヌクレオ チド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供す る。プローブは組織試料の核酸に暴露され；試料核酸へのプローブのハイブリッ ド形成が検出される。ある実施態様の場合、障害の検出は、例えばポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３ ，２０２号を参照されたい）における、あるいは別の場合、連結連鎖反応（ＬＣ Ｒ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４ ）ＰＮＡＳ ９１：３６０ −３６４を参照されたい）におけるプローブ／プライマーの利用を含み、後者は ｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ遺伝子における点突然変異の検出にさえ特に有用で あり得る。別の場合、又はさらにｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣタンパク質の量を イムノアッセイにおいて検出することができる。 又、アンチ−センス法の利用（例えばアンチセンス分子の微量注入、あるいは その転写物が例えばＵＢＣ ｍＲＮＡに関してアンチ−センスであるプラスミド を用いたトランスフェクション）は、本ＵＢＣタンパク質のそれぞれの内因性生 産の阻害により、細胞周期又は細胞増殖におけるそのタンパク質の役割を研究す るために用いることができる。そのような方法は細胞培養において用いることが できるが、形質転換動物の創造においても用いることができる。 本発明の他の側面は、例えば発生的及び増殖的疾患（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｌ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）に関する動物モ デルとしての形質転換動物に関しており、それは本発明の形質転換遺伝子を含む 細胞（その動物の）を含み、好ましくは（場合によりであるが）、動物の１つ又 はそれ以上の細胞において１つ又はそれ以上の組み換え形態の（作用薬又は拮抗 薬）本ＵＢＣ酵素を発現する。好ましい実施態様の場合、形質転換遺伝子の発現 は、例えば所望のパターンに発現を調節するシス−作用性配列を利用して細胞、 組織又は発育段階の特定のサブセットに制限されている。本発明の場合、本ＵＢ Ｃタンパク質のそのようなモザイク発現は多くの形態の血統分析に必須であり得 、さらに、そうでなかったら正常である胚内の組織の小区画における発生を全体 的に改変させ得るＵＢＣ突然変異又は過剰発現の影響を評価する手段を与えるこ とができる。これに向かい、組織−特異的調節配 列及び条件調節配列を用いて形質転換遺伝子の発現をある空間的パターンに調節 することができる。さらに、例えば条件的組み換え系又は原核転写調節配列によ り、発現の一時的パターンを与えることができる。 形質転換遺伝子の発現を生体内の部位−特異的遺伝子操作を介して調節できる ようにする遺伝子的方法は、当該技術分野における熟練者に既知である。例えば 標的配列の遺伝子組み換えを触媒するリコンビナーゼの調節された発現を可能に する遺伝子系を利用できる。本明細書で用いられる「標的配列」という句は、リ コンビナーゼにより遺伝子組み換えされるヌクレオチド配列を言う。標的配列に はリコンビナーゼ認識配列がフランキングし、リコンビナーゼ活性を発現する細 胞において一般に切り出されるか、又は逆転される。リコンビナーゼ触媒組み換 え現象は、標的配列の組み換えが本レセプターの発現の活性化又は抑制のいずれ かを生ずるように設計することができる。例えばレセプターの発現を活性化する ように、そのタンパク質の発現を妨害する標的配列の切り出しを設計することが できる。本タンパク質の発現のこの妨害は多様な機構、例えばプロモーター要素 からのＵＢＣ遺伝子の空間的分離又は内部停止コドンから生じ得る。さらに、Ｕ ＢＣ遺伝子のコード配列がリコンビナーゼ認識配列によりフランキングされてお り、最初にプロモーター要素に関して３’から５’への配向において細胞中にト ランスフェクションされる形質転換遺伝子を製造することができる。そのような 場合、標的配列の逆転は、コード配列の５’末端を、プロモーター要素に関して 、プロモーター促進転写活性を可能にする配向に置くことにより、本ＵＢＣ遺伝 子を再配向させるであろう。 典型的な実施態様の場合、バクテリオファージＰ１のｃｒｅｌｌｏｘ Ｐリコンビナーゼ系（Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ ８９： ６２３２−６２３６；Ｏｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ ８９： ６８６１−６８６５）又はサッカロミセス・セレビシアエのＦＬＰリコンビナー ゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１： １３５１−１３５５；ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／１５６９４）を用い、生体内にお いて部位−特異的遺伝子組み換え系を生成することができる。Ｃｒｅリコンビナ ーゼはｌｏｘＰ配列の間に位置する逆転標的配列の部位−特異的組み換えを触媒 する。ｌｏｘＰ配列はＣｒｅリコンビナーゼが結合する３４塩基対ヌクレオチド 繰り返し配列であり、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介遺伝子組み換えに必要である。 ｌｏｘＰ配列の配向は、介在する標的配列が、Ｃｒｅリコンビナーゼ配列が存在 する場合に切り出されるか、又は逆転されるかを決定し（Ａｂｒｅｍｓｋｉ ｅ ｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９−１５１４ ）；ｌｏｘＰ配列が正しい繰り返しとして配向している場合に標的配列の切り出 しを触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆転繰り返しとして配向している場合に標的配列の 逆転を触媒する。 従って標的配列の遺伝子組み換えはＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する。 リコンビナーゼの発現は、外部から加えられる薬剤により誘導可能又は抑制可能 な、例えば組織−特異的、発育段階−特異的な調節的制御に暴露されるプロモー ター要素により調節することができる。この調節された制御は、リコンビナーゼ 発現がプロモーター要素により媒介される細胞のみにおける、標的配列の遺伝子 組み換えを生ずる。かくして組み換えＵＢＣ遺伝子の発現の活性化を、リコンビ ナーゼ発現の調節を介して調節することができる。 例えばＣｙｓ８５Ｓｅｒ突然変異体又はアンチセンス遺伝子などの優性負の（ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）ＵＢＣ遺伝子の発現の調節のためのこれ らのリコンビナーゼの利用は、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び本遺伝子の両方をコー ドする形質転換遺伝子を含む形質転換動物の構築を必要とする。Ｃｒｅリコンビ ナーゼ及びＵＢＣ遺伝子の両方を含む動物は、「二重」形質転換動物の構築を介 して提供することができる。そのような動物の提供のための簡単な方法は、それ ぞれ例えばＵＢＣ遺伝子及びリコンビナーゼ遺伝子などの形質転換遺伝子を含む ２個の形質転換動物を交配することである。 本ＵＢＣタンパク質として有望なものから、リコンビナーゼ−媒介発現可能な フォーマットデバイス（ｆｏｒｍａｔ ｄｅｖｉｃｅ）に、ＵＢＣ形質転換遺伝 子を含む形質転換動物を最初に構築することから誘導される１つの利点は、形質 転換動物において発現されると有害であろう。そのような場合、本形質転換遺伝 子がすべての組織においてサイレントである始祖集団（ｆｏｕｎｄｅｒ ｐｏｐ ｕｌａｔｉｏｎ）を増殖させ、維持することができる。この始祖集団のそれぞれ を、例えば１つ又はそれ以上の組織においてリコンビナーゼを発現する動物と交 雑することができる。かくしてＵＢＣ形質転換遺伝子がサイレントである始祖集 団の創造は、例えば致死表現型を与え得る、組織又は発育段階におけるｐ５３チ ェックポイントの役割の研究を可能にするであろう。 原核プロモーター配列を用いた類似の条件的形質転換遺伝子を提供することが でき、それは形質転換遺伝子の発現を容易にするために原核タンパク質が同時に 発現されることを必要とする。代表的プロモーター及び対応するトランス−活性 化原核タンパク質が米国特許第４，８３３， ０８０号に示されている。さらに条件的形質転換遺伝子の発現を遺伝子療法−様 の方法により誘導することができ、その場合トランス−活性化タンパク質、例え ばリコンビナーゼ又は原核タンパク質をコードする遺伝子が組織に送達され、例 えば細胞−型特異的方法などにおいて発現させられる。この方法により、形質転 換遺伝子は、トランス−アクチベータの導入による「開始（ｔｕｒｎ ｏｎ）」 まで、サイレントのまま成熟することができる。 ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）又は崩壊形質転換動物を製造する方法も 一般に既知である。例えばＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅ ｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６） を参照されたい。 さらに、精製及び組み換え形態の本ＵＢＣタンパク質を利用できるようにする ことにより、本方法は結合性活性を阻害する薬剤に関するスクリーニングに用い ることができるアッセイの開発を容易にする。例えばＵＢＣタンパク質の他の細 胞（又はウィルス）タンパク質への結合を破壊する薬剤に加え、本Ｅ２酵素の酵 素活性の阻害剤はユビキチンの酵素への転移（Ｅ１酵素による）を妨げることが できるか、あるいはＥ２酵素からのユビキチンの細胞基質又は中間Ｅ３複合体、 例えばＥ６／Ｅ６−ＡＰへの下流転移を阻害することができる。好ましい実施態 様の場合、ＵＢＣ阻害剤は、例えばｈＵｂＣＥのＣｙｓ−８５又はｒａｐＵＢＣ のＣｙｓ−９３に共有結合する酵素を化学的に改変する機構に基づき、例えば本 ＵＢＣ酵素以外のヒトＥ２酵素に関して１０−倍、１００−倍、又はより好まし くは１０００−倍異なる阻害定数を有するその酵素の特 異的阻害剤である。阻害剤特異性は、例えばｈＵｂＣＥとＥ６／Ｅ６ＡＰ複合体 、あるいはｈＵｂＣＥとＥ１酵素の間の相互作用に含まれ、他のＥ２酵素に対し てこれらの複合体の１つに独特であるｈＵｂＣＥ酵素の特異性小部位を用いるこ とにより向上させることができる。類似の方法を用い、ｒａｐＵＢＣ活性に対し て作用性又は拮抗性の薬剤に関するスクリーニングを行うこともできる。 ユビキチン化の測定のためのアッセイは多種の形態で形成することができ、無 細胞系、例えば精製タンパク質又は細胞ライセートに基づくアッセイ、ならびに 無損傷の細胞を用いる細胞に基づくアッセイを含む。本明細書に記載のアッセイ を本Ｅ２酵素と結合させた用い、細胞又はウィルス調節タンパク質の特定のＥ２ −媒介ユビキチン化を阻害することができる薬剤の検出のためのユビキチン−結 合性系を生成することができる。そのような阻害剤は例えば増殖及び／又は分化 障害の処置において、アポプトシスの調節のために、及び例えばアデノウィルス 又は乳頭腫ウィルスによるウィルス感染の処置において用いることができる。殺 菌剤として働くことができる阻害剤の検出のために、菌同族体に関して類似のア ッセイ系を構築することができる。好ましい実施態様の場合、殺菌剤の同定のた めに用いられるアッセイ系はＵＢＣの哺乳類同族体、例えばｈＵｂＣＥ又はｒａ ｐＵＢＣを用いて誘導される類似のアッセイ系と並行して実施される。示差スク リーニングアッセイを用いて哺乳類ＵＢＣ及び酵母ＵＢＣ（他の酵母Ｅ２酵素を 含む）の間の機構又は特異性における差を引き出し、哺乳類酵素に対して酵母酵 素の阻害に関する特異性において統計的に有意な増加を示す薬剤を同定すること ができる。かくして真菌感染に含まれる菌などの病原体に特異的に作用する鉛化 合物を 開発することができる。 化合物及び自然の抽出物のライブラリを試験する多くの薬剤スクリーニングプ ログラムにおいて、与えられた時間内に調査される化合物の数を最大にするため に、高い処理量のアッセイが望ましい。精製もしくは半−精製タンパク質を用い て、又は細胞溶解物を用いて誘導され得るような無細胞系において行われるアッ セイは、迅速な展開及び試験化合物により媒介される標的分子における改変の比 較的容易な検出を可能にするように形成することができる点で、多くの場合に「 一次」スクリーニングとして好ましい。さらに細胞毒性の影響及び／又は試験化 合物の生物利用性は一般に、試験管内系においては無視することができ、その代 わりにアッセイは、他のタンパク質との結合アフィニティーの改変又は標的分子 の酵素性における変化において発現することができる標的分子への薬剤の影響に 主に焦点が当てられる。従ってＥ２阻害剤の可能性のあるものは、細胞ライセー トにおける機能性ユビキチン−タンパク質リガーゼ系の構築により形成される、 例えばユビキチン−枯渇網状赤血球ライセート（Ｈｅｒｓｋｏ ｅｔ ａｌ．（ １９８３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５８：８２０６−６２１４）に本ＵＢＣ 酵素の１つ、及び必要な場合はＥ１酵素、Ｅ３酵素（細胞又はウィルス起源）、 ユビキチン及びＵＢＣ−依存性ユビキチン化のための基質を装填することにより 形成される無細胞アッセイにおいて検出することができる。別の型の場合、アッ セイを再構築タンパク質混合物として誘導することができ、それは以下に記載す る通り、ライセートに基づくアッセイより優れた複数の利益を与える。 さらに別の実施態様の場合、本アッセイは生体内ユビキチン−結合性 系、例えばユビキチン−媒介タンパク質分解経路の少なくとも一部を通って調節 タンパク質を導くことができる細胞を含む。 系によりもたらされる基質タンパク質のユビキチン化の量は、薬剤候補の存在 下及び不在下で測定され、ユビキチン結合性量における減少は薬剤候補に関する 阻害活性の指標である。以下に記載する通り、調節タンパク質のユビキチン化の 量は、生成されるタンパク質：ユビキチン結合性体の実際の濃度の決定により測 定することができるか、あるいはタンパク質のタンパク質分解を含む、ユビキチ ン化により影響される本タンパク質のいくつかの他の特性の検出により推論する ことができる。試験化合物の存在下における標的タンパク質のユビキチン化の統 計的に有意な減少は、試験化合物がＥ２−依存性ユビキチン結合性の阻害剤であ ることの指標である。 本アッセイの好ましい試験管内における実施態様の場合、ユビキチン−結合性 系は少なくとも半−精製タンパク質の再構築タンパク質混合物を含む。半−精製 は、再構築混合物において用いられるタンパク質があらかじめ他の細胞又はウィ ルスタンパク質から分離されたことを意味する。例えば細胞ライセートと対照的 に、標的タンパク質へのユビキチンの結合性に含まれるタンパク質は標的タンパ ク質と一緒に、混合物の他のすべてのタンパク質に対して少なくとも５０％の純 度で混合物中に存在し、より好ましくは９０〜９５％の純度で存在する。本方法 のある実施態様の場合、再構築タンパク質混合物は、再構築混合物が、標的調節 タンパク質の特異的ユビキチン化又はユビキチン−媒介分解を測定できる可能性 を妨害する、又は他の場合改変し得る他のタンパク質（例えば細胞又はウィルス 起源の）を実質的に欠いているように、高度に精製さ れたタンパク質を混合することににより誘導される。 再構築ユビキチン−結合性系の生成に用いられるタンパク質成分のそれぞれは 、細胞又は細胞ライセートにおいて通常タンパク質に伴う他のタンパク質から単 離されている、又は他の場合実質的にそれらを含まないのが好ましい。「他の細 胞タンパク質を実質的に含まない」（本明細書で「汚染タンパク質」とも言われ る）という用語は、各成分タンパク質のそれぞれの試料が２０％（乾燥重量によ り）未満の汚染タンパク質を含む、好ましくは５％未満の汚染タンパク質を含む ことが意図されているとして定義される。機能的形態の各成分タンパク質は、添 付の実施例に記載のクローニングされた遺伝子を用いることにより精製試料とし て製造することができる。「精製された」は再構築タンパク質混合物の生成に用 いられる成分タンパク質試料を言う場合、示されている分子が他の生物学的巨大 分子、例えば他のタンパク質（特に精製試料としての成分タンパク質の性質を、 又は本再構築混合物におけるそれらの機能において成分タンパク質の性質を実質 的に覆う、減少させる、混乱させる又は改変させることができる他のタンパク質 ）の実質的不在の状態で存在することを意味する。本明細書で用いられる「精製 された」という用語は少なくとも８０乾燥重量％、より好ましくは９５〜９９重 量％の範囲、最も好ましくは少なくとも９９．８重量％の同じ型の生物学的巨大 分子が存在することを意味する（しかし水、緩衝液及び他の小分子、特に５００ ０未満の分子量を有する分子は存在することができる）。本明細書で用いられる 「純粋な」という用語は、すぐ上の「精製された」と同じ数的制限を有するのが 好ましい。「単離された」及び「精製された」は、その本来の状態の（例えば細 胞の一部としての）、又は細胞ライセ ートの一部としてのタンパク質、あるいは成分に分離されたが（例えばアクリル アミドゲルにおいて）純粋な（例えば汚染タンパク質を含まない）物質又は溶液 としては得られていないタンパク質を意図していない。本発明で用いられる単離 されたという用語は、組み換えＤＮＡ法により製造される場合は細胞材料又は培 地、化学的に合成される場合は化学的前駆体又は他の化学品を実質的に含まない 成分タンパク質も言う。 ユビキチン化の測定に関し、精製タンパク質混合物は、標的タンパク質及び／ 又はユビキチン結合性系の成分を分解するいずれのタンパク質分解活性も実質的 に欠如していることができる。例えば典型的網状赤血球ライセートに伴うタンパ ク質分解活性の１０％未満、好ましくは５％以下、最も好ましくは２％未満を有 するように再構築系を生成することができる。別の場合混合物を、ユビキチン化 の開始から、又は調節タンパク質のユビキチン結合性後のある点から、測定され る量で混合物中に存在する精製プロテオソーム複合体などのユビキチン−依存性 タンパク質分解活性を含むように生成することができる。 本方法の場合、精製タンパク質から誘導されるユビキチン結合性系は、細胞溶 解物又はコムギ胚芽抽出物に基づくアッセイ（後文では集合的に「ライセート」 と呼ぶ）を越える複数の有意な利点を保持している。再構築タンパク質系と異な り、ライセートに基づくアッセイにおける場合、標的タンパク質の合成及び破壊 は容易に制御できない。ライセートにおける標的タンパク質のＵｂ−非依存性及 びＵｂ−依存性分解に関する特定の速度論的パラメーターの知識がなく、２つの 経路の間の識別は非常に困難であり得る。もし可能であるとしても、これらのパ ラメーターの測定は、細胞ライセートがおそらく試料間で有意な変動を有し、バ ッチ 毎に一貫性がない傾向があるという事実によりさらに冗長なものとなる。ライセ ート系を用いた阻害剤の可能性の評価も、ライセートが標的タンパク質をコード するｍＲＮＡを装填されている状況においては、そのようなライセートがアッセ イの間にタンパク質を合成し続け、予測できない速度で合成し得るので、複雑で ある。 類似の考察を用いると、必要な時間経過を決定し、１つのライセート試料から 次の試料に行われる実験の感度を算出するために、ユビキチン結合性経路の各成 分の濃度に関する知識が、分解の速度論的データと共に各ライセートバッチに関 して必要であり得る。 さらにライセート系は、特にもし阻害剤が求められているユビキチン−媒介経 路以外の分解過程により、標的タンパク質自身が比較的短い半減期を有する場合 、満足できるものではない。例えばｐ５３のＨＰＶ−誘導ユビキチン化の阻害剤 に関するアッセイの場合、ライセートに基づく系は、上記の理由に加え、ＨＰＶ タンパク質を含まない抽出物においてさえｐ５３の短い半減期の故に用いるのが 困難であり得る。そのような系ではｐ５３のＨＰＶ−媒介ユビキチン化を測定で きる可能性は、おそらくＨＰＶタンパク質により媒介されないタンパク質分解に より起こるｐ５３のすでに速い、進行中の分解により困難にされる。 再構築タンパク質混合物の利用は、ユビキチン−結合性系における反応条件の 、より注意深い制御を可能にする。さらに系は、ユビキチン化過程の特定の段階 の阻害剤の発見に有利であるように誘導することができる。例えばユビキチン化 タンパク質の分解を促進しない再構築タンパク質アッセイを形成することができ る。ユビキチン結合性タンパク質の量は、そのような系の場合直接、薬剤候補の 存在下及び不在下の両方に おいて容易に測定することができ、それによりユビキチン化阻害剤の検出の能力 が強化される。別の場合Ｕｂ−結合性系を、タンパク質分解活性の不在下で調節 タンパク質：Ｕｂ結合性体の定常状態量を現すようにさせ、次いで精製Ｕｂ−依 存性プロテアーゼの添加により分解系に変えることができる。そのような分解系 はプロテオソーム阻害剤の同定に適していることができる。 精製タンパク質混合物は、調節タンパク質及びユビキチンの精製試料を、２種 の分子の結合性を促進する条件下で含む。例えば混合物はユビキチン−活性化酵 素（Ｅ１）、ユビキチン−結合性酵素（Ｅ２）及びヌクレオチド三リン酸（例え ばＡＴＰ）を含むことができる。別の場合、Ｅ１酵素、ユビキチン、及びヌクレ オチド三リン酸を系において、Ｅ１：Ｕｂ結合性体の形態の予備−活性化ユビキ チンで置換することができる。同様に、予備−活性化ユビキチンは代わりにＥ２ ：：Ｕｂ結合性体を含むことができ、それは予備−活性化ユビキチンを標的タン パク質基質に直接転移させることができる。 さらに、再構築混合物は少なくも１種の補助基質認識タンパク質（Ｅ３）を含 むように生成することもでき、それは例えば細胞又はウィルス起源のものである ことができる。以下に記載する典型的実施態様の場合、ＨＰＶ−１６又はＨＰＶ −１８感染細胞におけるｐ５３のユビキチン化を近似するアッセイの形成のため に、再構築ユビキチン結合性系はさらにＨＰＶ起源のＥ６タンパク質、ならびに 細胞起源のＥ６−結合タンパク質（Ｅ６−ＡＰ）を含むことができる。 阻害剤候補の存在下及び不在下における、試験管内ユビキチン−結合性系を介 した標的調節細胞のユビキチン化は、反応物を含むのに適した いずれの容器においても行うことができる。例にはミクロタイタープレート、試 験管及び微量遠心管が含まれる。本アッセイのある実施態様の場合、試験管内ア ッセイ系はユビキチン化標的タンパク質を分解する能力を含まずに形成される。 そのような実施態様の場合、広範囲の検出手段がユビキチン化タンパク質の存在 に関して印を付けることを予想することができる。 本アッセイの１つの実施態様の場合、非−分解性ユビキチン−結合性系の産物 をゲル電気泳動により分離し、標準的電気泳動案を用いて、標的タンパク質の分 子量における１つ又はそれ以上のユビキチン鎖の付加に相当する増加を測定する ことによりユビキチン化標的タンパク質の量を評価する。例えば標的タンパク質 とユビキチンの１つ又は両方を³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ又は³Ｈなどの放射性同位体で標識し 、同位体標識されたタンパク質バンドをオートラジオグラフィー法により定量す ることができる。アッセイ試料の標準化は、例えばアッセイが行われる条件下で それ自身はユビキチン化又は分解を受けない既知量の標識タンパク質を加えるこ とにより行うことができる。同様に、電気泳動により分離されるタンパク質を検 出する他の手段を用い、調節タンパク質のユビキチン化の量を定量することがで き、他の方法には、調節タンパク質又はユビキチン、あるいはそれらの誘導体の いずれかに特異的な抗体を用いるイムノブロット分析が含まれる。以下に記載す る通り、抗体を、調節タンパク質又はユビキチンの１つに結合することができる 他の分子で置換することができる。例えば本アッセイの１つの実施態様は、結合 性系におけるビオチン化ユビキチンの利用を含む。ビオチン量はゲル中で、続く 検出段階の間に、電気泳動産物（又はそれらのブロット）を従来の方法で容易に 検出 できるストレプトアビジン−結合性標識、例えばストレプトアビジン結合蛍光色 素又は酵素と接触させることにより検出される。さらに、結合性系として再構築 タンパク質混合物が用いられる場合（ライセートでなく）、クーマシーブルー及 び銀染色を含む標準的染色案により、ゲルにおいて調節タンパク質及びユビキチ ン結合性体を簡単に検出することができる。 他の実施態様の場合、イムノアッセイ又は類似の結合アッセイが、ユビキチン −結合性系で生産されるユビキチン化調節タンパク質の検出及び量の定量のため に用いられる。多種のイムノアッセイ法がそのような利用に適していることがで き、調節タンパク質：Ｕｂ結合性体の検出及び定量に用いることができる。例え ばミクロタイタープレートのウェル（又は他の適した固相）に調節タンパク質又 はユビキチンのいずれか１つに特異的に結合する抗体をコーティングすることが できる。ユビキチン−結合性系を薬剤候補と共に、あるいは薬剤候補なしでイン キュベートした後、産物をマトリックス結合抗体と接触させ、洗浄により非結合 材料を除去し、調節タンパク質のユビキチン結合性体を特異的に検出する。例え ば調節タンパク質に結合する抗体がマトリックス上におけるタンパク質の封鎖の ために用いられる場合、検出可能な抗−ユビキチン抗体を用いてマトリックス上 のユビキチン化調節タンパク質の存在に関して印を付けることができる。 しかし、これらの結合アッセイにおける抗体の利用は単に一般の結合分子の典 型であり、アッセイにおいて、基質タンパク質又はユビキチンのいずれか１つを 特異的に検出することができる適した分子で抗体を容易に置換できることは、当 該技術分野における熟練者に明らかであろう。 以下に記載する通り、ユビキチンのビオチン−誘導体を用いることができ、ビオ チン化ユビキチンに結合させるためにストレプトアビジン（又はアビジン）を用 いることができる。典型的実施態様の場合、ミクロタイタープレートのウェルに ストレプトアビジンをコーティングし、ビオチン化ユビキチンがウェルに結合し て封鎖される条件下で、展開された（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）ユビキチン−結合性 系と接触させる。非結合材料をウェルから洗浄し、各ウェルにおいて調節タンパ ク質（結合性ユビキチン部分を介してマトリックスに結合）の量を検出する。別 の場合、ミクロタイタープレートに固体担体上で調節タンパク質に結合し、封鎖 する抗体（又は他の結合分子）をコーティングし、続いてアルカリ性ホスファタ ーゼ／ストレプトアビジン複合体などの検出可能なストレプトアビジン誘導体を 用いてマトリックス−結合調節タンパク質のユビキチン化結合性体の検出を行う 。 同様の方法で、エピトープ−標識ユビキチン、例えばｍｙｃ−ｕｂ（Ｅｌｌｉ ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１１５ ０−２１１５７を参照されたい；ｃ−ｍｙｃのタンパク質をコードする１０−残 基配列を含むユビキチン）を、エピトープ標識に対する抗体と一緒に用いること ができる。Ｕｂ：タンパク質結合性体の検出のためにそのようなエピトープ−標 識ユビキチン法を用いる主な利点は、Ｎ−末端標識配列の、結合性調節タンパク 質のユビキチン−媒介タンパク質分解を阻害する能力である。 他のユビキチン誘導体は、調節タンパク質へのユビキチンの結合性を大きく妨 害しない検出可能な標識を含む。そのような検出可能な標識は蛍光−標識（例え ばＦＩＴＣ）又は酵素−標識ユビキチン融合タンパク 質を含むことができる。これらの誘導体は化学的架橋により製造することができ 、あるいは標識がタンパク質の場合、融合タンパク質の生成により製造すること ができる。いくつかの標識ユビキチン誘導体は商業的に入手可能である。 同様に、他の結合分子を調節タンパク質と結合する抗体の代わりに用いること ができる。例えば調節タンパク質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇ ＳＴ）融合タンパク質として生成することができる。実際問題として、そのよう なＧＳＴ融合タンパク質はユビキチン−結合性系の成分の製造において、調節タ ンパク質の精製を容易にすることができる(例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅ ｌ ｅｔ ａｌ．(ＮＹ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１)；Ｓ ｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１；及びＫａｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０：３５１を参照されたい)。さらに 、グルタチオン誘導マトリックス（例えばグルタチオン−セファロース又はグル タチオン−コーティングミクロタイタープレート）を用い、ユビキチン−結合性 系から遊離の、及び非ユビキチン化形態の調節タンパク質を封鎖し、上記の通り に固定化されたユビキチンの量を測定することができる。同様に、マトリックス がユビキチンに結合するように生成される場合、封鎖されたＧＳＴ−調節タンパ ク質の量をＧＳＴ部分に結合する試薬（例えば抗−ＧＳＴ抗体）を用いて、ある いはＧＳＴにより酵素的に作用されて検出可能な産物を生産する試薬（例えば１ −クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；Ｈａｂｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９７４） Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４９：７１３０）を用いて検出する ことができる。同様に、調節タンパク質及び酵素活性を含む他の融合タンパク質 が本方法により意図される。例えば少しだけ挙げれば、β−ガラクトシダーゼ又 はルシフェラーゼを含む融合タンパク質を標識として用い、結合性ユビキチン鎖 の故にマトリックス上に封鎖された調節タンパク質の量を決定することができる 。 さらに、そのような酵素融合タンパク質を用い、結合性系の成分の分離を必要 としないアッセイである不均質アッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓ ａｙ）においてユビキチン化調節タンパク質を検出し、定量することができる。 例えば調節タンパク質を分解するユビキチン−依存性プロテアーゼを有するよう に、ユビキチン結合性系を生成することができる。融合タンパク質の酵素活性は 基質の存在下で、調節タンパク質ユビキチン化の量の測定のための検出可能なシ グナルを与える。同様に、非−分解的結合性系の場合、融合タンパク質の調節タ ンパク質部分のユビキチン化は、融合タンパク質に伴う酵素活性にアロステリッ ク効果を与えることができ、それによりユビキチン結合性の量を監視するための 手段を与える。 上記に示した結合アッセイ−型検出段階において、調節タンパク質又はユビキ チンのいずれをマトリックス上に特異的に封鎖するべきかの選択は、結合性系に おける両成分の相対的存在量を含む複数の因子に依存するであろう。例えばユビ キチン結合性系の反応条件が調節タンパク質の量より非常に過剰な濃度でユビキ チンを与える場合、（例えば１０倍か又はそれ以上）ユビキチンの封鎖及びユビ キチンと結合した調節タンパク質の量の検出は、調節タンパク質を封鎖してマト リックスに結合した調節タンパク質全体からユビキチン結合性体を検出する逆の 実施態様 より狭い動的範囲を、本方法の検出段階に与え得る。すなわち、ユビキチンが調 節タンパク質に対して大過剰で与えられる場合、マトリックスに結合したユビキ チン全体におけるユビキチン結合性調節タンパク質のパーセンテージが十分に小 さく、例えば系の統計的誤差（例えばノイズ）が、測定される結合調節タンパク 質の濃度における変化の有意な部分となり得るという事実により、阻害剤により 起こされるユビキチン化の減少が検出困難になり得る。さらに、阻害剤の不在下 で強いユビキチン化タンパク質のシグナルが存在することを保証することにより 、検出段階において、より大きな感度を与えるように、ユビキチン−結合性系に おける反応条件及び反応物濃度を操作することができることは明らかである。 さらに、ユビキチン化自体を測定せず、阻害剤を、ユビキチン結合性経路の他 の直上流又は下流成分のいずれかとの本ＵＢＣタンパク質の１つの結合を妨害す るその能力に基づいて検出する薬剤スクリーニングアッセイを形成することがで きる。典型的結合アッセイの場合、問題の化合物を、単離及び精製Ｅ２タンパク 質、例えばｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣと、ＵＢＣタンパク質の１つと結合する ユビキチン結合性経路の他の成分（例えば「ＵＢＣ−結合タンパク質）、例えば Ｅ１又はＥ３タンパク質、あるいは本ＵＢＣの他の細胞基質から生成される混合 物と接触させる。Ｅ２複合体の検出及び定量は、ＵＢＣ−結合タンパク質とＵＢ Ｃタンパク質の間の複合体生成の阻害（又は増強）における化合物の効率の決定 のための手段を与える。化合物の効率は、種々の濃度の試験化合物を用いて得ら れるデータから用量応答曲線を形成することにより評価することができる。さら に比較のためのベースラインを与える標準アッ セイも行うことができる。標準アッセイの場合、単離及び精製ＵＢＣをＵＢＣ− 結合タンパク質を含む組成物に加え、ＵＢＣ−含有複合体の生成を試験化合物の 不在下で定量する。 ＵＢＣタンパク質及びＵＢＣ−結合タンパク質の間の複合体生成は多様な方法 により検出することができ、その多くは事実上、上記に説明されている。例えば 複合体の生成における変動（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、例えば検出可能に標識 されたタンパク質（例えば放射性標識、蛍光標識又は酵素標識）を用いて、イム ノアッセイにより、あるいはクロマトグラフィー検出により定量することができ る。 典型的にＵＢＣ又はＵＢＣ−結合タンパク質のいずれかを固定化し、タンパク 質の１つの非複合化形態からの複合体の分離を容易にし、ならびにアッセイの自 動化に適応させるのが望ましい。典型的実施態様の場合、タンパク質を不溶性マ トリックスに結合させるドメインを加える融合タンパク質を与えることができる 。例えばＧＳＴ／ＵＢＣ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）又はグルタチオン誘導 ミクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでそれをＵＢＣ−結合 タンパク質、例えば³⁵Ｓ−標識ＵＢＣ−結合タンパク質及び試験化合物と合わせ 、複合体生成に導く条件下でインキュベートする。インキュベーションに続き、 ビーズを洗浄して非結合ＵＢＣ−結合タンパク質を除去し、マトリックスビーズ −結合放射標識を直接（例えばビーズをシンチラント中に置く）、あるいは例え ばミクロタイタープレートが用いられる場合はＵＢＣ複合体を解離させた後に上 澄み液において決定する。別の場合、非結合タンパク質を洗浄した後、複合体を マトリックスから解離させ、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、マトリックス−結合画分に存在するＵＢＣ −結合タンパク質の量を標準的電気泳動法を用いてゲルから定量することができ る。 本アッセイのさらに別の実施態様の場合、ユビキチン−結合性系を全細胞にお いて生成し、細胞培養法を利用して本アッセイを支持する。例えば以下に記載す る通り、ユビキチン−結合性系（標的タンパク質及び検出手段を含む）を、哺乳 類及び酵母細胞を含む真核細胞培養系において構築することができる。無損傷の 細胞において本アッセイを形成する利点は、薬剤が細胞中に侵入する能力を含ん で阻害剤の治療的利用に必要な環境に、より密接に近似された環境で機能性であ る阻害剤を検出できる可能性を含む。さらに以下に示す実施例などの、アッセイ の生体内におけるある実施態様は、薬剤候補の高処理量分析に適している。 調節タンパク質を含むユビキチン−結合性系の成分は、アッセイを支持するた めに選択される細胞に内在性であることができる。別の場合成分のいくつか、又 は全部が外部供給源から誘導されることができる。例えばウィルスから誘導され るＥ３タンパク質、例えばＨＰＶ Ｅ６タンパク質を、組み換え法により（例え ば発現ベクターの使用を介して）、ならびにＥ３タンパク質自身又はＥ３タンパ ク質をコードするｍＲＮＡの微量注入により細胞中に導入することができる。 いずれの場合も、阻害剤候補と共にインキュベートされた後、究極的に細胞は 、調節タンパク質のユビキチン化又はユビキチン−媒介分解の検出を容易にする ために操作される。再構築タンパク質混合物又はライセートにおいて行われるア ッセイに関して上記で説明した通り、阻害剤候補の有効性は、調節タンパク質の 直接の特性、例えば電気泳動手段に よる分子量の変化の測定により、あるいは結合アッセイにおける検出により評価 することができる。これらの実施態様の場合、細胞は典型的に薬剤候補と一緒の インキュベーションの最後に溶解され、ライセートが検出段階において、再構築 タンパク質混合物又はライセートの場合とほとんど同じ方法で操作される。 標的タンパク質のユビキチン化の間接的測定も、ユビキチン−結合性により減 衰するか、又はユビキチン−依存性タンパク質分解過程により調節タンパク質と 共に破壊される調節タンパク質に伴う生物学的活性を検出することにより行うこ とができる。上記に示した通り、調節タンパク質及び酵素活性を含む融合タンパ ク質の利用は、検出手段が、付随する酵素活性の定量による調節タンパク質のユ ビキチン化の間接的測定に頼っている本アッセイの代表的実施態様である。 調節タンパク質が細胞におけるユビキチン−依存性又は非依存性分解の故に比 較的短い半減期を有する場合、アッセイの好ましい実施態様は細胞ライシスを必 要としないか、あるいは別の場合、細胞の溶解後の調節タンパク質の運命に依存 しないもっと長い寿命の検出シグナルを生成する。後者の実施態様に関し、検出 手段は例えば調節タンパク質に結合し、応答する正の転写調節要素を含むレポー ター遺伝子構築物を含むことができる。例えば問題の調節タンパク質がｐ５３で ある場合、レポーター遺伝子の構築にｐ５３応答要素を用いることができる。こ れらは実施例７及び図９に示すｐ５３結合配列、ならびにｐ５３−結合配列を含 むクレアチンキナーゼエンハンサー、インターロイキン−６プロモーター、ｃ− ｆｏｓプロモーター、β−アクチンプロモーター、ｈｓｃ７０プロモーター、ｃ −ｊｕｎプロモーター、ｐ５３プロモーター及びＣＹ Ｃ１ハイブリッドプロモーターを含む。遺伝子産物は検出可能な標識、例えばル シフェラーゼ又はβ−グラクトシダーゼであり、無損傷の細胞において生産され る。標識は、続く細胞のライセートにおいて測定することができる。しかし細胞 溶解段階は避け、標識の測定のための細胞の溶解の段階は、典型的に全細胞にお いて標識の検出を行えない場合のみに用いるのが好ましい。 さらに本アッセイの全細胞実施態様の場合、レポーター遺伝子構築物は、発現 されると選択可能なマーカーを与えることができる。例えばレポーター遺伝子の 産物は、抗生物質又は他の薬剤に対する耐性を与える酵素、あるいは宿主細胞に おける欠失を補足する酵素（すなちわチミジンキナーゼ又はジヒドロ葉酸レダク ターゼ）であることができる。例えばバクテリアトランスポゾン遺伝子Ｔｎ５ ｎｅｏによりコードされるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを、細胞 中に存在する標的調節タンパク質の量に応答するプロモーター要素の転写調節下 に置くことができる。かくして表現型マーカー遺伝子の発現の量は、調節タンパ ク質のユビキチン−媒介タンパク質分解の阻害剤の不在下ではより低く、そのよ うな阻害剤を、測定される表現型特性を与える能力によりアッセイにおいて検出 することができる。本アッセイのそのような実施態様は、細胞の増殖が調節タン パク質のユビキチン−媒介分解の阻害の簡単な尺度となることができる点で、高 処理量分析に特に適している。 本アッセイのさらに別の実施態様において、ユビキチン−結合性系は標的調節 タンパク質の生物学的活性が実質的に損傷を受けている細胞を含み、損傷は調節 タンパク質の異常なユビキチン化の結果である。細胞は阻害剤候補の存在下又は 不在下で、細胞の生存能力のために通常は調 節タンパク質の機能を必要とする増殖条件に供される。かくして調節タンパク質 のユビキチン−媒介分解の阻害剤はタンパク質の生物学的活性を細胞に復帰させ 、細胞の増殖能力により容易に検出することができる。さらに例示すると、調節 タンパク質の損傷はユビキチン経路の細胞タンパク質、例えばＥ２又はＥ３タン パク質の過剰発現の結果であることができ、それは調節タンパク質の過剰−ユビ キチン化を生ずる。別の場合、損傷は調節タンパク質のユビキチン−媒介分解を 増加させる非−細胞性薬剤、例えばウィルスタンパク質から生じ得る。例えば上 記の通り、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質の発現は、タンパク質のユビキチン−依存性 不活性化の増加の故に細胞におけるｐ５３の量を減少させ得る。 標的調節タンパク質が通常は有糸分裂の負のレギュレーターとして作用する本 方法の実施態様の場合、調節タンパク質の損傷は高−有糸分裂細胞を生じ得る。 高−有糸分裂細胞という用語は、細胞を続く有糸分裂段階に向かって異常に進行 させ、究極的に細胞の正確な増殖を阻害する、損傷を受けた細胞周期チェックポ イントを有する細胞を示す。調節タンパク質のユビキチン−媒介不活性化を阻害 することができる薬剤の存在下では、細胞周期を介した高有糸分裂細胞の進行は 調節タンパク質の調節下で再確立され、細胞が適切に増殖することを可能にする 。 例えば、ＨＰＶウィルスタンパク質Ｅ６の発現によりｐ５３−損傷細胞を生成 することができる。Ｅ６発現によりもたらされるｐ５３量の付随減少はそれ自身 で、及びひとりでには異常な有糸分裂減少を起こすことはない。しかし通常はｐ ５３チェックポイントで細胞周期休止を引き起こす因子（すなわち化学的又は環 境的）に損傷細胞が暴露されると、化学的又は環境的に誘導される休止から細胞 を不適切に逸脱させ得る。 この種のチェックポイント無視は究極的に細胞にとって致死であり得る。そのよ うな休止因子はＤＮＡ損傷放射線又はＤＮＡ損傷薬剤への暴露；ヒドロキシウレ アもしくはアフィジコリンなどのＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いたＤＮＡ合成 もしくは修復の阻害；４’−ジメチルエピポドフィロトキシン（ＶＭ−２６）な どのトポイソメラーゼ阻害剤；ノカダゾール及びタキソールなどの微小管集合を 妨害する薬剤を含むことができる。 調節タンパク質が通常は有糸分裂アクチベータとして作用する実施態様に関し ては、ユビキチン化によるタンパク質の活性の損傷は、細胞周期の少なくとも一 部を通る細胞の進行が抑制される低−有糸分裂細胞を生成し得る。調節タンパク 質のユビキチン−依存性分解の阻害剤の存在下では、有糸分裂アクチベータの活 性が復帰させられ、細胞は未処置細胞より大きな速度で増殖することができる。 本アッセイにおいて調節タンパク質のユビキチン−依存性分解の阻害剤として作 用するそれらの能力に関して調べられるべき薬剤はバクテリア、酵母又は他の生 物により生産される薬剤、あるいは化学的に製造される薬剤であることができる 。 ユビキチン−結合性系を構成する、特に再構築タンパク質混合物を生成するタ ンパク質のための供給源に関し、多くの種類の酵素及びユビキチン化に含まれる 他のタンパク質が同定され、そのかなりの場合にクローニングされ、組み換え供 給源が存在する。ユビキチン−結合性系の酵素の単離は「共有結合」ユビキチン −アフィニティークロマトグラフィーにより大きく助けられた（Ｃｒｅｃｈａｎ ｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２５３ ７−２５４２；及びＰｉｃｋａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：１５７３−１５８１）。この方法は、Ｅ１酵素がＡＴＰの存在下で固定 化ユビキチン（例えばユビキチン−セファロース）とチオールエステルを生成す ることができるという事実を利用している。実施例２に記載する通り、そのよう な案は組み換えにより発現されるＥ１の精製に用いることができる。さらに固定 化ユビキチンに結合したＥ１酵素をＥ２酵素で交換することができる。かくして Ｅ１及びＥ２酵素の両方をそのようなカラム上で特異的に精製することができ、 例えばジチオトレイトールを用いて溶出させた後に回収することができる。適し た溶出条件下でユビキチン活性化Ｅ１又はＥ２複合体を単離し、本明細書に記載 の通り本アッセイにおいて用い、ユビキチン−結合性の特定の段階の阻害剤に関 するアッセイの選択性を向上させることができる。さらに小さい変更を行い、こ の案を再構築タンパク質混合物において用いるためのＥ１：Ｕｂ又はＥ２：Ｕｂ 結合性体（例えば活性化ユビキチン結合性体）の単離に用いることができる。 種々の供給源からのユビキチン経路に含まれる酵素の同定は、対応する遺伝子 のクローニングを容易にした。例えばＥ１酵素をコードする遺伝子が種々の生物 からクローニングされた（例えばＡｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔ ｕｒｅ ３５５：６３２−６３４；Ｈａｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１） ＰＮＡＳ ８８：２５８−２６２；Ｈａｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１） ＰＮＡＳ ８８：７４５６；Ｈａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８１３−１５８１７；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：４８６−４８９；ＭｃＣｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ １０：２２７−２３６；Ｍｉｔｃｈ ｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：４８３−４８６；及 びＺａｃｋｓｅｎｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ ９：２９ ２３−２９２９を参照されたい）。クローニングされた種々のＥ１酵素の配列は 、約１００ｋｄであり、ヌクレオチド−結合共通配列Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ− Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙを含むタンパク質を予言している（ＭｃＧｒａｔｈ ｅ ｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ １０：２２７−２３６）。例えば遺伝子 ＵＢＡ１がＳ．セレビシアエからクローニングされ、１１４ｋｄのＥ１酵素をコ ードすることが示された（ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，同上）。さらに１個 より多いＥ１種が同じ細胞−型から検出され、２種又はそれ以上のＥ１酵素が存 在し得ることを示唆している。種々のＥ１酵素が酵素的に類似であるか否か、あ るいはそれらがユビキチン−結合性酵素の特定の組と協働するか否かはまだ未知 である。いずれの場合も、Ｅ１種のそれぞれを用いて本方法のユビキチン−結合 性系を生成することができる。 一般に与えられた１つの細胞において酵素の異なる種が比較的少ないと思われ ているユビキチン−活性化酵素（Ｅ１）と対照的に、真核細胞は多数で多様な種 類のＥ２酵素を発現することができる。Ｅ２酵素のこの顕著な多様性は、実験的 証拠と共に、Ｅ２酵素をユビキチン系における基質選択性の主要な決定因子と関 連付けた。上記に示した通り、Ｅ２酵素は基質認識因子（ユビキチン−リガーゼ タンパク質；Ｅ３）の補助を用いて、又は用いずに、ユビキチン及び基質タンパ ク質の間のイソペプチド結合生成を触媒する。従って本ＵＢＣタンパク質、例え ばＵｂＣＥ及びｒａｐＵＢＣに加え、本アッセイは他のＥ２酵素を用いて行うこ とができる。例えばＥ２酵素のいくつかの主要な種がウサギ網状赤血球 （Ｐｉｃｋａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０ ：１５７３−１５８１）、酵母（Ｊｅｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎ ａｔｕｒｅ ３２９：１３１−１３４）及びコムギ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：９８６１−９８６５）から同定され、抽出 物のユビキチン−アフィニティークロマトグラフィーにより精製された。さらに Ｅ２酵素をコードする多くの遺伝子が、最も顕著には酵母サッカロミセス・セレ ビシアエにおいてクローニングされ、特性化され、この場合はこれらの不活性化 の表現型における結果を容易に評価することができる。１０個より多い酵母Ｅ２ 遺伝子が今日までに同定され（Ｊｅｎｔｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２６：１７９−２０７；及びＪｅｎｔｓｃｈ（１９９２）Ｔｒｅｎ ｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：９８−１０３を参照されたい）、植物アラビポ ドプシス（Ａｒａｂｉｐｏｄｏｐｓｉｓ）において２０個を越えるＥ２遺伝子に 関する証拠がある（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ ｍ ２６７：１５１１６−１５１２１）。さらにＥ２酵素が線虫類（Ｚｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：１３７１−１３ ７７）、ドロソフィラ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）(Ｍｕｒａｌｉｄｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｅｕｒｏｎ １１：２５３−２６６；及びＫｏｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：３８３２−３８２６)、ウシ（Ｃｈ ｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１５６９８ −１５７０４）及びヒト細胞（Ｋｏｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏ ｍｉｃｓ １２：４４７−４５３；Ｋｏｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮ ＡＳ ８８：８８６５−８８６９ ；及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ ９：１４ ３１−１４３５）からクローニングされた。他のＥ２酵素を本アッセイにおいて 本発明のＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣタンパク質の代わりに置き換えることができ 、あるいはＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣタンパク質に加えて、例えば示差スクリー ニングアッセイにおいて与えることができる。 いくつかのユビキチン−結合性酵素は、ある種のタンパク質基質の認識のため に補助因子、Ｅ３タンパク質を必要とする。２種のＥ３タンパク質、Ｅ３α及び Ｅ３βがウサギ網状赤血球から同定された（Ｒｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８ ９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１０３７８−１０３８３；及びＲｅｉｓ ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３６８５−３ ６９０）。機能的にウサギＥ３αに類似のＥ３をコードする酵母遺伝子（ＵＢＲ １）がクローニングされた（Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ ９：３１７９−３１８９）。ウサギＥ３α及び酵母ＵＢＲ１は塩基性であ るか、又は嵩高い疎水性側鎖を有するＮ−末端アミノ酸残基を有する基質に結合 し、一方、Ｅ３βは基質のＮ−末端における小さい非変更（ｕｎｃｈａｎｇｅｄ ）残基を認識する。タンパク質基質のＮ−末端を認識するＥ３タンパク質に加え 、内部に位置するシグナルを認識することができる他のＥ３タンパク質（集合的 にＥ３γとして既知）の存在が予測された。 Ｅ２酵素との物理的相互作用なしでユビキチン−結合性反応を促進するタンパ ク質もＥ３タンパク質として分類することができる。この定義により、乳頭腫ウ ィルスのＥ６腫瘍タンパク質は、Ｅ６の結合がｐ５３ のユビキチン化及び分解を開始させるので、Ｅ３タンパク質とみなされる。例え ばハイリスク（ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ）ＨＰＶ−１８からの組み換えＥ６タンパク 質（配列番号１４）、ならびに細胞因子Ｅ６−ＡＰ（配列番号１５）が本アッセ イで用いるために利用できる。 本アッセイにおいて与えられる調節タンパク質は細胞からの精製により誘導す ることができ、その場合それは外因的に発現され、あるいはタンパク質の組み換 え供給源から誘導することができる。例えばｐ５３（Ｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ １９８３）ＥＭＢＯ Ｊ ２：１６３３−１６３９）；ｐ２７（Ｐｏｌｙａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：５９−６６；及びＴｏｙｏｓｈｉｍ ａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：６７−７４）；ｃ−ｍｙｃ（Ｈ ａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：１８５−１９５）；Ｎ−ｍ ｙｃ（Ｃｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２：７９− ８４）；ＭＡＴα２（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃ ｅｌｌ ６１：６９７−７０８）；並びにＥ１Ａ（Ｓａｌｖｉｃｅｋ ｅｔ ａ ｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ ７：３１７１−３１８０）を含む複数の調節タ ンパク質の場合、ｃＤＮＡクローンを利用することができる。 さらに本ユビキチン結合性酵素を、続いてｈＵｂＣＥ又はｒａｐＵＢＣ生物学 的活性の阻害剤を検出するための相互作用トラップアッセイ（ｔｒａｐ ａｓｓ ａｙ）の形成のために用いることができる（例えば米国特許第５，２８３，３１ ７号；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１０３００；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９ ３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３ ）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ ｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３ ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；及びＩｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６を参照 されたい）。典型的実施態様の場合、サッカロミセス・セレビシアエＹＰＢ２細 胞を、ＧＡＬ４ｄｂ−ｈＵｂＣＥ融合タンパク質をコードするプラスミドを用い て、及びｐ５３又はＥ６ＡＰに融合されたＧＡＬ４ａｄドメインをコードするプ ラスミドを用いて同時に形質転換する。さらに株を、ＧＡＬ４−応答性プロモー ターが表現型マーカーの発現を促進するように形質転換する。例えばヒスチジン の不在下で増殖する能力は、それがＧＡＬ４−応答性プロモーターの調節下にあ る場合はＨＩＳ３遺伝子の発現に依存し得、従って機能性ＧＡＬ４アクチベータ がｈＵｂＣＥ及びｐ５３又はＥ６ＡＰの相互作用を介して再構築されたことを示 す。かくしてこれらのタンパク質の１つとのｈＵｂＣＥ相互作用を阻害すること ができる薬剤は、ヒスチジンの不在下で増殖することができない酵母細胞を生ず る。別の場合表現型マーカーは、発現されると負の選択を与え、ｈＵｂＣＥ相互 作用を崩壊させる薬剤が細胞に正の増殖選択を与えるようなマーカーであること ができる。 本発明の他の側面は、本ＵＢＣタンパク質の３次元分子模型、ならびにユビキ チン結合性酵素の少なくとも１つの生物学的活性を阻害することができる薬剤の 設計のための鋳型としてのそれらの利用に関する。本ユビキチン−結合性酵素の 阻害剤の設計のための我々の方法への必須の段階は、理論的薬剤設計による薬理 団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅｓ）の設計に用いることができるユビキチン結 合性酵素のコンピューターグ ラフィクス模型の構築を含む。例えば本酵素と最適に相互作用する阻害剤の場合 、それは一般に酵素の特定の結合部位、例えばユビキチン、Ｅ１酵素、Ｅ３酵素 、例えばＥ６もしくはＥ６ＡＰ、あるいは経路の下流標的、例えばｐ５３の認識 に含まれるヒトユビキチン結合性酵素の部分の形と少なくとも部分的に相補的な 形を有するのが望ましい。さらに、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用、 脱溶媒和効果及びリガンドと酵素の協同的動きを含む他の因子はすべて結合効果 に影響し、生物活性阻害剤の設計の試みにおいて考慮されるべきである。 実施例９に記載される通り、本酵素のコンピューター−形成分子模型を創造す ることができる。好ましい実施態様の場合、問題のＵＢＣ配列の少なくともＣα −炭素位置を相同性モデリングにより、図１に示されるｈＵｂＣＥに関する配位 のような特定の配位パターンにマッピングし、ドッキングシミュレーションが決 定されるべきシミュレーション温度（Ｔ_o）においてタンパク質の構造及び各原 子の速度を算出する。典型的にそのような案は、図１に示されるような三次構造 から取られる主鎖の軌跡（ｔｒａｃｅ）を仮定しながら、モデリングされるタン パク質における側鎖立体配置の予測を主に含む。エネルギー最小化のルーチンを 行うためのコンピュータープログラムが分子模型の形成に通常用いられる。例え ばＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ ４：１８７−２１７）及びＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ（ １９８１）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１０６：７６５）の両アルゴリズムは 、分子系の構成、力場計算及び分析のすべてを扱っている（Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌ ｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６１：Ｃ３７６− ３８６；Ｌｙｂｒ ａｎｄ（１９９１）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｅｌｇ ４６：４９−５４；Ｆｒｏｉｍ ｏｗｉｔｚ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：６４０−６４４；Ｂ ｕｒｂａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７：９９−１１１； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５）Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃ ｔ ６１：１８５−１９０；及びＫｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｂｉ ｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｄｙｎ ９：４７５−４８８も参照されたい）。これ らのプログラムの中心に、模型における各原子の位置が与えられると系の合計位 置エネルギー及び各原子への力を算出する１組のサブルーチンがある。これらの プログラムは、図１に示される配位模型のような原子配位の出発セット、位置エ ネルギー関数の種々の項に関するパラメーター及び分子トポロジーの説明（共有 結合構造）を用いることができる。そのような分子モデリング法の共通の特徴は ：水素結合及び他の束縛力（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ ｆｏｒｃｅ）の取り扱いに 関する条件；周期的境界条件の利用；ならびに位置、速度、あるいは温度、圧力 、体積、束縛の力、又は他の外部的制御条件を保持又は変更するための他のパラ メーターを時々調節するための条件を含む。 最も慣例的なエネルギー最小化法は上記のインプットデータ、ならびに位置エ ネルギー関数がいずれの組の原子位置に関しても位置エネルギー及びその勾配（ 各原子に力を与える）を算出するために解明された、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ配位の 区別し得る関数であるという事実を用いる。この情報を合計位置エネルギーを減 少させる試みにおいて用い、新しい組の配位を生成することができ、この方法を 何回も繰り返すことにより、与えられる外部条件の下で分子構造を最適化するこ とができる。これら のエネルギー最小化法は本ＵＢＣタンパク質に類似の分子、ならびに核酸、ポリ マー及びゼオライトに日常的に適用される。 一般にエネルギー最小化法は与えられる温度、Ｔ_iに関して行うことができ、 それはドッキングシミュレーション温度、Ｔ_oと異なることができる。Ｔ_iにおけ る分子のエネルギー最小化が行われると、系におけるすべての原子の配位及び速 度が計算される。さらに系の標準モード（ｎｏｒｍａｌ ｍｏｄｅ）が算出され る。それぞれの標準モードは集合的周期的な動きであり、系のすべての部分が互 いに相において動き、分子の動きはすべての標準モードの重なりであることが当 該技術分野における熟練者により認識されるであろう。与えられた温度に関し、 特定のモードにおける動きの平均二乗振幅はそのモードに関する有効力定数に逆 比例し、分子の動きは多くの場合に低周波数振動が主である。 分子模型がＴ_iにおいてエネルギー最小化された後、所望の温度Ｔ_oに達するま で原子の速度を段階的に概算する平衡化実験を行うことにより、系をシミュレー ション温度Ｔ_oに「加熱」又は「冷却」する。さらに系を、系のある性質、例え ば平均運動エネルギーが一定となるまで、特定の時間、平衡化する。次いで平衡 化された系から各原子の配位及び速度が得られる。 さらに別のエネルギー最小化ルーチンも行うことができる。例えば第２の種類 の方法は、タンパク質に関する束縛ＥＯＭに関する近似解答の算出を含む。これ らの方法はＬａｇｒａｎｇｅ乗数（ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒｓ）に関して解くため の繰り返し法を用い、典型的に必要な修正が小さい場合は少数回の繰り返しのみ が必要である。この種の最も一般的な方法であるＳＨＡＫＥ（Ｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｐｈｙｓ ２３：３２７；及びＶａｎ Ｇｕｎｓｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｍｏｌ Ｐｈｙｓ ３４：１３１１）は実行が容易 であり、増加する束縛の数としてＯ（Ｎ）を概算する。従ってこの方法は本発明 のＵＢＣタンパク質などの巨大分子に適用できる。別の方法であるＲＡＴＴＬＥ （Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９８３）Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｐｈｙｓ ５２：２４）は Ｖｅｒｌｅｔアルゴリズムの速度バージョンに基づいている。ＳＨＡＫＥと同様 にＲＡＴＴＬＥは繰り返しアルゴリズムであり、本タンパク質の模型のエネルギ ー最小化に用いることができる。 結晶学的に解明された薬理団分子の可能性のある分子の生物巨大分子構造の利 用性の増加は、分子設計のための多様な直接コンピューター的方法の開発を促し 、その場合、基質結合部位の立体的及び電子的性質が阻害剤の可能性のある分子 の設計を導くために用いられる（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍ ｅｄ．Ｃａｍ．３３：８８３−８９４；Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８２） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １６１：２６９−２８８；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ（１９ ８８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．３１：７２２−７２９；Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）（Ｓｐｅｃ．Ｐｕｂｌ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．）７８ ：１８２−１９６；Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃａｍ．２８：８４９−８５７；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅ ｄ．Ｃａｍ．２９：２１４９−２１５３）。直接法は一般に２つの範疇：（１） 既知分子（例えば結晶学的データベースから）の３−Ｄ構造を酵素構造にドッキ ングさせ、適合度に関して評価する類似による設計；及び（２）酵素においてリ ガンド模型を各片毎に構築す る新規な設計の中に含まれる。特に後者の方法は、本ヒトユビキチン−結合性酵 素に結合するように独特に設計される新規な分子の開発を容易にすることができ る。 典型的実施態様の場合、ｈＵｂＣＥ阻害剤の可能性のある分子の設計は、酵素 の活性部位及び基質特異性小部位に関して相補的な形の一般的見込みから開始さ れ、標的タンパク質部位中に幾何学的に適合する候補に関して、既知の三次元構 造の小分子のデータベースを走査することができる検索アルゴリズム（ｓｅａｒ ｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いる。初期の検索の間に化学的相互作用の評価 が必ずしもなされないので、形の検索において見いだされる分子が必ず優勢であ ることは予測されない。むしろそのような候補はさらに設計するための枠組とし て働くことができ、適した原子置換を行うことができる分子骨格を与えることが 予想される。もちろんこれらの分子の化学的相補性を評価することができるが、 酵素との静電的、水素結合及び疎水性相互作用を最大にするように原子の型が変 えられるであろうことが予測される。この種のほとんどのアルゴリズムは、本酵 素の結合部位の形に相補的な化学構造の広い類別を見いだすための方法を提供す る。特定のデーターベース、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇ ｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＣＣＤＢ）（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（ １９７３）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｄｏｃ．１３：１１９）からの小分子の各組が、ドッ キングアルゴリズムを用い、複数の幾何学的に許され得る配向でｈＵｂＣＥ酵素 の結合部位にそれぞれドッキングされる。好ましい実施態様の場合、ＤＯＣＫと 呼ばれる１組のコンピューターアルゴリズムを用い、本酵素の活性部位及び認識 表面を形成する折り畳み及び溝の形を特性化することが できる（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１ ：２６９−２８８）。プログラムは、酵素の特定の結合部位に相補的な形を有す る鋳型に関して小分子のデータベースを検索することもできる（ＤｅｓＪａｒｌ ａｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３１：７２２−７２ ９）。これらの鋳型は通常優れた化学的及び静電的相互作用を達成するために修 正を必要とする（ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＡＣＳ Ｓ ｙｍｐ Ｓｅｒ ４１３：６０−６９）。しかしプログラムは、形の束縛のみに 基づいて、阻害剤に関する既知の補因子を正確に位置決定することが示された。 適合度のために配向が評価され、最も良いものがＡＭＢＥＲ又はＣＨＡＲＭＭ などの分子力学プログラムを用いたさらなる試験のために保持される。そのよう なアルゴリズムは以前に、レセプター−酵素の与えられた結合部位に形が相補的 である多様な分子の発見において成功することが証明され、いくつかの魅力的な 特徴を有することが示された。第１にそのようなアルゴリズムは分子構築物の顕 著な多様性を埋め合わせる（ｒｅｔｒｉｅｖｅ）ことができる。第２に、他のタ ンパク質への以前の適用において最良の構造は、広い表面積にわたって印象深い 形の相補性を示した。第３に、全体的方法は候補原子の位置決定における小さい 不確定性に関し、非常にたくましいと思われる。 Goodford（1985，J Med Chem 28:849-857）およびBoobbyerら（1989，J Med C hem 32:1083-1094）は、結合部位の分子表面における種々の化学基（プローブと 呼ばれる）に対して高い親和力をもつ領域を決定するための検索用コンピュータ ープログラム（ＧＲＩＤ）を作製した。それ故、ＧＲＩＤは、結合を増進するで あろう既知のリガンドについての改 変を示唆するための道具を提供する。高い親和力をもつ領域としてＧＲＩＤによ って識別されたある種の部位が、一連の既知リガンドから推定して決定された「 ファルマコホア・パターン（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｉｃ ｐａｔｔｅｒｎ） 」に対応することが期待されるであろう。ここに使用されるようなファルマコホ ア・パターンとは、結合のために重要であると信じられる予測リガンドの特徴の 幾何学的配列である。新規のリガンドを検索するスクリーニングとしてファルマ コホア・パターンを使用することが試みられた（Jakes et al．（1987）J Mol G raph 5:41-48; Brint et al．（1987）J Mol Graph 5:49-56; Jakes et al．（1 986）J Mol Graph 4:12-20）；しかしながら，推定の（そして多分未知の）レセ プター結合部位における立体的および「化学的」適合という拘束が、無視されて いる。GoodsellおよびOlson（1990，Protein: Struct Funct Genet 8:195-202） は、標的のタンパク質中にただ一つの既知リガンドを結合するために、Ｍｅｔｒ ｏｐｏｌｉｓ（アニーリングを模した）アルゴリズムを使用した。彼らは、リガ ンドにおける捩れのたわみ性を許し、おおよその相互作用エネルギーを算定する ために、迅速検索表としてＧＲＩＤ相互作用エネルギーマップを使用する。その リガンドに利用できる自由度を多数与えるので、Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓアルゴリ ズムは、時間を浪費し、そしてわづか数千の低分子の候補データベースを検索す るのには適さない。 なお、本発明のさらなる実施態様は、両方とも立体的に許容され、そして候補 分子と周囲のアミノ酸残基との間に有利な化学的相互作用を作り達成しうる高い 可能性をもつ方法で、レセプター結合部位に向けることができる低分子に関して 、ＣＣＤＢのようなデータベースを検索する ＣＬＩＸのようなコンピューターアルゴリズムを利用する。その方法は、種々の 化学基に対する有利な結合位置の集合という用語でレセプター部位を特徴づけ、 次いで、個々の候補化学基と集合のメンバーとの最高の空間的一致を引き起こす 候補分子の向きを探すことに基づいている。現在、コンピューターの力を利用す ることは、新規リガンドについてコンピューターに基づく検索が、広さ第１主義 の戦略に従うことを示す。１つの候補の最大に詳細な解析が、次に進む前に行わ れる深さ第１主義の戦略とは反対に、広さ第１主義の戦略は、ますます厳しくな る基準の適用によって、可能性のある候補検索空間の大きさを次第に縮小するこ とをねらっている。ＣＬＩＸは、その結合の解析が基本であるこの戦略に適合す る−それは、有利な結合相互作用が実際に生じる十分な条件を課することなしに 、結合のための「正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ）」場所に、立体的な適合性ならびに 個々の基をもつという必須条件を満足するために捜し求める。それらの有利な向 きに並べられた分子の「ショートリスト（ｓｈｏｒｔｌｉｓｔ）」が作製された が、これは、次に、コンピューターグラフィックスおよびより複雑な分子モデル 作製技術を用いて、分子毎に基づいて検査できる。また、ＣＬＩＸは、結合を増 進するであろう候補分子の置換化学基への変化を示唆することができる。 ＣＬＩＸのアルゴリズムの詳細は、Lawerence et al．（1992）Proteins 12:3 1-41に記述され、そのＣＬＩＸアルゴリズムは、次のように要約できる。ＧＲＩ Ｄプログラムは、広範な種々の代表的化学基に対するタンパク質の結合部位にお いて、離れた有利な相互作用位置（標的部位と呼ばれる）を決定するのに使用さ れる。ＣＣＤＢ中の各候補リガンドについて徹底的な試みが、タンパク質の結合 部位の空間的意味において、 １対の候補の置換化学基と、ＧＲＩＤによって提案された１対の対応する有利な 相互作用部位との一致させるように行われた。ＧＲＩＤ部位のペアーと、リガン ド基のペアーの全ての可能な組み合わせが、この過程の間に考慮される。そのよ うな一致の場所を探すに当たって、そのプログラムは、２対の基についての候補 リガンドを回転し、そして適当な標的部位と他の候補原子基との立体的障害およ び一致に関して検査する。結合部位に対し幾何学的適合が良好であり、ＧＲＩＤ 部位と原子基との十分な一致を示す特定の候補／向きの組み合わせが、保存され る。 広さ第１主義の戦略とともに、このアプローチは、仮説の単純化を必要とする 。堅固なタンパク質と低分子の幾何形が、徹底的に保存される。最初の近似とし て、堅固な幾何形は、その分子についてのエネルギー最小値を記している実施例 ９の記載のように、局在的なものではあるが、ｈＵｂＣＥから推定される構造の エネルギー最小化座標として受け入れられる。もし、問題の部位の表面残基が、 結晶に含まれない場合には、次いで、それらの残基の結晶の立体配置に接触する 。本発明者らは、実施例９に記載の推定構造が、平均的解答の立体配置を合理的 に模しているにちがいないと信じている。さらに、ｃａＵｂＣＥ，ｓｐＵｂＣＥ 、およびｒａｐＵＢＣの相当するモデルは、同じ方法で得ることができる。 ＣＬＩＸに含まれるさらなる仮定は、可能性のあるリガンドが、ユビキチン結 合性酵素の結合部位中に導入された場合には、タンパク質の立体化学における変 化や部分的な荷電分布を誘導せず、それ故、ＧＲＩＤの相互作用エネルギーマッ プが、算定される基礎を変えるということである。また、ＧＲＩＤによって予想 される相互作用部位は、位置的および形式的意味においてのみ使用されることが 強調されねばならず、すな わち、候補原子基が、ＧＲＩＤによって有利と予想された部位に置かれる場合に は、結合幾何学、プロトン付加の状態、または部分的荷電分布が、タンパク質と その基の間における強い相互作用を助けることを確実にするためのチェックは行 われない。そのような詳細な解析は、ＣＬＩＸショートリストにおいて同定され る候補のより進歩したモデル化という部分を形成しなければならない。 なお、主題のユビキチン結合性酵素の阻害剤を同定するためのコンピューター による分子設計法のその他の実施態様は、酵素の活性部位との望ましい構造的お よび静電的相補性を示すであろう低分子断片のアルゴリズム的接触による可能性 のある阻害剤のデ・ノボ合成を含む。その方法論は、ＵＢＣ活性部位のモデルに おいて繰り返し継ぎ合わされる低分子の大きい鋳型セットを用いる。リガンド成 長の各段階は、分子力学に基づくエネルギー関数により評価されるが、それは、 ファンデルワールスおよびクーロン相互作用、伸長するリガンドの内部ひずみエ ネルギー、およびリガンドと酵素の両方の脱溶媒和を考慮する。探索空間は、結 合基準に応じて切り詰めることによって調節されるデータ系図の使用によって管 理することができる。 具体的な態様では、探索空間は、分子構築ブロックとしてアミノ酸およびアミ ノ酸同族体のみを考慮するよう制限される。そのような方法論は、一般的に、丁 度２０種のアミノ酸に限定される必要はないけれども、薬化学者に興味のある他 の関連断片、例えばアミノ酸同族体を含むように、容易に拡大されるので、アミ ノ酸立体配座の大きいテンプレートセットを用いる。この構築方法から得られる 推定リガンドは、典型的にはドラッグデザイン研究の目的である低有機分子より も、むしろペプチドお よびペプチド様化合物である。ペプチド構築アプローチの魅力は、ペプチドが、 可能性のある医薬品として有機物に比べて好ましいことではなくて、むしろ、（ １）それらが、比較的急速にデ・ノボで生成され；（２）それらのエネルギー力 学が、良くパラメーター化された応力場法によって研究でき；（３）それらが、 多くの有機物よりもはるかに容易に合成され；そして（４）それらが、ペプチド に擬した阻害剤の設計、タンパク質−タンパク質結合の研究のために種々の方法 で使用でき、そして、より普通に使用される前記の３Ｄ有機物データベースの探 索アプローチにおける形状テンプレートとしてさえも使用できることである。 そのようなデ・ノボのペプチドデザイン（設計）法は、ＧＲＯＷ（Moon et al ．（1991）Proteins 11:314-328）と呼ばれるソフトウエアー・パッケージに組 み込まれている。代表的設計法においては、標準の相互作用する図式的モデル化 法が、ＧＲＯＷが作動すべき構造的環境を定めるために用いられる。例えば、環 境は、ｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣの活性部位付着（ｃｌｅｆｔ）であって もよく、またはそれは、使用者が、ペプチド様分子、例えば、ユビキチン、ｐ５ ３、Ｅ６もしくはＥ６ＡＰ疑似体を結合するよう期待するタンパク質の表面にお ける一組の特徴であってもよい。次いで、ＧＲＯＷプログラムは、一組の可能性 のあるリガンド分子を作製するように作動する。次いで、相互作用モデル化法は 、例えば、得られる分子の試験のため、そしてさらなる洗練のため、それらの１ 種以上を選択するために、再び作動する。 具体的に説明すれば、ＧＲＯＷは、図１に提供される座標、または図３に提供 される活性部位の座標、さらに加えて、ペプチド成長のための出発点を提供する ために活性部位に置かれる小断片（例えばアセチル基） のように、相互作用モデル化法において使用者によって作製された原子座標ファ イル上において作動する。これらは、それぞれ、「部位」原子および「シード（ ｓｅｅｄ）」原子と呼ばれる。使用者によって提供される第２のファイルは、ペ プチド成長を案内する多くの調節パラメーターを含む（Moon et al．（1991）Pr oteins 11:314-328）。 ＧＲＯＷアルゴリズムの作動は、概念的にはかなり単純であり、図４に総括さ れる。ＧＲＯＷは、相互作用様式で進行して、アミノ酸立体配座の予め構築され た大きいライブラリーにおける各アミノ酸テンプレートを、シード断片に整然と 接着する。テンプレート（鋳型）が接着された時、それは、レセプター部位への 適合の良好度について点数付け（ｓｃｏｒｅ）され、次いで、ライブラリー中の 次の鋳型が、そのシードに接着される。全ての鋳型が試験された後、最高の点数 を得たものが、成長の次のレベルのために保存される。この操作は、第２の成長 レベルについて繰り返され；各ライブラリーの鋳型が、最初の段階から保存され た結合シード／アミノ酸分子の各々に、順に接着され、次いで、点数付けされる 。再び、得られた結合シード／ジペプチド分子の最良のものが、第３の成長レベ ルについて保存される。ペプチドの成長は、使用者によって提供される最初の調 節の明細書に応じて、ＮからＣへの方向のみでも、その反対方向のみでも、また は交互の方向へも進行できる。それ故、連続成長レベルは、１個の残基によって 伸長されるペプチドを生じる。その操作は、使用者が定めたペプチドの長さに達 した時に終了するが、それは、使用者が次に研究すべきペプチドを、構築された ペプチドから選択できる時点である。ＧＲＯＷ操作によって提供される得られた データは、残基配列と点数のみならず、レセプター部位原子の座標系に直接関 連するそのペプチドの原子座標を含む。 なお、その他の実施態様においては、可能性のあるファルマコホア化合物は、 主題のユビキチン結合性酵素の結合部位中の官能基のエネルギー的に有利な位置 を決定するための、エネルギー最小化−消失（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）分子力学アル ゴリズムに基づく方法を用いて決定できる。その方法は、既知リガンドの改変ま たはデ・ノボ構築によって、そのような官能基を組み入れる分子の設計に役立つ ことができる。 例えば、多重コピー同時検索法（ＭＣＳＳ）は、Miranker et al．（1991）Pr oteins 11:29-34に記載された。タンパク質の力場における官能基の局所的最小 値を決定および特定するために、選択された官能基の多重コピーが、ＵＢＣタン パク質の目的の結合部位に、先ず分配される。分子力学または消失動力学による これらのコピーのエネルギー最小化は、明確な局所的最小値を生む。次に、これ らの最小値の近傍が、格子検索または制約最小化によって精査される。１つの態 様では、ＭＣＳＳ法は、タンパク質の力場における多くの同一基を同時に最小化 または消失するために、古典的な時間依存のＨａｒｔｅｅ（ＴＤＨ）近似を使用 する。 ＭＣＳＳアルゴリズムの実施は、官能基の選択およびそれらの各々の分子力学 モデルを必要とする。基は、容易に特定化され、取り扱えるよう十分に単純（３ 〜６個の原子、あるかないかの二面角の自由度）で、なお官能基が、ＵＢＣタン パク質の目的の部位への結合に際してもつであろう立体的および静電的相互作用 に接近するのに十分複雑であらねばならない。好適なセットは、例えば、ほとん どの有機分子が、そのような基の収集物として記載されているものがある（Pata i's Guide to the Chemistry of Functional Groups，ed．S．Patai（New York: John Wi ley，and Sons，(1989)）。これは、アセトニトリル、メタノール、酢酸、メチ ルアンモニウム、ジメチルエーテル、およびアセトアルデヒドのような断片を含 む。 結合部位における局所的なエネルギー最小値の決定には、多くの出発位置が、 サンプルとして採用されることが必要である。これは、例えば、結合部位の中心 領域内にランダムに１，０００〜５，０００個の基を分配することによって達成 でき；タンパク質によって占められない空間のみが、考慮される必要がある。も し、タンパク質と、ある場所における特定の基の相互作用エネルギーが、与えら れた切り捨て値（例えば５．０Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）より正であるならば、その 基は、その部位から捨てられる。出発位置のセットが与えられれば、全ての断片 は、ＴＤＨ近似（Elber et al．（1990）J Am Chem Soc 112:9161-9175）の使用 によって、同時に最小化される。この方法では、各断片上の力は、その内部の力 とタンパク質による力からなる。この方法の必須の要素は、断片間の相互作用が 、除外され、タンパク質上の力が、ただ１つの断片による力に平準化されること である。この方法で、単一タンパク質の場における全部の官能基の同時最小化ま たは動力学が遂行できる。 最小化は、ランダムに置かれた基の、例えば１００個のサブセットにおいて成 功裏に遂行できる。ある数の段階間隔、例えば１，０００間隔の後に、その結果 が、検査され、同じ最小値に収斂する基を除去する。この過程は、最小化が完結 するまで繰り返される（例えば、０．０１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／ÅのＲＭＳ勾配 ）。かくして、得られるエネルギー最小化された分子のセットは、可能性のある ファルマコホアを表す三次元における一組の離れ離れの断片に相当するものを含 む。次いで、次 の段階は、小さい化学実体（原子、鎖もしくは環部分）から組み立てられるスペ ーサーと、ファルマコフォア断片を連結することである。好適な実施態様では、 各々離れ離れのものが、空間において連結されて、例えば、ＮＥＷＬＥＡＤ（Ts chinke et al．（1993）J Med Chem 36:3863-3870）のようなコンピュータープ ログラムを用いて単一分子を作製することができる。ＮＥＷＬＥＡＤによって採 用された方法は、次の配列のコマンド（１）２つの単離された部分を連結し、（ ２）さらなる処理のための中間の解を保存し、（３）離れ離れのユニットが見ら れなくなるまで各中間の解について上記段階を繰り返し、そして（４）各々が単 一分子である最終解を引き出すことを実行する。そのようなプログラムは、例え ば、３種のスペーサー：ライブラリースペーサー、単一原子スペーサーおよび縮 合環スペーサーを使用できる。ライブラリースペーサーは、エチレン、ベンゼン およびメチルアミドのような低分子の最適化された構造である。ＮＥＷＬＥＡＤ のようなプログラムによって作製されるアウトプットは、今、スペーサーによっ て連結された最初の断片を含む一組の分子からなる。インプット断片に属する原 子は、空間におけるそれらの最初の向きを維持している。その分子は、スペーサ ーと官能基の単純な組み立てであるので、化学的に合理性をもち、そしてファン デルワールス半径の妨害による解の拒絶であるので、エネルギー的に許容できる 。 本発明の１つの実施態様では、標的の調節タンパク質は、腫瘍サプレッサーｐ ５３であり、そして前記アッセイ法または分子モデル化法のいずれか１つが、例 えば、ｐ５３とｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣとの相互作用、またはｈＵｂＣ ＥもしくはｒａｐＵＢＣと、Ｅ６もしくはＥ６ ＡＰのようなユビキチン系の他のタンパク質間の相互作用を破壊することによる か、あるいはまた、酵素の酵素活性を機構的に阻害することによって、ユビキチ ン媒介のｐ５３破壊の阻害剤を同定するために使用される。多数の証拠系が、ヒ トの発がんにおけるｐ５３の重要性を指摘している。例えば、ｐ５３遺伝子内の 突然変異は、ヒトのがんに深く関与するもっともしばしば起きる遺伝変異である 。ｐ５３が、人工的に高レベルで発現された場合には、細胞周期の進行を遮断で きるけれども、それは、正常の発生にはなくてもすむと考えられる。したがって 、同型接合の欠失をもつマウスおよびｐ５３の生殖系の突然変異をもつヒトに関 しては、発生は、正常であり、そしてｐ５３タンパク質は、ほとんどの細胞種に おいて非常に低レベルに発現される。しかしながら、明らかな証拠は、ｐ５３が 、ＤＮＡ損傷を認識したり、細胞のストレス応答を調節することに、重要な役割 を演じているチェックポイントタンパク質であることを示唆する。正常状態では 、ｐ５３は、不安定なタンパク質であり、細胞中に非常に低レベルで存在し、そ して細胞のｐ５３レベルは、ユビキチン系を伴う破壊によって、少なくとも仲間 内で調節されると考えられ、本明細書に示されるデータに基づけば、主題のｈＵ ｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣによって媒介されているようである。ＵＶ線もしく はＸ線による細胞処理は、劇的にｐ５３分解速度を低下し、それが、細胞におけ るその濃度の急速な増加に導き、そして多分、限定点の通過を阻止する遺伝子の 転写を誘導する。しかしながら、Ｇ₁期に照射された正常細胞系は、Ｓ期に入る ことができないのに対して、多くの腫瘍細胞系ではそれがない。事実、このフィ ードバック調節を欠く細胞系と、ｐ５３遺伝子に変異をもつ細胞の間には、完全 な相関がある。これらの突然 変異には、２種類：遺伝子を不活化する劣性突然変異および異常タンパク質を生 成する優性突然変異がある。ユビキチン結合アッセイにおいて主題のｈＵｂＣＥ もしくはｒａｐＵＢＣを用いるか、合理的なドラッグデザインによって開発され た阻害剤は、続いて、処理された細胞におけるｐ５３の定常状態の濃度を高める ことによって、ｐ５３チェックポイントの機能を増進するように、治療的に使用 できるであろう。野生型ｐ５３タンパク質の高いレベルが、種々の形質転換され た細胞型においてアポトーシスを起こすならば（Yonish-Rouach et al．（1991 ）Nature 352:345-347; Shaw et al．PNAS 89:4495-4499; およびCaelles et al ．（1994）Nature 370:220-223）、ｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣに仲介され るｐ５３分解の阻害剤は、野生型ｐ５３を含む形質転換細胞におけるチェックポ イントの堅固さを増すことによって、あるいは、（変異体）ｐ５３のレベルの増 大によるｐ５３活性における減少を相殺することによって、頸部がんのみならず 、その他のがん種における魅力的な治療剤になるかもしれない。さらにまた、そ のような薬剤は、ｐ５３レベルを増加させ、それによって、放射線のような損傷 因子への被曝がさし迫っていることが分かっている場合には、ＤＮＡ損傷因子に 対する防御を高めるために、正常細胞において予防的に使用できるであろう。あ る種のウイルス、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス ５型（Ａｄ５）、および高等のヒト・パピローマウイルス１６型および１８型（ ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８）の発がん活性は、細胞ｐ５３タンパク質と相互作 用し、それを失活させるウイルスの能力と相関していた。危険性の高いパピロー マウイルスの場合には、ｐ５３とがんタンパク質Ｅ６の会合が、ｐ５３の特異的 ユビキチン化と分解を起こ す。このことは、Ｅ６が、ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質の除去をとおして 細胞成長の調節を脱制御することによって、細胞を不死化するモデルを示唆した 。このモデルは、ｐ５３レベルが、ＨＰＶで不死化された細胞では非常に低く、 そしてＨＰＶ１６で不死化されたケラチン細胞のｐ５３の半減期が、本来のケラ チン細胞におけるよりも短くなるという観察を説明できる。したがって、本発明 は、Ｅ６によって仲介されるようなｐ５３のユビキチン依存性分解を阻止し、そ れによってＨＰＶ形質転換細胞の増殖を阻止できる薬剤を同定することに用いら れる。 主題のヒト・ユビキチン結合性酵素は、他の細胞タンパク質、特に、短い半減 期をもつと思われるタンパク質の活性を変えることに関与しているようであり、 そして本発明は、ｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣタンパク質の拮抗形を含むｈ ＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣ阻害剤を使用して、ｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵ ＢＣによる他の細胞タンパク質のユビキチン化を阻害することを意図する。例え ば、その他の実施態様では、ｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣによってユビキチ ン化される調節タンパク質は、ｍｙｃがんタンパク質である。ｍｙｃ調節タンパ ク質は、多くのＢ細胞リンパ腫における転座または突然変異によるか、または小 細胞肺がんおよび乳がんのような種類の腫瘍における増殖によって活性化される 。ｃ−ｍｙｃ遺伝子は、白血病およびがん腫を誘発するいくつかのサルおよびネ コのレトロウイルスウイルスに発見されるがん遺伝子ｖ−ｍｙｃの細胞同族体で ある。ｍｙｃは、多くの研究によって正常な細胞増殖の調節にかかわってきた。 特に、それは、マイトジェン誘導に際して、静止細胞で急速に誘導される即時初 期成長応答遺伝子の１つであり、このことは、それが、静止から増殖への転移の 仲介においてある種 の役割を演じていることを示唆する。しかしながら、ｍｙｃ自体のレベルの増大 は、増殖を引き起こすには十分ではない。事実、正常細胞においては、反対のこ とが起き、そして細胞はアポトーシスを受ける。それ故、本アッセイにおいて同 定された阻害剤は、正常には、ｍｙｃを過剰発現しない細胞において、アポトー シスを効果的に誘導するために使用できる。例えば、リンパ球へのこれらの薬剤 の特異的送達は、クローンの欠失を誘導したり、特定の抗原に対する寛容性を生 むために、Ｂ−および／またはＴ−細胞の増殖を阻害するのに使用できる。 腫瘍細胞において、一方では、高められたり脱制御されたｃ−ｍｙｃの発現は 、多段階がん腫におけるｍｙｃ遺伝子活性化に関する決定的役割を示唆するほど 広範囲なものである（Field et al．（1990）Anticancer Res 10:1-22; および Spencer et al．（1991）Adv Cancer Res 56:1-48）。しかしながら、これらの 細胞におけるそのようなｍｙｃの過剰発現は、典型的には、ｂｃｌ−２のような 他の細胞タンパク質の発現が続いて起きると信じられる。しかしながら、興味あ ることには、ほとんど全ての腫瘍細胞では、過剰発現ｍｙｃが、細胞毒性な成長 阻害薬物の存在下で、容易にアポトーシスがもたらされることが試験された（Co tter et al．（1990）Anticancer Res 10:1153-1159; および Lennon et a1．（ 1990）Biochem Soc Trans 18:343-345）。それ故、ｍｙｃのユビキチン媒介分解 の阻害剤は、細胞を化学療法的治療に対し一層感受性にするために、または形質 転換細胞の周到な均衡をうまくくつがえし、第２の細胞毒性薬物の不在下でさえ もアポトーシスを引き起こさせるために、ｍｙｃの発現をさらに脱制御するのに 使用できる。 なお、ユビキチン化によるサイクリンの調節は、ｈＵｂＣＥもしくは ｒａｐＵＢＣ阻害剤をまきこむことができるその他の治療上の標的である。サイ クリン分解は、有糸分裂期から出て、次の細胞周期に進行することを支配するキ ーステップである。例えば、中期から、有糸分裂の終了を示す後期への転移は、 ユビキチン媒介経路によるサイクリンの分解によって誘導され、次いで、周期− 周期段階で作動するサイクリン依存キナーゼ（ｃｄｋ）の不活化を起こす。細胞 が間期に入ると、サイクリン分解は停止し、サイクリンが蓄積し、そして複雑な 一連の翻訳後修飾の結果、サイクリン／ｃｄｋ複合体は、有糸分裂を通じて細胞 を動かすキナーゼとして活性化される。したがって、サイクリン分解は、有糸分 裂の出口における重大な出来事の１つである。実際に、ｃｄｋ複合体を活性化す る能力を保持するが、分解はできないサイクリン変異体は、有糸分裂において細 胞周期を停止する。同様のサイクリン依存性は、細胞周期の他の点においても同 じように存在する。かくして、サイクリン（例えば、サイクリンが、サイクリン Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３，ＥもしくはＦから選ばれる場合）のユビキチン 仲介分解の阻害剤は、抗増殖剤として使用できる。 なお、Ｅ２酵素の他の候補基質は、サイクリン依存キナーゼ阻害剤ｐ２７^kipl である（Polyak et al．（1994）Cell 78:59-66; および Toyoshima et al．（1 994）Cell 78:67-74）。このタンパク質は、ＴＧＦ−βおよび細胞−細胞の接触 によって媒介されるように、Ｇ₁相停止に関係していた。付記される実施例に記 載のように、本発明者らは、ユビキチン結合性酵素が、ｐ２７をユビキチン化で きることを発見したが、それは、そのタンパク質の細胞内代謝回転が、少なくと も一部はユビキチン媒介分解に依存していることを示している。その結果、ｐ２ ７へのユビ キチン転移の阻害は、この細胞周期阻害剤を蓄積させることになる。それ故、ｐ ２７のＥ２媒介分解を阻害する薬剤は、静細胞薬剤になるであろう。 そのような静細胞薬剤は、正常細胞と形質転換細胞の両方の増殖を阻害するの に有用であろう。例えば、ｐ２７のＥ２仲介ユビキチン化の阻害剤は、ラパマイ シンおよびそれに類するものと全く同様に、リンパ球の増殖を阻止するために使 用できるであろうし、また免疫抑制剤として使用できるであろう。同じく、繊維 芽細胞におけるｐ２７の蓄積は、結合組織障害の治療または傷の治癒過程の調節 の治療法の一部として使用できるであろう。 またｐ２７の調節因子は、乾癖のような過形成表皮症状の治療、ならびに、例 えば、基底細胞がん腫および鱗細胞がん腫のような種々の皮膚がんの早い増殖速 度に特徴がある新生物形成表皮症状の治療のために使用されてもよい。 正常の細胞増殖は、一般に、ＴＧＦ−βファミリーの一員、例えばＴＧＦ−β １、ＴＧＦ−β２もしくはＴＧＦ−β３、および関連するポリ ａｎ阻害物質、ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ、骨形態形成因子、およびｖｇ ｌ（例えば最終分化誘導物質）のようなネガティブ自己分泌または傍分泌成長調 節因子に対する応答性によって示される。通常は、特に、上皮および造血細胞に おけるそのような成長調節因子による細胞増殖の調節は、少なくともＴＧＦ−β 応答に関連するｐ２７蓄積による成長阻害の形で存在する。これは、一般には、 有糸分裂後表現型への細胞の分化につながる。しかしながら、これらの細胞種に 由来する有意な率 のヒトのがんが、ＴＧＦ−βのような成長調節因子に対し低い応答性を表すこと が観察されていた。例えば、結腸直腸、肝臓上皮、および表皮起源のある種の腫 瘍は、それらの正常なものと比較して、ＴＧＦ−βの成長阻害効果に感受性が低 く、耐性を示す。ｐ２７のユビキチン化の拮抗物質によるそのような腫瘍の治療 は、ＴＧＦ−βに仲介されるチェックポイントの機能を回復する機会を提供する 。 また、主題のＥ２阻害剤は、過増殖性血管障害、例えば、平滑筋肥厚（例えば アテローム性動脈硬化症）もしくはレスチノシス（ｒｅｓｔｉｎｏｓｉｓ）、な らびに繊維症、例えば類リューマチ関節炎、インシュリン依存糖尿症、糸球体腎 炎、硬変症および強皮症、特に、ＴＧＦ−β自己分泌または傍分泌信号の消失が 関係する増殖性障害によって特徴付けられる他の障害の治療にも使用できる。例 えば、レスチノシスは、使用されてきた種々の機械的および薬学的介在にも拘ら ず、冠状血管形成術の効果を制約し続けている。平滑筋細胞の動脈内膜増殖の正 常な調節に関与する重要なメカニズムは、平滑筋細胞における自己分泌および傍 分泌ＴＧＦ−β阻害ループの誘導であると思われる（Scott-Burden et al．（19 94）Tex Heart Inst J 21:91-97; Graiger et al．（1993）Cardiovasc Res 27: 2238-2247; および Grainger et al．（1993）Biochem J 294:109-112）。ＴＧ Ｆ−βに対する感受性の消失、あるいはまたＰＤＧＦによるようなこの阻害的刺 激の拒絶は、レスチノシスにおける異常な平滑筋増殖への寄与因子になりうる。 それ故、ｐ２７のユビキチン化を阻害する薬剤の使用によって、レスチノシスを 治療または予防することができるであろう。 なお、主題のｈＵｂＣＥもしくはｒａｐＵＢＣのさらなる可能性のあ る基質は、ｆｏｓがん遺伝子生成物であって、それは、細胞におけるユビキチン 媒介分解を受け、そして新生物形成形質転換、ならびに種々の細胞外刺激の作用 の媒介に関与していた。ｃ−ｆｏｓによる遺伝子発現の調節は、細胞増殖および 発生の応答に決定的役割を演じており、そしてｃ−ｆｏｓの正常パターンの変化 は、発がんを生むと信じられる。初期応答遺伝子としてｃ−ｆｏｓが顕著に存在 すれば、ｃ−ｆｏｓのユビキチン媒介分解の阻害剤によって引き起こされるよう に、ｃ−ｆｏｓの明らかな過剰発現と寿命の延長は、細胞周期を十分に不均衡に し、細胞の死を引き起こすであろう。あるいはまた、そのような阻害剤は、サイ トカインによる治療のように、細胞への外からの刺激の影響を擬するように使用 できる。 実施例 本発明は一般に記述されてきたが、ここに、本発明のある態様および実施態様 の具体的説明のためにのみ含まれ、本発明を限定することを意図しない次の実施 例を参考することによって、より一層容易に理解されるであろう。 本発明者らは、Ｅ６に刺激されるイン・ビトロでのｐ５３のユビキチン化にお けるｈＵｂＣＥおよびＥ６ＡＰの生化学的役割を定義し、そしてイン・ビボでの これらの酵素の阻害が、Ｅ６に刺激されるｐ５３分解を阻害できることを示した 。以下の実施例に記載のように、イン・ビボでのｈＵｂＣＥおよびＥ６ＡＰ酵素 機能の阻害は、Ｅ６に刺激されるｐ５３分解の阻害を引き起こす。実施例８にお けるマイクロインジェクション実験で達成された阻害レベルは、２５〜３０％で あった。これは、インジェクションした構築物の高レベル発現を達成するインジ ェクション された各細胞の全ての結果ではないかもしれない。また、細胞のユビキチン結合 機構に若干の重複があること、そしてＥ１、ｈＵｂＣＥおよびＥ６ＡＰの細胞内 濃度が、使用された細胞におけるｐ５３分解に対して律速ではないことが示唆さ れるであろう。本データの全ては、Ｅ６が、本イン・ビトロおよびイン・ビボの アッセイ系において、ｐ５３のユビキチン化に絶対的に必要であることを示唆す る。本発明者らは、ｈＵｂＣＥおよびＥ６ＡＰが、１種の、まだ未同定の細胞Ｅ ６同族体の関与の可能性とともに、ｐ５３の正常な代謝回転に関与しているとい う可能性を現在研究中である。 実施例１ 新規なヒト・ユビキチン結合性酵素のクローニングおよび発現 本発明のヒト・ユビキチン結合性酵素をコードしているｃＤＮＡを、ＨｅＬａ 細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）からクローン化した。簡単に言えば、ポリアデニル 化ＲＮＡを、培養ＨｅＬａ細胞から単離し、第１鎖ｃＤＮＡを、次の標準法（Ch omczynski 米国特許第4,843,155号;およびSambrook et al．Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY（1989）、参照） に従って調製した。組み入れられたＰＣＲプライマーセット5'-(GC)₃AAGCTTTAYG ARGGWGGWGTYTTYTT-3′(配列番号:８)、5′-(GC)₃GAATTCACNGCRTAYTTYTTNGTCCCAY TC-3′(配列番号:９)および5′-(GC)₃AAGCTTCCNGTNGGNG-AYTTRTTYCAYTGGCA-3′( 配列番号:10)、5-(GC)₃G-AATTCATNGTNARNGCNGGCGACCA-3′(配列番号:11)、（ま た、ＰＣＲ生成物に都合のよい制限酵素部位を提供する）を用いて、ｈＵｂＣＥ 遺伝子をコードする配列を、ＨｅＬａｃＤＮＡライブラリーから増幅し、そして それからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、続いて、 さらなる操作のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋ファージミド（ｐ ＫＳ＋ Stratagene catalog No.212207）に連結した。得られるｐＫＳ−ｈＵｂ ＣＥ構築物を、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｃｅｌｌ（Stratagene catalog No.260268） で増幅し、そして二本鎖の構築物を精製した。ｈＵｂＣＥクローンについて決定 された核酸配列は、配列番号：１に表され、そして対応する演繹されたアミノ酸 配列は、配列番号：２に示される。 続いて、細菌細胞か昆虫細胞のいずれかにおいて、組み換えｈＵｂＣＥタンパ ク質を生産するための遺伝子構築物を作製するために、ｈＵｂＣＥ遺伝子を、ｐ ＫＳ＋から他の発現ベクターにサブクローン化した。ある場合には、組み換えｈ ＵｂＣＥが、融合タンパク質を生産するように外因性の配列を加えたが、融合タ ンパク質の付加された配列は、その精製を容易にする。例えば、さらなる増幅の 後、ｐＫＳ−Ｅ２構築物を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、そしてｈＵｂ ＣＥをコードする配列を含む断片を、予めＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化した ｐＧＥＸベクター（Pharmacia catalog No.PGEX-4T）中にサブクローン化した 。得られるｐＧＥＸ−ｈＵｂＣＥ構築物は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ ーゼ（ＧＳＴ）／ｈＵｂＣＥ融合体（Smith et al．（1988）Gene 67:31-40）を コードした。ｐＧＥＸ構築物を、形質転換によってＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中 に導入し、そして形質転換株を、ＩＰＴＧ存在下で液体培地（ＬＢ）中で増殖し た。ＧＳＴ／ｈＵｂＣＥ融合タンパク質の精製は、グルタチオン−セファロース ・カラム(Pharmacia catalog No.27-4570)を用いる標準法（Current Protocols in Molecular Biology ，eds．Ausubel et al．(NY:John Wiley & Sons，1991); Pharmaci a instruction booklet（catalog No.27-4570））によった。トロンビンによる 処理は、融合タンパク質からＧＳＴドメインを除去した。 あるいはまた、ｈＵｂＣＥをコードする配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ 断片としてｐＫＳ−ｈＵｂＣＥ構築物から切り取り、ＳｍａＩおよびＥｃｏＩで 切断されたｐＶＬ１３９３に連結した。簡単には、ｈＵｂＣＥ遺伝子断片を、ア ガロースゲル分離によって精製し、そしてＳｍａｌおよびＢｇｌＩＩで予め切断 したバクロウイルス・ベクターｐＶＬ１３９３（Invitrogen catalog No.V1392 -20）に連結した。ｐＶＬ１３９３−ｈＵｂＣＥ構築物を、次に、スポドプテラ ・フルジペルダ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９細胞 、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）をトランスフェクションするのに使用し、そして 、その細胞を、標準法（Invitrogen 製品案内；Summers and Smith(1987); Texa s Agricultural Experiment Station Bulletin No．1555 ，College Station，Te xas; Luckow et al．（1988）Bio/technology 6:47-55; および Miller et al. ，in Genetic Engineering，Vol.８ ed．Setlow and Hollaender（Plenum Press : New York）pages 277-298）にしたがって、１０％ＦＢＳ、ラクトアルブミン 加水分解物、ＴＣ ｙｅａｓｔｏｌａｔｅおよびグルタミン酸塩を補足した（In vitrogen catalog No.B823）昆虫細胞培養基（Ｇｒａｃｅ’ｓ Ａｎｔｈｅｒ ａｅａ ｍｅｄｉｕｍ）で維持した。トランスフェクションした細胞を、細胞が 、培養平板表面への粘着を失い始めるまで増殖し、その時点で、細胞を収穫し、 遠心によって回収し、そして溶解した。その溶解物を、遠心によって清澄にして 、細胞壁破片を除き、そしてｈＵｂＣＥを、溶解液から精製した。 例えば、ｈＵｂＣＥタンパク質は、Ｅ１：ユビキチン担持カラムで単離された 。ユビキチン結合系の酵素の単離は、「共有結合」ユビキチン−アフィニティー クロマトグラフィー（Crechanover et al．（1982）J．Biol．Chem．257:2537-2 542; および Pickart et al．（1985）J．Biol．Chem．260:1573-1581）によっ て非常に助けられた。この方法は、Ｅ１酵素が、ＡＴＰの存在下で固定化された ユビキチン（例えばユビキチン−セファロース）とチオールエステルを形成する ことができるという事実の利点を用いる。さらに、固定化ユビキチンに結合され たＥ１酵素は、主題のｈＵｂＣＥタンパク質と交換できる。かくして、Ｅ１およ び主題のｈＵｂＣＥの両タンパク質が、そのようなカラムにおいて特異的に精製 でき、そして、例えばジチオトレイトールによる溶出の後、回収できる。さらに 、少しばかりの変更をしたこの方法は、治療標的のアッセイにおいて使用するた めのｈＵｂＣＥ：Ｕｂ複合体（例えば、活性化ユビキチン複合体）を単離するの に使用できる。 米国特許出願第08/176,937号に記載のように、ＡＴＰ存在下（例えば、５ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂、および０．２ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２））で、Ｅ１含有の溶解液を、セファロース−ユビ キチンカラム（Hershko et al．（1983）J．Bio1．Chem．257:2537-2542）に適 用した。そのカラムを、このバッファーで数回洗浄した。ｈＵｂＣＥを生産する 昆虫細胞の清澄溶解液を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、５ｍＭＡＴ Ｐ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂、および０．２ｍＭジチオトレイトールに調整し、次い で、Ｕｂ：Ｅ１カラムに適用し、洗浄し、次いで、溶出して、残っているＵｂ： Ｅ１のすべてを除去した（例えば、ｈＵｂＣＥは、カラム上のＥ１と交換される であろう）。 その他の模範的な実施態様では、組み換えｈＵｂＣＥタンパク質を、Ｎｉ²⁺金 属カラムでの精製のために、ポリ（Ｈｉｓ）融合タンパク質として作製する。ｐ ＫＳ構築物のＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ断片を、予めＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消 化したｐＢｌｕｅＢａｃＡバクロウイルス（Invitrogen catalog no.V360-20） 中にクローン化する。次いで、製造者の方法にしたがって、Ｈｉｓ₆−ｈＵｂＣ Ｅ融合タンパク質を、Ｓｆ９昆虫細胞中で発現させ、そしてＮｉ²⁺担持セファロ ース樹脂で精製した（Invitrogen catalog no.R801; また、Hochuli et al．（1 987）J．Chromatography 411:177-184; および Janknecht et al．（1991）PNAS 88:8972-8976、参照）。融合タンパク質の精製に続いて、Ｈｉｓ₆タグを、エン トロキナーゼによる処理によって除去できる。 実施例２ イン・ビトロのユビキチン結合系の成分の単離 ユビキチンは、市販のものを入手し、そして再構成されるタンパク質系の残り のタンパク質成分は、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）からクローン化した 。簡単には、ポリアデニル化ＲＮＡを、培養ＨｅＬａ細胞から単離し、そして第 １鎖ｃＤＮＡを、標準法（Chomczynski 米国特許第4,843,155号;およびSambrook et al．Molecular Cloning: A Laboratory Manual，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)、参照）にしたがって調製した。各成分タンパク質をコードし ているＤＮＡ配列を増幅し、ならびにＰＣＲ生成物に都合のよい制限部位を与え るために設計されたＰＣＲプライマー類を使用して、ヒトＥ１、ヒトｐ５３、Ｈ ＰＶ−１８Ｅ６、ヒトＥ６−ＡＰおよび種々のヒトＥ２のコード配列を 単離し、それらを、続いて、その後の操作のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩ Ｉ ＫＳ＋ファージミド（ｐＫＳ＋ Stratagene catalog No.212207）に連結し た。以下に記述するように、成分タンパク質の遺伝子の各々を、続いて、ｐＫＳ ＋から他の発現ベクター中にサブクローン化して、細菌か昆虫細菌において組み 換えタンパク質を生産するための遺伝子構築物を作製した。ある場合には、組み 換えタンパク質に、融合タンパク質を生産するように外因性の配列を加えたが、 融合タンパク質の付加された配列は、その精製を容易にする。 ｉ）ヒトＥ１ プライマー5′-(GC)₃AAGCTTATGTCCAGCTCGCCGCTGTCCAAG-3′および5′-(GC)₃GG ATCCTCAGCGGATGGTGTATCGGACATA-3′を利用した。ヒトＥ１のコード配列（配列番 号：１４）を、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。Ｅ１コード配 列を含むＰＣＲ増幅生成物を、精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ （ＰＣＲプライマーによって提供される制限部位）で切断し、ｐＫＳ＋ファージ ミド中に連結した。得られるｐＫＳ−Ｅ１構築物を、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（St rategen catalog no.260268）中で増幅した。 Ｅ１コード配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ｆｉｌｌＢａｍＨＩ断片を、ｐＫＳ− Ｅ１構築物から単離したが、ここで「ＨｉｎｄＩＩＩ／ｆｉｌｌ」とは、断片中 に生じたＨｉｎｄＩＩＩオーバーハンドが、クレノウおよびｄＮＴＰを用いて充 足されて、平滑末端を形成したことを示す。Ｅ１遺伝子断片を、アガロースゲル 分離によって精製し、そして予めＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩで切断したバクロウ イルスベクターｐＶＬ１３９３（Invitrogen catalog no.V1392-20）中に連結し た。ｐＶＬ１３９ ３−Ｅ１構築物は、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｆ９細胞）（ＡＴＣＣ Ｃ ＲＬ１７１１）をトランスフェクションするのに使用され、そしてその細胞は、 標準法（Invitrogen 製品案内；Summers and Smith(1987); Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No．1555 ，College Station，Texas; Luckow et al．（1988）Bio/technology 6:47-55; および Miller et al.，in Genetic En gineering，Vol.8 （Setlow and Hollaender eds）pp．277-298，Plenum，New Yo rk）にしたがって、１０％ＦＢＳ、ラクトアルブミン加水分解物、ＴＣ ｙｅａ ｓｔｏｌａｔｅおよびグルタミン酸塩を補足した昆虫細胞培養基（Ｇｒａｃｅ’ ｓ Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｍｅｄｉｕｍ）（Invitrogen catalog No.B823）で 維持された。トランスフェクションされた細胞を、細胞が、培養平板表面への粘 着を失い始めるまで増殖させ、その時点で、細胞を収穫し、遠心によって回収し 、そして溶解した。その溶解物を、遠心によって清澄にして、細胞壁破片を除き 、そしてＥ１含有溶解液を、ＡＴＰ存在下（例えば、５ｍＭＡＴＰ，１０ｍＭＭ ｇＣｌ₂、および０．２ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ Ｈ７．２））で、セファロース−ユビキチンカラム（Hershko et al．（1983）J ．Biol．Chem ．257:2537-2542）に適用した。そのカラムを、このバッファーで 数回洗浄し、Ｅ１タンパク質を、次の溶液：５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７． ２を含有する１ＭＫＣｌ（ＫＣｌ溶出液）；上記トリスバッファーで溶出して塩 を除き、そして最後に、上記トリスバッファー中２ｍＭＡＴＰおよび０．０４ｍ Ｍピロリン酸ナトリウムで溶出した。Ｅ１含有溶出液を、新しいバッファー溶液 に入れて、ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐまたはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ膜(Amicon Corp.，M A)を用いる遠心限外濾過によっ て濃縮した。さらにまた、ユビキチン−固定化Ｅ１は、以下に記載のＥ２酵素の 精製に使用できる。 ｉｉ）ヒトＥ２ ヒトｒａｄ６同族体（配列番号：１５）を、プライマー5′-(GC)₃AAGCTTATGTC GACCCCGGCCCGGAGGAGG-3′および5′-(GC)₃GAATTCTTATGAATCATTCCAGCTTTGTTC-3′ を用いて、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡから増幅し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩｐＫＳ＋中にクローン化した。さらに 増幅後、ｐＫＳ−Ｅ２構築物を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、そしてＥ２ コード配列を含む断片を、予めＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＧＥＸベ クター(Pharmacia catalog No.PGEX-4T-3)中にサブクローン化した。得られる ｐＧＥＸ−Ｅ２構築物は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ Ｅ２融合体（Smith et al．（1988）Gene 67:31-40）をコードした。ｐＧＥＸ構 築物を、形質転換によってＥ．コリ中に導入し、そして形質転換株を、ＩＰＴＧ 存在下で液体培地（ＬＢ）中で増殖させた。ＧＳＴ／Ｅ２融合タンパク質の精製 は、グルタチオン−セファロース・カラム(Pharmacia catalog No.27-4570)を 用いる標準法（Current Protocols in Molecular Biology，eds．Ausubel et al ．(NY:John Wiley & Sons，1991); Pharmacia instruction booklet(catalog No .27-4570用)）によった。トロンビンによる処理により、融合タンパク質からＧ ＳＴドメインを除去した。 さらにまた、ｒａｄ６をコードする配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片 としてｐＫＳ−ｒａｄ６構築物から切り取り、ＳｍａＩおよびＥｃｏＩで切断し たｐＶＬ１３９３中に連結した。Ｅ２タンパク質を、 上記のようにＳｆ９細胞中で生産し、そしてセファロース−ユビキチン：Ｅ１カ ラムで精製した。上記のように、Ｅ２を生産している昆虫細胞の清澄溶解液を、 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、５ｍＭＡＴＰ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂、 および０．２ｍＭジチオトレイトールに調整し、ｕｂ：Ｅ１カラムに適用し、洗 浄し、次いで、溶出して、残っているｕｂ：Ｅ１のすべてを除去した（例えば、 Ｅ２は、カラム上のＥ１と交換されるであろう）。次に、ｒａｄ６を、２ｍＭジ チオトレイトール含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）での洗浄によ って、カラムから溶出した。 同様の方法で、ヒトＵＢＣ３／ＣＤＣ３４の組み 換え型（配列番号：１９）を作製した。 ｉｉｉ）ＨＰＶ−１８Ｅ６ ＨＰＶ−１８Ｅ６のコード配列（配列番号：１６）を、プライマー5′-(GC)₃A AGCTTATGGCGCGCTTTGAG-GATCCAACA-3′および5′-(GC)₃′GAATTCTTATACTTGTGTTTC TCTGCGTCG-3′を用いて、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーから増幅し、そし て増幅されたＥ６配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕ ｅＳｃｒｉｐｔＩＩｐＫＳ＋ファージミド中に連結した。数種の異なる発現ベク ターを、ｐＫＳ−Ｅ６構築物からＥ６配列をサブクローン化することによって作 製した。例えば、Ｅ６コード配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、Ｓ ｍａＩおよびＥｃｏＩで切断したｐＶＬ１３９３中に連結して、上記のようにバ クロウイルス発現系を生産した。 あるいはまた、Ｅ６を、Ｎｉ²⁺金属カラムでの精製のために、Ｈｉｓ₆融合タ ンパク質として作製した。ｐＫＳ構築物のＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ断片を、予めＸ ｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅＢａｃ Ａバクロウイルス（Invitrogen catalog no.V360-20）中にクローン化した。製 造者の方法にしたがって、Ｈｉｓ₆−Ｅ６融合タンパク質を、Ｓｆ９昆虫細胞中 で発現し、そしてＮｉ²⁺担持セファロース樹脂で精製した（Invitrogen catalog no.R801; また、Hochuli et al．（1987）J. Chromatography 411:177-184; お よび Janknecht et al．（1991）PNAS 88:8972-8976、参照）。融合タンパク質 の精製に続いて、Ｈｉｓ₆タグを、エントロキナーゼによる処理によって除去で きる。 ｉｖ）ヒトＥ６−ＡＰ Ｅ６−ＡＰ（配列番号：１７）を、ＰＣＲプライマー5′-(GC)₃AAGCTTTCAGGAC CTCAGTCTGACGAC-3′および5′(GC)₃GGATCCTTACAGCATGCCAAATCCTTTGGC-3′を用い て、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーからクローン化したが、この場合、増幅 されたＥ６−ＡＰ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔＩＩｐＫＳ＋中に連結した。ＨＩＳ₆タグおよびＧＳＴタグされ た両方のＥ６−ＡＰを発現する構築物を作製した。１例は、ＮｈｅＩ〜ＢａｍＨ ＩのＥ６−ＡＰを含む断片を、ｐＢｌｕｅＢａｃＡ（ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ で切断された）中にクローン化し、そしてその構築物を、昆虫細胞中で発現した 。上記のようにＨｉｓタグされたＥ６−ＡＰタンパク質を、Ｎｉ²⁺アフィニティ ーによって精製し、続いて、Ｈｉｓタグを、エントロキナーゼによる処理によっ て除去した。 ｖ）ヒトｐ５３ ヒトｐ５３（配列番号：１８）を、プライマー5′(GC)₃GAATTCGCCATGGAGGAGCC -GCAGTCAGATCCT-3′および5′-(GC)₃AAGCTT-TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGT-3′を用 いて、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーからｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＩＩｐＫＳ＋中にクローン化した。上記の他の成分タンパク質と同 様にして、数種の異なる発現構築物を、ｐ５３について作製したが、そのあるも のは、精製を容易にするために、外因性ポリペプチド配列を含んだ。昆虫細胞中 での発現のために、２種のバクロウイルス構築物を作製した。生来のｐ５３につ いては、ｐＫＳ−ｐ５３ベクターのＢａｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩ消化されたｐ ＶＬ１３９３中に連結した。Ｈｉｓ₆タグされたｐ５３については、ＢａｍＨＩ 断片を、予めＢａｍＨＩで消化したｐＢｌｕｅＢａｃＡ中に連結した。同様に、 ＧＳＴ−ｐ５３を、ｐＫＳ−ｐ５３構築物のｐ５３を含むＥｃｏＲＩ〜ＮｏｔＩ 断片をｐＧＥＸ−４Ｔ−１中に連結することにより作製されたｐＧＥＸ構築物の 発現によって、Ｅ．コリにおいて生産した。 ２種の融合タンパク質の各々の例では、標準法を用いて、溶菌した形質転換株 からｐ５３を精製した。ｐＶＬ１３９３−ｐ５３構築物によって生産される生来 のｐ５３については、Huppらの方法を用いて、ヘパリン−セファロースカラムで ｐ５３を精製した（Hupp et al．（192）Cell 71:875-886）。 ｖｉ）ユビキチン ユビキチンは、市販のものを入手できる（ウシ・ユビキチン、Sigma catalog no.6253; 酵母ユビキチン、Sigma catalog no.2129）。また、種々の改変型のユ ビキチンは、例えば、蛍光標識ユビキチン（Sigma catalog no.U5504）、および セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ標識ユビキチン（Sigma catalog no.U9879） を入手できる。ビオチン化ユビキチンは、既知の方法（ビオチン化キット；Pier ce catalog no.214206,203188（６原子スペーサー）または203114（１４原子ス ペーサー））を用 いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド エステル）から調製 できる。 Ｖｉｉ）その他の試薬 ここに記載のある種の検出手段を作製するために、若干の次の試薬：ユビキチ ンに対するポリクローナル血清（Sigma catalog no.U5379）；ビオチンに対する 標識抗体（Sigma catalog no.A4541(ペルオキシダーゼ共役)およびF6762(ＦＩＴ Ｃ共役)）；標識アビジン（Sigma catalog no.A7294,E2636(ペルオキシダーゼ共 役)およびA2050,E2761(ＦＩＴＣ共役)）；ストレプトアビジン(Sigma catalog n o.S3762(ＦＩＴＣ共役)およびS5512(ペルオキシダーゼ共役))；ストレプトアビ ジン塗布ビーズ（Sigma catalog no.400966; Pierce catalog no.20347G）；ス トレプトアビジン塗布した９６穴ミクロタイタープレート（Pierce catalog no. 15124）；無水マレイン酸活性化ポリスチレン９６穴プレート（Pierce catalog no.15110）；およびヒトｐ５３に対する抗体（PharMingen catalog no.14091Aお よび14211A）を使用できる。 実施例３ ｐ５３のイン・ビトロのユビキチン化 本発明者らは、実施例１において新規なヒト・ユビキチン結合性酵素ｈＵｂＣ Ｅのクローニングを記述する。実施例４および５では、ｈＵｂＣＥが、Ｅ６ＡＰ を特異的にユビキチン化し、そしてイン・ビボでのｐ５３の代謝回転に関与して いることが示される。本発明者らは、活性化およびｐ５３へのユビキチンの転移 における数個の区別される生化学的段階を定義した。これらの生化学的反応は、 ｐ５３のユビキチン化において、２つのレベルの特異性；Ｅ６ＡＰのｈＵｂＣＥ 依存ユビキチン化、 およびユビキチン化Ｅ６ＡＰからｐ５３へのユビキチンのＥ６依存性転移を提供 する。 タンパク質 イン・ビトロのユビキチン化反応を実施するために、生来のｈＵｂＣＥおよび ＵＢＣ２、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡ修復遺伝子、Ｒ ａｄ６（Koken et al．（1991）PNAS 88:8865-8869）のヒト同族体を、Ｅ．コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）から発現、精製した。両タンパク質は、容易に溶解し、そし て標準法を用いて容易に精製された。タンパク質ｈＵｂＣＥ、ＵＢＣ２、ｐ５３ 、ヒトＥ１、Ｅ６、およびＥ６ＡＰの各々のクローニングおよび精製は、前記実 施例２に記述される。簡単には、生来のｐ５３を、製造者の指示（Pharmingen） にしたがって、昆虫細胞中でバクロウイルスベクターｐＶＬ１３９２から発現さ せ、そしてｐ５３アフィニティーカラムで精製した。ＨＰＶ１８Ｅ６を、ＧＳＴ 融合タンパク質としてＥ．コリＢＬ２１で発現させ、ＧＳＨ−セファロースで精 製した。ヒトＥ１を、公表されたｃＤＮＡ配列（Handley et al．（1991）PNAS 88:258-262）からＰＣＲによってクローン化し、そして生来のタンパク質を、バ クロウイルス感染細胞で発現させ、精製した。Ｅ６ＡＰを、ＧＳＴ融合タンパク 質としてＥ．コリＪＭ１０９で発現させ、ＧＳＨ−セファロースで精製した。 ユビキチン化反応 ユビキチン化反応液は、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、５ｍＭＡＴＰ−γ−Ｓ、 ０．１ｍＭＤＴＴおよび５μＭユビキチン中に指定されたタンパク質５０〜２０ ０ｎｇを含んだ。全反応液（３０μｌ）を、２５℃で３時間インキュベートし、 次いで、ｐ５３ユビキチン化の分析用の８％ ＳＤＳゲルか、またはユビキチン結合性酵素およびＥ６ＡＰのユビキチン化の分 析用の４〜２０％勾配ゲルに添加した。ゲルを泳動し、そしてタンパク質を、電 気泳動的にニトロセルロースに転写した。ｐ５３タンパク質を、モノクローナル 抗体ＤＯ−１（Oncogene Science）およびＮＥＮ製ＥＣＬシステムにより現した 。ユビキチン化タンパク質を、Sigma製Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰおよびＮ ＥＮ製ＥＣＬシステムを用いて目に見えるようにした。 図６に例証するように、特異的ｐ５３−ユビキチン結合体の出現には、ｈＵｂ ＣＥ、ＨＰＶ１８−Ｅ６、Ｅ６ＡＰ、ユビキチンとＥ１、ユビキチン活性化酵素 を必要とする。一方、ＵＢＣ２は、Ｅ１、ＡＴＰおよびユビキチンを含む最小複 合反応液において活性があり、そこでは、Ｅ１が、ユビキチンを活性化し、それ をＵＢＣ２上に転移することができた。しかしながら、ＵＢＣ２は、ｐ５３複合 反応においてｈＵｂＣＥを置換できなかった（図２、列３）。その上、本発明者 は、ｈＵｂＣＥにおいて活性部位をシステインからセリンへ変異させた。そのよ うな活性部位Ｅ２変異体は、Ｅ１から活性化されたユビキチンを受け入れるが、 活性部位のセリンとユビキチンのカルボキシ末端の間に形成されるエステル（ｅ ｓｔｈｅｒ）結合の高い安定性により、それらの下流の基質をユビキチン化しな いであろう。この変異体は、ｐ５３複合反応において不活性であった（図６、列 ７）。これらの結果は、触媒的に活性なｈＵｂＣＥが、このイン・ビトロ系では 、ユビキチン化ｐ５３の発生には絶対的に必要であることを示している。 図７Ａでは、本発明者は、ユビキチン化されたＥ１は、ｈＵｂＣＥには効率的 にユビキチンを転移できるが、Ｅ６ＡＰには直接には転移でき なかったこと、そしてユビキチン化ｈＵｂＣＥが、Ｅ６によってさらに刺激され ない反応においては、ユビキチンをＥ６ＡＰに転移したことを示している。すべ てのこれらのユビキチン化反応は、ユビキチン活性化酵素、Ｅ１、およびユビキ チンの存在を必要とした。 Ｅ６ＡＰのｈＵｂＣＥ媒介ユビキチン化の特異性の発行先を指示するために、 本発明者は、精製された組み換えｈＵｂＣＥ、ＧＳＴ−ＵＢＣ２、ＧＳＴ−ＵＢ Ｃ８（Kaiser et al．（1994）J．Biol．Chem. 269:8797-8802）およびいわゆる 表皮ユビキチン結合性酵素（Liu et al．（1992）J Biol Chem 267:15829-15835 ）を用いて、ユビキチン化反応を行った。これらの組み換えタンパク質の各々は 、Ｅ１から活性化されたユビキチンを受け入れることができたが、ｈＵｂＣＥの みが、Ｅ６ＡＰにユビキチンを与えることができた（図７Ｂ）。また、本発明者 は、生来のＵＢＣ２が、Ｅ１からユビキチンを受け入れるが、ユビキチンをＥ６ ＡＰに与えることはできないことを確認した（データ提示なし）。 次に、本発明者は、ユビキチン化Ｅ６ＡＰを、グルタチオン−セファロースの アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして、それが、有意な量 のユビキチン化Ｅ１、ユビキチン化ｈＵｂＣＥまたは有意な量のユビキチンを含 まないことを例証した。本発明者は、この精製され、ユビキチン化されたＥ６Ａ Ｐが、Ｅ６依存性反応において、ｐ５３にユビキチンを供与できることを発見し た。 実施例４ 放射標識検出アッセイ ³⁵Ｓ−メチオニンを利用する細胞培養技術によって調製された³⁵Ｓ標識ｐ５３ を、ビオチン化ユビキチンを含むユビキチン結合系の精製成分 を一緒にしてインキュベートする。その反応を、９６穴ミクロタイタープレート で実施し、ヨード酢酸により停止した。反応混合液を、ストレプトアビジン塗布 ミクロタイタープレートのウェルに移し、ビオチン化ユビキチンおよびｐ５３の 複合体を捕捉するためにインキュベートした（遊離のビオチン化ユビキチンも、 ウェル上の結合部位に競合するであろう）。ウェルをバッファー（例えば、リン 酸緩衝生理食塩水、またはユビキチンとＡＴＰを欠く複合用バッファー）で洗浄 し、非複合ｐ５３を除去する。ユビキチン化ｐ５３を、ウェルにシンチレーター を添加し、シンチレーション装置でカウントして検出する。添加した候補薬剤の ユビキチン結合系の阻害を、放射活性カウントの低下によって示す。 実施例５ 免疫検出アッセイ ｐ５３を、ビオチン化ユビキチンを含む前記ユビキチン結合系の精製成分と一 緒にしてインキュベートする。反応を、９６穴ミクロタイタープレートで行い、 ヨード酢酸で停止する。反応混合液を、ストレプトアビジン塗布ミクロタイター プレートのウェルに移し、ビオチン化ユビキチンおよびｐ５３の複合体を捕捉す るためにインキュベートする（遊離のビオチン化ユビキチンも、ウェル上の結合 部位に競合するであろう）。ウェルをバッファーで洗浄し、非複合ｐ５３を除去 する。次に、プレート上に補足されたｕｂ：ｐ５３複合体を、ｐ５３に対するマ ウスのモノクローナル抗体で修飾する。ウェルを、洗浄し、そしてモノクローナ ル抗体の結合を、マウスＩｇＧ(Piece catalog no.91430Gおよび91450G)に対す るペルオキシダーゼ共役抗体の添加、そしてｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ Sigma catalog no.P9187）のような適当な基質系との接 触によって検出する。 実施例６ ＧＳＴ検出アッセイ ＧＳＴ−ｐ５３融合タンパク質を、ビオチン化ユビキチンを含むユビキチン結 合系の精製成分と一緒にしてインキュベートする。反応を、９６穴ミクロタイタ ープレートで行い、ヨード酢酸で停止する。反応混合液を、ストレプトアビジン 塗布ミクロタイタープレートのウェルに移し、ビオチン化ユビキチンおよびＧＳ Ｔ−ｐ５３の複合体を捕捉するためにインキュベートする（遊離のビオチン化ユ ビキチンも、ウェル上の結合部位に競合するであろう）。ウェルをバッファーで 洗浄し、非複合ＧＳＴ−ｐ５３を除去する。ユビキチン化ＧＳＴ−ｐ５３の結合 を、ＧＳＴの生化学的アッセイ（例えば、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼ ン、Pharmacia catalog no.27-4590-01）か、またはヒツジ抗ＧＳＴ抗体（Pharm acia catalog no.27-4590-01）を用いる免疫学的アッセイに基づく検出系で検査 する。 実施例７ レポーター構築物検出アッセイ 図９に示されたプラスミドｐＴＫｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子を含み、そ の発現は、ｐ５３（ｐ５３ＲＥ／ＴＫ）、ｍｙｃ（ｍｙｃＲＥ／ＴＫ）、または Ｓｐ１（Ｓｐ１ＲＥ／ＴＫ）結合部位のいずれかにより改変されたコア単純ヘル ペスウイルスのチミジン−キナーゼ（ＴＫ）プロモーターによって進行する。Ｔ Ｋプロモーターの改変のいずれかを欠く構築物が、哺乳動物細胞にトランスフェ クションされる場合には、このコアＴＫプロモーター断片は、ルシフェラーゼ遺 伝子の効率的転写 の活性化に必要な上流の活性化配列を含まないので、検出可能なルシフェラーゼ 活性が低い。しかしながら、ＴＫが、さらに改変されて、ｐ５３、ｍｙｃまたは Ｓｐ１の１つに対する３または６個の応答要素（ＲＥ）のいずれかを含む構築物 によってトランスフェクションされると、検出可能なルシフェラーゼ活性は、適 当なタンパク質を発現する細胞中で増大する。例えば、ルシフェラーゼ発現レベ ルは、ＴＫ構築物よりもｐ５３ＲＥＴＫを含む構築物によりトランスフェクショ ンされたｐ５３生産細胞（例えば、ＭＬ１細胞）中で、一層有意に高い。同様に 、内因性ｍｙｃおよびＳｐ１タンパク質は、ｍｙｃＲＥ／ＴＫおよびＳｐ１ＲＥ ／ＴＫ構築物の発現を作動することができる。先述したように、両ｐ５３および ｍｙｃは、ユビキチン経路によって分解される。しかしながら、Ｓｐ１は、いか なるユビキチン仲介経路によっても分解されることが知られておらず、したがっ て、Ｓｐ１ＲＥ／ＴＫ構築物は、本アッセイにおける対照として使用できる。か くして、ｐ５３ＲＥ／ＴＫ構築物を担持する細胞において、ｐ５３のユビキチン 仲介分解を阻害する薬剤の存在下では、ルシフェラーゼ活性のレベルは、候補薬 剤で処理されない細胞における活性に比較して増大するであろう。 図９に示されるルシフェラーゼレポーター構築物を構築するために、ｐＧＬ２ −Ｂａｓｉｃベクター（Promega catalog no.E1641）を、ＴＫプロモーターの上 流に置かれた３または６個のいずれかの縦列配置の結合部位とともにＴＫプロモ ーター配列を含むＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片の、多重クローニング領域における 付加によって改変した。ＲＥ／ＴＫプロモーター配列の付加の前に、ｐＧＬ２− Ｂａｓｉｃの２７４４におけるＳａｌＩ制限部位を、オリゴヌクレオチド部位特 異的突然変異誘発 によって破壊した。続いて、ｐ５３ＲＥ／ＴＫ、ｍｙｃＲＥ／ＴＫおよびＳｐ１ ＲＥ／ＴＫと命名された得られる構築物を、各々、製造者の指示（Technical no tes，Part#TM003 of Promega Catalog no.E164）にしたがって、哺乳動物細胞を トランスフェクションするために使用した。 その他の実施態様においては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むｐ５３ ／ＲＥ／ＴＫのＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ断片を、単離し、そしてあらかじめＢｇｌ ＩＩおよびＸｈｏＩで消化したその他の真核生物の発現ベクターｐｃＤＮＡＩＩ Ｉ（Invitrogen，San Diego，CA）中にサブクローン化した。 ベクターｐ５３ＲＥ／ＴＫを、野生型ｐ５３を発現するヒト慢性白血病細胞系 ＭＬ１にトランスフェクションする。このイン・ビボの状態では、ルシフェラー ゼ発現は、ｐ５３の存在によって正制御（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）されるが、そ れは、ＴＫプロモーターの上流のｐ５３応答要素に結合することによって転写活 性化因子として機能する。ユビキチン結合系は、ｐ５３の分解に関与し、そして 機能的である場合には、この系におけるルシフェラーゼの発現を負制御（ｄｏｗ ｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ）する。ルシフェラーゼ活性の測定は、標準法（例えば、 Promega Technical Bulletin #TB161、参照）によって実施される。細胞を増殖 させ、組織培養用の９６穴ミクロタイタープレートに移す。培養細胞を、候補薬 剤の存在および不在下で培養し、次いで、回収し、遠心分離する。次いで、回収 した細胞を、溶菌バッファーで溶菌する。溶菌液を、遠心によって清澄化し、そ の上澄液を、ルミネセンス用ミクロタイタープレートに移す。ルシフェラーゼア ッセイ基質（甲虫ルシフェラーゼ、Promega catalog no．E1603）を添加し、そ して各ウェル中の反応を、ルミ ノメーターもしくはシンチレーションカウンターにおいて追跡する。ユビキチン 結合系の阻害は、非阻害系よりも高いルミネセンス信号を生じる。イン・ビボの アッセイではあるが、このスクリーニング法は、一般の細胞毒化合物の影響を受 けないであろう。 実施例８ ｈＵｂＣＥ遺伝子のセンスおよびアンチセンス構築物の マイクロインジェクション ｐ５３分解においてｈＵｂＣＥおよびＥ６ＡＰ機能の妨害の結果を研究するた めに、本発明者らは、ｈＵｂＣＥ遺伝子のセンスおよびアンチセンス構築物を用 いて、マイクロインジェクション実験を行った。間接的な免疫蛍光法によるｐ５ ３の検出を容易にするために、実験は、高レベルの突然変異体ｐ５３（Ａｒｇ２ ７３Ｈｉｓ）を含むヒト腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８において実施された。 この細胞系では、ｐ５３の分解は、ＨＰＶ−１８Ｅ６発現プラスミドのマイクロ インジェクションによって刺激できた。 ｈＵｂＣＥおよびＥ６ＡＰが、ｐ５３のＥ６に依存するユビキチン化と分解を 仲介するかどうかを決定するために、イン・ビボでの同時インジェクション実験 を実施した。実施を簡単に述べれば、ＣＭＶ発現ベクターを、ＨＰＶ−１８Ｅ６ 、ヒトＥ６−ＡＰ、ｈＵｂＣＥ、なたはｈＵｂＣＥのＣｙｓ−８５変異体の１つ の完全な読み枠を、ｐＸ−プラスミド（Baldin et al．（1993）Genes & Devel. ，7:812-821）中に、センスまたはアンチセンスのいずれかの方向（図８に示す ように）に挿入することによって得た。プラスミドを、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚ ａｒｄ Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットで精製し、そしてマイクロインジェクション ・ マーカーとして使用される正常のアフィニティー精製されたウサギかマウスの抗 体（５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）の存在下で、濃度５０〜１００μｇ／μｌでインジェ クションした。 非同調性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の細胞モノレアーに、自動マイクロインジ ェクション・システム（AIS，Zeiss; Ansorge et al．（1988）J．Biochem．Bio phys．Meth. ，16:283-292）を用いて、インジェクションされた細胞の同定を可 能にするためにウサギＩｇＧとともに、指定されたＤＮＡ（図８）をインジェク ションした。すべてのマイクロインジェクション実験を、インジェクションの間 の培地のｐＨ低下を避けるために、炭酸塩不含のＤＭＥＭ培地３ｍｌを含む３． ５ｃｍペトリ皿において実施した。各細胞を、圧力５０〜１５０ｈＰａでインジ ェクションした。２４時間後、細胞を固定し、そしてｐ５３特異的モノクローナ ル抗体（ＤＯ−１；Oncogene Science），続いてビオチン化ウマ・抗ウサギ抗体 およびＴｅｘａｓ ｒｅｄ共役ストレプトアビジンを用いて染色した。インジェ クションされた細胞は、ＦＩＴＣ共役ヒツジ・抗ウサギ抗体を用いて染色して同 定した（Baldin et al．（1993）Genes and Dev７:812-821）。 アンチセンスまたは変異体のｈＵｂＣＥ発現プラスミドか、またはアンチセン スＥ６ＡＰをコードしている発現プラスミドかのいずれかを、Ｅ６発現プラスミ ドと同時にインジェクションした場合、ｐ５３のＥ６に剌激される分解を阻害し た（図８）。ヒトｈＵｂＣＥか、Ｅ６ＡＰの変異型をコードしている発現プラス ミドに対して作製されたポリクローナル抗体を、マイクロインジェクションした 場合も、同様の結果を得た（図示なし）。 また、アンチセンスＥ１をコードしている発現プラスミドとＥ６発現プラスミ ドの同時インジェクションは、ｐ５３のＥ６刺激分解を阻害した。アンチセンス または変異体のＵＢＣ２発現プラスミドの同時インジェクションは、ｐ５３のＥ ６刺激分解にはほとんど影響しなかった（図８）。 さらに、酵素の不活性型を生産するｈＵｂＣＥ変異体、Ｃｙｓ−８５→Ｓｅｒ 、は、多分、少なくとも部分的にｐ５３を救援できる優性のネガティブ変異体で あろう。 実施例９ ｈＵｂＣＥタンパク質の分子モデルの作製 Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＵＢＣ１の構造からのタンパク 質骨格の三次元座標（Brookhaven databank file 1AAK.pdb）を、ｈＵｂＣＥの 相同モデル作製のために使用した。モデル作製を、ＱＵＡＮＴＡのＰｒｏｔｅｉ ｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウエアーパッケージ、バージョン４（MSI，Burmi ngton MA）を用いて行った。 簡単に言えば、ｈＵｂＣＥ（配列番号：２）およびＵＢＣ１のアミノ酸配列を 、ＱＵＡＮＴＡにおける一列化プログラムを用いて一列にした。この一列化では 、４４％合致する同じ残基を示した。次いで、骨格の非水素原子の座標を、ｈＵ ｂＣＥ配列上に複写したが、ｈＵｂＣＥモデルの側鎖座標は、この点では無視さ れるものであった。次いで、得られるｈＵｂＣＥ構造を、ｓｔｅｅｐｅｓｔ ｄ ｅｃｅｎｔアルゴリズム２００ステップに続いて、採用ベースＮｅｗｔｏｎ Ｒ ａｐｈｓｏｎアルゴリズム５０００ステップを用いて、エネルギーを最小化した 。極性水素および全側鎖を含むすべての原子を動かせた。その系の得られるＣＨ ＡＲＭＭエネルギーは、−７０８４．２ｋｃａｌであった。 次の段階では、その構造を、２０００ステップまたは総時間２ｐｓｅｃを用い て５００°Ｋまで加熱した。加熱後、次に、その系を、９ｐｓｅｃ（９０００ス テップ）の間平衡させた。１０ｐｓｅｃ後の最終ＣＨＡＲＭＭエネルギーは、約 −５７５０ｋｃａｌであった。最後に、その系を、５０°Ｋの段階（１ｐｓｅｃ 冷却、４ｐｓｅｃ平衡）で３００°Ｋまで冷却し、最後に、３００°Ｋで６ｐｓ ｅｃ平衡させた。最終ＣＨＡＲＭＭエネルギーは、約−６６５０ｋｃａｌであっ た。最終構造は、重大なコンホメーションのひずみまたは不適当な角を示さなか った。全長モデルの原子座標を、図１に示す。 次の段階では、活性部位に、４量体ペプチドＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ をモデル化した。このペプチドは、ユビキチンのｃ−末端配列から得られた（Ｒ ＩＲＧ）。チオエステル結合を、Ｃ−末端Ｇｌｙおよび活性部位のシステインの 間の両場合について、手動で構築した。その系をエネルギー最小化し、続いて、 分子動力学シミュレーションにかけた。両場合において、ペプチドのＩｌｅ残基 は、疎水性ポケット中に安定する。ループとペプチド間には、２種の骨格・骨格 水素結合が存在する。ペプチドのＡｒｇは、両場合において保存Ａｓｐ残基（保 存ＶａｌおよびＩｌｅ残基間）と水素結合を形成した。 活性部位クレフト中へのペプチドの一般的なしっかりした適合は、この領域が またユビキチンへの接合部位でもあることを明確にさせた。本発明者は、もはや ユビキチンを結合しないであろうと信じられる種々の変異体の構築のために、こ の構造上の情報を使用するであろう。また、ペプチドまたはペプチド疑似体の設 計にも、この三次元情報を使用するであろう。合理的な薬物設計にもっとも重要 であると決定された残基の サブセットの座標を、図２に示す。 実施例１０ 酵母ＵｂＣＥ遺伝子のクローニング ｈＵｂＣＥ遺伝子の同族体をクローン化するために、保存領域ＰＶＧＤＤＬＦ ＨＷＨ／ＱおよびＩＴＬＡＰＳＷ（配列番号：１）に基づく退化したオリゴヌク レオチドを、設計し、そして、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ゲノムＤＮＡとλ ＺＡＰ（菌株ｈ＋^Nｈｉｓ３−）中のｃＤＮＡ、およびＣ．アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ ）ゲノムとλＺＡＰ（菌株３１５３Ａ）中のｃＤＮＡを増幅す るために使用した。増幅は、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分間の ３０サイクルからなった。ＰＣＲ反応物を、２．５％低温融解アガロースゲルで 分離し、それにより、Ｃ．アルビカンス由来のゲノムと相補的両ＤＮＡについて ２５０ｂｐ断片を同定した。Ｓ．ポンベ由来の２５０と６５０ｂｐ断片を、それ ぞれ相補的およびゲノムＤＮＡについて検出した。相補的ＤＮＡとゲノムＳ．ポ ンベＤＮＡ断片の間のサイズの相違は、多分、イントロンの存在を反映している のであろう。２５０ｂｐの断片を、溶出し、ｐＣＲＩＩ（ＴＡクローニング系、 Invitrogen）中にクローン化した。 Ｓ．ポンベおよびＣ．アルビカンスＤＮＡプローブを、ニックトランスレーシ ョンによって³²Ｐ標識し、そしてサザンブロットにおいて使用して、断片の種同 一性を確認し、Ｓ．ポンベおよびＣ．アルビカンスｃＤＮＡライブラリーをスク リーニングした。全長さのｃＤＮＡの配列決定では、クローンの同一性を確認し た。Ｃ．アルビカンスおよびＳ．ポンベＵｂＣＥの読み枠は、両方とも１４７個 のａａ残基長であった（それぞれ、配列番号：３および５）。新しく単離された 遺伝子を、それぞ れ、Ｃ．アルビカンスおよびＳ．ポンベについてｃａＵｂＣＥおよびｓｐＵｂＣ Ｅと命名した。 実施例１１ ヒトｒａｐＵＢＣ酵素のクローニング ＦＫＢＰ１２−ｂａｉｔタンパク質を含む二ハイブリッドアッセイを利用して 、薬物依存性相互作用トラップアッセイを使用して、ｐＧＡＤＧＨ（ＸｈｏＩ挿 入断片、Clonetech）においてＷ１３８（混合Ｇ₀および分裂する繊維芽細胞）ｃ ＤＮＡライブラリー（Clonetech，Palo Alto CA）をスクリーニングした。簡単 には、二ハイブリッドアッセイを、ＦＫＢ１遺伝子を破壊されたＨＦ７Ｃ酵母細 胞（Clonetech）において実施した。単離されたクローンについて、新規なヒト ・ユビキチン結合性酵素（ｒａｐ−ＵＢＣ，配列番号：１２および１３）を、同 定した。本来のクローンは、活性部位システインと遺伝子の３’末端を含むｒａ ｐＵＢＣのコード領域の実質的部分を含む遺伝子の５’末端を含んだ。ｒａｐＵ ＢＣ遺伝子の全長の配列を得るために５’末端を、ライブラリーベクター（ＭＴ ＸＰ３７）および本来のｃＤＮＡクローンＳＭＲ４−１５の５’末端近接配列に 対応するオリゴを用いてクローン化した。使用したオリゴは、VB1040: CTACTAAT AGGTAGAAGCGGTGG(配列番号:20)およびVB1041: GGTAAACCAAAGCCCGACAGGG(配列番 号:21)であった。ＰＣＲ生成物を、正常のヒト繊維芽細胞（分裂するＷ１３８細 胞）由来のｃＤＮＡライブラリーから得た。 実施例１２ ＵＢＣ３によるｐ２７のユビキチン化 本発明者らは、ヒトＣＤＣ３４（ＵＢＣ３）が、チオエステルおよび ユビキチン化アッセイにおいて、ｐ２７（また、ｌｃｋ、Ｋｉｐ１およびＰｉｃ ２とも呼ばれる）を負荷できることを発見した。簡単には、ユビキチン化反応を 、前記のように行った。各反応液は、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣ ｌ₂、２ｍＭＡＴＰ−γ−Ｓ、０．１ｍＭＤＴＴおよび５μＭユビキチン中にＥ １、Ｅ２およびｐ２７タンパク質５０〜２００ｎｇを含んだ。全反応液（３０μ ｌ）を、２５℃で３時間インキュベートし、次いで、ｐ２７ユビキチン化の分析 のために、１２．５％ＳＤＳゲル上に添加した。ゲルを展開し、そしてタンパク 質を、ニトロセルロースに電気泳動的に転写した。ｐ２７タンパク質を、市販の モノクローナル抗体（Transduction Laboratory）およびＮＥＮ製ＥＣＬシステ ムにより現した。ユビキチン化タンパク質を、Sigma製ＥＸｔｒａｖｉｄｉｎ− ＨＲＰおよびＮＥＮ製ＥＣＬシステムを用いて目視化した。 先に引用された参考文献および出版物のすべては、本明細書に引用によって組 み入れられる。 等価物 当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様との多くの等価物を、認 識するか、日常の実験以外のものを用いなくても確認できるであろう。そのよう な等価物は、次の請求の範囲に包含されることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/48 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｚ 33/68 0276−2Ｊ 33/68 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０８／２５０，７９５ (32)優先日 1994年５月27日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／３０５，５２０ (32)優先日 1994年９月13日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 エクステイン， ジエンズ・ダブリユー アメリカ合衆国マサチユセツツ州02139ケ ンブリツジ・アパートメント５・ビジエロ ウストリート35 (72)発明者 コタレル， ギヨーム アメリカ合衆国マサチユセツツ州02167チ エスナツトヒル・クロスビーロード32 (72)発明者 ジユリス， ジエノ アメリカ合衆国マサチユセツツ州01890ウ インチエスター・カーデイナルストリート 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞−周期調節タンパク質のユビキチン−媒介タンパク質溶解のインヒビタ ーを同定するためのアッセイであって、 （ｉ）調節タンパク質のユビキチン化を促進する条件下で、調節タンパク質およ びユビキチンを含む再構成したタンパク質混合物を含んで成るユビキチン−結合 系を提供し； （ii）ユビキチン−結合系を候補薬剤と接触させ； （iii）調節タンパク質のユビキチン化を測定し；そして （iv）候補薬剤の存在下で測定されたユビキチン化レベルと、候補薬剤の不在下 で調節タンパク質のユビキチン化レベルとを比較する、 ことを含んで成り、ここで候補薬剤の存在下で調節タンパク質のユビキチン化の 減少が調節タンパク質のユビキチン化のインヒビターを示す、上記アッセイ。 ２．調節タンパク質がｐ５３、ｐ２７^kipl、ｍｙｃ、ＭＡＴα２、サイクリンお よびｆｏｓから成る群から選択される、請求の範囲第１項に記載のアッセイ。 ３．ユビキチンが； （ｉ）非結合ユビキチン、この場合はユビキチン−結合系はさらにＥ１ユビキチ ン−活性化酵素（Ｅ１）、Ｅ２ユビキチン−結合性酵素（Ｅ２）およびアデノシ ン三リン酸を含んで成り； （ii）活性化Ｅ１：ユビキチン複合体、この場合はユビキチン−結合系はさらに Ｅ２を含んで成り；そして （iii）活性化されたＥ２：ユビキチン複合体 から成る群から選択される状態で提供される、請求の範囲第１項に記載 のアッセイ。 ４．再構成されたタンパク質混合物がさらにＥ３ユビキチン−リガーゼタンパク 質を含んで成る、請求の範囲第１項に記載のアッセイ。 ５．ユビキチンおよび調節タンパク質の少なくとも１つが検出しうる標識を含ん で成り、そしてユビキチン−結合性調節タンパク質のレベルが調節タンパク質、 ユビキチンおよびユビキチン−結合性調節の少なくとも１つの標識を検出するこ とにより定量される、請求の範囲第１項に記載のアッセイ。 ６．標識基が、放射性同位体、蛍光化合物、酵素および酵素コファクターから成 る群から選択される、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．検出しうる標識が測定できる活性を有するタンパク質であり、そして調節タ ンパク質が検出しうる標識を含む融合タンパク質である、請求の範囲第５項に記 載のアッセイ。 ８．ユビキチン−結合性調節タンパク質の量がイムノアッセイにより定量される 、請求の範囲第１項に記載のアッセイ。 ９．ｐ５３のユビキチン−媒介タンパク質溶解のインヒビターを同定するための アッセイであって、 （ｉ）パピローマウイルスＥ６タンパク質を発現し、そしてｐ５３反応性要素の 転写制御下にレポーター遺伝子を有する真核細胞を提供し；（ii）細胞を候補薬 剤に接触させ； （iii）候補薬剤の存在下でレポーター遺伝子の発現レベルを測定し；そして、 （iv）候補薬剤の存在下で測定されたユビキチン化レベルと、候補薬剤の不在下 でのｐ５３のユビキチン化レベルとを比較する、 ことを含んで成り、ここで候補薬剤の存在下でｐ５３タンパク質のユビキチン化 の減少がｐ５３タンパク質のユビキチン化のインヒビターであることを示す、上 記アッセイ。 １０．Ｅ６タンパク質が高危険性のヒトパピローマウイルスに由来する、請求の 範囲第９項に記載のアッセイ。 １１．高危険性のヒトパピローマウイルスがＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８および ＨＰＶ−３３から成る群から選択される、請求の範囲第１０項に記載のアッセイ 。 １２．ｐ５３のＥ６−媒介分解のインヒビターを同定するためのアッセイであっ て、 （ｉ）Ｅ６タンパク質がｐ５３タンパク質のユビキチン化を媒介する条件下で、 ヒトパピローマウイルス由来のＥ６タンパク質、ｐ５３タンパク質、アデノシン 酸三リン酸、Ｅ１ユビキチン−活性化酵素、Ｅ２ユビキチン−結合性酵素および ユビキチンを含む再構成されたタンパク質混合物を含んで成るインビトロユビキ チン−結合系を提供し； （ii）ユビキチン−結合系を候補薬剤に接触させ； （iii）候補薬剤の存在下でｐ５３タンパク質のユビキチン化レベルを測定し； そして、 （iv）候補薬剤の存在下で測定されたユビキチン化レベルと、候補薬剤の不在下 でのｐ５３のユビキチン化レベルとを比較する、 ことを含んで成り、ここで候補薬剤の存在下でのｐ５３タンパク質の減少がｐ５ ３タンパク質のＥ６−媒介分解を指示している、上記アッセイ。 １３．ユビキチン−結合系が、さらにＥ６−ＡＰタンパク質を含んで成る、請求 の範囲第１２項に記載のアッセイ。 １４．ｐ５３のＥ６−媒介分解のインヒビターを同定するためのアッセイであっ て、 ｉ．ｐ５３のユビキチン−依存性分解を媒介し、そして欠落したｐ５３細胞−周 期チェックポイントを生じるヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質を発現する 細胞を提供し、ここで未成熟な進行が細胞死を生じる条件下で、ｐ５３細胞−周 期チェックポイントの欠落が未成熟な細胞の有糸分裂細胞−周期への進行を容易 にすることにより、細胞の生存能力を減少させることができ、； ii．ｐ５３細胞−周期チェックポイントの欠落が細胞死を生じる条件下で、細胞 を候補薬剤に接触させ； iii．候補薬剤の存在下で細胞の生存能レベルを測定し；そして、 iv．候補薬剤の存在下の細胞の生存能レベルと、候補薬剤の不在下での細胞の生 存能レベルとを比較する、 ことを含んで成り、ここで候補薬剤の存在下で生存能レベルの増加が，ｐ５３の Ｅ６−媒介分解の阻害を指示している、上記アッセイ。 １５．ｐ５３細胞−周期チェックポイントの欠落が細胞死を生じる条件が、細胞 のＤＮＡ障害源への暴露を含んで成る、請求の範囲第１４項に記載のアッセイ。 １６．ＤＮＡ障害源がγ−照射である、請求の範囲第１５項に記載のアッセイ。 １７．細胞−周期調節タンパク質のユビキチン−媒介タンパク質溶解のインヒビ ターを同定するためのアッセイであって、 （ｉ）調節タンパク質のＵＢＣ−依存性ユビキチン化を促進する条件下で、調節 タンパク質、ユビキチンおよび配列番号２または１３のＵＢＣ 酵素を含むユビキチン−結合系を提供し； （ii）ユビキチン−結合系を候補薬剤に接触させ； （iii）候補薬剤の存在下で調節タンパク質のユビキチン化レベルを測定し；そ して、 （iv）候補薬剤の存在下で測定したユビキチン化レベルを、候補薬剤の不在下で の調節タンパク質のユビキチン化レベルと比較する、 ことを含んで成り、ここで候補薬剤の存在下での調節タンパク質の減少が調節タ ンパク質のユビキチン化のインヒビターを指示している、上記アッセイ。 １８．調節タンパク質がｐ５３、ｐ２７^kipl、ｍｙｃ、ＭＡＴα２、サイクリン およびｆｏｓから成る群から選択される、請求の範囲第１７項に記載のアッセイ 。 １９．ユビキチンが； （ｉ）非結合ユビキチン、この場合はユビキチン−結合系はさらにＥ１ユビキチ ン−活性化酵素（Ｅ１）、およびアデノシン三リン酸を含んで成り； （ii）活性化Ｅ１：ユビキチン複合体；そして （iii）活性化ＵＢＣ：ユビキチン複合体 から成る群から選択される状態で提供される、請求の範囲第１７項に記載のアッ セイ。 ２０．再構成されたタンパク質混合物がさらに、Ｅ３ユビキチン−リガーゼタン パク質を含んで成る、請求の範囲第１７項に記載のアッセイ。 ２１．ユビキチンおよび調節タンパク質の少なくとも１つが検出しうる標識を含 んで成り、そしてユビキチン−結合性調節タンパク質のレベル が調節タンパク質、ユビキチンおよびユビキチン−結合性調節タンパク質中の少 なくとも１つの標識を検出することにより定量される、請求の範囲第１７項に記 載のアッセイ。 ２２．配列番号２に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有するhUCEポリペ プチドまたはその断片の実質的に純粋な調製物。 ２３．上記ポリペプチドが少なくとも４個の連続的なアミノ酸を、配列番号２の 残基１０７と残基１４７との間に含む、請求の範囲第２２項に記載のポリペプチ ド。 ２４．配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列を有 する、請求の範囲第２２項に記載のポリペプチド。 ２５．上記ポリペプチドが、細胞−周期調節のアゴニストまたは細胞−周期調節 のアンタゴニストのいずれか１つの機能を果たす、請求の範囲第２２項に記載の ポリペプチド。 ２６．上記ポリペプチドがｐ５３タンパク質のユビキチン化を媒介する、請求の 範囲第２５項に記載のポリペプチド。 ２７．上記ポリペプチドが配列番号２とは異なる少なくとも１つアミノ酸残基を 含み、そしてこれが配列番号２と同一の配列を有する酵素によるｐ５３タンパク 質のユビキチン化を阻害する、請求の範囲第２５項に記載のポリペプチド。 ２８．ユビキチン、Ｅ１酵素、Ｅ６−ＡＰタンパク質、パピローマウイルスＥ６ タンパク質またはｐ５３の少なくとも１つに特異的に結合する、請求の範囲第２ ２項に記載のポリペプチド。 ２９．免疫原性調製物中で、免疫原が上記ユビキチン−結合性酵素ポリペプチド との特異的免疫反応を顕現できる、請求の範囲第２２項に記載 のポリペプチドを含んで成る免疫原。 ３０．請求の範囲第２２項に記載のポリペプチドのエピトープに特異的に反応性 の抗体調製物。 ３１．配列番号１３に少なくとも８０％相同的なアミノ酸配列を有するrapUBCポ リペプチドまたはその断片の実質的に純粋な調製物。 ３２．上記ポリペプチドが、細胞−周期調節のアゴニストまたは細胞−周期調節 のアンタゴニストのいずれか１つの機能を果たす、請求の範囲第３１項に記載の ポリペプチド。 ３３．上記ポリペプチドが配列番号１３とは異なる少なくとも１つアミノ酸残基 を含み、そしてこれが配列番号１３と同一の配列を有する酵素によるユビキチン 化を阻害する、請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。 ３４．免疫原性調製物中で、免疫原が上記rapUBCポリペプチドとの特異的免疫反 応を顕現できる、請求の範囲第３１項に記載のポリペプチドを含んで成る免疫原 。 ３５．請求の範囲第３１項に記載のポリペプチドのエピトープに特異的に反応性 の抗体調製物。 ３６．配列番号４に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有するカンジダ(C andida )UbCEポリペプチド、またはその断片の実質的に純粋な調製物。 ３７．請求の範囲第３６項に記載のポリペプチドのエピトープに特異的に反応性 の抗体調製物。 ３８．配列番号６に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有するシゾサッカ ロミセス(Schizosaccharomyces)UbCEポリペプチドまたはその 断片の実質的に純粋な調製物。 ３９．請求の範囲第３８項に記載のポリペプチドのエピトープに特異的に反応性 の抗体調製物。 ４０．配列番号２に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有する組換えhUbC Eポリペプチドまたはその断片。 ４１．hUbCEポリペプチドが少なくとも４個の連続的なアミノ酸を、配列番号２ の残基１０７と残基１４７との間に含む、請求の範囲第４０項に記載のポリペプ チド。 ４２．配列番号７の一般式により表されるアミノ酸配列を有する、請求の範囲第 ４０項に記載のポリペプチド。 ４３．上記hUbCEポリペプチドが、細胞−周期調節のアゴニストまたは細胞−周 期調節のアンタゴニストのいずれか１つの機能を果たす、請求の範囲第４０項に 記載のポリペプチド。 ４４．上記hUbCEポリペプチドが、ｐ５３タンパク質のユビキチン化を媒介する 、範囲第４３項に記載のポリペプチド。 ４５．上記hUbCEポリペプチドが配列番号２とは異なる少なくとも１つアミノ酸 残基を含み、そしてこれが配列番号２と同一の配列を有する酵素によるｐ５３タ ンパク質のユビキチン化を阻害する、請求の範囲第４３項に記載のポリペプチド 。 ４６．上記hUbCEポリペプチドが、配列番号２と同一のユビキチン結合性酵素の ５％未満のユビキチン結合性活性を有する、請求の範囲第４５項に記載のポリペ プチド。 ４７．ユビキチン、Ｅ１酵素、Ｅ６−ＡＰタンパク質、パピローマウイルスＥ６ タンパク質またはｐ５３の少なくとも１つに特異的に結合する、 請求の範囲第４０項に記載のポリペプチド。 ４８．上記hUbCEポリペプチドが、配列番号２のタンパク質とは無関係なタンパ ク質に由来するアミノ酸配列を有する第二ポリペプチド部分をさらに含んで成る 融合タンパク質である、請求の範囲第４０項に記載のポリペプチド。 ４９．上記融合タンパク質が２−ハイブリッドアッセイ中で機能的である、請求 の範囲第４８項に記載のポリペプチド。 ５０．配列番号２、４、６または７の少なくとも１つに、少なくとも９０％相同 的なアミノ酸配列を有する組換えユビキチン結合性酵素ポリペプチドまたはその 断片。 ５１．配列番号１３に少なくとも８０％相同的なアミノ酸配列を有する、組換え ポrapUBCポリペプチドまたはその断片。 ５２．上記rapUbCEポリペプチドが、細胞−周期調節のアゴニストまたは細胞− 周期調節のアンタゴニストのいずれか１つの機能を果たす、請求の範囲第５１項 に記載のポリペプチド。 ５３．上記rapUbCEポリペプチドが、ｐ５３タンパク質のユビキチン化を媒介す る、請求の範囲第５２項に記載のポリペプチド。 ５４．上記rapUBCポリペプチドが、配列番号１３と同一のユビキチン結合性酵素 の５％未満のユビキチン結合活性を有する、請求の範囲第５２項に記載のポリペ プチド。 ５５．上記rapUBCポリペプチドが、配列番号１３のタンパク質とは無関係なタン パク質に由来するアミノ酸配列を有する第二ポリペプチド部分をさらに含んで成 る融合タンパク質である、請求の範囲第４０項に記載のポリペプチド。 ５６．上記融合タンパク質が２−ハイブリッドアッセイ中で機能的である、請求 の範囲第５５項に記載のポリペプチド。 ５７．配列番号２に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有する、ユビキチ ン−結合性酵素またはその断片をコードするヌクレオチド配列を有する実質的に 純粋な核酸。 ５８．上記ユビキチン結合性酵素が、ユビキチン、Ｅ１酵素、Ｅ６−ＡＰタンパ ク質、パピローマウイルスＥ６タンパク質またはｐ５３の少なくとも１つに特異 的に結合する、請求の範囲第５７項に記載の核酸。 ５９．上記ユビキチン結合性酵素が少なくとも４個の連続的なアミノ酸を、配列 番号２の残基１０７と残基１４７との間に含む、請求の範囲第５７項に記載の核 酸。 ６０．上記核酸によりコードされる上記ポリペプチドが、細胞−周期調節のアゴ ニストまたは細胞−周期調節のアンタゴニストのいずれか１つの機能を果たす、 請求の範囲第５７項に記載の核酸。 ６１．上記核酸によりコードされる上記ポリペプチドが、ｐ５３タンパク質のユ ビキチン化を媒介する、請求の範囲第６０項に記載の核酸。 ６２．上記核酸によりコードされる上記ポリペプチドが、配列番号２と同一のユ ビキチン結合性酵素の５％未満のユビキチン結合活性を有し、このポリペプチド は配列番号２と同一の酵素により媒介されるユビキチン化を拮抗する、請求の範 囲第６０項に記載のポリペプチド。 ６３．上記ヌクレオチド配列がストリンジェント条件下で、配列番号１の少なく とも１２個の連続的ヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする 、請求の範囲第５７項に記載の核酸。 ６４．配列番号１３に少なくとも８０％相同的なアミノ酸配列を有する、 ユビキチン−結合性酵素またはその断片をコードするヌクレオチド配列を有する 実質的に純粋な核酸。 ６５．上記核酸によりコードされる上記ポリペプチドが、細胞−周期調節のアゴ ニストまたは細胞−周期調節のアンタゴニストのいずれか１つの機能を果たす、 請求の範囲第６４項に記載の核酸。 ６６．上記ヌクレオチド配列がストリンジェント条件下で、配列番号１の少なく とも１２個の連続的ヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする 、請求の範囲第６４項に記載の核酸。 ６７．上記ヌクレオチド配列を発現ベクターとしての使用に適するようにするよ うに、該ヌクレオチド配列に操作可能に連結された転写調節配列をさらに含んで 成る、請求の範囲第５７または第６４項に記載の核酸。 ６８．請求の範囲第５７または第６４項に記載の核酸を含んで成り、原核細胞ま たは真核細胞中の少なくとも１つで複製できる発現ベクター。 ６９．請求の範囲第６８項に記載の発現ベクターでトランスフェクトされ、上記 ポリペプチドを発現する宿主細胞。 ７０．上記ユビキチン結合性酵素を発現させるために、細胞培養培地中で請求の 範囲第６９項に記載の細胞を培養し、そして該ユビキチン結合性酵素を該細胞培 養物から単離することを含んで成る、組換えユビキチン結合性酵素の生産法。 ７１．請求の範囲第５７または第６４項に記載の核酸の発現可能な状態を含んで 成る、トランスジェニック動物。 ７２．配列番号１のUbCE遺伝子に相同的な少なくとも1つの遺伝子コピーが破壊 されている、トランスジェニック動物。 ７３．配列番号１２のrapUBC遺伝子に相同的な少なくとも1つの遺伝子 コピーが破壊されている、トランスジェニック動物。 ７４．配列番号２、４または６の少なくとも１つに、少なくとも９０％相同的な アミノ酸配列を有する、ユビキチン−結合性酵素またはその断片をコードするヌ クレオチド配列を有する実質的に純粋な核酸。 ７５．ヌクレオチド配列が読み取り枠中の転写調節配列に操作可能に連結され、 そして細胞−周期調節のアゴニストまたは細胞−周期調節のアンタゴニストのい ずれか１つの機能を果たすことができるポリペプチドに翻訳できる、配列番号１ 、３または５の１つに、少なくとも９０％相同的なＵＢＣ−コーディングヌクレ オチド配列を含んで成る組換え遺伝子。 ７６．ゲノムクローンに由来し、そして場合によっては上記ＵＢＣ−コーディン グヌクレオチド配列を破壊するイントロンのヌクレオチド配列を含んでもよい、 請求の範囲第７５項に記載の組換え遺伝子。 ７７．上記組換え遺伝子が２−バブリッドアッセイ中で機能的である、請求の範 囲第７５項に記載の組換え遺伝子。 ７８．オリゴヌクレオチドが、ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５ま たは１２のセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも１０個の連続的ヌクレオ チド、あるいは天然に存在するその突然変異体にハイブリダイズするヌクレオチ ド配列の領域を含む、実質的に精製された該オリゴヌクレオチドを含んで成るプ ローブ／プライマー。 ７９．さらに付加され、そして検出できる標識基を含んで成る、請求の範囲第７ ８項に記載のプローブ／プライマー。 ８０．望ましくない細胞増殖が特徴である疾患について、患者が危険な状態であ るかどうかを決定する方法であって、該患者の組織中に少なく とも１つの 配列番号２または１３により表されるタンパク質をコードするＵＢＣ 遺伝子の突然変異、またはその相同物；および該遺伝子の誤−発現、が特徴で ある遺伝子損傷の存在または不在を検出することを含んで成る、上記方法。 ８１．上記遺伝子損傷の検出が、少なくとも1つの ｉ．該遺伝子の１つ以上のヌクレオチド欠失、 ii．該遺伝子への１つ以上のヌクレオチド付加、 iii．該遺伝子の１つ以上のヌクレオチド置換、 iv．該遺伝子の大まかな染色体再配置(gross chromosomal rearrangement)、 ｖ．該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルの大まかな変化、 vi．該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非−野生型スプライシングパターン の存在、 vii．該タンパク質の非−野生型レベル の存在を確認することを含んで成る、請求の範囲第８０項に記載の方法。 ８２．上記遺伝子損傷の検出が、 ｉ．配列番号１または１２のセンスまたはアンチセンス配列あるいはその天然に 存在する突然変異体、あるいは上記遺伝子に結合している５’または３’フラン キング配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオ チドを含んで成るプローブ／プライマーを提供し； ii．該プローブ／プライマーを上記組織中の核酸に暴露し；そして iii．該プローブ／プライマーの該核酸へのハイブリダイゼーションによ り、該遺伝子損傷の有無を検出する、 ことを含んで成る、請求の範囲第８０項に記載の方法。 ８３．上記損傷の検出が、該遺伝子のヌクレオチド配列を決定するために、そし て場合によっては該フランキング核酸配列のヌクレオチド配列を決定するために 、上記プローブ／プライマーを使用することを含んで成る、請求の範囲第８０項 に記載の方法。 ８４．上記損傷の検出が、上記プローブ／プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ PCR）に使用することを含んで成る、請求の範囲第８０項に記載の方法。 ８５．上記損傷の検出が、上記プローブ／プライマーをライゲーション連鎖反応 （LCR）に使用することを含んで成る、請求の範囲第８０項に記載の方法。 ８６．上記タンパク質レベルがイムノアッセイで検出される、請求の範囲第８１ 項に記載の方法。 ８７．ヒトユビキチン−結合性酵素(hUCE)のインヒビターを同定する方法であっ て、 （i）アミノ酸残基Cys-85、Leu-86、Asp-87、Ile-88、Arg-90、Ser-91、Leu-109 、Asn-114、Asp-116およびAsp-117を含むhUCEの分子モデルを提供し、これらの 残基の原子配位は、300°Kで、全ＲＭＳを第２図に示す２Å以内の原子配位に有 し、 （ii）候補薬剤の分子モデルを提供し、 （iii）該薬剤モデルと該hUCEモデルをドッキングさせ、そしてドッキングした モデルの結合基準を決定し、そして （iv）該結合基準から、同様の候補薬剤を該hUCEのインヒビターと決定 する、 ことを含んで成る、上記方法。 ８８．上記結合基準が、静電的相互作用、水素結合、疎水的相互作用、脱溶媒和 効果、リガンドおよび酵素の共同的挙動、およびこれらの組み合わせから選択さ れる、請求の範囲第８７項に記載の方法。 ８９．さらに上記候補薬剤を製造する工程を含んで成る、請求の範囲第８７項に 記載の方法。 ９０．さらに、上記候補薬剤および配列番号２に表されるアミノ酸配列を含んで 成るタンパク質をアッセイに提供して、該候補薬剤の阻害活性を決定する工程を 含んで成る、請求の範囲第８７項に記載の方法。 ９１．上記hUCEモデルが配列番号２のアミノ酸残基Arg-5からMet-147を含んで成 り、これらの残基の原子配位は、300°Kで、全ＲＭＳを第１図に示す２Å以内の 原子配位に有する、請求の範囲第８７項に記載の方法。 ９２．残基の原子配位が、300°Kで、全ＲＭＳを第２図に示す２Ａ以内の原子配 位に有する、アミノ酸残基Cys-85、Leu-86、Asp-87、Ile-88、Arg-90、Ser-91、 Leu-109、Asn-114、Asp-116およびAsp-117を含むヒトユビキチン−結合性酵素の 分子モデルの原子配位の入手可能な電気的表示を中に保存して有する電気的記憶 手段。 ９３．上記ヒトユビキチン−結合性酵素の分子モデルが、配列番号２のアミノ酸 残基Arg-5からMet-147を含んで成り、該残基の原子配位が、300°Kで、全ＲＭＳ を第１図に示す２Å以内の原子配位に有する、請求の範囲第９２項に記載の電気 的記憶。