JP2002300880A - 新規ユビキチン特異プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】新規の脱ユビキチン化活性を有するプロテアー
ゼ（ＵＳＰ）およびこれに由来するペプチドまたはポリ
ペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドを提供
し、遺伝子工学手法による、新規ＵＳＰ由来のペプチド
またはポリペプチドの製造法を提供すること。 【解決手段】ヒト由来特定のアミノ酸配列で示されるポ
リペプチド、前記ポリペプチドを含有するポリペプチ
ド、前記ポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸
配列上の相同性を有しかつ脱ユビキチン化活性を有する
ポリペプチド、および前記アミノ酸配列において１ない
し数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入とい
った変異を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリ
ペプチド、から選択されるポリペプチド、および該ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補
鎖。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な脱ユビキチン化
活性を有するプロテアーゼ（以下ＵＳＰと呼ぶこともあ
る）に関するものである。さらに詳しくは、新規ＵＳＰ
のアミノ酸配列の全部または一部を有するペプチドまた
はポリペプチド、該ペプチドまたはポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌ
クレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベク
ター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ペプチド
またはポリペプチドに対する抗体、該ペプチドまたは該
ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物、該ポリペ
プチドもしくは該ポリヌクレオチドに作用する脱ユビキ
チン化活性阻害化合物または脱ユビキチン化活性賦活化
合物、これらの１種以上を含む医薬組成物、該ペプチド
または該ポリヌクレオチドを検定することからなる診断
手段、該形質転換体または該組換えベクターを使ったペ
プチドまたはポリペプチドの製造方法、該ペプチドまた
は該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物のスク
リーニング方法に関係する。

【０００２】

【従来の技術】ユビキチン（以下Ubと略称することもあ
る）は７６個のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、そ
のアミノ酸配列は酵母からヒトまで高度に保存されてい
る。Ubの生体内での役割は様々であり、発癌（引用文献
1-4）、細胞周期（引用文献5-7）、ウイルス感染（引用
文献8）および神経変性疾患（引用文献9-11）等多くの
生体反応に関与している。

【０００３】Ubの最も重要な機能は、２６Ｓプロテアソ
ームでの蛋白分解におけるシグナルとしての働きであ
る。ユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素
（E2）およびユビキチンリガーゼ（E3）といった一連の
ユビキチン化酵素によって、Ubは標的蛋白質にイソペプ
チド結合し、ポリユビキチン鎖を形成する。そのポリユ
ビキチン鎖が分解シグナルとなりプロテアソームに認識
され、ユビキチン化された蛋白質は分解される。

【０００４】一方、生体は蛋白質からUbを遊離させ、蛋
白質の分解を抑制する機能も備えている。その脱ユビキ
チン化反応を担うのが脱ユビキチン化酵素（DUB）であ
る。DUBは、その構造から大きく２つのファミリーに分
類されている（引用文献12-14）。一つはユビキチンＣ
末端ヒドラーゼ（Ubiquitin C-terminal hydrase）（UC
H）と呼ばれるもので、分子量２０ｋＤａから３０ｋＤ
ａのものが多く、異種間で一次構造が保存されている。
UCHは主にUbのＣ末端に低分子が結合している場合にUb
を遊離させる。もう一つはユビキチン特異プロテアーゼ
（Ubiquitin specific protease）（USP）と呼ばれるも
ので、その分子量は４０ｋＤａから１５０ｋＤａと様々
であり、アミノ酸配列の共通性が少ない。USPはその活
性ドメインとしてシステイン（Cys）ドメイン（Cys bo
x）、ヒスチジン（His）ドメイン（His box） およびア
スパラギン酸（Asp）ドメインを持ち、Cysドメイン内に
存在するシステイン残基を活性部位とするシステインプ
ロテアーゼである。USPはUbのＣ末端に高分子が結合し
ている場合にUbを遊離させる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題の一つは、新規なＵＳＰを見いだし、生体内に
おける該ＵＳＰの制御を可能にすることである。より具
体的には、本発明の課題は新規な特性をもつＵＳＰを提
供することであり、それに伴い有用性がある新規ＵＳＰ
由来のペプチドまたはポリペプチド、これらをコードす
るポリヌクレオチドを提供することである。また本発明
の別の課題は、新規ＵＳＰ由来のペプチドまたはポリペ
プチドに対する抗体を提供することである。さらに本発
明の別の課題は、新規ＵＳＰの脱ユビキチン化活性の阻
害剤・拮抗剤・賦活剤等の同定を行うことであり、同定
された化合物を提供することである。またこれらを利用
した医薬組成物および診断のための測定方法を提供する
ことである。さらにまた、上記ポリヌクレオチドを用い
て遺伝子工学手法による新規ＵＳＰ由来のペプチドまた
はポリペプチドの製造法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、 １．下記の群より選ばれるポリペプチド； 配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ
酸配列からなるポリペプチド、 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド、 前記のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ
酸配列上の相同性を有しかつ脱ユビキチン化活性を有す
るポリペプチド、および 前記アミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の
欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、か
つ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド、 ２．配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列の少なくとも約５個の連続するアミノ酸配列を
有するペプチド、 ３．前項１または２のポリペプチドまたはペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、 ４．配列表の配列番号３または配列番号４に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、 ５．配列表の配列番号３または配列番号４に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少な
くとも約１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレ
オチド、 ６．前項３から５のいずれかのポリヌクレオチドまたは
その相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチド、 ７．前項３から６のいずれかのポリヌクレオチドを含有
する組換えベクター、 ８．前項７の組換えベクターを形質導入された形質転換
体、 ９．前項８の形質転換体を培養する工程または前項７の
組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含
む、前項１または２のポリペプチドまたはペプチドの製
造方法、 １０．前項１または２のポリペプチドまたはペプチドを
免疫学的に認識する抗体、 １１．脱ユビキチン化活性を抑制する、前項１０の抗
体、 １２．前項１のポリペプチドと相互作用して脱ユビキチ
ン化活性を阻害もしくは活性化する化合物、および／ま
たは前項３もしくは４のポリヌクレオチドと相互作用し
てその発現を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニ
ング方法であって、前項１もしくは２のポリペプチドも
しくはペプチド、前項３から６のいずれかのポリヌクレ
オチド、前項７のベクター、前項８の形質転換体、前項
１０もしくは１１の抗体のうちの少なくともいずれか１
つを用いることを特徴とするスクリーニング方法、 １３．前項１２の方法で同定される化合物、 １４．前項１のポリペプチドと相互作用して脱ユビキチ
ン化活性を阻害もしくは活性化する化合物、または前項
３もしくは４のポリヌクレオチドと相互作用してその発
現を阻害もしくは促進する化合物、 １５．前項１または２のポリペプチドもしくはペプチ
ド、前項３から６のいずれかのポリヌクレオチド、前項
７のベクター、前項８の形質転換体、前項１０もしくは
１１の抗体、または前項１３もしくは１４の化合物のう
ちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とす
る医薬組成物、 １６．前項１のポリペプチドの発現または脱ユビキチン
化活性に関連した疾病の診断のための測定方法であっ
て、（ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸および
／または（ｂ）試料中の該ポリペプチドをマーカーとし
て分析することを含む測定方法、 １７．前項１もしくは２のポリペプチドもしくはペプチ
ド、前項３から６のいずれかのポリヌクレオチド、また
は前項１０もしくは１１の抗体のうちの少なくとも１つ
を含んでなる、（ａ）該ポリペプチドまたは蛋白質をコ
ードしている核酸および／または（ｂ）試料中の該ポリ
ペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方法
に使用する試薬キット、 １８．前項１のポリペプチドと相互作用して脱ユビキチ
ン化活性を阻害もしくは活性化する化合物、および／ま
たは前項３もしくは４のポリヌクレオチドと相互作用し
てその発現を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニ
ング方法であって、前項１もしくは２のポリペプチドも
しくはペプチド、前項３から６のいずれかのポリヌクレ
オチド、前項７のベクター、前項８の形質転換体、前項
１０もしくは１１の抗体のうちの少なくともいずれか１
つを用いることを特徴とするスクリーニング方法で得ら
れる化合物を含有する神経変性疾患の予防・治療剤、 １９．前項１または２のポリペプチドもしくはペプチ
ド、前項３から６のいずれかのポリヌクレオチド、前項
７のベクター、前項８の形質転換体、前項１０もしくは
１１の抗体、または前項１３もしくは１４の化合物のう
ちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とす
る神経変性疾患の予防・治療剤、 ２０．前項１８または前項１９に記載の神経変性疾患が
アルツハイマー病および／またはパーキンソン病である
神経変性疾患の予防・治療剤、からなる。

【０００７】

【発明の実施の形態】（新規ＵＳＰ）本発明において提
供される新規ＵＳＰは、ヒトｃＤＮＡライブラリーか
ら、新規なアミノ酸配列を有する物質としてそのｃＤＮ
Ａが取得されたものである。当該新規ＵＳＰは、ヒトの
腎臓、卵巣、胎盤、小脳での発現が比較的高いことがノ
ザンブロッティング法で確認された。当該新規ＵＳＰは
脱ユビキチン化活性を持ち、その配列中に少なくともＣ
ｙｓドメインおよびＨｉｓドメインを保有する。このド
メイン部位における相同性を除き、当該新規ＵＳＰは既
知ＵＳＰとそのアミノ酸配列において殆ど相同性を有さ
ない。

【０００８】（ポリペプチドまたはペプチド）本発明に
係る新規ＵＳＰは、配列表の配列番号１に記載のアミノ
酸配列からなるポリペプチドまたは該ポリペプチドを含
む配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドである。さらに本発明に係るポリペプチドまたはペプ
チドは、配列表の配列番号１または配列番号２に記載の
アミノ酸配列からなるポリペプチドの少なくとも一部分
を含有するポリペプチドまたはペプチドから選択され
る。その選択されるポリペプチドまたはペプチドは、配
列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配
列からなるポリペプチドと、アミノ酸配列上で約４０％
以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０
％以上、さらに好ましくは約９０％、特に好ましくは約
９５％以上の相同性を有する。この相同性をもつポリペ
プチドまたはペプチドの選択は、脱ユビキチン化活性の
有無の確認により行うことができる。脱ユビキチン化活
性は、例えば後述する実施例に示したように、ヒトユビ
キチンのＣ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
（GST）を付加したものを基質として、該基質からユビ
キチンを遊離させうるか否かを、ユビキチン遊離後のＧ
ＳＴを抗ＧＳＴ抗体によりイムノブロッティング法等の
公知の方法で検出することにより測定できる。

【０００９】アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、
自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方
法、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定後これにコード
されるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。

【００１０】本発明に係るポリペプチドまたはペプチド
は、配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列を有するポリ
ペプチドまたはペプチドを包含し、これらは例えば試薬
・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位と
しては５個以上のアミノ酸、好ましくは８個以上のアミ
ノ酸、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは１
５個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列
からなり、好ましくは免疫学的に同定しうるポリペプチ
ドまたはペプチドも本発明の対象とする。これらのペプ
チドは、試薬もしくは標準物質、または後述するように
新規ＵＳＰに特異的な抗体を作製するための抗原として
単独またはキャリアと結合して使用できる。

【００１１】本発明の範囲には、上記のようにキャリア
等の別種の蛋白質または物質を結合したものも包含され
る。例えば、本発明に係るポリペプチド等の検出もしく
は精製を容易にするために、または別の機能を付加する
ために、そのＮ末端側やＣ末端側に別の蛋白質、例えば
アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｉｇ
Ｇ等の免疫グロブリンＦｃ断片またはＦＬＡＧ−ｔａｇ
等のペプチドを直接またはリンカーペプチド等を介して
間接的に遺伝子工学的手法等の公知の方法を用いて付加
することもできる。

【００１２】さらに、上記ポリペプチドまたはペプチド
を基にして脱ユビキチン化活性の存在を指標とすること
により、１以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜
３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは
１〜１０個で特に好ましくは１ないし数個のアミノ酸の
欠失・置換・付加あるいは挿入といった変異を有するア
ミノ酸配列からなるポリペプチドまたはペプチドも提供
される。欠失・置換・付加あるいは挿入の手段は自体公
知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同
組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増
幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えば
サムブルック等編［モレキュラークローニング，ア ラ
ボラトリーマニュアル 第２版］コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー，１９８９、村松正實編［ラボマニ
ュアル遺伝子工学］丸善株式会社，１９８８、エールリ
ッヒ，ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原
理と応用］ストックトンプレス，１９８９等の成書に記
載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実
施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２１９，６６６，１９８３）を利用することが
できる。

【００１３】上記のような変異の導入において、当該蛋
白質の基本的な性質（物性、活性、または免疫学的活性
等）を変化させないという観点からは、例えば、同族ア
ミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ
酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミ
ノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想
定される。

【００１４】本発明においては、配列表の配列番号１ま
たは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプ
チドが有する生理活性と同様の活性を有するポリペプチ
ドまたはその最小活性単位（領域もしくはドメイン）も
提供されるが、それら以外にも、活性の強度または基質
特異性を変更したポリペプチドも提供される。これら
は、例えば配列表の配列番号１または配列番号２に記載
のアミノ酸配列からなるポリペプチド様物質もしくは該
ポリペプチドの拮抗物質として、または該ポリペプチド
の生理活性を調節する物質のスクリーニング等に使用す
る試薬として有用である。なお、ヒト以外の動物種の相
同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。

【００１５】本明細書において、ペプチド、オリゴペプ
チドもしくはオリゴマーとも称する短鎖をポリペプチ
ド、また、長鎖のものを蛋白質ということもある。ペプ
チドは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合に
より互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸
を意味する。

【００１６】（ポリヌクレオチド）本発明の１つの態様
は、上記ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列、
例えば配列表の配列番号１または配列番号２に記載のア
ミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびその相
補鎖である。好ましくは、配列番号３または配列番号４
に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび該ポ
リヌクレオチドに対する相補鎖である。これらは例えば
上記新規ＵＳＰの製造に有用な遺伝子情報を提供するも
のであり、あるいは核酸に関する試薬・標準品としても
利用できる。

【００１７】別の態様において本発明は、上記ポリペプ
チドまたはペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配
列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号
３または配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチ
ドまたはその相補鎖の対応する領域にストリンジェント
な条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例え
ばサムブルック等編［モレキュラークローニング，ア
ラボラトリーマニュアル 第２版］コールドスプリング
ハーバーラボラトリー，（１９８９）等に従うことがで
きる。これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオ
チド、特に配列表の配列番号３または配列番号４に記載
の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖
にハイブリダイゼーションするものであれば必ずしも相
補的配列でなくとも良い。例えば、配列表の配列番号３
または配列番号４に記載の塩基配列からなるポリペプチ
ドまたはその相補鎖に対する相同性において、少なくと
も約４０％、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０
％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましく
は約９５％以上であればよい。また本発明に係るポリヌ
クレオチドは、上記ポリヌクレオチドの指定された塩基
の領域に対応する連続する１０個以上のヌクレオチド、
好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上の配
列からなるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよ
び該相補鎖を包含する。

【００１８】これらのポリヌクレオチドは、本発明に係
るポリペプチド等の製造においても、新規ＵＳＰをコー
ドする核酸、例えばその遺伝子もしくはｍＲＮＡの検出
のためのプローブもしくはプライマーとしても、または
遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレ
オチド等としても有用である。その意味で、本発明に係
るポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは翻訳領
域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。
ここで、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同様の活性を有す
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの選別
は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋白質の
確認を行い、その生理活性特に脱ユビキチン化活性を指
標にして行うことができる。蛋白質発現に無細胞蛋白質
発現系を利用する場合は、例えば胚芽、家兎網状赤血球
等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒ
ｅ、１７９、１６０〜１６１、１９５７）。

【００１９】（形質転換体）また本発明は、大腸菌、酵
母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を
利用した遺伝子組換え技術によっても、本発明に係る新
規ＵＳＰおよびその由来物からなるペプチドおよびポリ
ペプチドは提供可能である。本発明の具体例において
は、大腸菌を利用したが、無論これに限定されるもので
はない。

【００２０】形質転換は、自体公知の手段が応用され、
例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイル
ス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好まし
い系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色
体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝
子を利用した自律複製系の利用である。

【００２１】ベクターは、選択した宿主の種類により選
別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関す
る情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合
せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモータ
ー、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配
列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組合せ利
用できる。

【００２２】形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培
養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、発
現産生される新規ＵＳＰおよびその由来物からなるペプ
チドおよびポリペプチドの酵素活性特に脱ユビキチン化
活性をマーカーにして行ってもよいが、培地中の形質転
換体量を指標にして継代培養またはバッチによって、生
産してもよい。

【００２３】（新規ＵＳＰおよびその由来物回収）培地
からの新規ＵＳＰおよびその由来物からなるペプチドお
よびポリペプチドの回収は、脱ユビキチン化活性を指標
にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、ア
フィニティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度
差にもとづく硫安、アルコール等の分画手段により精製
回収できる。好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づ
き、該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリクロー
ナル抗体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に
吸着回収する方法を用いる。

【００２４】（抗体）抗体は、本発明に係る新規ＵＳＰ
およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド
の抗原決定基を選別し、作製する。抗原は新規ＵＳＰま
たはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少
なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さ
らに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。新
規ＵＳＰに特異的な抗体を作製するためには、ＵＳＰフ
ァミリーの保存領域以外の新規ＵＳＰに固有なアミノ酸
配列からなる領域を用いることが好ましい。この領域の
アミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号１または配
列番号２に記載のものと相同である必要はなく、蛋白質
の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位
のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露
出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗
体は免疫学的に新規ＵＳＰおよびその由来物からなるペ
プチドまたはポリペプチドを結合または認識する限り特
に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の
抗原抗体結合反応によって決定される。

【００２５】抗体を産生するためには、本発明に係る新
規ＵＳＰおよびその由来物からなるペプチドまたはポリ
ペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単
独または担体に結合して、動物に対して体液性応答およ
び／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことによって
行われる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を
おこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重
合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動
物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に
用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清か
らの抗体回収法によって取得される。好ましい手段とし
ては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法であ
る。

【００２６】モノクロ−ナル抗体を生産するためには、
上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例え
ば、脾臓またはリンパ節由来）を回収し、自体公知の永
久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエロ
ーマ株）への形質転換手段を導入することによって行わ
れる。例えば、該抗体産生細胞と永久増殖性細胞とのハ
イブリドーマをクローン化し、本発明に係るＵＳＰを特
異的に認識する抗体を選別し、該ハイブリドーマの培養
液から抗体を回収する。

【００２７】ＵＳＰの活性を抑制し得るポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体は、直接本発明に係る新
規ＵＳＰに結合し、脱ユビキチン化活性を制御可能であ
る。そのため、ＵＳＰが関連する各種疾患の治療・予防
のために有用である。さらにこれらの抗体は、上記ＵＳ
Ｐおよびその由来物であるポリペプチドまたはペプチド
の精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用
できる。

【００２８】（同定・スクリーニング）かくして調製さ
れた新規ＵＳＰおよびその由来物からなるペプチドまた
はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド
およびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配
列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを
用いる蛋白質合成系ならびに新規ＵＳＰおよびその由来
物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認
識する抗体は、単独または複数手段を組合せることによ
って、新規ＵＳＰおよびその由来物からなるペプチドお
よびポリペプチドに対する活性阻害剤または活性賦活剤
の同定・スクリーニングに有効な手段を提供する。例え
ば、ペプチドまたはポリペプチドの立体構造に基づくド
ラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利
用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用
した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリ
ーニングシステムにおいて、利用可能である。

【００２９】また、本発明に係る新規ＵＳＰおよびその
由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを用いて、
スクリーニングされる化合物とこれらペプチドまたはポ
リペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選別
し、この相互作用の有無を検出することのできるシグナ
ル（マーカー）を使用する系を導入し、このシグナル
（マーカー）の存在・不存在を検出することにより、本
発明に係る新規ＵＳＰおよびその由来物からなるペプチ
ドおよびポリペプチドの活性、例えば脱ユビキチン化活
性、を賦活または阻害する化合物を同定可能である。

【００３０】（化合物、医薬組成物）上記手段により同
定された化合物は、新規ＵＳＰおよびその由来物からな
るペプチドおよびポリペプチドの活性、例えば脱ユビキ
チン化活性、の活性阻害剤、活性拮抗剤、または活性賦
活剤の候補化合物として、利用可能である。また、遺伝
子レベルでの新規ＵＳＰおよびその由来物の系に対する
発現阻害剤、発現拮抗剤、発現賦活剤の候補化合物とし
ても利用可能である。その効果は、ＵＳＰの発現や活性
の増加、減少または欠失等が関連する各種病的症状の予
防・治療を期待できる。後述するように、神経変性疾患
との係わりが重要であることから、同疾患の予防・治療
剤となる。かくして選別された候補化合物は、生物学的
有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによっ
て、医薬組成物として調製可能である。

【００３１】また本発明に係る新規ＵＳＰおよびその由
来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコ
ードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの
塩基配列を含むベクター、ならびに新規ＵＳＰおよびそ
の由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学
的に認識する抗体は、それ自体が、診断マーカーや試薬
等の疾病診断手段として、または新規ＵＳＰの活性の阻
害、拮抗、もしくは賦活等の機能を利用して治療薬等の
医薬手段として使用し得る。なお、製剤化にあたって
は、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、蛋白質、
ポリヌクレオチド、抗体等各対象に応じた製剤化手段を
導入すればよい。

【００３２】本発明に係る新規ＵＳＰの発現およびその
活性の減少や欠失等に関連する異常な症状の治療には、
１つの方法として当該ＵＳＰ自体あるいはＵＳＰをコー
ドする遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物（促進
剤）を医薬上許容される担体とともに投与し、そのこと
により異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙
げられる。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細
胞内で当該ＵＳＰを生成なさしめてもよい。上記ポリヌ
クレオチドを利用した遺伝子治療は、公知の方法が利用
できるが、例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌク
レオチドを組み入れた複製欠損レトロウイルスベクター
を作製して遺伝子治療に利用すればよい。また、遺伝子
治療において、治療に使用する蛋白質を対象中において
生成させることもできる。例えば、蛋白質をコードして
いるＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、例えばレトロウイル
スプラスミドベクターを用いることによりエクスビボ
（exvivo）において対象由来の細胞を処理し、次いで、
細胞を対象に導入することもできる。

【００３３】本発明に係る新規ＵＳＰの発現およびその
活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上
許容される担体とともに対象に投与して、当該ＵＳＰの
活性を阻害し、そのことにより異常な症状を改善するこ
ともできる。さらに、発現ブロック法を用いて内在性の
上記ＵＳＰをコードしている遺伝子の発現を阻害しても
よい。細胞内で生成させた、あるいは別個に投与された
当該遺伝子のアンチセンス配列を使用して当該遺伝子の
発現を阻害できる。これらのオリゴヌクレオチドは、上
記本発明に係るポリヌクレオチドを基にして設計し合成
できる。当該オリゴヌクレオチドはそれ自体投与するこ
とができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現さ
せることもできる。

【００３４】ＵＳＰの発現や活性の増加、減少もしくは
欠失等の機能障害はＵＳＰが係るユビキチンシステムの
異常をきたす。ユビキチンシステムの機能の一つは、生
体内で生じた異常蛋白の除去や転写因子、シグナル伝達
因子の分解による量的調節等である（引用文献21）。そ
のため、ＵＳＰの異常と発癌や神経変性疾患との関わり
が示唆されている（引用文献21-23）。例えば、アルツ
ハイマー病やパーキンソン病で観察される蛋白凝集体の
多くが抗ユビキチン抗体に反応することから（引用文献
21）、神経変性疾患とＵＳＰの機能異常との関係が示唆
される。上記本発明に係るＵＳＰは、腎臓、卵巣および
胎盤と同様に小脳での発現が比較的高いことから、当該
ＵＳＰがこれらの神経変性疾患と関わりがある可能性が
高い。また、当該ＵＳＰを細胞内蛋白局在予測プログラ
ムＰＳＯＲＴにより解析したところ、核内に局在するこ
とが予測された。ＵＳＰは染色体構造の維持にも関与し
ており、ユビキチン化されたヒストンの脱ユビキチン化
が染色体凝集に重要であることが知られている （引用
文献24）。最近、ＵＳＰファミリーの１つであるＵＳＰ
１６がＨ２Ａを脱ユビキチン化することが報告されたが
（引用文献25）、本発明に係るＵＳＰもヒストンの脱ユ
ビキチン化に関与している可能性がある。生体内には多
くのＵＳＰが存在しており、それぞれ異なる基質特異性
や生理機能を有していると思われる。従って、本発明
は、ＵＳＰの関与する生体機能の解明、とりわけ、発癌
プロセスの解明や、神経変性疾患、例えばアルツハイマ
ー病やパーキンソン病等の解明、ならびにそれらの予防
・治療剤および診断を可能とする上で非常に有用なもの
である。

【００３５】（診断のための測定方法および試薬）本発
明に係る新規なＵＳＰおよびその由来物からなるペプチ
ドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレ
オチドおよびその相補鎖、ならびに当該ＵＳＰおよびそ
の由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学
的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカー
や試薬等として使用可能である。また本発明は、これら
のうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそ
れ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。な
お、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポ
リペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、または抗体等
それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。

【００３６】本発明に係る新規ＵＳＰおよびその由来物
からなるペプチドまたはポリペプチドの発現または活性
に関連した疾患の診断手段は、例えば当該ＵＳＰをコー
ドしている核酸との相互作用や反応性を利用して、相応
する核酸の存在量を決定すること、および／または当該
ＵＳＰについて個体中の生体内分布を決定すること、お
よび／または当該ＵＳＰの存在、個体由来の試料中の存
在量を決定することによって行われる。詳しくは、新規
ＵＳＰを診断マーカーとして検定するのである。試料中
の当該ＵＳＰの検出またはその存在量の決定に用いるこ
とができる測定法は当業者に周知である。このような測
定法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、
ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等が
ある。また、本発明に係る新規ＵＳＰをコードするポリ
ヌクレオチドの検出法および定量法としては、例えば増
幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブ
ロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法
を用いてＲＮＡレベルで測定することができる。

【００３７】測定される試料として、個体由来の細胞、
例えば血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料
等を挙げることができる。また、測定される核酸は、上
記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核
酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、ある
いは分析前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いるこ
とにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮ
Ａを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較におい
て、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検
出することができる。増幅ＤＮＡを標識した上記ＵＳＰ
をコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせるこ
とにより点突然変異を同定することができる。

【００３８】上記測定により本発明に係るＵＳＰおよび
該ＵＳＰをコードするＤＮＡの変異、減少、増加を検出
することにより、当該ＵＳＰが関連する疾患、例えば、
癌あるいは神経変性疾患等、特にアルツハイマー病やパ
ーキンソン病等の診断が可能となる。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明
するが、本発明は下記の実施例に限定されない。本発明
に係るＵＳＰは、かずさＤＮＡ研究所のヒト長鎖ｃＤＮ
Ａ解析情報データベースから、バイオインフォーマティ
クス（bioinformatics）により、新規プロテアーゼ候補
遺伝子として抽出されたクローンpg01082を基に、その
全長ｃＤＮＡ配列が決定された。当該クローンは、１１
４５個のアミノ酸をコードするＣＤＳを含む６６４２ｂ
ｐのクローンであり（配列表の配列番号１）、プロテア
ーゼモチーフ検索から、ＵＳＰのCysドメイン（Cys bo
x）（G-[LIVMFY]-x（1,3）-[AGC]-[NASM]-x-C-[FYW]-[L
IVMFC]-[NST]-[SACV]-x-[LIVMS]-Q）とHisドメイン（Hi
s-box）（Y-x-L-x-[SAG]-[LIVMFT]-x（2）-H-x-G-x（4,
5）-G-H-Y）およびアスパラギン酸（Asp）ドメインを有
する。なお、本発明に係る遺伝子は、Cys box内におい
て既知の当該ドメイン配列と一致していないアミノ酸残
基が一つ存在する。

【００４０】Ａ．大腸菌を用いた組換えpg01082の発現 １．組換えpg01082発現プラスミドの構築 組換えpg01082発現プラスミドをGATEWAY^TM Cloning Tec
hnology（Life Technologies社）を用いて作製した。ま
ず、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（引用文献26）より得
たpg01082クローン（pBluescript II SK₊のSalI-NotI部
位に挿入）を鋳型として、Advantage-HF2 PCR Kit（Clo
ntech社）を用いて推定ＯＲＦ領域（ヌクレオチド番号1
0-3438）を増幅した後、BP clonase enzymeを用いた組
換え反応によりエントリーベクター（pDONR201）に挿入
し、pDONR-01082を作成した。なお、プライマーはattB-
01082（+）（5'-GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC
TTA ATG CTT CTT CCT ACA TGT CCT AAT ATG-3'）とattB
-01082（+）（5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TG
G GTC TCA ACA ACT TAA AGA AAG GAT TGG CTG-3'）を使
用した。次に、pDONR-01082とN-terminal His-tagged P
rotein発現用ベクターであるpDEST17を用いて、LR clon
ase enzymeによる組替え反応によりHis-tagged pg01082
発現プラスミド（pHis-01082）を作成した。発現プラス
ミドは、NaClにより発現誘導が可能な大腸菌（E. col
i）BL21-SI（Life Technologies社）に導入した。な
お、増幅したＯＲＦ領域にＰＣＲエラー等の変異が起き
ていないことはシーケンシングにより確認した。シーケ
ンス反応はThermo Sequenase Cy5.5 Dye Terminator Cy
cle Sequencing Kitを、泳動および解析はGene Rapid
（いずれもAmersham pharmacia biotech社）を用い、添
付の説明書に従い実施した。

【００４１】２． pg01082の大腸菌での発現誘導 LBON/Amp培地〔NaClを含まず、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリン（ampicillin）を含むＬＢ培地〕に1/10量の前
培養液を接種し、２５℃にてＯＤ_６００が約１．０にな
るまで培養後、NaClを終濃度０．３Ｍになるように添加
し、さらに約６時間培養後、菌体を回収した。菌体をリ
ン酸緩衝食塩水（PBS）に懸濁後、超音波処理、遠心に
より上清を回収し、抽出液とした。抽出液を７．５％SD
S-PAGEにより分離後、抗His-tag抗体（Penta-His^TM Ant
ibody, QIAGEN社）を用いたイムノブロッティングによ
り蛋白質を検出した。なお、検出にはECL western blot
ting detection kit（Amersham pharmacia biotech社）
を使用した。

【００４２】３．インビトロ（iv vitro）での脱ユビキ
チン化活性の検出 His-tagged USP15発現プラスミドpHis-USP15を、ヒト脳
ｃＤＮＡライブラリー（引用文献26）から得たUSP15 cD
NA（KIAA0529クローン）を鋳型として、上記と同様にGA
TEWAY^TM Cloning Technologyを用いて作成した。なお、
KIAA0529はUSP15のＮ末端３アミノ酸残基（Met-Ala-Gl
u）が欠失していたため、Bakerらの方法に従い（引用文
献15）、この３残基に対応するコドンをプライマー内に
設計し、完全なＯＲＦとした。pHis-USP15はpg01082と
同様に大腸菌BL21-SIに導入した。

【００４３】大腸菌抽出液の調製は、pHis-01082または
pHis-USP15を保持する大腸菌BL21-SIを上記と同様に誘
導培養した後、菌体を回収した。菌体を培養液の1/10量
の50mM His-HCl, pH7.6/ 5mM EDTA/ 1mM DTTに懸濁後、
超音波処理により菌体を破壊し、遠心分離により上清を
回収した。これを活性測定用の大腸菌抽出液とした。

【００４４】基質（Ub-M-GST）の調製は、ヒトユビキチ
ンのＣ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GS
T）を結合させたUb-M-GSTの発現プラスミド、pTV118N/U
b-GSTを保持する大腸菌（E. coli）DH5αを３７℃にて
ＯＤ_６００が約１．０になるまで培養後、ＩＰＴＧを終
濃度１０ｍＭになるように添加し、さらに約４時間培養
後、菌体を回収した。菌体を50 mM Tris-HCl, pH7.6/ 5
mM EDTA/ 1 mM DTT/10% glycerol に懸濁し、リゾチー
ム、超音波処理により破壊後、遠心分離により上清を回
収し、グルタチオン・セファロース４Ｂ（Amersham pha
rmacia biotech社）を用いてUb-M-GSTを精製した。精製
物は50 mM Tris-HCl, pH7.6/ 5 mM EDTA/ 1 mM DTT/ 10
% glycerolに対して透析を行った後、使用時まで−８０
℃にて保存した。

【００４５】インビトロでの脱ユビキチン化反応は上記
の調製した各大腸菌抽出液１０μｌとUb-M-GST ５μｌ
（２．５μｇ）を50 mM Tris-HCl, pH7.6/ 5 mM EDTA/
1 mMDTT中にて混合後（計２０μｌ）、３７℃にて１６
時間インキュベートした。反応液を１５％または５−２
０％ SDS-PAGEにより分離した後、１次抗体として抗Ｇ
ＳＴ抗体（Amersham pharmacia biotech社）、２次抗体
としてＨＲＰ（ホースラディシュパーオキシダーゼ）標
識抗ヤギ抗体（Alpha diagnostic international社）用
いたイムノブロッティングによりUb-M-GSTおよび遊離し
たＧＳＴを検出した。なお、検出はECL western blotti
ng detection kitを使用した。

【００４６】大腸菌を用いた組換えpg01082の発現は、p
g01082でのＣＤＳの５′末端が翻訳開始コドンのATGで
はないため、最初（1st）のATGがさらに上流に存在する
可能性が考えられたが、pg01082のＣＤＳにおける最初
のATGからの領域をＯＲＦとし、アミノ酸番号４から１
１４５までの１１４２個のアミノ酸を発現させた（配列
表の配列番号１）。pg01082のこの領域をN-terminal Hi
s-tagged proteinとして大腸菌BL21-SI株を用いて誘導
発現させたところ、予想される分子量（135 kDa）の蛋
白の発現が抗His抗体を用いたイムノブロッティングに
おいても検出されなかった。検出されない原因として発
現系が上手く動いていない可能性も考えられたが、発現
量が極めて微量である可能性（検出限界以下）も考え、
以下の活性の有無を検討した。

【００４７】大腸菌にはＵＳＰが存在しないことから、
上記で誘導発現させた大腸菌の抽出液を用いてpg01082
の脱ユビキチン化活性について検討した。しかしなが
ら、UbのＣ末端にＧＳＴを結合させた人工基質、Ub-M-G
STに対する検討を行った結果、活性は検出されなかった
（図１）。ただし、脱ユビキチン化活性を有することが
報告されているUSP15（引用文献15）では活性が検出さ
れたことから（図１）、試験系には問題が無いことを確
認した。

【００４８】Ｂ．共発現系での脱ユビキチン化活性の検
出 １．共発現用各種基質（Ub-X-GST）発現プラスミドの構
築 pTV118N/Ub-GSTを鋳型としてUb-GSTコード領域をＰＣＲ
により増幅させた後、GATEWAY^TM Cloning Technologyを
用いて大腸菌発現用ベクター、pDEST14に挿入し、pDEST
14Ub-GSTを作成した。次に、pDEST14Ub-GSTからＴ７プ
ロモーターおよびUb-GSTコード領域を含む領域をSphIお
よびHindIII処理により切り出し、p15A由来の開始点（o
ri）を持つpACYC184（ニッポンジーン社）のSphI-HindI
II間に組み込み、pACUb-M-GSTを作成した。これを共発
現用Ub-M-GST発現プラスミドとした。次に、pACUb-M-GS
TをSalIおよびHindIIIで処理し、Ｔ７プロモーターおよ
びUb-GSTコード領域を含む領域をpBluescriptII SK
（+）（Stratagene社）のSalI-HindIII間に組み込み、p
BSUbGSTを作成した。さらに、pBSUbGSTを鋳型に、QuikC
hange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene
社）を用いてＧＳＴのＮ末端のアミノ酸に対応するコド
ンをATG〔メチオニン（Met）〕からCCG〔プロリン（Pr
o）〕、ATC〔イソロイシン（Ile）〕およびCGT〔アルギ
ニン（Arg）〕に変換させたpBSUb-P-GST、pBSUb-I-GST
およびpBSUb-R-GSTを作成した。コドンの変換は、シー
ケンシングにより確認した。次に、各pBSUb-X-GSTをHin
dIIIおよびSphIで処理し、Ｔ７プロモーターおよびUb-X
-GSTコード領域を含む領域をpACYC184のHindIII-SphI間
に組み込み、各共発現用Ub-X-GST発現プラスミド、pACU
b-X-GSTを作成した。作成した４種類のpACUb-X-GSTは大
腸菌BL21-SIに導入し、塩化カルシウム法によりコンピ
テントセル化した。

【００４９】２．His-tagged pg01082^C508A発現プラス
ミドの構築 pg01082の推定活性残基である５０８番目のシステイン
（508-Cys）のアラニン（Ala）への置換は、QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて行った。使用
したプライマーは、508-CysのコドンであるTGTがAlaの
コドンであるGCGに置換するように設計した（5'-CTT AC
T AAC CTT GGA GCT ACT GCG TAC TTA GCTTCT ACT ATT C
AG-3'）。変異の導入をシーケンシングにて確認し、His
-taggedpg01082^C508A発現プラスミド、pHis-01082C^508A
を得た。

【００５０】３．共発現株の作成 各pACUb-X-GSTをそれぞれ保持する大腸菌BL21-SIコンピ
テントセルにpHis-01082、pHis-01082C508A、pHis-USP1
5またはpHis-Lucを加え、形質転換した。形質転換体
は、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍ
ｌクロラムフェニコールを含むLBON （NaClを含まない
ＬＢ培地） プレート上にて選択し、各種共発現株を得
た。なお、ヒスチジン付加ルシフェラーゼ（His-tagged
luciferase）発現プラスミドであるpHis-Lucは、pGL3-
Lucベクター（Promega社）を鋳型として、上記と同様に
GATEWAY^TM Cloning Technologyを用いて作成した。

【００５１】４．共発現試験 各種共発現株を１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３
４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むLBON培地中で
ＯＤ_６００が約０．７から１．０になるまで２５℃にて
培養後、NaClを終濃度０．３Ｍになるように添加し、さ
らに約９時間培養後、菌体を回収した。上記大腸菌抽出
液の調製に従い抽出液を調製した後、抽出液をSDS-PAGE
により分離し、上記と同様に抗ＧＳＴ抗体を用いたイム
ノブロッティングによりUb-X-GSTおよび遊離のＧＳＴを
検出した。

【００５２】既知のＵＳＰの中にはインビトロの系では
活性が認められないものの、基質との共発現系では活性
が認められるものもある （引用文献18）。そこで、pg0
1082についてもこの可能性を考え、共発現系での活性の
検出を試み、酵素発現用プラスミドが有するpBR322系の
oriとcompatibility（互換性）を示すp15Aのoriを有す
る基質（Ub-GST）発現用プラスミドを使用することによ
り、酵素と基質を同一菌体内で共発現させた（引用文献
16）。その結果、Ub-M-GSTに対するpg01082の脱ユビキ
チン化活性が、この共発現系で遊離のＧＳＴが検出され
たことから、認められ、pg01082がＵＳＰの一つである
ことが確認された（図２）。また、陽性コントロールと
してUSP15、陰性コントロールとしてルシフェラーゼ
（図中ではLucと表示）をそれぞれ同様に共発現させた
結果、USP15では活性が認められ、ルシフェラーゼでは
活性が認められなかったことから（図２）、試験系の妥
当性も確認された。

【００５３】pg01082の脱ユビキチン化活性における基
質特異性を検討するために、Ub-M-GSTにおいてUbのＣ末
端直後のアミノ酸であるMetをPro、IleおよびArgに置換
させたUb-P-GST、Ub-I-GSTおよびUb-R-GSTを発現させる
各共発現用プラスミドを作成し、これら基質に対する活
性を共発現系で調べた。その結果、Ub-R-GSTに対しては
活性が認められたが、Ub-I-GSTおよびUb-P-GSTに対して
は活性は認められなかった（図２）。Ub-P-GSTに対して
活性を示すことが報告されているUSP15は（引用文献1
7）、Ub-P-GSTを含め全ての基質に対して活性が認めら
れた （図２）。

【００５４】ＵＳＰはシステインプロテアーゼの一つで
あり、Cys box内に存在するCys残基が活性部位であるこ
とが知られている。そこで、pg01082における推定活性
部位である508-CysをAlaに置換した変異体（pg01082
^C508A）を上記のように作成し、Ub-M-GSTおよびUb-R-GS
Tを基質とした共発現系での脱ユビキチン化活性への影
響を検討した結果、pg01082^C508Aにおいて両基質に対す
る活性の消失が認められた（図３）。本発明に係るＵＳ
Ｐは、既知のＵＳＰと同様に、508-Cysが活性に重要で
あることが確認された。また、pg01082はUb-M-GSTおよ
びUb-R-GSTに対しては活性が認められたが、Ub-I-GSTお
よびUb-P-GSTに対しては活性を示さず、基質選択性があ
ることが明らかとなった。一般にUb-P-GSTは切れにくい
基質であることが知られており、酵母に存在するＵＳＰ
は全てUb-P-GSTに対する活性が低い（引用文献17,1
9）。Ub-P-GSTに活性を示すヒトのＵＳＰとしてＵＳＰ
４（引用文献17）とＵＳＰ１５（引用文献15）が報告さ
れており、pg01082はこれらのＵＳＰとは生体内で異な
る基質選択性を持つものと考えられた。

【００５５】Ｃ．全長ＵＳＰ（hk03615x2）の調製 pg01082を基礎として、これのＣ末、Ｎ末を伸張させたh
k03615x2の調製を行った。まず、pg01082のＣ末端を更
に伸長させたクローンであるhk03615x1（図４Ａ）が取
得された。pg01082の１１３８番目のアミノ酸でグルタ
ミン（1138-Gln）以下のＣ末端８アミノ酸はフレームシ
フトにより生じた配列であり、実際は１１３７番目のア
ルギニン（1137-Arg）からｃ末端側に更に１０１４個の
アミノ酸が付加されることが明らかとなった。また、Ｎ
末端側をさらに１２６１個のアミノ酸伸長させたクロー
ンであるhh02365mrp1（図４Ａ）も取得し、これら３つ
のクローンをin silico上で連結させると、３３９５個
のアミノ酸をコードするＯＲＦを有するｃＤＮＡ（hk03
615x2）となることが明らかとなった（ＯＲＦは１８番
目のMetを1st Metとして規定した。ちなみに、ＣＤＳで
は３４１２個のアミノ酸をコードする。図４Ａ中、ＣＤ
Ｓにおける1st Met含むＮ末端側１８個のアミノ酸を一
文字表記しているが、三文字表記では、Leu Arg Arg As
n Leu Gln ArgVal Leu Ile Leu Leu Val Tyr Gly Val G
ln Met）（図４Ｂ）。よって、生体内では３３８１アミ
ノ酸からなるhk03615x2が存在しており、上記脱ユビキ
チン化活性の確認は、hk03615x2内の触媒ドメイン（cat
alytic domain）に対応する領域について行ったことと
なる。

【００５６】

【発明の効果】本発明は、ＵＳＰの関与する生体機能の
解明、とりわけ、発癌プロセスの解明や、神経変性疾
患、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等の解
明、ならびにそれらの予防、治療および診断を可能とす
る上で非常に有用なものである。

【００５７】

【引用文献】1. Honda, R., Tanaka, H. and Yasuda,
H. Oncoprotein MDM2 is a ubiquitinligase E3 for tu
mor supressor p53. FEBS Letter. 420, 25 （1997） 2. Gupta, K., Copeland, N. G., Gilbert, D. J., Jen
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【００５８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD Kazusa DNA Research Institute <120> Novel Ubiquitin specific protease <130> NP01-1027 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Leu Leu Met Leu Leu Pro Thr Cys Pro Asn Met Leu Met Ala Phe 1 5 10 15 Gln Asn Ile Ser Asp Glu Gln Ser Asn Asp Gly Phe Asn Trp Lys Glu 20 25 30 Leu Leu Lys Ile Lys Ser Ala His Lys Leu Leu Tyr Ala Leu Glu Ile 35 40 45 Ile Glu Ala Leu Gly Lys Pro Asn Arg Arg Ile Arg Arg Glu Ser Thr 50 55 60 Gly Ser Tyr Ser Asp Leu Tyr Pro Asp Ser Asp Asp Ser Ser Glu Asp 65 70 75 80 Gln Val Glu Asn Ser Lys Asn Ser Trp Ser Cys Lys Phe Val Ala Ala 85 90 95 Gly Gly Leu Gln Gln Leu Leu Glu Ile Phe Asn Ser Gly Ile Leu Glu 100 105 110 Pro Lys Glu Gln Glu Ser Trp Thr Val Trp Gln Leu Asp Cys Leu Ala 115 120 125 Cys Leu Leu Lys Leu Ile Cys Gln Phe Ala Val Asp Pro Ser Asp Leu 130 135 140 Asp Leu Ala Tyr His Asp Val Phe Ala Trp Ser Gly Ile Ala Glu Ser 145 150 155 160 His 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ttgctgctgg agggcttcaa 300 cagttattag aaatttttaa ttctggaatt ctagagccta aagagcagga atcatggact 360 gtgtggcagc tagactgtct tgcttgcttg ctgaagttaa tatgccagtt tgcagtagat 420 ccatccgatt tggatttagc ttatcatgat gtctttgcct ggtctggtat agcggaaagc 480 cataggaaaa gaacctggcc tggcaaatca aggaaggctg ctggtgatca tgctaagggt 540 cttcatatac cacgattaac agaggtattt cttgttcttg tccaaggaac cagtttgatt 600 cagcgactta tgtctgttgc ttatacgtat gataatctgg ctcctagagt tttaaaagct 660 cagtctgatc acaggtctag acatgaagtt tcacattatt caatgtggct cttggtgagt 720 tgggctcatt gctgttcttt agtgaaatct agccttgctg atagcgatca tttacaagat 780 tggctaaaga aattgactct ccttattcct gagactgcag ttcgtcatga atcatgcagt 840 ggtctctata agttatccct gtcagggctg gatggaggag actcaatcaa tcgttctttt 900 ctgctattgg ctgcctcaac attattgaaa tttcttcctg atgctcaagc actcaaacct 960 attaggatag atgattatga ggaagaacca atattaaaac caggatgtaa agagtatttt 1020 tggttgttat gcaaattagt tgacaacata catataaagg acgctagtca gacaacgctc 1080 ctcgacttag atgccttggc aagacatttg gctgactgta ttcgaagtag ggagatcctt 1140 gatcatcagg atggtaatgt agaagatgat gggcttacag gactcctaag gcttgcaaca 1200 agtgttgtta aacacaaacc accctttaaa ttttcaaggg aaggacagga atttttgaga 1260 gatatcttca atctcctgtt tttgttgcca agtctaaagg accgacaaca gccaaagtgc 1320 aaatcacatt cttcaagagc tgccgcttac gatttgttag tagagatggt aaaggggtct 1380 gttgagaact acaggctaat acacaactgg gttatggcac aacacatgca gtcccatgca 1440 ccttataaat gggattactg gcctcatgaa gatgtccgtg ctgaatgtag atttgttggc 1500 cttactaacc ttggagctac ttgttactta gcttctacta ttcagcaact ttatatgata 1560 cctgaggcaa gacaggctgt cttcactgcc aagtattcag aggatatgaa gcacaagacc 1620 actcttctgg agcttcagaa aatgtttaca tatttaatgg agagtgaatg caaagcatat 1680 aatcctagac ctttctgtaa aacatacacc atggataagc agcctctgaa tactggggaa 1740 cagaaagata tgacagagtt ttttactgat ctaattacca aaatcgaaga aatgtctccc 1800 gaactgaaaa ataccgtcaa aagtttattt ggaggtgtaa ttacaaacaa tgttgtatcc 1860 ttggattgtg aacatgttag tcaaactgct gaagagtttt atactgtgag gtgccaagtg 1920 gctgatatga agaacattta tgaatctctt gatgaagtta ctataaaaga cactttggaa 1980 ggtgataaca tgtatacttg ttctcattgt gggaagaaag tacgagctga aaaaagggca 2040 tgttttaaga aattgcctcg cattttgagt ttcaatacta tgagatacac atttaatatg 2100 gtcacgatga tgaaagagaa agtgaataca cacttttcct tcccattacg tttggacatg 2160 acgccctata cagaagattt tcttatggga aagagtgaga ggaaagaagg ttttaaagaa 2220 gtcagtgatc attcaaaaga ctcagagagc tatgaatatg acttgatagg agtgactgtt 2280 cacacaggaa cggcagatgg tggacactat tatagcttta tcagagatat agtaaatccc 2340 catgcttata aaaacaataa atggtatctt tttaatgatg ctgaggtaaa accttttgat 2400 tctgctcaac ttgcatctga atgttttggt ggagagatga cgaccaagac ctatgattct 2460 gttacagata aatttatgga cttctctttt gaaaagacac acagtgcata tatgctgttt 2520 tacaaacgca tggaaccaga ggaagaaaat ggcagagaat acaaatttga tgtttcgtca 2580 gagttactag agtggatttg gcatgataac atgcagtttc ttcaagacaa aaacattttt 2640 gaacatacat attttggatt tatgtggcaa ttgtgtagtt gtattcccag tacattacca 2700 gatcctaaag ctgtgtcctt aatgacagca aagttaagca cttcctttgt cctagagaca 2760 tttattcatt ctaaagaaaa gcccacgatg cttcagtgga ttgaactgtt 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atg tca cct act 1055 Asp Lys Glu Ser Leu Asp Leu Ala Phe Lys Tyr Phe Met Ser Pro Thr 180 185 190 ttg act atg agg ttg gct gga ttg agt cag ata aca aat caa ctc cat 1103 Leu Thr Met Arg Leu Ala Gly Leu Ser Gln Ile Thr Asn Gln Leu His 195 200 205 acc ttc aat gat gtg tgc aat aat gaa tca tta gta tcg gac aca gaa 1151 Thr Phe Asn Asp Val Cys Asn Asn Glu Ser Leu Val Ser Asp Thr Glu 210 215 220 acg tcc att gca aaa gaa ctt gca gac tgg ctt att agc aac aat gtg 1199 Thr Ser Ile Ala Lys Glu Leu Ala Asp Trp Leu Ile Ser Asn Asn Val 225 230 235 240 gtg gag cat ata ttt gga cca aat tta cat att gag att atc aaa cag 1247 Val Glu His Ile Phe Gly Pro Asn Leu His Ile Glu Ile Ile Lys Gln 245 250 255 tgc caa gtg att ttg aat ttt ttg gca gca gaa ggg cga ctg agt act 1295 Cys Gln Val Ile Leu Asn Phe Leu Ala Ala Glu Gly Arg Leu Ser Thr 260 265 270 caa cat att gac tgt att tgg gct gca gca cag ttg aaa cat tgt agt 1343 Gln His Ile Asp Cys Ile Trp Ala Ala Ala Gln Leu Lys His Cys Ser 275 280 285 cgg tat ata cat gac tta ttt cct tca ctc atc aag aat ttg gat ccc 1391 Arg Tyr Ile His Asp Leu Phe Pro Ser Leu Ile Lys Asn Leu Asp Pro 290 295 300 gta cca ctt aga cat cta ctt aat ctg gtc tca gct ctt gag cca agt 1439 Val Pro Leu Arg His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ala Leu Glu Pro Ser 305 310 315 320 gtt cat act gaa cag aca ctg tac ttg gca tcc atg tta att aaa gca 1487 Val His Thr Glu Gln Thr Leu Tyr Leu Ala Ser Met Leu Ile Lys Ala 325 330 335 ctg tgg aat aac gca cta gca gct aag gct cag tta tct aaa cag agt 1535 Leu Trp Asn Asn Ala Leu Ala Ala Lys Ala Gln Leu Ser Lys Gln Ser 340 345 350 tct ttt gca tct tta tta aat act aat att ccc att gga aat aag aaa 1583 Ser Phe Ala Ser Leu Leu Asn Thr Asn Ile Pro Ile Gly Asn Lys Lys 355 360 365 gag gaa gaa gag ctt aga aga aca gct cca tca cct tgg tca cct gca 1631 Glu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Thr Ala Pro Ser Pro Trp Ser Pro Ala 370 375 380 gct agt cct caa agc agt gat aat agc gat aca cat caa agt gga ggt 1679 Ala Ser Pro Gln Ser Ser Asp Asn Ser Asp Thr His Gln Ser Gly Gly 385 390 395 400 agt gac att gaa atg gat gag caa ctt att aat aga acc aaa cat gtg 1727 Ser Asp Ile Glu Met Asp Glu Gln Leu Ile Asn Arg Thr Lys His Val 405 410 415 caa caa cga ctt tca gac aca gag gaa tcc atg cag gga agt tct gac 1775 Gln Gln Arg Leu Ser Asp Thr Glu Glu Ser Met Gln Gly Ser Ser Asp 420 425 430 gaa act gcc aac agt ggt gaa gat gga agc agt ggt cct ggt agc agt 1823 Glu Thr Ala Asn Ser Gly Glu Asp Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser Ser 435 440 445 agt ggg cat agt gat gga tct agc aat gag gtt aat tct agc cac gca 1871 Ser Gly His Ser Asp Gly Ser Ser Asn Glu Val Asn Ser Ser His Ala 450 455 460 agc cag tca gct ggg agc cct ggc agt gag gta cag tca gaa gac att 1919 Ser Gln Ser Ala Gly Ser Pro Gly Ser Glu Val Gln Ser Glu Asp Ile 465 470 475 480 gca gat att gaa gcc ctc aaa gag gaa gat gaa gac gat gat cat ggt 1967 Ala Asp Ile Glu Ala Leu Lys Glu Glu Asp Glu Asp Asp Asp His Gly 485 490 495 cat aat cct ccc aaa agc agt tgt ggt aca gat ctt cgg aat aga aag 2015 His Asn Pro Pro Lys Ser Ser Cys Gly Thr Asp Leu Arg Asn Arg 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His His His His His His 610 615 620 cac cac gat ggg cat atg gtt gat gat atg cta agt gca gat gat gtc 2399 His His Asp Gly His Met Val Asp Asp Met Leu Ser Ala Asp Asp Val 625 630 635 640 agt tgt agt agc tcc cag gtt agt gca aaa tca gaa aaa aat atg gct 2447 Ser Cys Ser Ser Ser Gln Val Ser Ala Lys Ser Glu Lys Asn Met Ala 645 650 655 gat ttt gat ggt gaa gaa tct gga tgt gaa gag gag cta gtt cag att 2495 Asp Phe Asp Gly Glu Glu Ser Gly Cys Glu Glu Glu Leu Val Gln Ile 660 665 670 aat tca cat gcg gaa ctg aca tct cac ctc caa caa cat ctt ccc aat 2543 Asn Ser His Ala Glu Leu Thr Ser His Leu Gln Gln His Leu Pro Asn 675 680 685 tta gct tcc att tac cat gaa cat ctt agt caa gga cct gta gtt cat 2591 Leu Ala Ser Ile Tyr His Glu His Leu Ser Gln Gly Pro Val Val His 690 695 700 aaa cat caa ttc aac agt aat gct gtt aca gac att aat ttg gat aat 2639 Lys His Gln Phe Asn Ser Asn Ala Val Thr Asp Ile Asn Leu Asp Asn 705 710 715 720 gtt tgc aag aaa gga aat act ttg ttg tgg gat ata gtc caa gat gaa 2687 Val Cys Lys Lys Gly Asn Thr Leu Leu Trp Asp Ile Val Gln Asp Glu 725 730 735 gat gca gtt aat ctt tct gaa gga tta ata aat gaa gca gag aaa ctt 2735 Asp Ala Val Asn Leu Ser Glu Gly Leu Ile Asn Glu Ala Glu Lys Leu 740 745 750 ctt tgt tcg tta gta tgt tgg ttt aca gat aga caa att cga atg aga 2783 Leu Cys Ser Leu Val Cys Trp Phe Thr Asp Arg Gln Ile Arg Met Arg 755 760 765 ttc att gaa ggt tgc ctt gaa aac ttg gga aac aac aga tca gta gta 2831 Phe Ile Glu Gly Cys Leu Glu Asn Leu Gly Asn Asn Arg Ser Val Val 770 775 780 att tca ctt cgt ctt ctt cca aaa cta ttt ggt act ttt cag cag ttt 2879 Ile Ser Leu Arg Leu Leu Pro Lys Leu Phe Gly Thr Phe Gln Gln Phe 785 790 795 800 ggg agc agt tac gat aca cac tgg ata aca atg tgg gca gaa aaa gaa 2927 Gly Ser Ser Tyr Asp Thr His Trp Ile Thr Met Trp Ala Glu Lys Glu 805 810 815 ctg aac atg atg aag ctt ttc ttt gat aat ttg gta tac tac att caa 2975 Leu Asn Met Met Lys Leu Phe Phe Asp Asn Leu Val Tyr Tyr Ile Gln 820 825 830 act gtg aga gaa gga aga caa aaa cat gca ctg tac agc cat agt gct 3023 Thr Val Arg Glu Gly Arg Gln Lys His Ala Leu Tyr Ser His Ser Ala 835 840 845 gaa gtt caa gtt cgt ctt caa ttc ttg act tgt gta ttt tca act ctg 3071 Glu Val Gln Val Arg Leu Gln Phe Leu Thr Cys Val Phe Ser Thr Leu 850 855 860 gga tca cct gat cat ttc agg tta agt tta gag caa gtt gac atc tta 3119 Gly Ser Pro Asp His Phe Arg Leu Ser Leu Glu Gln Val Asp Ile Leu 865 870 875 880 tgg cat tgt tta gta gaa gat tct gaa tgt tat gat gat gca ctc cat 3167 Trp His Cys Leu Val Glu Asp Ser Glu Cys Tyr Asp Asp Ala Leu His 885 890 895 tgg ttt tta aat caa gtt cga agt aaa gat caa cat gct atg ggt atg 3215 Trp Phe Leu Asn Gln Val Arg Ser Lys Asp Gln His Ala Met Gly Met 900 905 910 gaa acc tac aaa cat ctt ttc ctg gag aag atg ccc cag cta aaa cct 3263 Glu Thr Tyr Lys His Leu Phe Leu Glu Lys Met Pro Gln Leu Lys Pro 915 920 925 gaa aca att agc atg act ggc tta aac ctg ttt cag cat ctc tgt aac 3311 Glu Thr Ile Ser Met Thr Gly Leu Asn Leu Phe Gln His Leu Cys Asn 930 935 940 ttg gct cga ttg gct acc agt gcc tat gat ggt tgt tca aat tct gag 3359 Leu Ala Arg Leu Ala Thr Ser Ala Tyr Asp Gly Cys Ser Asn Ser Glu 945 950 955 960 ctg tgt ggt atg gac caa ttt tgg ggc att gct tta aga gca caa tct 3407 Leu Cys Gly Met Asp Gln Phe Trp Gly Ile Ala Leu Arg Ala Gln Ser 965 970 975 ggt gat gtc agt cga gca gct atc cag tat att aac tcc tat tat att 3455 Gly Asp Val Ser Arg Ala Ala Ile Gln Tyr Ile Asn Ser Tyr Tyr Ile 980 985 990 aat ggt aaa aca ggt ttg gag aag gag caa gaa ttt att agt aag tgc 3503 Asn Gly Lys Thr Gly Leu Glu Lys Glu Gln Glu Phe Ile Ser Lys Cys 995 1000 1005 atg gag agt ctt atg ata gct tct agc agt ctt gaa cag gaa tca cac 3551 Met Glu Ser Leu Met Ile Ala Ser Ser Ser Leu Glu Gln Glu Ser His 1010 1015 1020 tca agt ctc atg gtt ata gaa aga gga ctc ctt atg ctg aag aca cat 3599 Ser Ser Leu Met Val Ile Glu Arg Gly Leu Leu Met Leu Lys Thr His 1025 1030 1035 1040 ctg gaa gcg ttt agg aga agg ttt gca tat cat ctg aga cag tgg caa 3647 Leu Glu Ala Phe Arg Arg Arg Phe Ala Tyr His Leu Arg Gln Trp Gln 1045 1050 1055 att gaa ggc act ggt att agt agt cat ttg aaa gca ctg agt gac aaa 3695 Ile Glu Gly Thr Gly Ile Ser Ser His Leu Lys Ala Leu Ser Asp Lys 1060 1065 1070 cag tct ctg ccg cta agg gtt gta tgc cag cca gct gga ctt cct gac 3743 Gln Ser Leu Pro Leu Arg Val Val Cys Gln Pro Ala Gly Leu Pro Asp 1075 1080 1085 aag atg act att gaa atg tat cct agt gac cag gta gca gat ctt agg 3791 Lys Met Thr Ile Glu Met Tyr Pro Ser Asp Gln Val Ala Asp Leu Arg 1090 1095 1100 gct gaa gta act cat tgg tat gaa aat tta cag aaa gaa caa ata aat 3839 Ala Glu Val Thr His Trp Tyr Glu Asn Leu Gln Lys Glu Gln Ile Asn 1105 1110 1115 1120 caa caa gct cag ctt cag gag ttt ggt caa agc aac cga aaa gga gag 3887 Gln Gln Ala Gln Leu Gln Glu Phe Gly Gln Ser Asn Arg Lys Gly Glu 1125 1130 1135 ttt cct gga ggc ctc atg gga cct gtc agg atg att tca tct gga cac 3935 Phe Pro Gly Gly Leu Met Gly Pro Val Arg Met Ile Ser Ser Gly His 1140 1145 1150 gag tta aca aca gat tat gat gaa aaa gca ctt cat gag ctt ggt ttt 3983 Glu Leu Thr Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Ala Leu His Glu Leu Gly Phe 1155 1160 1165 aag gat atg cag atg gta ttt gta tct ttg ggt gca cca agg aga gag 4031 Lys Asp Met Gln Met Val Phe Val Ser Leu Gly Ala Pro Arg Arg Glu 1170 1175 1180 cgg aaa ggg gaa ggt gtt cag ctg cca gca tct tgc ctc cca ccc cct 4079 Arg Lys Gly Glu Gly Val Gln Leu Pro Ala Ser Cys Leu Pro Pro Pro 1185 1190 1195 1200 cag aag gac aac att cca atg ctt ttg ctt tta caa gag cct cat tta 4127 Gln Lys Asp Asn Ile Pro Met Leu Leu Leu Leu Gln Glu Pro His Leu 1205 1210 1215 act act ctt ttt gat tta tta gag atg ctt gca tca ttt aaa cca ccc 4175 Thr Thr Leu Phe Asp Leu Leu Glu Met Leu Ala Ser Phe Lys Pro Pro 1220 1225 1230 tca gga aaa gtg gca gtg gat gat agt gag agc tta cga tgt gaa gaa 4223 Ser Gly Lys Val Ala Val Asp Asp Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Glu 1235 1240 1245 ctt cat ctt cat gca gaa aat ctg tct agg cgg gtc tgg gag cta ctg 4271 Leu His Leu His Ala Glu Asn Leu Ser Arg Arg Val Trp Glu Leu Leu 1250 1255 1260 atg ctt ctt cct aca tgt cct aat atg ttg atg gca ttc cag aat atc 4319 Met Leu Leu Pro Thr Cys Pro Asn Met Leu Met Ala Phe Gln Asn Ile 1265 1270 1275 1280 tca gat gag cag agt aat gat gga ttt aat tgg aaa gaa ctt ctc aaa 4367 Ser Asp Glu Gln Ser Asn Asp Gly Phe Asn Trp Lys Glu Leu Leu Lys 1285 1290 1295 att aag agc gcc cac aag cta ttg tat gct ctg gaa att att gaa gca 4415 Ile Lys Ser Ala His Lys Leu Leu Tyr Ala Leu Glu Ile Ile Glu Ala 1300 1305 1310 ctg gga aaa cct aat aga aga ata agg agg gag tct acg gga agt tac 4463 Leu Gly Lys Pro Asn Arg Arg Ile Arg Arg Glu Ser Thr Gly Ser Tyr 1315 1320 1325 agt gat ctt tat cca gat tca gat gat tca agt gag gat caa gtg gaa 4511 Ser Asp Leu Tyr Pro Asp Ser Asp Asp Ser Ser Glu Asp Gln Val Glu 1330 1335 1340 aat agt aaa aat tcc tgg agt tgc aag ttt gtt gct gct gga ggg ctt 4559 Asn Ser Lys Asn Ser Trp Ser Cys Lys Phe Val Ala Ala Gly Gly Leu 1345 1350 1355 1360 caa cag tta tta gaa att ttt aat tct gga att cta gag cct aaa gag 4607 Gln Gln Leu Leu Glu Ile Phe Asn Ser Gly Ile Leu Glu Pro Lys Glu 1365 1370 1375 cag gaa tca tgg act gtg tgg cag cta gac tgt ctt gct tgc ttg ctg 4655 Gln Glu Ser Trp Thr Val Trp Gln Leu Asp Cys Leu Ala Cys Leu Leu 1380 1385 1390 aag tta ata tgc cag ttt gca gta gat cca tcc gat ttg gat tta gct 4703 Lys Leu Ile Cys Gln Phe Ala Val Asp Pro Ser Asp Leu Asp Leu Ala 1395 1400 1405 tat cat gat gtc ttt gcc tgg tct ggt ata gcg gaa agc cat agg aaa 4751 Tyr His Asp Val Phe Ala Trp Ser Gly Ile Ala Glu Ser His Arg Lys 1410 1415 1420 aga acc tgg cct ggc aaa tca agg aag gct gct ggt gat cat gct aag 4799 Arg Thr Trp Pro Gly Lys Ser Arg Lys Ala Ala Gly Asp His Ala Lys 1425 1430 1435 1440 ggt ctt cat ata cca cga tta aca gag gta ttt ctt gtt ctt gtc caa 4847 Gly Leu His Ile Pro Arg Leu Thr Glu Val Phe Leu Val Leu Val Gln 1445 1450 1455 gga acc agt ttg att cag cga ctt atg tct gtt gct tat acg tat gat 4895 Gly Thr Ser Leu Ile Gln Arg Leu Met Ser Val Ala Tyr Thr Tyr Asp 1460 1465 1470 aat ctg gct cct aga gtt tta aaa gct cag tct gat cac agg tct aga 4943 Asn Leu Ala Pro Arg Val Leu Lys Ala Gln Ser Asp His Arg Ser Arg 1475 1480 1485 cat gaa gtt tca cat tat tca atg tgg ctc ttg gtg agt tgg gct cat 4991 His Glu Val Ser His Tyr Ser Met Trp Leu Leu Val Ser Trp Ala His 1490 1495 1500 tgc tgt tct tta gtg aaa tct agc ctt gct gat agc gat cat tta caa 5039 Cys Cys Ser Leu Val Lys Ser Ser Leu Ala Asp Ser Asp His Leu Gln 1505 1510 1515 1520 gat tgg cta aag aaa ttg act ctc ctt att cct gag act gca gtt cgt 5087 Asp Trp Leu Lys Lys Leu Thr Leu Leu Ile Pro Glu Thr Ala Val Arg 1525 1530 1535 cat gaa tca tgc agt ggt ctc tat aag tta tcc ctg tca ggg ctg gat 5135 His Glu Ser Cys Ser Gly Leu Tyr Lys Leu Ser Leu Ser Gly Leu Asp 1540 1545 1550 gga gga gac tca atc aat cgt tct ttt ctg cta ttg gct gcc tca aca 5183 Gly Gly Asp Ser Ile Asn Arg Ser Phe Leu Leu Leu Ala Ala Ser Thr 1555 1560 1565 tta ttg aaa ttt ctt cct gat gct caa gca ctc aaa cct att agg ata 5231 Leu Leu Lys Phe Leu Pro Asp Ala Gln Ala Leu Lys Pro Ile Arg Ile 1570 1575 1580 gat gat tat gag gaa gaa cca ata tta aaa cca gga tgt aaa gag tat 5279 Asp Asp Tyr Glu Glu Glu Pro Ile Leu Lys Pro Gly Cys Lys Glu Tyr 1585 1590 1595 1600 ttt tgg ttg tta tgc aaa tta gtt gac aac ata cat ata aag gac gct 5327 Phe Trp Leu Leu Cys Lys Leu Val Asp Asn Ile His Ile Lys Asp Ala 1605 1610 1615 agt cag aca acg ctc ctc gac tta gat gcc ttg gca aga cat ttg gct 5375 Ser Gln Thr Thr Leu Leu Asp Leu Asp Ala Leu Ala Arg His Leu Ala 1620 1625 1630 gac tgt att cga agt agg gag atc ctt gat cat cag gat ggt aat gta 5423 Asp Cys Ile Arg Ser Arg Glu Ile Leu Asp His Gln Asp Gly Asn Val 1635 1640 1645 gaa gat gat ggg ctt aca gga ctc cta agg ctt gca aca agt gtt gtt 5471 Glu Asp Asp Gly Leu Thr Gly Leu Leu Arg Leu Ala Thr Ser Val Val 1650 1655 1660 aaa cac aaa cca ccc ttt aaa ttt tca agg gaa gga cag gaa ttt ttg 5519 Lys His Lys Pro Pro Phe Lys Phe Ser Arg Glu Gly Gln Glu Phe Leu 1665 1670 1675 1680 aga gat atc ttc aat ctc ctg ttt ttg ttg cca agt cta aag gac cga 5567 Arg Asp Ile Phe Asn Leu Leu Phe Leu Leu Pro Ser Leu Lys Asp Arg 1685 1690 1695 caa cag cca aag tgc aaa tca cat tct tca aga gct gcc gct tac gat 5615 Gln Gln Pro Lys Cys Lys Ser His Ser Ser Arg Ala Ala Ala Tyr Asp 1700 1705 1710 ttg tta gta gag atg gta aag ggg tct gtt gag aac tac agg cta ata 5663 Leu Leu Val Glu Met Val Lys Gly Ser Val Glu Asn Tyr Arg Leu Ile 1715 1720 1725 cac aac tgg gtt atg gca caa cac atg cag tcc cat gca cct tat aaa 5711 His Asn Trp Val Met Ala Gln His Met Gln Ser His Ala Pro Tyr Lys 1730 1735 1740 tgg gat tac tgg cct cat gaa gat gtc cgt gct gaa tgt aga ttt gtt 5759 Trp Asp Tyr Trp Pro His Glu Asp Val Arg Ala Glu Cys Arg Phe Val 1745 1750 1755 1760 ggc ctt act aac ctt gga gct act tgt tac tta gct tct act att cag 5807 Gly Leu Thr Asn Leu Gly Ala Thr Cys Tyr Leu Ala Ser Thr Ile Gln 1765 1770 1775 caa ctt tat atg ata cct gag gca aga cag gct gtc ttc act gcc aag 5855 Gln Leu Tyr Met Ile Pro Glu Ala Arg Gln Ala Val Phe Thr Ala Lys 1780 1785 1790 tat tca gag gat atg aag cac aag acc act ctt ctg gag ctt cag aaa 5903 Tyr Ser Glu Asp Met Lys His Lys Thr Thr Leu Leu Glu Leu Gln Lys 1795 1800 1805 atg ttt aca tat tta atg gag agt gaa tgc aaa gca tat aat cct aga 5951 Met Phe Thr Tyr Leu Met Glu Ser Glu Cys Lys Ala Tyr Asn Pro Arg 1810 1815 1820 cct ttc tgt aaa aca tac acc atg gat aag cag cct ctg aat act ggg 5999 Pro Phe Cys Lys Thr Tyr Thr Met Asp Lys Gln Pro Leu Asn Thr Gly 1825 1830 1835 1840 gaa cag aaa gat atg aca gag ttt ttt act gat cta att acc aaa atc 6047 Glu Gln Lys Asp Met Thr Glu Phe Phe Thr Asp Leu Ile Thr Lys Ile 1845 1850 1855 gaa gaa atg tct ccc gaa ctg aaa aat acc gtc aaa agt tta ttt gga 6095 Glu Glu Met Ser Pro Glu Leu Lys Asn Thr Val Lys Ser Leu Phe Gly 1860 1865 1870 ggt gta att aca aac aat gtt gta tcc ttg gat tgt gaa cat gtt agt 6143 Gly Val Ile Thr Asn Asn Val Val Ser Leu Asp Cys Glu His Val Ser 1875 1880 1885 caa act gct gaa gag ttt tat act gtg agg tgc caa gtg gct gat atg 6191 Gln Thr Ala Glu Glu Phe Tyr Thr Val Arg Cys Gln Val Ala Asp Met 1890 1895 1900 aag aac att tat gaa tct ctt gat gaa gtt act ata aaa gac act ttg 6239 Lys Asn Ile Tyr Glu Ser Leu Asp Glu Val Thr Ile Lys Asp Thr Leu 1905 1910 1915 1920 gaa ggt gat aac atg tat act tgt tct cat tgt ggg aag aaa gta cga 6287 Glu Gly Asp Asn Met Tyr Thr Cys Ser His Cys Gly Lys Lys Val Arg 1925 1930 1935 gct gaa aaa agg gca tgt ttt aag aaa ttg cct cgc att ttg agt ttc 6335 Ala Glu Lys Arg Ala Cys Phe Lys Lys Leu Pro Arg Ile Leu Ser Phe 1940 1945 1950 aat act atg aga tac aca ttt aat atg gtc acg atg atg aaa gag aaa 6383 Asn Thr Met Arg Tyr Thr Phe Asn Met Val Thr Met Met Lys Glu Lys 1955 1960 1965 gtg aat aca cac ttt tcc ttc cca tta cgt ttg gac atg acg ccc tat 6431 Val Asn Thr His Phe Ser Phe Pro Leu Arg Leu Asp Met Thr Pro Tyr 1970 1975 1980 aca gaa gat ttt ctt atg gga aag agt gag agg aaa gaa ggt ttt aaa 6479 Thr Glu Asp Phe Leu Met Gly Lys Ser Glu Arg Lys Glu Gly Phe Lys 1985 1990 1995 2000 gaa gtc agt gat cat tca aaa gac tca gag agc tat gaa tat gac ttg 6527 Glu Val Ser Asp His Ser Lys Asp Ser Glu Ser Tyr Glu Tyr Asp Leu 2005 2010 2015 ata gga gtg act gtt cac aca gga acg gca gat ggt gga cac tat tat 6575 Ile Gly Val Thr Val His Thr Gly Thr Ala Asp Gly Gly His Tyr Tyr 2020 2025 2030 agc ttt atc aga gat ata gta aat ccc cat gct tat aaa aac aat aaa 6623 Ser Phe Ile Arg Asp Ile Val Asn Pro His Ala Tyr Lys Asn Asn Lys 2035 2040 2045 tgg tat ctt ttt aat gat gct gag gta aaa cct ttt gat tct gct caa 6671 Trp Tyr Leu Phe Asn Asp Ala Glu Val Lys Pro Phe Asp Ser Ala Gln 2050 2055 2060 ctt gca tct gaa tgt ttt ggt gga gag atg acg acc aag acc tat gat 6719 Leu Ala Ser Glu Cys Phe Gly Gly Glu Met Thr Thr Lys Thr Tyr Asp 2065 2070 2075 2080 tct gtt aca gat aaa ttt atg gac ttc tct ttt gaa aag aca cac agt 6767 Ser Val Thr Asp Lys Phe Met Asp Phe Ser Phe Glu Lys Thr His Ser 2085 2090 2095 gca tat atg ctg ttt tac aaa cgc atg gaa cca gag gaa gaa aat ggc 6815 Ala Tyr Met Leu Phe Tyr Lys Arg Met Glu Pro Glu Glu Glu Asn Gly 2100 2105 2110 aga gaa tac aaa ttt gat gtt tcg tca gag tta cta gag tgg att tgg 6863 Arg Glu Tyr Lys Phe Asp Val Ser Ser Glu Leu Leu Glu Trp Ile Trp 2115 2120 2125 cat gat aac atg cag ttt ctt caa gac aaa aac att ttt gaa cat aca 6911 His Asp Asn Met Gln Phe Leu Gln Asp Lys Asn Ile Phe Glu His Thr 2130 2135 2140 tat ttt gga ttt atg tgg caa ttg tgt agt tgt att ccc agt aca tta 6959 Tyr Phe Gly Phe Met Trp Gln Leu Cys Ser Cys Ile Pro Ser Thr Leu 2145 2150 2155 2160 cca gat cct aaa gct gtg tcc tta atg aca gca aag tta agc act tcc 7007 Pro Asp Pro Lys Ala Val Ser Leu Met Thr Ala Lys Leu Ser Thr Ser 2165 2170 2175 ttt gtc cta gag aca ttt att cat tct aaa gaa aag ccc acg atg ctt 7055 Phe Val Leu Glu Thr Phe Ile His Ser Lys Glu Lys Pro Thr Met Leu 2180 2185 2190 cag tgg att gaa ctg ttg acg aaa cag ttt aat aat agt cag gca gct 7103 Gln Trp Ile Glu Leu Leu Thr Lys Gln Phe Asn Asn Ser Gln Ala Ala 2195 2200 2205 tgt gag tgg ttt tta gat cgt atg gct gat gac gac tgg tgg cca atg 7151 Cys Glu Trp Phe Leu Asp Arg Met Ala Asp Asp Asp Trp Trp Pro Met 2210 2215 2220 cag ata cta att aag tgc cct aat caa att gtg aga cag atg ttt cag 7199 Gln Ile Leu Ile Lys Cys Pro Asn Gln Ile Val Arg Gln Met Phe 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Met Gly Thr Lys Gly Pro Glu Asn Pro Gln Val Glu Val 2340 2345 2350 tta tca gag gaa gaa ggg gaa gaa gaa gag gag gaa gaa gat atc ctc 7583 Leu Ser Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ile Leu 2355 2360 2365 tct ctg gca gaa gaa aaa tac agg cca gct gcc ctt gaa aag atg ata 7631 Ser Leu Ala Glu Glu Lys Tyr Arg Pro Ala Ala Leu Glu Lys Met Ile 2370 2375 2380 gct tta gtt gct ctt ttg gtt gaa cag tct cga tca gaa agg cat ttg 7679 Ala Leu Val Ala Leu Leu Val Glu Gln Ser Arg Ser Glu Arg His Leu 2385 2390 2395 2400 aca tta tca cag act gac atg gca gca tta aca gga gga aag gga ttt 7727 Thr Leu Ser Gln Thr Asp Met Ala Ala Leu Thr Gly Gly Lys Gly Phe 2405 2410 2415 ccc ttc ttg ttt caa cat att cgt gat ggc atc aat ata aga caa act 7775 Pro Phe Leu Phe Gln His Ile Arg Asp Gly Ile Asn Ile Arg Gln Thr 2420 2425 2430 tgt aat ctg att ttc agc ctg tgt cga tac aat aat cga ctt gca gaa 7823 Cys Asn Leu Ile Phe Ser Leu Cys Arg Tyr Asn Asn Arg Leu Ala Glu 2435 2440 2445 cat att gta tct atg ctt ttc aca tca ata gca aag ttg act cct gag 7871 His Ile Val Ser Met Leu Phe Thr Ser Ile Ala Lys Leu Thr Pro Glu 2450 2455 2460 gca gcc aat cct ttc ttt aag ttg ttg act atg cta atg gag ttt gct 7919 Ala Ala Asn Pro Phe Phe Lys Leu Leu Thr Met Leu Met Glu Phe Ala 2465 2470 2475 2480 ggt gga cct cca gga atg cct ccc ttt gca tct tat att ctg cag agg 7967 Gly Gly Pro Pro Gly Met Pro Pro Phe Ala Ser Tyr Ile Leu Gln Arg 2485 2490 2495 ata tgg gag gtg att gaa tac aat cct tct cag tgt cta gat tgg ttg 8015 Ile Trp Glu Val Ile Glu Tyr Asn Pro Ser Gln Cys Leu Asp Trp Leu 2500 2505 2510 gca gtg cag aca ccc cga aat aaa ctg gca cac agc tgg gtc tta cag 8063 Ala Val Gln Thr Pro Arg Asn Lys Leu Ala His Ser Trp Val Leu Gln 2515 2520 2525 aat atg gaa aac tgg gtc gag cgg ttt ctt ttg gct cac aat tat cct 8111 Asn Met Glu Asn Trp Val Glu Arg Phe Leu Leu Ala His Asn Tyr Pro 2530 2535 2540 aga gtg agg act tct gca gct tat ctt ctg gtg tcc ctt ata cca agc 8159 Arg Val Arg Thr Ser Ala Ala Tyr Leu Leu Val Ser Leu Ile Pro Ser 2545 2550 2555 2560 aat tca ttc cgt cag atg ttc cgg tca aca agg tct ttg cac atc cca 8207 Asn Ser Phe Arg Gln Met Phe Arg Ser Thr Arg Ser Leu His Ile Pro 2565 2570 2575 acc cgt gac ctt cca ctc agt cca gac aca aca gta gtc cta cat cag 8255 Thr Arg Asp Leu Pro Leu Ser Pro Asp Thr Thr Val Val Leu His Gln 2580 2585 2590 gtc tac aac gtg ctc ctt ggt ttg ctc tca aga gcc aaa ctt tat gtt 8303 Val Tyr Asn Val Leu Leu Gly Leu Leu Ser Arg Ala Lys Leu Tyr Val 2595 2600 2605 gat gct gct gtt cat ggc act aca aag cta gtg ccc tat ttt agc ttt 8351 Asp Ala Ala Val His Gly Thr Thr Lys Leu Val Pro Tyr Phe Ser Phe 2610 2615 2620 atg act tac tgt tta att tcc aaa act gag aag ctg atg ttt tcc aca 8399 Met Thr Tyr Cys Leu Ile Ser Lys Thr Glu Lys Leu Met Phe Ser Thr 2625 2630 2635 2640 tat ttc atg gat ttg tgg aac ctt ttc cag cct aaa ctt tct gag cca 8447 Tyr Phe Met Asp Leu Trp Asn Leu Phe Gln Pro Lys Leu Ser Glu Pro 2645 2650 2655 gca ata gct aca aat cac aat aaa cag gct ttg ctt tca ttt tgg tac 8495 Ala Ile Ala Thr Asn His Asn Lys Gln Ala Leu Leu Ser Phe Trp Tyr 2660 2665 2670 aat gtc tgt gct gac tgt cca gag aat atc cgc ctt att gtt cag aac 8543 Asn Val Cys Ala Asp Cys Pro Glu Asn Ile Arg Leu Ile Val Gln Asn 2675 2680 2685 cca gtg gta acc aag aac att gcc ttc aat tac atc ctt gct gac cat 8591 Pro Val Val Thr Lys Asn Ile Ala Phe Asn Tyr Ile Leu Ala Asp His 2690 2695 2700 gat gat cag gat gtg gtg ctt ttt aac cgt ggg atg ctg cca gcg tac 8639 Asp Asp Gln Asp Val Val Leu Phe Asn Arg Gly Met Leu Pro Ala Tyr 2705 2710 2715 2720 tat ggc att ctg agg ctc tgc tgt gag cag tct cct gca ttc aca cga 8687 Tyr Gly Ile Leu Arg Leu Cys Cys Glu Gln Ser Pro Ala Phe Thr Arg 2725 2730 2735 caa ctg gct tct cac cag aac atc cag tgg gcc ttt aag aat ctt aca 8735 Gln Leu Ala Ser His Gln Asn Ile Gln Trp Ala Phe Lys Asn Leu Thr 2740 2745 2750 cca cat gcc agc caa tac cct gga gca gta gaa gaa ctg ttt aac ctg 8783 Pro His Ala Ser Gln Tyr Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Phe Asn Leu 2755 2760 2765 atg cag ctg ttt ata gct cag agg cca gat atg aga gaa gaa gaa tta 8831 Met Gln Leu Phe Ile Ala Gln Arg Pro Asp Met Arg Glu Glu Glu Leu 2770 2775 2780 gaa gat att aaa cag ttc aag aaa aca acc ata agt tgt tac tta cgt 8879 Glu Asp Ile Lys Gln Phe Lys Lys Thr Thr Ile Ser Cys Tyr Leu Arg 2785 2790 2795 2800 tgc tta gat ggc cgc tcc tgc tgg act act tta ata agt gcc ttc aga 8927 Cys Leu Asp Gly Arg Ser Cys Trp Thr Thr Leu Ile Ser Ala Phe Arg 2805 2810 2815 ata cta tta gaa tct gat gaa gac aga ctt ctt gtt gta ttt aat cga 8975 Ile Leu Leu Glu Ser Asp Glu Asp Arg Leu Leu Val Val Phe Asn Arg 2820 2825 2830 gga ttg att cta atg aca gag tct ttc aac act ttg cac atg atg tat 9023 Gly Leu Ile Leu Met Thr Glu Ser Phe Asn Thr Leu His Met Met Tyr 2835 2840 2845 cac gaa gct aca gct tgc cat gtg act gga gat tta gta gaa ctt ctg 9071 His Glu Ala Thr Ala Cys His Val Thr Gly Asp Leu Val Glu Leu Leu 2850 2855 2860 tca ata ttt ctt tcg gtt ttg aag tct aca cgc cct tat ctt cag aga 9119 Ser Ile Phe Leu Ser Val Leu Lys Ser Thr Arg Pro Tyr Leu Gln Arg 2865 2870 2875 2880 aaa gat gtg aaa caa gca tta atc cag tgg cag gag cga att gaa ttt 9167 Lys Asp Val Lys Gln Ala Leu Ile Gln Trp Gln Glu Arg Ile Glu Phe 2885 2890 2895 gcc cat aaa ctg tta act ctt ctt aat tcc tat agt cct cca gaa ctt 9215 Ala His Lys Leu Leu Thr Leu Leu Asn Ser Tyr Ser Pro Pro Glu Leu 2900 2905 2910 aga aat gcc tgt ata gat gtc ctc aag gaa ctt gta ctt ttg agt ccc 9263 Arg Asn Ala Cys Ile Asp Val Leu Lys Glu Leu Val Leu Leu Ser Pro 2915 2920 2925 cat gat ttt ctt cat act ctg gtt ccc ttt cta caa cac aac cat tgt 9311 His Asp Phe Leu His Thr Leu Val Pro Phe Leu Gln His Asn His Cys 2930 2935 2940 act tac cat cac agt aat ata cca atg tct ctt gga cct tat ttc cct 9359 Thr Tyr His His Ser Asn Ile Pro Met Ser Leu Gly Pro Tyr Phe Pro 2945 2950 2955 2960 tgt cga gaa aat atc aag cta ata gga ggg aaa agc aat att cgg cct 9407 Cys Arg Glu Asn Ile Lys Leu Ile Gly Gly Lys Ser Asn Ile Arg Pro 2965 2970 2975 ccg cgc cct gaa ctc aat atg tgc ctc ttg ccc aca atg gtg gaa acc 9455 Pro Arg Pro Glu Leu Asn Met Cys Leu Leu Pro Thr Met Val Glu Thr 2980 2985 2990 agt aag ggc aaa gat gac gtt tat gat cgt atg ctg cta gac tac ttc 9503 Ser Lys Gly Lys Asp Asp Val Tyr Asp Arg Met Leu Leu Asp Tyr Phe 2995 3000 3005 ttt tct tat cat cag ttc atc cat cta tta tgc cga gtt gca atc aac 9551 Phe Ser Tyr His Gln Phe Ile His Leu Leu Cys Arg Val Ala Ile Asn 3010 3015 3020 tgt gaa aaa ttt act gaa aca tta gtt aag ctg agt gtc cta gtt gcc 9599 Cys Glu Lys Phe Thr Glu Thr Leu Val Lys Leu Ser Val Leu Val Ala 3025 3030 3035 3040 tat gaa ggt ttg cca ctt cat ctt gca ctg ttc ccc aaa ctt tgg act 9647 Tyr Glu Gly Leu Pro Leu His Leu Ala Leu Phe Pro Lys Leu Trp Thr 3045 3050 3055 gag cta tgc cag act cag tct gct atg tca aaa aac tgc atc aag ctt 9695 Glu Leu Cys Gln Thr Gln Ser Ala Met Ser Lys Asn Cys Ile Lys Leu 3060 3065 3070 ttg tgt gaa gat cct gtt ttc gca gaa tat att aaa tgt atc cta atg 9743 Leu Cys Glu Asp Pro Val Phe Ala Glu Tyr Ile Lys Cys Ile Leu Met 3075 3080 3085 gat gaa aga act ttt tta aac aac aac att gtc tac acg ttc atg aca 9791 Asp Glu Arg Thr Phe Leu Asn Asn Asn Ile Val Tyr Thr Phe Met Thr 3090 3095 3100 cat ttc ctt cta aag gtt caa agt caa gtg ttt tct gaa gca aac tgt 9839 His Phe Leu Leu Lys Val Gln Ser Gln Val Phe Ser Glu Ala Asn Cys 3105 3110 3115 3120 gcc aat ttg atc agc act ctt att aca aac ttg ata agc cag tat cag 9887 Ala Asn Leu Ile Ser Thr Leu Ile Thr Asn Leu Ile Ser Gln Tyr Gln 3125 3130 3135 aac cta cag tct gat ttc tcc aac cga gtt gaa att tcc aaa gca agt 9935 Asn Leu Gln Ser Asp Phe Ser Asn Arg Val Glu Ile Ser Lys Ala Ser 3140 3145 3150 gct tct tta aat ggg gac ctg agg gca ctc gct ttg ctc ctg tca gta 9983 Ala Ser Leu Asn Gly Asp Leu Arg Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ser Val 3155 3160 3165 cac act ccc aaa cag tta aac cca gct cta att cca act ctg caa gag 10031 His Thr Pro Lys Gln Leu Asn Pro Ala Leu Ile Pro Thr Leu Gln Glu 3170 3175 3180 ctt tta agc aaa tgc agg act tgt ctg caa cag aga aac tca ctc caa 10079 Leu Leu Ser Lys Cys Arg Thr Cys Leu Gln Gln Arg Asn Ser Leu Gln 3185 3190 3195 3200 gag caa gaa gcc aaa gaa aga aaa act aaa gat gat gaa gga gca act 10127 Glu Gln Glu Ala Lys Glu Arg Lys Thr Lys Asp Asp Glu Gly Ala Thr 3205 3210 3215 ccc att aaa agg cgg cgt gtt agc agt gat gag gag cac act gta gac 10175 Pro Ile Lys Arg Arg Arg Val Ser Ser Asp Glu Glu His Thr Val Asp 3220 3225 3230 agc tgc atc agt gac atg aaa aca gaa acc agg gag gtc ctg acc cca 10223 Ser Cys Ile Ser Asp Met Lys Thr Glu Thr Arg Glu Val Leu Thr Pro 3235 3240 3245 acg agc act tct gac aat gag acc aga gac tcc tca att att gat cca 10271 Thr Ser Thr Ser Asp Asn Glu Thr Arg Asp Ser Ser Ile Ile Asp Pro 3250 3255 3260 gga act gag caa gat ctt cct tcc cct gaa aat agt tct gtt aaa gaa 10319 Gly Thr Glu Gln Asp Leu Pro Ser Pro Glu Asn Ser Ser Val Lys Glu 3265 3270 3275 3280 tac cga atg gaa gtt cca tct tcg ttt tca gaa gac atg tca aat atc 10367 Tyr Arg Met Glu Val Pro Ser Ser Phe Ser Glu Asp Met Ser Asn Ile 3285 3290 3295 agg tca cag cat gca gaa gaa cag tcc aac aat ggt aga tat gac gat 10415 Arg Ser Gln His Ala Glu Glu Gln Ser Asn Asn Gly Arg Tyr Asp Asp 3300 3305 3310 tgt aaa gaa ttt aaa gac ctc cac tgt tcc aag gat tct acc cta gct 10463 Cys Lys Glu Phe Lys Asp Leu His Cys Ser Lys Asp Ser Thr Leu Ala 3315 3320 3325 gag gaa gaa tct gag ttc cct tct act tct atc tct gca gtt ctg tct 10511 Glu Glu Glu Ser Glu Phe Pro Ser Thr Ser Ile Ser Ala Val Leu Ser 3330 3335 3340 gac tta gct gac ttg aga agc tgt gat ggc caa gct ttg ccc tcc cag 10559 Asp Leu Ala Asp Leu Arg Ser Cys Asp Gly Gln Ala Leu Pro Ser Gln 3345 3350 3355 3360 gac cct gag gtt gct tta tct ctc agt tgt ggc cat tcc aga gga ctc 10607 Asp Pro Glu Val Ala Leu Ser Leu Ser Cys Gly His Ser Arg Gly Leu 3365 3370 3375 ttt agt cat atg cag caa cat gac att tta gat acc ctg tgt agg acc 10655 Phe Ser His Met Gln Gln His Asp Ile Leu Asp Thr Leu Cys Arg Thr 3380 3385 3390 att gaa tct aca atc cat gtc gtc aca agg ata tct ggc aaa gga aac 10703 Ile Glu Ser Thr Ile His Val Val Thr Arg Ile Ser Gly Lys Gly Asn 3395 3400 3405 caa gct gct tct tga cattaggtgt agcatgtcta cttttaagtc cctcaccccc 10758 Gln Ala Ala Ser 3410 aacccccatg ctgtttgtat aagttttgct tatttgtttt tgtgcttcag tttgtccagt 10818 gctctctgct tgaatggcaa gatagattta taggcttaat tcttggtcag gcagaactcc 10878 agatgaaaaa aacttgcatc ttcagtatac ttcctaaagg gcaatcagat aatggatatg 10938 ttttatgtaa ttaagagttc actttagtgg ctttcattta atatggctgt ctgggaagaa 10998 cagggttgcc tagccctgta caatgtaatt taaacttaca gcatttttac tgtgtatgat 11058 atggtgtcct ctgtgccagt tttgtacctt atagaggcag attgcctccg atcgctgtgg 11118 ttcttattat caaaattaag tttacttgta tacggaacaa ccacaagaaa tttgattctg 11178 taaagaatcc tctttagctg tggcctggca gtatataaat ggtgctttat ttaacagaat 11238 acctgtggag gaaataaagc acacttgatg t 11269

【図面の簡単な説明】

【図１】 pg01082のインビトロでの脱ユビキチン化活
性の検出を示す図である。レーン１は、緩衝液単独、レ
ーン２は陽性コントロール、レーン３および４はpg0108
2発現プラスミド含有大腸菌（E.coli）BL21-SIの発現誘
導および発現非誘導により得られた抽出物の結果を示
す。

【図２】 共発現系でのpg01082の脱ユビキチン化活性
の検出を示す図である。レーン１、４、７、１０がpg01
082であり、レーン２、５、８、１１は陰性コントロー
ルのルシフェラーゼであり、レーン３、６、９、１２は
陽性コントロールである。

【図３】 活性部位変異の影響を示す図である。レーン
１と５が、５０８番目のシステインがアラニンに置換さ
れたpg01082（pg01082^c508A）である。

【図４】 hk03615x2とpg01082とがコードするアミノ酸
配列の関係を示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 25/00 ４Ｃ０８４ 48/00 25/16 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 25/00 25/28 ４Ｃ０８６ 25/16 43/00 １１１ ４Ｈ０４５ 25/28 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/64 Ｚ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/37 5/10 1/68 Ａ 9/64 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/37 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 長瀬 隆弘 千葉県木更津市矢那1532番３号 財団法人 かずさディー・エヌ・エー研究所内 (72)発明者 大石 道夫 千葉県木更津市矢那1532番３号 財団法人 かずさディー・エヌ・エー研究所内 (72)発明者 横田 博 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬株式会社東京研究開発センター内 (72)発明者 和田 直也 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬株式会社東京研究開発センター内 (72)発明者 岡本 貴史 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬株式会社東京研究開発センター内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 CA09 CA20 DA06 EA04 GA11 HA14 4B050 CC01 CC03 DD11 EE01 LL01 LL03 LL05 4B063 QA01 QA05 QA13 QA17 QA19 QQ21 QQ41 QQ43 QQ53 QQ61 QQ89 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR55 QR62 QS16 QS25 QX02 4B065 AA01X AA26X AA58X AA72X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 DC50 NA14 ZA022 ZA152 ZA162 ZC022 4C085 AA13 AA14 BB11 CC04 CC05 CC13 DD22 DD33 DD34 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 MA07 NA14 ZA02 ZA15 ZA16 ZC02 4H045 AA11 AA30 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の群より選ばれるポリペプチド； 配列表の配列番号１または配列番号２に記載のアミノ
   酸配列からなるポリペプチド、 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド、 前記のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ
   酸配列上の相同性を有しかつ脱ユビキチン化活性を有す
   るポリペプチド、および 前記アミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の
   欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、か
   つ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１または配列番号２に
   記載のアミノ酸配列の少なくとも約５個の連続するアミ
   ノ酸配列を有するペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のポリペプチド
   またはペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそ
   の相補鎖。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号３または配列番号４に
   記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相
   補鎖。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号３または配列番号４に
   記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相
   補鎖の少なくとも約１５個の連続する塩基配列からなる
   ポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３から５のいずれか１項に記載の
   ポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェント
   な条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
   ド。
7. 【請求項７】 請求項３から６のいずれか１項に記載の
   ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の組換えベクターを形質
   導入された形質転換体。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の形質転換体を培養する
   工程または請求項７に記載の組換えベクターを利用した
   無細胞蛋白質合成手段を含む、請求項１または２に記載
   のポリペプチドまたはペプチドの製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載のポリペプチ
    ドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体。
11. 【請求項１１】 脱ユビキチン化活性を抑制する、請求
    項１０に記載の抗体。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のポリペプチドと相互
    作用して脱ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する
    化合物、および／または請求項３もしくは４に記載のポ
    リヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは
    促進する化合物のスクリーニング方法であって、請求項
    １もしくは２に記載のポリペプチドもしくはペプチド、
    請求項３から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ド、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の形質
    転換体、請求項１０もしくは１１に記載の抗体のうちの
    少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスク
    リーニング方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法で同定される
    化合物。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載のポリペプチドと相互
    作用して脱ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する
    化合物、または請求項３もしくは４に記載のポリヌクレ
    オチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する
    化合物。
15. 【請求項１５】 請求項１または２に記載のポリペプチ
    ドもしくはペプチド、請求項３から６のいずれか１項に
    記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、
    請求項８に記載の形質転換体、請求項１０もしくは１１
    に記載の抗体、または請求項１３もしくは１４に記載の
    化合物のうちの少なくともいずれか１つを含有すること
    を特徴とする医薬組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載のポリペプチドの発現
    または脱ユビキチン化活性に関連した疾病の診断のため
    の測定方法であって、（ａ）該ポリペプチドをコードし
    ている核酸および／または（ｂ）試料中の該ポリペプチ
    ドをマーカーとして分析することを含む測定方法。
17. 【請求項１７】 請求項１もしくは２に記載のポリペプ
    チドもしくはペプチド、請求項３から６のいずれか１項
    に記載のポリヌクレオチド、または請求項１０もしくは
    １１に記載の抗体のうちの少なくとも１つを含んでな
    る、（ａ）該ポリペプチドまたは蛋白質をコードしてい
    る核酸および／または（ｂ）試料中の該ポリペプチドを
    マーカーとして分析することを含む測定方法に使用する
    試薬キット。
18. 【請求項１８】 請求項１に記載のポリペプチドと相互
    作用して脱ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する
    化合物、および／または請求項３もしくは４に記載のポ
    リヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは
    促進する化合物のスクリーニング方法であって、請求項
    １もしくは２に記載のポリペプチドもしくはペプチド、
    請求項３から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ド、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の形質
    転換体、請求項１０もしくは１１に記載の抗体のうちの
    少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスク
    リーニング方法で得られる化合物を含有する神経変性疾
    患の予防・治療剤。
19. 【請求項１９】 請求項１または２に記載のポリペプチ
    ドもしくはペプチド、請求項３から６のいずれか１項に
    記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、
    請求項８に記載の形質転換体、請求項１０もしくは１１
    に記載の抗体、または請求項１３もしくは１４に記載の
    化合物のうちの少なくともいずれか１つを含有すること
    を特徴とする神経変性疾患の予防・治療剤。
20. 【請求項２０】 請求項１８または請求項１９に記載の
    神経変性疾患がアルツハイマー病および／またはパーキ
    ンソン病である神経変性疾患の予防・治療剤。