WO2005019472A1

WO2005019472A1 - シノビオリン活性調節作用の検出方法

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Publication number: WO2005019472A1
Application number: PCT/JP2004/012329
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Nakajima; Tetsuya Amano; Lei Zhang; Rie Ikeda; Satoshi Yamasaki; Naoko Yagishita; Hiromitsu Yokohama; Motoji Kogushi
Original assignee: Locomogene, Inc.; Eisai Co., Ltd.
Priority date: 2003-08-20
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2005-03-03
Also published as: AU2004267317A1; CA2536071A1; EP1666606A4; EP1666606A1; KR20060036119A; AU2004267317A2; JPWO2005019472A1; KR20070092767A; US20070134720A1

Abstract

本発明は、プロリン４水酸化酵素の活性を調節する作用を評価するための方法を提供する。また、本発明は、その評価方法を利用するスクリーニング方法を提供する。さらに本発明は、線維症または関節リウマチの治療または予防に有用な化合物のスクリーニング方法を提供する。　本発明は、シノビオリンによるプロリン４水酸化酵素αサブユニット(P4HA1)のユビキチン化活性を調節する作用を検出するための方法に関する。更に本発明は、この方法に基づくシノビオリンのP4HA1のユビキチン化活性を調節する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。このスクリーニングによって見出される化合物は、プロリン４水酸化酵素の活性異常によってもたらされる線維症や関節リウマチなどの疾患の治療や予防に有用である。

Description

明細書シノビオリン活性調節作用の検出方法

技術分野

本発明は、シノビオリン活性を調節する作用を検出するための方法に関する。さらに本発明は、線維症やリウマチの治療または予防に有用な化合物のスクリ —ニング方法に関する。背景技術

シノビオリンは、リゥマチ患者由来滑膜細胞に存在する膜蛋白質として発見された蛋白質である（W0 02/052007参照)。遺伝子改変動物を用いた研究により、骨 ·関節の発生および関節症の発症に同因子が直接関与することが明らかとなつたことから、シノビオリンは正常な骨形成または四肢の発達に貢献する活性を有する蛋白質と考えられる。また、蛋白質構造予測システムにより、シノビオリンに RING f inger モチーフの存在が示された。このモチーフは蛋白質の分解に関わる E3 ュビキチン蛋白質リガーゼに共通に存在することが知られている。実際に、シノビォリンが RING f inger 型 E3ュビキチン蛋白質リガーゼの特徵である自己ュビキチン化活性を有することが証明されている（W0 02/052007参照）。

骨 ·関節の発生および関節症におけるシノビオリンの機能、すなわちシノピオリンはどのような細胞内シグナル伝達経路に関わっているかを解明するには、シノビォリンと結合する因子の探索が有力な手法のひとつである。特に、シノビォリンの基質蛋白質を同定することは、シノビォリンが関与する細胞内シグナル伝達経路を明らかにするための重要な課題である。シノビオリンと結合する蛋白質、その中でもシノビオリンの基質蛋白質を同定することは、骨 ·関節の発生および関節症におけるシノビォリンの機能を解明し、新たな関節症の診断および治療法の開発に有用である。しかしながら、シノビォリンの基質は同定されていない。したがって、シノビォリンとその基質との間の相互作用に影響を与える物質も明らかにされていない。

一方、コラーゲンは以下のような特徴を有する重要な生体構成成分である。

結合組織の主成分である、

三重らせん構造のドメインを 1つ以上持つ、

超分子集合体を形成する、そして

細胞外マトリックスを構成する

コラーゲンの主要な役割のひとつは組織の構造形成と維持、さらに細胞の足場としての働きである。またコラーゲンは、細胞の移動、分化、増殖、代謝機能にも影響を与えている。コラーゲンの産生細胞は主として線維芽細胞である。まず、プレブ口コラーゲンが細胞内で合成され、粗面小胞体でプロコラーゲンとなる。プロコラーゲンの N末端および C末端にはプロペプチドが結合している。プロべプチドは、細胞から分泌される直前にプロコラ一ゲンべプチダーゼによって切り離されて、プロコラ一ゲンが卜ロボコラーゲンとなる。分泌されたトロポコラーゲンは膠原線維の基本成分である。分泌後のトロポコラーゲンが相互に架橋されて、コラーゲン線維束が形成される。一

プロリン 4水酸化酵素は、コラーゲン合成に必須の酵素である。プロリン 4水酸化酵素の構造は公知である。すなわちプロリン 4水酸化酵素は、それぞれ 2つの _αサブユニットと j3サブュニットが会合して構成された 4量体構造を有する。 aサブュニットがプロリンの水酸化反応を触媒する作用を、そして /3サブュニットはジスルフィドイソメラーゼ（disul f ide i somerase)活性を有していると考えられている。プロリン 4水酸化酵素を構成する αサブユニットを、 P4HA1 と記載する。プロリン 4水酸化酵素は、プロコラーゲンの- X- Pro- Gly配列上のプロリン残基をヒドロキシル化することによって、安定なコラーゲン三重らせん構造を形成させる (Pihl aj anicmi, Τ· , et. al. , J. Hepatol. , 1991 , 13, S2 - 7参照）。更にプロリン 4水酸化酵素は、ヒドロキシル化されていないプロコラーゲンに結合することによって、その小胞体からの分泌を防ぐ作用を持つことも報告された (Walras ley, A. R.， et. al . , J. Biolog. Chem. , 1999, 274 (21)， pl4884-14 892 参照）。ヒドロキシル化されていないプロコラーゲンは、未成熟なプロコラ —ゲンである。したがって、プロリン 4水酸化酵素は、生体内におけるコラーゲンの品質管理を担当していると考えられる。

コラーゲンは生体の重要な構成要素であるとともに、線維症（f ibrosis)などの病的な生体反応の原因にもなつている。たとえば、肺、肝、あるいは腎などの組織におけるコラーゲンの蓄積は、各臓器の線維症の原因となる。リウマチや変形性骨関節症の関節においては、軟骨や滑膜細胞のコラーゲンを含む細胞外マトリックスの異常が見られることが知られている（桑名正隆、 Molecular Medicine, 2001, Vol. 38 (8) , p900- 907参照）。

したがって、コラーゲン産生の制御によって、これらの疾患を治療できる可能性がある。たとえばストレス蛋白質 H S P 4 7 (heat shock protein 47)の活性阻害によってコラーゲンの産生を抑制することで、これらの疾患の治療が可能なことが報告されている (Kivi r ikko KI. Ann Med. 1993 Apr ; 25 (2) : 113- 26.参照）。プロリン 4水酸化酵素、およびこの酵素にるコラーゲン産生は、線維症及び関節炎の診断や治療法の開発における重要な標的となるはずである。しかし、プロリン 4水酸化酵素の活性調節機構は明らかにされていない。

関節リウマチ（以下、 RA あるいはリウマチと記載することがある）は、関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の慢性炎症性疾患である。滑膜細胞 (synovial cel l) は、関節の滑膜で 1一 6層の上皮様層を形成する繊維芽細胞様の細胞で、滑液にプロテオダリカンやヒアルロン酸を供給するものとされている。 RA患者の関節では、滑膜組織の増殖、その結果として引き起こされる多層構造、滑膜細胞の他の組織への浸潤といったような症状が観察される。また RA 患者の血清中には、自己の IgGの Fc領域に対する自己抗体が存在することから、自己免疫疾患のひとつとして考えられているがその病因については未だに解明されていない。発明の開示

本発明は、プロリン 4水酸化酵素の活性調節機構を明らかにすることを課題とする。また本発明は、プロリン 4水酸化酵素の活性を調節する作用を評価するための方法の提供を課題とする。あるいは本発明は、その評価方法を利用して、当該作用を有する化合物をスクリーニングするための方法の提供を課題とする。さらに本発明は、関節リゥマチまたは線維症の治療または予防に有用な化合物をスクリーニングするための方法の提供を課題とする。

本発明者らは、シノビオリンと結合する蛋白質を同定するため、酵母ツーハイブリツド法を用いてスクリーニングを行った。シノビオリンをべィトとして用い、ヒト軟骨由来 cDNA ライブラリ一を酵母ッ一ハイブリッドシステム（クロンテツク社 MATCHMAKER ッ一ハイブリッドシステム）によってスクリーニングした。その結果、プロリン 4水酸化酵素 a;サブユニット（Prolyl 4- Hydroxyl ase subu ni t； P4HA1)を得た。次に、 GST プルダウン解析により、 P4HA1 とシノピオリンの結合を確認した。

更に本発明者らは、 P4HA1 がシノビォリンのュビキチンリガーゼ活性によって、ュビキチン化されることを明らかにした。すなわち P4HA1は、シノビオリンュビキチンリガーゼ (E3)の基質ポリぺプチドであることが確認された。シノピオリンは、 P4HA1のュビキチン化によって、プロテアソーム（proteasome) による P4HA 1 の分解を誘導する。プロリン 4水酸化酵素は、コラーゲン合成における重要な酵素（key enzyme) の一つである。したがって、シノビォリンが、プロリン 4水酸化酵素活性の制御を介して、個体の発達や骨 ·関節の発生および関節症の発症に関わる可能性が考えられた。

これらの知見に基づいて、本発明者らは、シノビォリンと P4HA1の相互作用に干渉する作用を評価するための方法を確立した。またその方法を利用して、当該作用を有する物質のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に記載の被験化合物のシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法に関する。あるいは本発明は、当該方法を利用してシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を有する化合物のスクリ —ニング方法に関する。

〔1〕以下の工程を含む、被験化合物のシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログである方法。

a)シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベ一卜する工程、

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のュビキチン化が可能な条件下で他方とィンキュベ一卜する工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベート後に被験化合物と接触させる工程、 b)前記 a)、 Ά ) , および a' ' )のいずれかの工程の後に、基質のュビキチン化のレベルを測定する工程、および

c)基質のュビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたュビキチン化のレベルと違うときに、被験化合物のシノピオリンによる基質のュビキチン化作用を調節する活性が検出される工程

〔2〕以下の成分の共存により、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 1に記載の方法。

i)ュビキチン活性化酵素 i i)ュビキチン転移酵素、

i i i)ュビキチン、および

iv)アデノシン 3リン酸

〔3〕シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をュビキチン化することによって、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 1に記載の方法。

〔4〕基質のュビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項 1に記載の方法。

A)ュビキチン化された基質のレベル

B)ュビキチン化されなかった基質のレベル、および

C)プロリン 4水酸化酵素 αサブュニッ卜の生物学的活性のレベル

〔 5〕プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモ口グが以下の（ a ) 一 ( e ) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 1に記載の方法。

( a ) 配列番号： 1に記載された塩基配列によってコードされるポリべプチド、

( b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、

( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、シノビォリンによってュビキチン化することができるポリぺプチド、

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによつてュビキチン化することができるポリペプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリペプチド

〔6〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Α) ― (Ε) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 1に記載の方法。

(Α) 配列番号： 3に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、 (Β) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、

( C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、および Ζまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドをュビキチン化する活性を有するポリぺプチド、および

( Ε) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド

〔7〕以下の工程を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法。

a ) 請求項 1〜請求項 6のいずれか一項に記載の方法によって、被験化合物のシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および

b ) 対照と比較して、基質のュビキチン化のレベルに差がある被験化合物を選択する工程

〔 8〕請求項 7に記載の方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、シノビオリンによる基質のュビキチン化の調節剤。

〔9〕以下の要素を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキッ卜。

(1)シノビオリンまたはそのホモログ、および

(2)プロリン 4水酸化酵素 αサブュニッ卜またはそのホモログ

〔1 0〕更に以下の要素を含む、請求項 9に記載のキット。

(3)ュビキチン活性化酵素

(4)ュビキチン転移酵素、

(5)ュピキチン、および

(6)アデノシン 3リン酸

〔 1 1〕シノピオリンまたはそのホモログ、およびプロリン 4水酸化酵素 αサブユニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン 4水酸化酵素ひサブュニットまたはそのホモログのュビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、シノピオリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキッ卜。

〔 1 2〕以下の工程を含む、被験化合物のシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素サブュニットまたはそのホモログである方法。

. a)被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベートする工程、

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノピオリンと基質との結合が可能な条件下でィンキュペートする工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベ一トした後に被験化合物を接触させる工程、

b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および c)シノピオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のュビキチン化作用を調節する活性が検出される工程

〔1 3〕シノビォリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項 1 2に記載の方法。

〔1 4〕プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログが以下の ( a) ― ( e ) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 1 2に記載の方法。

( a) 配列番号： 1に記載された塩基配列によってコードされるポリべプチド、

(b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、

( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノビォリンと結合することができるポリべプチド、、

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコ —ドされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビォリンと結合することができるポリぺプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビォリンと結合することができるポリペプチド

〔1 5〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（A) ― (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 1 2に記載の方法。

(A) 配列番号： 3に記載の塩基配列によってコードされるポリべプチ (B) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、

( C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリぺプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下で八イブリダィズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリぺプチド、および

(E) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリぺプチド

〔1 6〕以下の工程を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法。

a ) 請求項 1 2〜請求項 1 5のいずれか一項に記載の方法によって、被験化合物のシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および

b ) 対照と比較して、シノビォリンと基質の結合のレベルに差がある被験化合物を選択する工程

〔1 7〕請求項 1 6に記載の方法によって得るこ-とができる化合物を有効成分として含有する、シノビォリンによる基質のュビキチン化の調節剤。

また、本発明者らは、線維症の治療または予防に有用な化合物のスクリ一ニングが可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に記載のスクリーニング方法、そのためのキット、そしてこの方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する線維症の治療および Zまたは予防のための医薬組成物に関する。

〔1 8〕以下の工程を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 (¾サブユニットまたはそのホモログである方法。

a)シノピオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベ一トする工程、 a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のュビキチン化が可能な条件下で他方とインキュべ一卜する工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベート後に被験化合物と接触させる工程、 b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、基質のュビキチン化のレベルを測定する工程、および

c)基質のュビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたュビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程

〔1 9〕以下の成分の共存により、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 1 8に記載の方法。

i)ュビキチン活性化酵素

i i)ュビキチン転移酵素、

i i i)ュビキチン、および '

iv)アデノシン 3リン酸

〔2 0〕シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をュビキチン化することによって、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 1 8に記載の方法。

〔2 1〕基質のュビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項 1 8に記載の方法。

A)ュビキチン化された基質のレベル B)ュビキチン化されなかった基質のレベル、および

C)プロリン 4水酸化酵素 αサブュニッ卜の生物学的活性のレベル〔22〕プロリン 4水酸化酵素 a;サブュニットまたはそのホモログが以下の (a) - (e) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 18に記載の方法。

(a) 配列番号： 1に記載された塩基配列によってコードされるポリべプチド、

(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およびノまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリペプチド、

(d) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコ —ドされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリペプチド、および

(e) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビォリンによってュピキチン化することができるポリペプチド

〔23〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（A) — (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 18に記載の方法。

(A) 配列番号： 3に記載の塩基配列によってコードされるポリべプチド、

(B) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、

(C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドをュビキチン化する活性を有するポリぺプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる MA とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドをュビキチン化する活性を有するポリぺプチド、および

(E) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドをュビキチン化する活性を有するポリぺプチド

〔2'4〕請求項 1 8〜請求項 2 3のいずれか一項に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、線維症の治療および Zまたは予防のための医薬組成物。

〔2 5 ) 以下の要素を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリ一ニングのためのキット。

(1)シノビオリンまたはそのホモログ、および

(2)プロリン 4水酸化酵素ひサブユニットまたはそのホモログ

〔2 6 ) 更に以下の要素を含む、請求項 2 5に記載のキット。

(3) ュビキチン活性化酵素、

(4) ュビキチン転移酵素、

(5) ュビキチン、および

(6) アデノシン 3リン酸

〔2 7〕シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン 4水酸化酵素ひサブュニットまたはそのホモログのュビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、線維症を治療または予防するための被験化合物のスクリ一ニングのためのキット。

〔2 8〕以下の工程を含む、線維症を治療または予防するための化合物のスクリ —ニング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素サブュニットまたはそのホモログである方法。

a)被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベートする工程、

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でィンキュペートする工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと ¾質との結合が可能な条件下でィンキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、

b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および c)シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程〔2 9〕シノビォリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項 2 8に記載の方法。

〔3 0 3 プロリン 4水酸化酵素 αサブュニッ卜またはそのホモログが以下の ( a ) ― ( e ) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 2 8に記載の方法。

( b ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、 ( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、シノピオリンと結合することができるポリべプチド、、

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビォリンと結合することができるポリペプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、シノビォリンと結合することができるポリぺプチド

〔3 1〕シノピオリンまたはそのホモログが、以下の（A) — (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 2 8に記載の方法。

(A) 配列番号： 3に記載の塩基配列によってコードされるポリべプチド、、

( C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリぺプチド、

〔3 2 ] 請求項 2 8〜請求項 3 1に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、線維症の治療および/または予防のための医薬組成物。

また、本発明者らは、関節リウマチの治療または予防に有用な化合物のスクリ一二ングが可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に記載のスクリーニング方法、そのためのキット、そしてこの方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する慢性関節リゥマチの治療および _ または予防のための医薬組成物に関する。

〔3 3〕以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリ一ニング方法であつて、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログである方法。

a)シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベー卜する工程、 a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のュビキチン化が可能な条件下で他方とィンキュペートする工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベート後に被験ィ匕合物と接触させる工程、 b)前記 a)、 a' ) , および a' ' )のいずれかの工程の後に、基質のュビキチン化のレベルを測定する工程、および

c)基質のュビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたュビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程

〔3 4〕以下の成分の共存により、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 3 3に記載の方法。

i)ュビキチン活 '性化酵素

i i)ュビキチン転移酵素、

i i i)ュビキチン、および iv)アデノシン 3リン酸

〔3 5〕シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をュビキチン化することによって、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 3 3に記載の方法。

〔3 6〕基質のュビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項 3 3に記載の方法。

A)ュビキチン化された基質のレベル

B)ュビキチン化されなかった基質のレベル、および

C)プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットの生物学的活性のレベル〔3 7〕プロリン 4水酸化酵素サブユニットまたはそのホモログが以下の ( a ) 一 ( e ) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 3 3に記載の方法。

( b ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、

( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、およびノまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによつてュビキチン化することができるポリペプチド、

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコ —ドされるァミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリペプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってュビキチン化するこ 8 - とができるポリペプチド'

〔3 8〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（A) (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 3 3に記載の方法。

( C ) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、およびノまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドをュビキチン化する活性を有するポリぺプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリべプチド、および

(E) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からな

〔3 9〕請求項 3 3〜請求項 3 8のいずれか一項に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの治療および Zまたは予防のための医薬組成物。

〔4 0〕以下の要素を含む関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリ一ニングのためのキッ卜。

(1)シノビオリンまたはそのホモログ、および

(2)プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログ

〔4 1〕更に以下の要素を含む、請求項 3 9に記載のキット。

(3)ュビキチン活性化酵素、 (4)ュビキチン転移酵素、

(5)ュビキチン、および

(6)アデノシン 3リン酸

〔4 2〕シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン 4水酸化酵素 αサブユニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン 4水酸化酵素 α サブュニッ卜またはそのホモ口グのュビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、関節リウマチを治療または予防するための被験化合物のスクリーニングのためのキッ卜。

〔4 3〕以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリ一ニング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログである方法。

a' )シノピオリン若しくはそのホモ口グ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノピオリンと基質との結合が可能な条件下でィンキュべ一卜する工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、

b)前記 a)、 a' ) , および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および c)シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程

〔4 4〕シノビォリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項 4 3に記載の方法。

〔4 5〕プロリン 4水酸化酵素ひサブュニットまたはそのホモログが以下の (a) — (e) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 43に記載の方法。

(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリぺプチド、

(d) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコ —ドされるァミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビォリンと結合することができるポリペプチド、および

(e) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 70¾以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、シノピオリンと結合することができるポリぺプチド

〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（A) ― (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 43に記載の方法。

(C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリペプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA とストリンジエンドな条件下でハイプリダイズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリぺプチド、および

〔4 7〕請求項 4 3 〜 4 6に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの治療およびまたは予防のための医薬組成物。

また、本発明者らは、本願発明の方法を用いて被験化合物のスクリーニングを行い、配列番号： 5に示されるポリペプチドを単離した。すなわち本発明は、以下に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および該ポリぺプチドを有効成分として含有する医薬組成物に関する。

〔4 8〕配列番号： 5に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。

〔4 9〕配列番号： 5に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およびノまたは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、請求項 1に記載の方法において該ポリ,ペプチドを被験化合物として用いたときに、基質のュビキチン化のレベルが該ポリぺプチド不存在下において測定されたュビキチン化のレベル結合のレベルよりも低い、ポリペプチド。

〔5 0〕配列番号： 5に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、請求項 1 2に記載の方法において該ポリペプチドを被験化合物として用いたときに、シノピオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが該ポリペプチド不存在下において測定された結合のレベルよりも低い、ポリペプチド。

〔5 1〕請求項 4 8 〜 5 0のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリスクレ才チド。

〔5 2〕請求項 4 8〜5 0のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、線維症の治療および Zまたは予防のための医薬組成物。

〔5 3〕請求項 4 8〜5 0のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療および Zまたは予防のための医薬組成物。

本発明は、プロリン 4水酸化酵素の活性が、シノビォリンによるプロリン水酸化酵素 αサブュニットのュビキチン化によって制御されているという新規な知見に基いている。すなわち本発明は、以下の工程を含む、被験化合物のシノビオリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質が P4HA1 またはそのホモログである方法を提供する。 .

a)シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベートする工程、

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のュビキチン化が可能な条件下で他方とインキュべ一トする工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベート後に被験化合物と接触させる工程、

b)前記 a)、 a' ) > および a' ' )のいずれかの工程の後に、基質のュビキチン化のレベルを測定する工程、および - c)基質のュビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたュビキチン化のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のュビキチン化作用を調節する活性が検出される工程

ュビキチン化とは、少なくとも 1つのュビキチンが結合されることを言う。またュビキチン化のレベルとは、結合したュビキチンの数、並びにュビキチンが結合した場所の数のいずれか、または両方を言う。すなわち、あるポリペプチドの特定の部分に結合したュビキチンの数を測定することによって、ュビキチン化のレベルを評価することができる。更に、あるポリペプチドの複数の領域がュビキチン化される場合には、ュビキチン化された領域の数を測定することによって、ュピキチン化のレベルを評価することもできる。

ュビキチン化のレベルを測定する方法は公知である。たとえば、ュピキチンに結合する親和性物質を利用して、ュビキチン化のレベルを測定することができる。親和性物質として、抗ュビキチン抗体を利用することができる。たとえばュビキチンを特異的に認識して結合するモノクローナル抗体が市販されている。ュビキチンに対する親和性物質を標識しておけば、基質に結合した標識物質のレベルに基いて、ュビキチン化のレベルを明らかにすることができる。あるいは予め標識したュビキチンを与え、基質ポリペプチドに結合したュビキチンの量を標識物質のレベルに基いて測定することもできる。

抗体やュビキチンの標識には、一般に用いられる標識技術を応用することができる。具体的には、放射活性物質、酵素活性物質、蛍光活性物質、あるいは発光物質などを標識として利用することができる。また、標識物質を間接的に抗体やュビキチンに結合させるために、結合性のタグを利用することもできる。たとえば、ピオチン化した抗体やュビキチンには、アビジン化した標識物質を結合することができる。更に、結合性のタグを導入したュビキチンを利用し、ュビキチン化された基質を捕捉することもできる。捕捉された基質ポリペプチドのレベルを測定することによって、ュビキチン化のレベルを評価することができる。この方法においては、基質ポリペプチドに対する標識抗体を利用して、ュビキチン化のレベルが測定される。ュビキチン化のレベルの測定を目的として、以下のような標識ュビキチンが市販されている。

フルォレセイン結合ュビキチン：蛍光物質であるフルォレセインを結合したュビキチン。蛍光強度を指標としてュビキチン化のレベルを測定することができる。ピオチン化ュビキチン：結合性リガンドであるピオチンで標識されたュビキチン。ピオチン化ュビキチンでュビキチン化された基質ポリペプチドは、アビジンカラムに捕捉することができる。あるいはアビジン化された酵素や蛍光物質などを利用して、ュビキチン化のレベルを測定することもできる。

(Hi s) 6-ュビキチン：ヒスチジンタグで標識したュビキチン。ヒスチジンタグは二ッケルカラムに捕捉することができる。つまり、ュビキチン化された基質をュビキチンを介してカラムに捕捉することができる。あるいは、抗ヒスチジン夕グ抗体を利用して間接的に標識することもできる。

ュビキチン化のレベルの測定に当たっては、基質を固相化するのが有利である。たとえば、予め基質を固相に結合させておくことができる。具体的には、ビ一ズや反応容器の内壁に、化学的に基質を共有結合させる、あるいは物理吸着させることができる。ビーズや反応容器には、ポリスチレンなどが利用できる。基質の化学的な結合のために、アミノ基ゃカルボキシル基などの官能基を導入したポリスチレン誘導体も公知である。

あるいは、先に述べた結合親和性物質で標識したュビキチンを用いて、ュビキチン化された基質を、ュピキチンを介して間接的に捕捉することもできる。逆に、基質に対する抗体や、結合性親和性物質を導入した基質を、固相に捕捉することもできる。いずれにせよ、固相化された基質は、固相に結合しなかった成分と分離され、続いてュビキチン化のレベルが測定される。ュビキチンや基質自身が標 - 識されていない場合には、ュピキチンや基質に対する親和性物質を利用して標識物質を結合させる。たとえばュビキチンに対する抗体が利用される。最終的に、固相上に捕捉された標識（または結合されなかった標識）のレベルを測定して、ュビキチン化のレベルを決定することができる。このようなュビキチン化のレべルの測定の結果、最終的に、ュビキチン化された基質の量を明らかにすることができる。あるいは、ュビキチン化のレベルの測定によって、ュビキチン化されなかった基質の量を明らかにすることもできる。

加えて、 P4HA1 のュビキチン化によって、プロリン 4水酸化酵素の生物学的活性が制御されていることが本発明によって明らかにされた。したがって、プロリン 4水酸化酵素の生物学的活性のレベルを指標として、ュビキチン化のレベルを測定することもできる。プロリン 4水酸化酵素の生物学的活性のレベルは、たとえばトリチウム放出アツセィ（Tr i t ium rel ease assay ; Methods Enzymol . Vo l . 8 2, pp. 246-259, 1982)などの方法によって測定することができる。

シノビオリン（またはそのホモログ)、基質、および被験物質を接触させる順序は任意である。すなわち本発明は、前記工程 a)、 a' )、および a' ' )に記載したいずれかの順序でシノピオリン（またはそのホモログ）、基質、および被験物質を接触させる工程を含むことができる。被験物質の存在下で三者をィンキュベ一トする場合（a)には、シノビオリン（またはそのホモログ）によるュピキチン化反応に与える被験物質の影響を評価することができる。あるいは、シノビオリン (またはそのホモログ）および基質のいずれかに被験物質を接触後にュビキチン化が可能な条件を与えることもできる（a' )。この場合には、シノビォリンのュビキチンリガ一ゼ活性に与える影響、または基質のュビキチン化される機能のいずれかに対する被験物質の影響が評価される。更に、ュビキチン化が可能な条件を与えた後に被験物質を接触させる（a' ' )ことによって、ュビキチン化された基質に対する被験物質の影響を評価することができる。

本発明においては、 Ρ4ΗΑΓまたはそのホモログが基質として利用される。 P4HA 1 は、 4量体構造のプロリン 4水酸化酵素を構成するサブユニットの 1つである。 αサブュニットは、プロリンの水酸化反応を触媒する作用を有していると考えられている。一方そのホモログとは、 P4HA1 との構造的な類似性を有し、かつシノピオリンによってュビキチン化することができるポリペプチドである。本発明における P4HA1またはそのホモログとして、たとえば以下の（a ) - ( e ) に示すポリペプチドを用いることができる。

( a ) 配列番号： 1に記載された塩基配列によってコ一ドされるポリペプチド、 ( b ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、

( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリぺプチド、

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビォリンによってュビキチン化することができるポリペプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、シノビォリンによってュビキチン化することができるポリぺプチド

配列番号： 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して変異を含む塩基配列で構成されるポリヌクレオチドは、当業者によつて公知の方法で単離することができる（実験医学別冊 ·遺伝子工学ハンドブック， PP246- 251、羊土社、 1991 年発行）。たとえば類似する遺伝子を含むライブラリーを対象に、配列番号： 1に示す塩基配列（またはその断片）をプローブとしてスクリーニングすれば、相同性の高い塩基配列を持った DNAをクロ一ニングすることができる。このようなライブラリ一としては、配列番号： 1の塩基配列に対してランダムに変異を入れたもの、ヒト以外の種に由来する cDNA ライブラリ一等を示すことができる。

与えられた塩基配列に対してランダムに変異を加える方法としては、たとえば DNAの亜硝酸処理による塩基対の置換が知られている（Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA. , 79 : 7258-7260, 1982)。この方法では、変異を導入したいセグメントを亜硝酸処理することにより、特定のセグメント内にランダムに塩基対の置換を導入することができる。あるいはまた、目的とする変異を任意の場所にもたらす技術としてはギャップドデュプレックス法（gapped dupl ex 法）等がある（Method s Enzymo l . , 154 : 350-367, 1987)。変異を導入すべき遺伝子をクローニングした環状 2本鎖のベクターを 1本鎖とし、目的とする部位に変異を持つ合成ォリゴヌクレオチドをハイブリダィズさせる。制限酵素により切断して線状化させたべク夕一由来の相補 1本鎖 DNAを、前記環状 1本鎖べクタ一にァニールさせ、前記合成ヌクレオチドとの間のギヤップを DNAポリメラーゼで充填し、更にライゲ一シヨンすることにより完全な 2本鎖環状べクターとする。

改変されるアミノ酸の数は、典型的には 50 アミノ酸以内であり、好ましくは 30 アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5 アミノ酸以内（例えば、 1 ァミノ酸）であり、数個のアミノ酸である。アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとのタンパク質の活性が維持されやすいと考えられる。本発明のタンパク質には、上記アミノ酸置換において保存的置換が加えられたポリペプチドであって、 P4HA1 (配列番号： 2 ) と機能的に同等なポリぺプチドが含まれる。保存的置換は、タンパク質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにおいて重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。

保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸 (例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン）、非極性アミノ酸 (例えばァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエ二ルァラニン、メチォニン、トリブトファン）、 ]3分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フエ二ルァラニン、トリブトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。

また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇（例えば恒常的活性化型タンパク質などを含む）または下降（例えばドミナントネガティブなどを含む）させることも考えられる。

配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと機能的に同等なポリぺプチドは、人為的に合成された、または天然に存在するポリペプチドを含む。ここで「複数のアミノ酸」とは、典型的には 50アミノ酸以内であり、好ましくは 30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 1アミノ酸）であり、数個のアミノ酸である。一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象（po lymorphi sm) を有する。この多型現象によつて生じた塩基配列の変化によって、 1または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、およびまたは付加される場合がある。このように自然に存在するポリべプチドであって、かつ配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等なポリぺプチドは、本発明に利用することができる。

あるいは多型現象によつて塩基配列に変化はあっても、ァミノ酸配列が変わらない場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サィレント変異を有する塩基配列からなる遺伝子も、本発明に利用することができる。なおここで言う多型現象とは、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有することを言う。多型現象は、異なる遺伝子が見出される割合とは無関係である。

この他、： P4HA1 またはそのホモログであるタンパク質を得る方法として、ハイブリダィゼ一シヨンを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号： 1に示すような P4HA1をコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片をプローブとし、これとハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドを単離するのである。八イブリダィゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離されるタンパク質には P4HA1またはそのホモログであるタンパク質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば 70%以上、望ましくは 90%以上の同一性を示すことができる。

なおストリンジェントな条件とは、具体的には例えば 6 X SS 40%ホルムアミド、 25 でのハイブリダィゼーシヨンと、 1 X SSC、 55ででの洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシ一は、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジエンシーを得られるように設定することは自明である。

ハイブリダィゼ一ションを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種における P4HA1のホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちマウス、ラット、ゥサギ、ブタ、あるいはャギ等の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコードする P4HA1のホモログは、本発明における機能的に同等な夕ンパク質を構成する。

本発明によるポリヌクレオチドは、その由来を問わない。すなわち、 cDNA、ゲノム DNAのほか、合成によって得ることもできる。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレォチドが含まれる。

ヒト P4HA1 (配列番号： 2 ) に変異を導入して得たタンパク質や、上記のようなハイプリダイゼ一ション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコ一ドするタンパク質は、通常、ヒト P4HA1 (配列番号： 2 ) とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なぐとも 30 %以上、好ましくは 5 0%以上、さらに好ましくは 80 %以上（例えば、 95 %以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インタ一ネットを利用したホモロジ一検索サイトを利用して行うことができる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ) において、 FASTA、 BLAST, PSト BLAST、および SSEARCH等の相同性検索が利用できる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ) のウェブサイトの相同性検索（Sear ch and Analys i s) のぺ——ジ； t tp ://www. ddbj . nig. ac. j /E-mai l/homo l ogy-j . html]。また、 Nat i onal Center for Bi otechnology Informat ion (NCBI) において、 BLAST を用いた検索を行うことができる（例えば NCBI のホームページのゥエブサイトの BLASTのページ； http：〃 ww. ncbi.nlni.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al.， J. Mol. Biol., 1990, 215(3) :403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic A cids Res., 1997, 25:3389-3402)]

本発明においては、シノピオリンまたはそのホモログがュビキチンリガーゼ (E 3)として利用される。シノビオリンは、 RING finger モチーフを有するポリぺプチドである。そのアミノ酸配列（配列番号： 4) と、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号： 3) は明らかにされている。一方そのホモログとは、シノビオリンとの構造的な類似性を有し、かつ P4HA1をュビキチン化することができるポリペプチドである。本発明におけるシノビオリンまたはそのホモログとして、たとえば以下の（A) — (E) に示すポリペプチドを用いることができる。

(A) 配列番号： 3に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、

(C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およびまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド、および

(E) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド

既知のアミノ酸配列情報、および塩基配列情報に基いて、機能的に同等なポリペプチドを得るための方法は、既に述べた。また、ホモログとして望ましい構造的な条件も先に述べたとおりである。このようにして得ることができるホモログは、シノビォリンと同様に本発明に用いることができる。たとえば W0 02/05200 7 には、各種のシノビオリンホモログが開示されている。これらのホモログは、 P4HA1 をュビキチン化する作用を有する限り、本発明の方法に用いることができる。

配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2 に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等なポリぺプチドは、人為的に合成された、または天然に存在するポリペプチドを含む。ここで「複数のアミノ酸」とは、典型的には 50アミノ酸以内であり、好ましくは 30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 1アミノ酸）であり、数個のアミノ酸である。一般に真核生物の遺伝子は、インタ一フエロン遺伝子等で知られているように、多型現象 (po lymon)hi sni)を有する。この多型現象によつて生じた塩基配列の変化によって、 1または複数のアミノ酸が、置換、欠失、揷入、および Zまたは付加される場合がある。このように自然に存在する蛋白質であって、かつ配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のァミノ酸が、置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、本発明に利用することができる。

あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらない場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サィレント変異を有する塩基配列からなる遺伝子も、本発明に含まれる。なおここで言う多型現象とは、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有することを言う。多型現象は、異なる遺伝子が見出される割合とは無関係である。

この他、シノビオリンまたはそのホモログであるタンパク質を得る方法として、ハイブリダィゼーシヨンを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号： 3に示すような本発明によるシノビオリンをコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドを単離するのである。ハイブリダイゼーシヨンをストリンジエンドな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離されるタンパク質にはシノビオリンまたはそのホモ口グであるタンパク質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば 70%以上、望ましくは 90%以上の同一性を示すことができる。

なおストリンジェン卜な条件とは、具体的には例えば 6 X SSC、 40%ホルムアミド、 25^：でのハイブリダィゼ一シヨンと、 1 X SSC、 55°Cでの洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジエンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジエンシーを得られるように設定することは自明である。

ハイブリダイゼーシヨンを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種におけるシノビォリンのホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちマウス、ラット、ゥサギ、ブタ、あるいはャギ等の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコードするシノビオリンのホモログは、本発明における機能的に同等なタンパク質を構成する。

本発明によるポリヌクレオチドは、その由来を周わない。すなわち、 cDNA、ゲノム DNAのほか、合成によって得ることもできる。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレォチドが含まれる。

ヒトシノピオリン（配列番号： 4 ) に変異を導入して得たタンパク質や、上記のようなハイブリダイゼ一ション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、通常、ヒトシノビォリン（配列番号： 4 ) とァミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも 30%以上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上（例えば、 95%以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジ一検索サイトを利用して行うことができる [例えば日本 MAデータバンク (DDBJ) において、 FASTA、 BLAST, PSト BLAST、および SSEARCH等の相同性検索が利用できる [例えば日本 MAデータバンク（DDBJ) のウェブサイトの相同性検索 (Search and Analysis) のページ； http:// ww. ddbj.nig. ac. jp/E-mail /homo logy - j.html」。また、 National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、 BLASTを用いた検索を行うことができる（例えば NCBIのホ一ムページのウェブサイトの BLASTのページ； http：〃 www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAS T/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3) :403-10; Altschul, S.F. S Gish, W.， Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et a l.， ucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402)]

実際に本発明者らは、 W0 02/052007 において、シノビオリンを構成するアミノ酸配列に対して、 1アミノ酸を欠失したクローンを明らかにした。このようなアミノ酸配列に変異を含む蛋白質は、本発明に必要な機能を有する限り、本発明におけるシノビオリンのホモログに含まれる。本発明者らが確認した 1アミノ酸を欠失した変異体は、配列番号： 3における 1293-1295に相当する gcaを欠損している。その結果、配列番号： 4における 412位の Alaを欠損している。

本発明において、ある蛋白質が P4HA1をュビキチン化する作用を有することは、先に述べたュビキチン化が可能な条件において当該蛋白質と基質を接触させて、基質のュビキチン化を検出することによって確認することができる。

次に本発明において、基質またはそのホモログのュビキチン化が可能な条件下とは、シノビォリンによる P4HA1のュビキチン化が可能な条件をいう。このような条件は、インビトロで、あるいはインビボで構成することができる。たとえば以下の成分の共存により、基質のュビキチン化が可能な条件が与えられる。

(0 ュビキチン活性化酵素 (El)、 (i i) ュビキチン転移酵素 (E2)、

(i i i) ュビキチン、および

(iv) アデノシン 3リン酸

一般に、生体内において、蛋白質のュビキチン化は、以下のようにして進行すると考えられている。まず蛋白質のュビキチン化には上記 4つの成分に加えて、ュピキチン連結酵素（リガーゼ/ E3) が必要である。ュビキチン活性化酵素 (El)、ュビキチン転移酵素 (E2)、およびュビキチン連結酵素（リガ一ゼ /E3) は、ュビキチンシステムと呼ばれる複合酵素系を構成している。場合により、 E2 によつて基質がュビキチン化される場合もあるが、 P4HA1 は、シノビオリン（E3)によつてュビキチン化される。

ュビキチン活性ィヒ酵素 (E1)は、ュビキチン転移酵素 (E2)を活性化する。一方、ュビキチン連結酵素（リガーゼ/ E3) は、基質蛋白質を認識して捕捉する。そして、活性化されたュビキチン転移酵素 (E2)のュビキチンを用いて、捕捉した基質蛋白質をュビキチン化する。ュビキチンシステムにおいて、ュビキチン連結酵素 (リガ一ゼ /E3) は、基質となる蛋白質を識別する重要な役割を有している。すなわち、ュビキチン連結酵素（リガーゼ/ E3) による基質の選択は、基質蛋白質の運命の終わりを意味している。

ュビキチンシステムにおいて、基質を識別するュビキチン連結酵素（リガーゼ /E3) と基質の組み合わせは重要である。したがって、本発明における基質は、 P 4HA1 またはそのホモログが用いられなければならない。他方、ュビキチン連結酵素（リガ一ゼ /E3) は、シノピオリンまたはそのホモログである必要がある。しかしその他の酵素は、基質のュビキチン化が可能な任意の酵素とすることがでさる。

たとえば実施例においては、ュビキチン活性化酵素 (E1)には、酵母由来の酵素が用いられた。またュビキチン転移酵素（E2)には、ヒト由来の UbcH5c が用いられた。しかし本発明におけるュビキチン活性化酵素 (E1)は、酵母由来の酵素に限定されない。たとえば、ラット由来のュビキチン活性化酵素 (El)を本発明に利用することができる。同様にュビキチン転移酵素 (E2)も、ヒト由来の酵素に限定されない。 E1あるいは E2は、天然の酵素であっても遺伝子組み換え体であっても良い。遺伝子組み換え体は、 E1や E2がその活性を維持している限り、構造の改変が許容される。構造の改変には、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、あるいは付加が含まれる。たとえば以下に述べる実施例においては、ヒト由来の UbcH5c を GST融合蛋白質として大腸菌で発現させた E2を用いている。このような遺伝子組み換え体は、本発明における E2に含まれる。

上記成分（i) - (iv)を用いて、基質のシノビオリンによるュビキチン化が可能な条件を与えるとき、当業者は、ュビキチン化に必要なその他の条件をデザインすることができる。具体的には、インキュベーションのための条件や、各成分の使用量を、当業者は決定することができる。これらの条件を例示すれば、各成分はたとえば、以下のような濃度で利用される。

シノピオリン（E3) ： 5 0 O ng

GST-P4HA1： 8 0 O ng

(i) ュビキチン活性化酵素 (El) ： 6 O ng

(i i) ュビキチン転移酵素 (E2)： 0 . 3 mg

(i i i) ュビキチン (³²P-標識 His-ュビキチン）： 0 . 7 5 g

上記組成を以下の反応緩衝液に加えて反応液量を 3 0 L とする。この混合液を 3 7 °Cで 1時間インキュベートすることによって、基質のュビキチン化が可能な条件とすることができる。各成分の濃度は、必用に応じて適宜調節することができる。たとえば上記の使用量の 1 Z 1 0から 1 0倍の間で、調節することができる。

反応緩衝液の組成

5 O mM Tris- HC1緩衝液 pH 7 . 4

5 mM MgCl₂ 2 fflM NaF

1 O nMオカダ酸

2mM ATP (iv)

0 . 6 mM ジチオスレィトール (DTT)

あるいは、本発明におけるュビキチン化が可能な条件は、インビポにおいて構成することもできる。すなわち、シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をュビキチン化することによって、基質のュビキチン化が可能な条件を与えることができる。シノビォリンと基質とを発現する細胞としては、たとえば滑膜細胞を用いることができる。

あるいは、シノビオリン（またはそのホモログ）と基質とを遺伝子工学的に強制発現させた細胞によって、基質のュビキチン化が可能な条件を与えることもできる。外来遺伝子としてシノビオリン（またはそのホモログ）あるいは基質をコ一ドする遺伝子を導入した細胞においては、誘導発現が可能な発現システムを利用することによって、シノビオリンゃ基質の発現時期を調節することができる。生きている細胞は、ュビキチンシステムを持っている。すなわち上記成分（i) - (iv)を細胞内に備えている。したがって、シノビォリンと基質とを存在させれば、本発明におけるュビキチン化が可能な条件を構築することができる。

シノピオリンとその基質である P.4HA1をコードする塩基配列は公知である。当業者は、公知の遺伝情報に基いて、その発現系を-デザインすることができる。強制発現させるための宿主細胞には、動物細胞、昆虫細胞、あるいは酵母などを利用することができる。

細胞内でュビキチン化された基質は、細胞を破壊して回収することができる。更に、ュビキチンや基質に対する親和性物質を利用して、目的の基質を単離することができる。なお細胞内には、目的としている基質以外にもュビキチン化された蛋白質が多く存在する。したがって、細胞内で基質をュビキチン化した場合には、目的とする基質蛋白質のュビキチン化を特異的に測定することが望ましい。そのためには、たとえば、基質蛋白質に対する抗体を使って基質蛋白質を特異的に捕捉する方法を利用することができる。あるいは基質蛋白質を、ヒスチジンタグなどのタグペプチドとの融合蛋白質として発現させ、タグをマーカーとして基質蛋白質を単離することもできる。こうして細胞から回収された基質蛋白質は、先に述べたような方法によってそのュビキチン化のレベルが測定される。

たとえば、タグ付きのュビキチン、並びにシノビオリン（またはそのホモ口グ）および P4HA1 (またはそのホモログ）の両方あるいはいずれかを共形質転換した細胞をュビキチン化が可能な条件として利用することができる。ュビキチン化のレベルは、タグに対する抗体を使った免疫沈降の後に、沈降分画の P4HA1 のレベルを測定することによって、決定することができる。沈降分画の P4HA1のレベルは、 P4HA1 に対する抗体を利用して免疫学的に測定することができる。あるいは、免疫沈降の後に、沈降しなかった P4HA1のレベルを測定することによつて、ュビキチン化されなかった基質を測定することもできる。

更に、タグ付きのュビキチンおよびシノビオリン（またはそのホモログ）を、 P4HA1 を発現している細胞に共形質転換することによって、ュビキチン化が可能な条件を構築することができる。抗 P4HA1抗体で免疫沈降した後に、タグに対する抗体またはュビキチンに対する抗体を用いて、ュビキチン化のレベルを測定することができる。 P4HA1 を発現している細胞としては、たとえば滑膜細胞などを利用することができる。

また本発明は、以下の工程を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法に関する。

a ) 本発明によるシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法によって、被験化合物のシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および

b ) 対照と比較して、基質のュビキチン化のレベルに差がある被験化合物を選択する工程本発明のスクリーニング方法について、より具体的な方法を以下に例示する。シノビォリンと P4HA1との相互作用に影響を与える物質の選択に当っては、最も一般的には、被験化合物の存在下で、酵素であるシノビオリンとその基質である P4HA1とを反応させ、その反応量を測定すればよい。この場合、対照として、被験化合物の非存在下でシノビオリンと P4HA1とを反応させた結果とを比較すればより客観的な選択が可能である。

シノピオリンは、 P4HA1 をュビキチン化する反応を触媒する。従って、反応量の測定のためには、前記反応をュビキチンの存在下で行い、ュビキチン化された P4HA1を測定すればよい。ュビキチン化された P4HA1の量、すなわち P4HA1に結合したュビキチンの量を測定する方法としては、ュビキチンに対して特異的に結合する物質、例えばュビキチンに対する抗体を使用する方法が挙げられる。ュビキチンに対する抗体は、定法に従って得ることができる。例えば、免疫原であるュビキチンを免疫動物に注射し、そしてその動物の血液から血清を採取すればよレ^ 免疫動物には、マウス、ラット、あるいはゥサギなどを用いることができる。また、抗体としてモノクローナル抗体を利用することもできる。モノクローナル抗体を得るための方法は公知である。

さらに、ュビキチンの測定のためには、ュビキチン自体を標識し、それを検出又は測定することもできる。このための標識としては、常用の種々の標識を用いることができる。具体的には、放射能標識、酵素標識、ピオチン等が標識としてあげられる。例えば、ュピキチンを ³²P により標識した場合には、ォ一トラジオグラフィ一により検出することができる。あるいは、シンチレ一シヨンカウンタ一で ³² P の放射活性を測定することもできる。また、ピオチンにより標識した場合には、標識したアビジンにより検出することができる。

具体的な方法としては、例えば次のような方法を例示することができる。

方法 1 .

まず夕グ付き P4HA1 を調製し、これと El、 E2、 ATP, シノビオリン、ュビキチン及び被験化合物をィンキュベ一トし、 P4HA1—ュビキチンの複合体を生成させる。次に P4HA1に付したタグに対する抗体を反応させ、免疫沈降によって、前記複合体と未反応のュビキチンとを分離する。更に前記複合体を形成したュビキチンを、ュビキチンに対する抗体により検出又は測定する。被験化合物を含まない反応系により、上記と同じ検出又は測定を行い、被験化合物の有無によるュビキチンの結合量を比較する。

方法 2 .

P4HAK El、 E2、 ATP、シノビオリン、 [³²P] 標識ュビキチン、及び被験化合物を一緒にインキュベートし、 P4HA1—ュビキチンの複合体を生成させる。次に電気泳動などにより、前記の複合体と未反応のュビキチンとを分離する。更に前記複合体を形成したュビキチンを、ォ一トラジオグラフィーにより検出又は測定する。被験化合物を含まない反応系により、上記と同じ検出又は測定を行い、被験化合物の有無によるュビキチンの結合量を比較する。

なお、上記の方法において、 ³²P に代えて、ピオチン標識したュピキチンを利用することもできる。この場合、標識アビジンでュビキチンが検出または測定される。標識には、ホースラディッシュペルォキシダ一ゼ、アルカリフォスファターゼ、蛍光等を利用することができる。

方法 3 .

シノピオリン、 El、 E2、 ATP, 液体シンチランを含むビーズに結合した P4HA1、 [³³P]または [³²P] 標識ュビキチン、及び被験化合物を反応させ、標識ュビキチンが P4HA1に結合したときに生じる励起光を液体シンチレ一シヨンカウンタ一により検出又は測定する。被験化合物を含まない反応系により、上記と同じ検出又は測定を行い、被験化合物の有無によるュビキチンの結合量を比較する。

方法 1〜3において、被験化合物がシノビォリンの活性、即ちシノビォリンと P4HA1 との相互作用を阻害する物質（アン夕ゴニスト）である場合、被験化合物の存在下でのュビキチンの結合量が被験化合物の非存在下でのそれに比べて少なくなる。被験化合物がシノビォリンと MHA1との相互作用を活性化する物質（ァゴニスト）である場合、結果は逆になる。したがって、上記の実験の結果により、被験化合物がァゴニスト（活性化物質）であるかアンタゴニスト（阻害物質）であるかを決定することができる。

本発明者らによって、シノビォリンが P4HA1に結合し、ュビキチン化することが明らかにされた。したがって、両者の結合に干渉する作用を検出することによつて、シノピオリンによる P4HA1のュビキチン化作用を調節する作用を評価することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む、被験化合物のシノビオリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質が P4HA1またはそのホモログである方法に関する。

a)被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベー卜する工程、

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でィンキュベートする工程、または

a' ' )シノピオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、

b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノピオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および

c)シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のュビキチン化作用を調節する活性が検出される工程

シノビオリン（またはそのホモログ）、基質、および被験物質を接触させる順序は任意である。すなわち本発明は、前記工程 a)、 a' ) , および a' ' )に記載したいずれかの順序でシノビオリン（またはそのホモログ）、基質、および被験物質を接触させる工程を含むことができる。被験物質の存在下で三者をインキュべ一トする場合（a)には、シノビオリン（またはそのホモログ）と基質の結合に与える影響を評価することができる。あるいは、シノビオリン（またはそのホモ口グ）および基質のいずれかに被験物質を接触後に両者の結合が可能な条件を与えることもできる（a'；)。この場合には、シノピオリン、または基質の結合能に対する被験物質の影響が評価される。更に、シノビォリンと基質の結合が可能な条件を与えた後に被験物質を接触させる（a' ' )ことによって、シノビオリンと基質の結合体に対する被験物質の影響を評価することができる。

上記方法において、シノビオリンまたはそのホモログと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有していることが望ましい。固相に結合可能な標識とは、たとえば結合性リガンドを示すことができる。結合性リガンドにはピオチンなどが含まれる。ピオチンは、アビジンセファロ一スなどの固相に捕捉することができる。固相への結合により、両者の結合生成物を容易に分離することができる。

一方、固相化しなかった他方の成分は、検出を容易にするために標識しておくことができる。シノビオリン、そのホモログ、あるいは基質は、蛋白質を標識するための公知の方法により標識することができる。具体的には、放射活性物質、酵素活性物質、蛍光活性物質、あるいは発光物質などを標識として利用することができる。また、標識物質を間接的に蛋白質に結合させるために、結合性のタグを利用することもできる。たとえば、ピオチン化した蛋白質には、アビジン化した標識物質を結合することができる。

本発明の方法において、 P4HA1 またはそのホモログは、シノビォリンとの結合活性を有する任意の蛋白質を用いることができる。具体的には、 P4HA1 またはそのホモログは、以下の（a ) - ( e ) のいずれかに記載のポリペプチドを含む。 ( a ) 配列番号： 1に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、 ( b ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、

( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およびまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノピオリンと結合することができるポリぺプチド、

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビォリンと結合することができるポリペプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、シノピオリンと結合することができるポリペプチドまた本発明の方法において、シノビオリンまたはそのホモログは、 P4HA1 との結合活性を有する任意の蛋白質を用いることができる。具体的には、シノビオリンまたはそのホモログは、以下の（A) — (E) のいずれかに記載のポリべプチドを含む。

( C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およびまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリべプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる MAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドと結合するポリペプチド、および

( E) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド

与えられたアミノ酸配列に対して、任意の変異を導入するための方法は既に述ベた。あるいは、人為的にまたは天然に存在する変異体をコードするポリヌクレォチドから、ハイプリダイゼ一シヨンや PCRによって、構造的に類似のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法も公知である。当業者は、このようにして得ることができる各種の変異体の中から、シノピオリンあるいは P 4HA1 との結合活性を有するポリペプチドを選択することができる。たとえば、ある蛋白質が固定化されたシノビォリンに捕捉されるとき、その蛋白質はシノビォリンとの結合活性を有すると判定される。また、ある蛋白質が固定化された P 4HA1 に捕捉されるとき、その蛋白質はシノビォリンとの結合活性を有すると判定される。

たとえば、 P4HA1 の cDNAを断片化した DNAを適当な発現べクタ一に組み込んで発現させることによって、 P4HA1 の断片蛋白質を得ることができる。断片蛋白質のライブラリーについて上記のようにしてシノビオリンとの結合活性を確認すれば、シノビォリンとの結合に必要な領域を決定することができる。このようにして決定された領域を含むシノビオリンの断片は、本発明の方法におけるシノビォリンのホモログとして利用することができる。更に当該領域を構成するァミノ酸配列を保存している他の種に由来する P4HA1のカウンターパートや、その断片配列からなるポリペプチドも、本発明の方法における P4HA1 のホモログとして利用することができる。

本発明の、被験化合物のシノビオリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法は、シノビォリンと基質との結合への千渉によって、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法に有用である。すなわち本発明は、以下の工程を含む、シノピオリンのュビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法に関する。

a ) 前記の被験化合物のシノビオリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法によって、被験化合物のシノビオリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および

b ) 対照と比較して、シノピオリンと基質の結合のレベルに差がある被験化合物を選択する工程

本発明によるシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法については既に述べたとおりである。当該方法によって、各種の被験化合物についてその活性を評価し、対照と比較することによって、目的の活性を有する被験化合物を選択することができる。本発明において対照としては、目的とする活性のレベルが予め確認されている任意の化合物を用いることができる。たとえば目的とする活性がないことが明らかな化合物は、陰性対照として利用できる。また、被験化合物を加えない場合のュビキチン化のレベルを陰性対照として比較しても良い。あるいは、一定の活性を有する物質を対照として用いれば、その活性レべルを超える物質をスクリーニングすることもできる。

本発明のスクリーエングに用いる被験化合物は特に制限されない。たとえば、無機化合物、有機化合物、ペプチド、蛋白質、天然または合成低分子化合物、天然または合成高分子化合物、組織または細胞抽出液、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分などを被験化合物とすることができる。遺伝子ライブラリーの発現産物または発現 cMA ライブラリーなどを被験化合物として用いることもできる。

本発明のスクリーニング方法によって、 P4HA1 に対するシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を有する化合物を選択することができる。そのような化合物には、関節リウマチまたは線維症の治療用薬剤が含まれる。本発明において、ュビキチン化作用を調節する活性とは、活性の刺激と抑制が含まれる。蛋白質のュビキチン化は、 ATP依存性プロテア一ゼによる当該蛋白質の選択的な分解を誘導する。生体内においては、異常な蛋白質や不要となった蛋白質の除去のためにュビキチン化が行われていると推定されている。したがって、 P4HA1 に対するシノビオリンのュビキチン化作用の調節によって、プロリン 4水酸化酵素の活性を調節することができる。

P4HA1 のュビキチン化が促進されれば、当該酵素の活性レベルが上昇する。たとえば、関節リウマチ患者の滑膜細胞においては、シノビォリンの発現が上昇している。その結果、 P4HA1 のュビキチン化が促進され、当該酵素の活性レベルが上昇する。 P4HA1 のュビキチン化によって、異常な分子が特異的に分解され、正常な蛋白質の割合が高まることが、そのメカニズムとして予測される。異常な蛋白質としては、たとえば次のような蛋白質を示すことができる。

一異常な修飾を受けた蛋白質

—蛋白質のフォールディングに異常を持つ蛋白質

逆に P4HA1のュビキチン化が阻害された場合には、異常な蛋白質の蓄積が進むため、プロリン 4水酸化酵素活性が低下する。異常な蛋白質は、それ自身の酵素活性が低下の原因となるばかりでなく、正常な蛋白質と他のサブユニットとの会合、あるいは酵素分子と基質との会合に対しても阻害的に働く。

シノビォリンによる、 P4HA1 のュビキチン化作用の調節作用を有する化合物は、シノビォリンによる基質のュビキチン化の調節剤として有用である。すなわち本発明は、本発明の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、シノビォリンによる基質のュビキチン化の調節剤を提供する。本発明のュビキチン化の調節剤は、プロリン 4水酸化酵素活性の異常に起因する疾患の治療ゃ予防に有用である。プロリン 4水酸化酵素は、コラーゲン代謝をつかさどる酵素である。したがって、コラーゲン合成の異常を伴う疾患を、シノビォリンによるュビキチン化の調節によって治療あるいは予防することができる。

実際に、本発明者らは、遺伝子工学的にシノビオリンを欠失させたマウスの細胞において、正常細胞と比べてプロリン 4水酸化酵素の活性（図 6 )、およびコラーゲンの産生量（図 5 ) が低下することを実験的に確認している。この細胞における P4HA1 の蛋白質量には、正常細胞との有意な差が見ら lなかった（図 4 )。つまり、シノビォリンによる P4HA1のュビキチン化が、プロリン 4水酸化酵素の活性上昇をもたらしていると考えられた。したがって、シノピオリンの作用を抑制すればコラ一ゲンの過剰な産生を抑制することができる。あるいはシノビオリンの作用を増強することによって、コラーゲン産生を刺激することができる。より具体的には、 P4HA1 のュビキチン化作用に対する影響を指標として見出されたシノビオリンの阻害剤は、線維細胞の蓄積が原因とされている疾患あるいは病態の治療や予防に有用である。たとえば、肺線維症、あるいは肝線維症などの疾患を、線維細胞の蓄積を原因とする疾患、あるいは病態として示すことができる（Kivi r ikko KI . Ann Med. 1993 Apr ; 25 (2) : 113—26. )。

本発明において線維症とは、組織の修復や障害に対する反応として線維の形成と蓄積が増加する病態を有する疾患を言う。先に示した肺線維症、あるいは肝線維症は、線維症の代表的な疾患である。これらの疾患の病因には、様々なメカ二ズムが関与する可能性が指摘されている。しかしいずれにせよ、組織の線維化によって、組織の機能が損なわれることは共通している。たとえば肺線維症においては呼吸機能が損なわれる。肝線維症は肝臓の血流を妨げ、肝機能障害の原因となる。したがって、線維症を改善することができれば、これらの疾患の症状を治療、治癒、あるいは予防することができる。

肝線維症のような線維症の進行がコラ一ゲン産生の阻害によつて抑制されることは公知である（Kivi r ikko KI. Ann Med. 1993 Apr ; 25 (2)： 113-26. ) ₀

本発明による、線維症の治療または予防のための化合物のスクリーニング方法は、先に述べたシノビオリンによる P4HA1のュビキチン化作用を調節する化合物のスクリーニング方法と同様の操作によって実施することができる。

したがって本発明によって、以下の工程を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリーング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブユニットまたはそのホモログである方法が提供される。

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のュビキチン化が可能な条件下で他方とィンキュベー卜する工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベー卜後に被験化合物と接触させる工程、

b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、基質のュビキチン化のレベルを測定する工程、および

c)基質のュビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたュピキチン化のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程

あるいは本発明は、以下の工程を含む、線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、.基質がプロリン 4水酸化酵素 aサブュニットまたはそのホモログである方法に関する。

a)被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベ一卜する工程、

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビォリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または

b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および

c)シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程

また、リウマチにおけるコラーゲンの産生過剰は、リウマチの代表的な病態の 1つである。したがって、シノビォリンによる P4HA1活性の調節を制御し、コラ一ゲンの産生を抑制することは、リウマチの治療戦略として有効である（Kivirik ko KI . Ann Med. 1993 Apr ; 25 (2)： 1 13-26. )。したがって本発明によって、以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログである方法が提供される。

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベ一ト後に被験化合物と接触させる工程、

c)基質のュビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたュビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を選択する工程

また、本発明は、以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素ひサブュニットまたはそのホモログである方法に関する。

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノピオリンと基質との結合が可能な条件下でィンキュベ一トする工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、 b)前記 a)、 a' ) , および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノピオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および

c)シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程

一方、 P4HA1 のュビキチン化作用に対する影響を指標として見出されたシノビォリンの活性化剤は、コラ一ゲンの補充療法において有用である。たとえば加齢、紫外線照射、あるいはストレスなどによって減少するコラーゲンを、シノビオリンの活性ィヒ剤の投与によって補充することができる。

加えて本発明は、以下の要素を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキット、ならびに線維症及び関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニングのためのキットに関する。本発明のキットに必要な下記要素（1)および (2)は、既に述べたようにして得ることができる。

(1) シノビオリンまたはそのホモログ、および

(2) P4HA1またはそのホモログ

本発明のキットにおいて、 P4HA1 またはそのホモログは、予め標識されていても良い。あるいは標識するための手段を組み合わせることもできる。たとえば、 P4HA1 またはそのホモログを認識レて結合する標識抗体を組み合わせることができる。

本発明のキットには、更に付加的に以下の要素を組み合わせることができる。これらの要素も先に述べたとおりである。

(3) ュビキチン活性化酵素

(4) ュビキチン転移酵素、

(5) ュピキチン、および

(6) アデノシン 3リン酸（ATP)

上記構成要素のうち、ュビキチンについては予め標識しておくことができる。あるいは、ュビキチンを標識するための手段を組み合わせることができる。たとえば、ュビキチンを認識して結合する標識抗体を組み合わせることができる。

本発明のキットを構成する P4HA1は、ビーズなどの固相に結合させておくことができる。特に液体シンチランを含むビーズは、 ³²P標識したュビキチンと P4HA 1 との結合を簡便に検出することができるので有利である。したがって、液体シンチランを含むビーズに結合された P4HA1と放射活性標識されたュビキチンを含むキットは、本発明のキットとして好ましい。

本発明のキットには、細胞を培養するための容器や培地を組み合わせることもできる。本発明のキットは、既に述べた本発明の方法を実施するために用いることができる。

本発明の試験またはスクリ一二ング方法により同定された化合物は、シノピオリンとプロリン 4水酸化酵素が関与する疾患に対する医薬の候補となり、その予防または治療に利用することができる。このような疾患として、たとえば線維症または関節リウマチを示すことができる。これらの化合物は、有効成分以外に適宜他の溶質や溶媒と組み合わせて医薬組成物とすることができる。本発明のスクリーエング方法により単離される化合物を医薬品として用いる場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。

例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、ッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。化合物の含有率は適宜決定すればよい。患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、経口投与、関節内注入、その他の当業者に公知の方法により行いうる。

投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、症状などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。一般的な投与量は、薬剤の有効血中濃度や代謝時間により異なるが、 1日の維持量として約 0. lmg/kg 〜約 1. Og/kg、好ましくは約 0. lmg/kg〜約 10mg/kg、より好ましくは約 0. lmg/k g〜約 1. Oing/kgであると考えられる。投与は 1回から数回に分けて行うことができる。また、該化合物がポリヌクレオチドによりコードされうるものであれば、該ポリヌクレオチドを遺伝子治療用べクタ一に組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。図面の簡単な説明

図 1は、酵母ツー八イブリッドシステムを用いたスクリーニングに用いたペイトのコンストラクシヨンの構造を示す図である。

図 2は、〔³² P〕標識した Fl ag- HA1融合タンパク質と GST- Syno dTM及び GS T-Syno RING融合タンパク質との結合を示すオートラジオグラフの写真である。図 3は、シノビオリン各蛋白質： Syno dTM、 Syno dTM (C307S) 、 Syno dTM (d RING) 、 Syno RING による GST蛋白質、または GST融合 P4HA1 蛋白質のュビキチンァッセィの結果を示すォ一ドラジォダラフの写真である。

図 4は、各種マウス胎児線維芽細胞における P4HA1発現量を示すウエスタンブロット法の結果を示す写真である。

図 5は、各種マウス胎児線維芽細胞の培養上清に含まれるコラーゲン含量を示すグラフである。図中、縦軸はコラーゲン含量の比（0 . 0 9 コラーゲン/ mg 蛋白質を 1とする）を、また横軸はマウスの細胞の種類を示す。

図 6は、各種マウス胎児線維芽細胞におけるプロリン 4水酸化酵素活性を示すグラフである。図中、縦軸は Syno+Λの実測値を 1とする - ¾0の産生量の比を、また横軸はマウスの細胞の種類を示す。図 7は、肝硬変の病理組織におけるシノピオリンの発現を示す顕微鏡写真（2 0 0倍）である。

左上：抗シノビオリン抗体による染色

右上：へマトキシリン核染色

左下：マウス IgGによる染色（対照）

図 8は、結節性筋膜炎の病理組織におけるシノピオリンの発現を示す顕微鏡写真（2 0 0倍/右および 4 0 0倍/左）である。上から順に、マウス IgG、抗シノピオリン抗体、および抗シノビオリン抗体 +ブロッキングべプチドによる染色結果を示す。発明を実施するための最良の形態

次に、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

実施例 1 . 酵母ツーハイプリッド法による P4HA1 のスクリーニング

酵母ッ一ハイブリッドシステムとして、クロンテック社の MATCHMAKER ッ一ハイブリツドシステムを用い、酵母形質転換法（Pro. Nat l . Aca. Sc i . USA. , 88 : 9578-9582, 1991) によりシノビォリンの基質タンパク質のスクリーニングを行なった。シノピオリン cDNAの 706 b から 1854 bp及び 805 bp から 1260 bpの末端を EcoR I/Xho Iで修飾し、 PGBT9 ベクタ一の EcoR I/Xho Iサイトに揷入した。以下、シノピオリンの 706 b から 1854 bpのフラグメントを Syno dTM、 80 5 b から 1260 bpを Syno RING と呼ぶ（図 1 )。

シノビオリンの基質タンパク質のスクリーニングに用いるライブラリ一はヒト軟骨由来の cDNAを pACT2 ベクターに掙入したものを用いた（pACT2- Y；)。 42 、 15分のヒートショックの後、酵母株 Y190に PGBT9- Syno dTM又は pGBT9- Syno RI NG (2. O n g ) > PACT2-Y (20 M g ) を導入した。各ベクターを導入した酵母 Y190 を Tr i s- EDTA (pH7. 5) 緩衝液（TE緩衝液）で洗浄後、 SD-Trp_Leu- Hi sプレートに TE緩衝液で希釈した酵母 Y190の溶液を広げ 30でで 10日培養した。現れてきたコロニーに対し、 0.5 mg/ml の X- gal を基質とする^ガラクトシダーゼフィル夕一アツセィを行ない陽性クローンを検出した。

陽性クローンを SD- Leu- His培地にて 30°Cで 10 日振盪培養し、アルカリ- SDS 法 (Methods Enzymol., 194:169-182, 1991) にて酵母 DNA を抽出した。抽出した酵母 DNA を大腸菌株 HB101 に形質転換し、 M9プレ一ト（-Leu) に広げ 37°Cで 2日培養した。現れてきたコロニーを 20 gZmlのアンピシリンを添加した LB 培地で 37 、 16時間震盪培養しアルカリ- SDS法によってプラスミド DNA を抽出した。抽出したプラスミド DNA に挿入されているヒト軟骨由来の cDNA断片の解析にはアプライド ·バイオシステムズ社の BigDye Terminator Cycle Sequenc ing system を用いた。

配列を BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih, gov/BLAST/) により解析した結果、コラーゲン産生において必須であるプロコラーゲンのプロリン残基の水酸化を触媒する酵素であるプロリン 4水酸化酵素の aサブュニット（procollagen- prol in e， 2-oxoglutarate 4-di oxygenase (.proline 4hydraxylase), alpha polypeptid e I (ACCESSION No. XM_032511P4HA1) を得た。実施例 2. シノビォリンと P4HA1 の結合

TNT-coupled Translation System (プロメガ社) 及び cDNA3-Flag-P4HAl を用い、〔³⁵S〕標識した Flag_P4HAl融合タンパク質を作成し、これと GST- Syno d TM、 GST - Syno RING及び GST タンパク質を 20 mM HEPES (pH7.9)、 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Tween、 5 % グリセロール、 1 mM DTT, 0.2 mM NaV0₄, 5 m M NaF, 1 mM PMSFを含む結合バッファ一に加え、 4°Cで 16時間反応させた。その反応物を SDS- PAGE 上で展開後、イメージアナライザ一（BAS2000, Fujix) で放射活性を検出した。 GST- Syno dTM及び GST- Syno RING融合タンパク質と〔³⁵ S〕 PCDNA3- Flag- P4HA1では、結合が観察された。またコントロールである GST タンパク質と PCDNA3- Flag- P4HA1 との結合は認められなかった（図 2)。この結果から、シノピオリンと P4HA1 は、結合することが明らかとなった。実施例 3 . シノビォリンのュビキチンリガーゼ（E3) としての基質の同定ュビキチンは、活性化酵素（El)、結合酵素（E2) 及びリガ一ゼ（E3) から成るュビキチン系酵素により標的蛋白質（基質）に共有結合し、この反応が繰り返されることにより形成されるポリュビキチン鎖が、基質のプロテアゾームによる分解マ一カーとして作用する。 E3 は基質を選択する最も重要な酵素である。シノビオリンの基質蛋白質を同定することは、シノビオリンが関与するシグナル伝達経路を決定する上で重要な手係りになると考えられる。酵母ツーハイプリッド法を用いたスクリーニングで得られたシノビオリンと結合する蛋白質はシノピオリンュビキチンリガーゼ (E3)の基質候補となる。

そこで、インービトロでのュビキチンリガ一ゼ活性測定系を用いて検討した。 Syno dTM、 Syno RING, シノビォリンの 307番目のシスティンをセリンに置換した Syno dTM (C307S)、 291番目から 329番目のアミノ酸を欠損した Syno dTM (d RING) および P4HA1 の全領域を含む cDNAを、 GST融合蛋白質のベクター（pGEX 4T-1) に挿入し、大腸菌での融合蛋白質の産生を行った。大腸菌の可溶化上清から得られた各融合蛋白質はダル夕チオンセファロ一ス ^TM 4B ビーズ（アマシャムバイオサイエンス社）に結合させた。

次に、各シノビオリン融合蛋白質ビーズをプロテア一ゼの一種、トロンビンによって GST部分を除き、シノビオリン蛋白質を得た。あらかじめ PKAサイトを挿入した His-ュビキチン蛋白質は〔³²P-ァ〕 ATP で標識した。 E1 (酵母由来)、 E2 (UbcH5c)、 ATP 、 C³²P-r ) 標識ュビキチン、 GST融合 P4HA1 蛋白質ビーズ及び各シノビオリン蛋白質を混合し、 37でにて 60 分間反応させた。反応後の各サンプルに 4xSDS- PAGE緩衝液を加え、 5分間煮沸した後、 10% SDS-PAGE 上で展開させた。

展開したゲルをイメージアナライザ一（BAS2000, Fuj ix) によりイメージングし、ュビキチン化されたバンドを検出した。結果として、 Syno dTMおよび Syno RING により、 P4HA1 がュビキチン化されることが明らかとなった（図 3)。しかし、 Syno dTM (C307S) および Syno dTM (dRING) では P4HA1 はュビキチン化されなかった。従って、 P4HA1 はシノビォリンの基質であることが明らかとなった。実施例 4. シノビォリンとコラ一ゲン産生

各種マウス胎児線維芽細胞（MEFs)における P4HA1 発現量およびコラーゲン産胎児線維芽細胞（MEFs) を 2 X 10⁵個まき、 3 日間培養後に回収した。 P4HA1 発現量は、抗 P4HA1抗体（抗 hPH ( 、精製 I_gG、第一ファインケミカル（株)）を用いたウエスタンプロット法により定量した。同時に、抗シノビオリン抗体 (モノクローナル抗体、 10 Da) および抗 j3ァクチン抗体（モノクローナル抗- /3 - ァクチン、クローン AC- 15，シグマ）により、シノビォリンおよび )3ァクチンの発現量も比較した。コラーゲンは Sircol ™ soluble collagen assay kit (Bioc olor 社）を用いて定量した。データは MEF(syno +Λ)細胞中のコラーゲン含量 (0.09 g コラーゲン/ mg蛋白質）を 1として処理した。

その結果、シノビオリン欠損マウス（syno -/- ) MEFs においては、 P4HA1 の蛋白質レベルは野生型マウス（syno +/+ )の MEFs の場合とほぼ同様であった (図 4)。一方 syno -/- の MEFs 培養上清中のコラーゲン含量は、 syno +/+ のそれより少ないことが観察された（図 5)。この二つの所見から、シノビオリンは P4HA1をュビキチン化することによって、細胞中のプロリン 4水酸化酵素蛋白質の品質を管理している可能性が示唆された。

各種 MEFにおけるプロリン 4水酸化酵素活性の比較

プロリン 4水酸化酵素活性は以下の論文を参考にして測定した。

DGribble TJ, Coins tock JP, Udenfriend S. Collagen chain formation and pe ptidyl proline hydroxylation in monolayer tissue cultures of L一 929 fib roblasts. Arch Biochem Biophys. 1969 Jan;129(l) :308-16

2)Margol is RL, Lukens LN. The role of hydroxylation in the secretion of collagen by mouse fibroblasts in culture. Arch Biochem Biophys. 1971 D ec;147(2) :612-8.

3)Methods enzymol. Vol. 82 (1982) p247- 265.

コラ一ゲン産生細胞である正常滑膜細胞の培地にひ， α' - ジピリジルを添加することにより、細胞中のヒドロキシラーゼによる水酸化反応を停止させ、その後培養上清中に [2，3-¾] プロリンを加え、合成された ¾- プロトコラ一ゲンを抽出した。また、 syno -/- の MEF 培養細胞と syno +/+ の MEF 培養細胞から P4 Hが含まれるライセ一トを回収し、 ¾_ プロトコラーゲンを水酸化する活性 (¾ - H ₂0の産生量)を測定した。

その結果、 ¾-H₂0の産生量は、 Syno+/+では 39. 28 cpm/^g全細胞抽出物、 Syno_/_では 27. 58 c / fig全細胞抽出物であった。 Syno+/+の実測値を 1 として ¾- H₂0の産生量の比を図 6に示した。 syno - /- の MEFs における P4H の酵素活性は syno I/+ の MEFs に比べて低いことが分かった（図 6)。実施例 5. 肝硬変および結節性筋膜炎の病理組織におけるシノビオリンの発現線維化を伴う疾患において、シノピオリンの発現部位を確認するために、肝硬変および結節性筋膜炎の病理組織を用いて、抗シソビオリン抗体による組織免疫染色を行った。

肝硬変および結節性筋膜炎の病理組織はインフォームド ·コンセントを行ない入手した。組織は定法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに抱埋をしてミクロト一ムにて薄切し、組織検体として使用した。組織切片はキシレン各 5分ずつ 3回の処理で完全にパラフィンを除き、 100%エチルアルコールから 10%ずつ濃度を下げた 50%までの 6段階下降系列のアルコール溶液をくぐらせた後、 1%牛血清アルブミン (BSA)にて 30分間ブロッキングした。ブロッキング終了後の組織に、 1 % BSAを含む PBS溶液で希釈した 1次抗体溶液（抗シノビオリンモノクローナル抗体）を、室温にて 60分反応させた。次いで、その組織を PBSにて 5分間、 5回洗浄した後、 1 %BSA溶液にて希釈した 2次 HRP標識抗マウスィムノグロブリン抗体を室温 30分間反応させた。反応終了後 P BS にて 5 分間、 5 回洗浄して更に発色試薬（3, 3' -ジァミノべンジジン四塩酸塩）を反応させた。適度な発色が得られた後に組織を水洗して顕微鏡で観察した。また、対比染色としてへマトキシリン核染色を行い、顕微鏡にて観察した。更に、対照として染色に用いた抗シノビオリンモノクローナル抗体のェピトープのァミノ酸配列からなるブロッキングペプチドとともに反応させた試料も顕微鏡で観察した。

その結果、肝硬変の病理組織においては、肝臓の実質細胞、特に、細胞増殖性の高い部分にシノピオリンの高い発現が見られた（図 7 )。筋膜の線維芽細胞の腫瘍様増殖を特徴とする結節性筋膜炎の病理組織においても、細胞増殖性の高い結節部分において、シノビォリンの高い発現が見られた（図 8 )。実施例 6 . シノビオリンと P4HA1の結合を阻害する化合物のスクリーニング法シノビォリンとその基質である P4HA1との結合を阻害する化合物を、ハイスル —プットスクリーニング（HTS) する方法を検討した。シノビオリンを His タグとの融合蛋白質として発現し、 P4HA1 も GSTとの ·ΐ$合蛋白として発現して、シノビオリンと HA1が結合すれば、 XL665標識した抗 His抗体と Eu (K)標識した抗 GST抗体との間でエネルギートランスファーが起こり、蛍光が検出される系を考案した。

1 ) MBP-Syno dTM-Hi sの作製

MBP シノビオリン dTM- Hisx₁₂は、細胞膜貫通部分（TM)を欠損させたシノピオリン（シノピオリン dTM)を MBPと融合させたものである。 MBP シノビオリン dT M- Hi sx₁₂は、大腸菌で融合タンパク質を産生し、 Ni- NTAカラム（キアゲン社）で精製することにより調製した。

2) His-E2の作製

His- E2は UbcHScの全領域を含む cDNAを Hisタグ融合タンパク質のベクター (pET) に挿入し、大腸菌で融合タンパク質を産生し、 Ni_NTAカラム（キアゲン社）で精製することより得た。

3) GST-P4HA1の作製

P4HA1の全領域を含む cDNAを、 GST融合蛋白質のベクター（pGEX 4T-1) に揷入し、大腸菌での融合蛋白質の産生を行った。大腸菌の可溶化上清から得られた融合蛋白質はダル夕チオンセファロ一ス^ 4Bビーズ（アマシャムバイオサイエンス社）で精製することにより調製した。

4) シノビォリンと P4HA1との結合阻害活性の測定

384穴プレートを用い、 15 の 50 mM HEPES ( H 7.5) 溶液中に 60 ng MBP- シノビオリン- His、 10 ng GST-P4HAK 1 mM DTT、 1 iM EDTA、 50 mM NaCK 0.1% BSA、 0.3¾ DMSO及び被験化合物を含む標準反応液を作製した。反応はの G ST-P4HA1を含む 50 mM HEPES溶液添加で開始した。室温、 30分反応後、 Eu(K)標識した抗 GST 抗体（20000 B counts, CIS bio international 社製）、 L665 標識した抗 His 抗体（0.025 g、 CIS bio international社製）及び 1 M KF を含む 50 mM HEPES溶液 5 Lを添加し、室温で一晚静置後、蛍光をルビースタ一™で測定した。ノ

一部改変したシノビォリンの部分ペプチド（配列番号 5) について阻害活性を調べたところ、 167 zg/inl の IC₅₍₎でシノビォリンと P4HA1 との結合を抑制した。実施例 7. シノビオリンの P4HA1ュビキチン化活性を阻害する化合物のスクリ一二ング法

1) XL665—Eu(K)のエネルギートランスファ一（HTRF 法）を用いたュビキチン化活性を阻害する化合物のスクリーニング法

シノビオリンの P4HA1ュビキチン化活性を阻害する化合物を、ハイスループットスクリーニング（HTS) する方法を検討した。 GST との融合蛋白として発現させた P4HA1を基質とし、 Eu(K) 標識したュビキチンによるュピキチン化を行って、 P4HA1が Eu(K) 標識したュビキチン化されれば、 XL665標識した抗 GST抗体と Eu (K) 標識したュビキチンとの間でエネルギートランスファーが起こり、蛍光が検出される系を考案した。

384穴プレートを用い、 15^Lの 20 HEPES ( H 7.5) 溶液中に 60 ng MBP- シノビオリン- His、 15 ng GST-P4HAK 15 ng El (Boston Biochem社製）、 200 n g His-E2、 6.25 nM Eu(K)標識したュビキチン (CIS bio international 社製）、 5 mM MgCl₂、 2 mM ATP、 1 mM DTT、 0.1¾ BSA、 0.3¾ DMS0 及び被験化合物を含む標準反応液を作製した。 37°Cで 30分反応後、 5;aLの 0.5 M EDTAを添加して反応を停止させた。これに XL665標識した抗 His抗体（0.025 /g) 及び 1 M KFを含む 20 mM HEPES溶液 5 Lを添加し、室温で一晚静置後、蛍光をルビース夕一 ^τ ^Μで測定した。

一部改変したシノビォリンの部分ペプチド（配列番号 5) は、結合を阻害する 1/20の濃度で P4HA1のュビキチン化を阻害した。

2) ELISA法を用いたュビキチン化活性を阻害する化合物のスクリーニング法

96穴 ELISA用プレートを抗 GST抗体で 4でで晚吸着後、使用するまで室温下、 5¾BSA/PBS溶液でブロッキングした。プレートは使用前に 0.3% BSA を含む PBS (PBSA) で 300 Lで 2回洗浄した。

反応用チューブで 30 illの 50 mM HEPES (pH7.5) 溶液中に 80 ng MBP-シノビォリン- His、 40 ng GST-P4HAK 15 ng El、 200 ng His- E2、 5 mM MgCl₂、 2 mM A TP、 1 mM DTT、 0.1¾ BSA, 0.3% DMS0及び被験化合物を含む標準反応液を作製した。室温で 30分反応後、 70 の 70 mM EDTA及び 50 mM HEPESを含む溶液を添加して反応を停止させた。この 30 Lをあらかじめ 70 nl PBSAを添加したプレートに添加し、室温で 1時間インキュベートした。 300 l PBSAで 3回洗浄後、 PBSAで 5000倍稀釈したマウス抗ュビキチン抗体溶液 100 Lを添加し、室温で 1時間インキュベートした。 300 ^L PBSAで 3回洗浄後、 PBSAで 10000倍稀釈したパーォキシダーゼ標識抗マウス IgG溶液 100 L を添加し室温で 1 時間インキュベートした。 300 L PBSAで 3回洗浄後、 100 ΐ ΤΜΒ溶液を添加し室温でインキュベーションした。発色が充分認められた時点で、 1 Μ リン酸を加え反応を停止し、 450 nmの吸光度を測定した。

一部改変したシノビォリンの部分ペプチド（配列番号 5 ) は、 P4HAしのュビキチン化を 55 g/mlの IC₅。で阻害した。産業上の利用の可能性

本発明によって、シノビオリンによるプロリン 4水酸化酵素の αサブュニットのュビキチン化作用を調節する活性を評価することができる。更に本発明の方法に基いて、シノピオリンによるプロリン 4水酸化酵素のひサブュニットのュビキチン化作用を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法が提供された。また、本発明によって、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリ一ニング方法が提供された。

シノビォリンが αサブュニットのュビキチン化によって、プロリン 4水酸化酵素の活性を調節していることは本発明者らによって明らかにされた新規な知見である。プロリン 4水酸化酵素は、生体内のコラーゲン合成において重要な役割を果たす酵素である。したがって、本発明の方法によって選択することができる化合物は、プロリン 4水酸化酵素の活性異常によつてもたらされる疾患の治療ゃ予防に有用である。たとえば、コラーゲンの蓄積によってもたらされる各種の線維症または関節リウマチを、本発明によって得ることができる化合物によって、治療あるいは予防することができる。

Claims

請求の範囲下の工程を含む、被験化合物のシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 0!サブュニットまたはそのホモログである方法。

a)シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベ一トする工程、

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のュビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベ一トする工程、または

c)基質のュピキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたュビキチン化のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のュビキチン化作用を調節する活性が検出される工程

以下の成分の共存により、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 1に記載の方法。

i)ュビキチン活性化酵素

i i)ュビキチン転移酵素、

i i i)ュビキチン、および

iv)アデノシン 3リン酸

シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をュビキチン化することによって、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項

1に記載の方法。

4. 基質のュビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項 1に記載の方法。

A)ュビキチン化された基質のレベル

B)ュビキチン化されなかった基質のレベル、および

C)プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットの生物学的活性のレベル

5 . プロリン 4水酸化酵素 aサブユニットまたはそのホモログが以下の（a ) —

( e ) のいずれかに記載のポリぺプチドである請求項 1に記載の方法。

( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリべプチド、

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノピオリンによつてュビキチン化することができるポリペプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、シノビォリンによってュビキチン化することができるポリペプチド

6 . シノピオリンまたはそのホモログが、以下の（A) - (E) のいずれかに記載のポリぺプチドである請求項 1に記載の方法。

( C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリぺプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドをュビキチン化する活性を有するポリぺプチド、およぴ

( E ) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド

7 . 以下の工程を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法。

a ) 請求項 1〜請求項 6のいずれか一項に記載の方法によって、被験化合物のシノビオリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および

8 . 請求項 7に記載の方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、シノビオリンによる基質のュビキチン化の調節剤。

9 . 以下の要素を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキット。

(1)シノビオリンまたはそのホモログ、および

(2)プロリン 4水酸化酵素サブュニットまたはそのホモログ

1 0 . 更に以下の要素を含む、請求項 9に記載のキット。

(3)ュビキチン活性化酵素

(4)ュビキチン転移酵素、 (5)ュビキチン、および

(6)アデノシン 3リン酸

1 . シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン 4水酸化酵素ひサブュニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモ口グのュビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキッ卜。

2 . 以下の工程を含む、被験化合物のシノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログである方法。

a)被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベ一トする工程、

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でィンキュべ一トする工程、または

b)前記 a)、 a' ) , および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および

c)シノピオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のュビキチン化作用を調節する活性が検出される工程

3 . シノピオリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項 1 2に記載の方法。

4. プロリン 4水酸化酵素 aサブユニットまたはそのホモログが以下の（a ) 一 ( e ) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 1 2に記載の方法。

( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリぺプチド、

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコ ―ドされるアミノ酸配列からなるポリぺプチドであって、シノビォリンと結合することができるポリペプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンと結合することができるポリペプチド

シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（A) - (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 1 2に記載の方法。

(A) 配列番号： 3に記載の塩基配列によってコードされるポリべプチド、、 -'

( C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、およびまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリペプチド、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリぺプチド、および

. 以下の工程を含む、シノビォリンのュビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法。

' a ) 請求項 1 2〜請求項 1 5のいずれか一項に記載の方法によって、被験化合物のシノビオリンのュビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および

. 請求項 1 6に記載の方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、シノビオリンによる基質のュビキチン化の調節剤。

. 以下の工程を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリー二ング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログである方法。

a' )シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のュビキチン化が可能な条件下で他方とインキュペートする工程、または

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベート後に被験ィヒ合物と接触させる工程、 b)前記 a)、 a' ) , および a' ' )のいずれかの工程の後に、基質のュビキチン化のレベルを測定する工程、および

19. 以下の成分の共存により、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 18に記載の方法。

i)ュビキチン活性化酵素

ii)ュビキチン転移酵素、

iii)ュピキチン、および

iv)アデノシン 3リン酸

20. シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をュビキチン化することによって、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 18に記載の方法。

21. 基質のュピキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項 18に記載の方法。

A)ュビキチン化された基質のレベル

B)ュビキチン化されなかった基質のレベル、および

0プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットの生物学的活性のレベル

22. プロリン 4水酸化酵素 aサブユニットまたはそのホモログが以下の（a) 一 (e) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 18に記載の方法。

(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノピオリンによつてュビキチン化することができるポリペプチド、

(d) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコ —ドされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリペプチド、および

( e ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリペプチド

3 . シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（A) ― (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 1 8に記載の方法。

( C ) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド、

(E) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド 4. 請求項 1 8〜請求項 2 3のいずれか一項に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、線維症の治療および Zまたは予防のための医薬組成物。

2 5 . 以下の要素を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリー二ングのためのキッ卜。

(1)シノビオリンまたはそのホモログ、および

(2)プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモ口グ

2 6 . 更に以下の要素を含む、請求項 2 5に記載のキット。

(3) ュビキチン活性化酵素、

(4) ュビキチン転移酵素、

(5) ュビキチン、および

(6) アデノシン 3リン酸

2 7 . シノピオリンまたはそのホモログ、およびプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログのュビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、線維症を治療または予防するための被験化合物のスクリー二ングのためのキット。

2 8 . 以下の工程を含む、線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素ひサブュニットまたはそのホモログである方法。

a' ' )シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、 b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および c)シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程

29. シノビォリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項 28に記載の方法。

30. プロリン 4水酸化酵素 αサブユニットまたはそのホモログが以下の（a) 一 (e) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 28に記載の方法。

(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、シノビォリンと結合することができるポリべプチド、

(e) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビォリンと結合することができるポリぺプチド

31. シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（A) — (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 28に記載の方法。

(B) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、 ( C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリペプチド、

請求項 2 8〜請求項 3 1に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、線維症の治療および/または予防のための医薬組成物。

以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリ一ニング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログである方法。

a)シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベートする工程、 a' )シノピオリン若しくはそのホモログ、 3よび基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のュビキチン化が可能な条件下で他方とィンキュベ一卜する工程、または

a' ' )シノピオリンまたはそのホモログと基質を、基質のュビキチン化が可能な条件下でィンキュベ一ト後に被験化合物と接触させる工程、 b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、基質のュビキチン化のレベルを測定する工程、および

34. 以下の成分の共存により、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 33に記載の方法。

i)ュビキチン活性化酵素

ii)ュビキチン転移酵素、

iii)ュビキチン、および

iv)アデノシン 3リン酸

35. シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をュビキチン化することによって、基質のュビキチン化が可能な条件を与える請求項 33に記載の方法。

36. 基質のュビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項 33に記載の方法。

A)ュビキチン化された基質のレベル

B)ュビキチン化されなかった基質のレベル、および

0プロリン 4水酸化酵素サブュニットの生物学的活性のレベル

37. プロリン 4水酸化酵素 Kサブユニットまたはそのホモログが以下の（a) 一 (e) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 33に記載の方法。

(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノビォリンによつてュビキチン化することができるポリペプチド、

(d) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハィブリタイズするポリヌクレオチドによってコ —ドされるァミノ酸配列からなるポリぺプチドであって、シノビオリンによってュビキチン化することができるポリペプチド、および

シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（A) — (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 3 3に記載の方法。

( C ) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、掙入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド、

(E) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをュビキチン化する活性を有するポリペプチド請求項 3 3〜請求項 3 8のいずれか一項に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの治療および /または予防のための医薬組成物。

4 0 . 以下の要素を含む関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーエングのためのキット。

(1)シノビオリンまたはそのホモログ、および

4 1 . 更に以下の要素を含む、請求項 3 9に記載のキット。

(3)ュビキチン活性化酵素、

(4)ュビキチン転移酵素、

(5)ュビキチン、および

(6)アデノシン 3リン酸

4 2 . シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン 4水酸化酵素ひサブュニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログのュビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、関節リウマチを治療または予防するための被験化合物のスクリ一ニングのためのキッ卜。

4 3 . 以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン 4水酸化酵素 αサブュニットまたはそのホモログである方法。

a)被験化合物の存在下でシノピオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でィンキュベートする工程、

b)前記 a)、 a' )、および a' ' )のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および c)シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程 44. シノビォリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項 43に記載の方法。

45. プロリン 4水酸化酵素 0；サブユニットまたはそのホモログが以下の（a) 一 (e) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 43に記載の方法。

(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およびまたは付加したアミノ酸配列からなり、シノピオリンと結合することができるポリべプチド、、

(d) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコ —ドされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビォリンと結合することができるポリペプチド、および

(e) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 70¾以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビォリンと結合することができるポリぺプチド

46. シノピオリンまたはそのホモログが、以下の（A) — (E) のいずれかに記載のポリペプチドである請求項 43に記載の方法。

(B) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、 ( C) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、挿入、およびノまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと結合するポリペプチド、

(E) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド

4 7 . 請求項 4 3〜4 6に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの治療および/または予防のための医薬組成物。

4 8 . 配列番号： 5に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。

4 9 . 配列番号： 5に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有するポリべプチドであって、請求項 1に記載の方法において該ポリペプチドを被験化合物として用いたときに、基質のュビキチン化のレベルが該ポリペプチド不存在下において測定されたュビキチン化のレベル結合のレベルよりも低い、ポリペプチド。

5 0 . 配列番号： 5に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有するポリべプチドであって、請求項 1 2に記載の方法において該ポリペプチドを被験化合物として用いたときに、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが該ポリペプチド不存在下において測定された結合のレベルよりも低い、ポリペプチド。

5 1 . 請求項 4 8〜5 0のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

5 2 . 請求項 4 8〜5 0のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、線維症の治療および Zまたは予防のための医薬組成物。

5 3 . 請求項 4 8〜5 0のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、関節リゥマチの治療および Zまたは予防のための医薬組成物。